CN102382771B - 一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及了一种利用体外微生物发酵法模拟体内肠道微生物转化的方式对京尼平苷进行有效的转化而生成京尼平，即利用本实验室筛选保藏的β-葡萄糖苷酶的高产菌发酵中药栀子，通过单因素实验优化，确定微生物转化得到产物京尼平的最佳条件，一方面在温和条件下水解其中的京尼平苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，另一方面利用现代微生物发酵工程技术使桅子的有效成分京尼平苷在体外可控条件下实现规模转化，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

Description

一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微生物转化技术，尤其是一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法。

背景技术

京尼平是一种环烯醚萜类物质，无毒，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂，在水中的溶解度较小。近年来，由于京尼平在抗肿瘤、治疗肝硬化等方面疗效显著，同时作为一种新兴的药物中间体具有很多新型的、重要的药理价值，因此在注射剂开发等方面具有很好的应用前景。同时京尼平还作为一种新型的生物交联剂被应用于生物材料中，它不仅能形成稳定的交联制品，并且具有细胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力强和应用领域广泛等优点，是非常有前途的交联材料。

京尼平在植物中含量非常低，直接提取很难实现，如京尼平在栀子中的含量约为0.005％，且主要是以其前体形式京尼平苷形式存在。由于酸碱水解打断糖苷键生成苷元的方法并不适用于京尼平，其环烯醚萜结构在酸碱作用下会遭到破环，影响其生物活性，所以，目前制备京尼平的方法主要是酶解法，即利用β-葡萄糖苷酶水解大量存在于植物中的京尼平苷生成苷元京尼平。β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶的一个重要组成部分，在医疗、食品、生物质转化中有重要的应用价值。纤维素酶在自然界的分布很广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，甚至哺乳动物中的反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有能够分解纤维素的菌群存在。纤维素酶的产酶菌很多，主要有细菌、放线菌和丝状真菌。丝状真菌的纤维素酶产量较高，可达20g/L以上，而且丝状真菌产酶具有诸多优点：产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分离和提取；产酶效率高，且产生的纤维素酶酶系结构较为合理。

国内近年来研究β-葡萄糖苷酶已经成为热点，已由过去的研究β-葡萄糖苷酶的简单提取到现在的产酶条件优化以及粗酶液的纯化。β-葡萄糖苷酶基因的克隆表达已经得到实现，新构建的工程菌已经应用到生产实践中。目前国内已有利用β一葡萄糖苷酶对提取出的京尼平苷进行酶解。但也同时存在很多不足，如：工艺复杂、成本过高，从而限制了其进一步发展。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种β-葡萄糖苷酶产生菌及利用该菌转化制备京尼平的方法，本方法利用体外微生物发酵法模拟人体内肠道微生物转化的方式对京尼平苷进行有效的转化而生成京尼平。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种β-葡萄糖苷酶产生菌，其特征在于：名称为黑曲霉Y-4，其分类命名为黑曲霉Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC NO.5141，保藏日期：2011年8月16日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

一种β-葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法，步骤如下：

(1)将保存的黑曲霉Y-4孢子接种于斜面培养基上，置25-30℃恒温箱培养1-5天，获得孢子，用无菌水溶解孢子获得孢子液，将孢子液接入摇瓶发酵培养基；

所述摇瓶发酵培养基：将栀子粉溶于去离子水中，使料水比为g/ml：10％，霉菌；

所述斜面培养基为PDA培养基；

(2)转化制备京尼平：在温度为25-30℃、pH7.0、装液量为45-55ml、接种量为8-12％、转速150-200r/min的条件下发酵80-110h。

而且，所述黑曲霉Y-4孢子液的浓度为每毫升孢子1.00±0.05×108个。

而且，所述转化制备京尼平的条件为：温度为28℃、pH7.0、装液量为50ml、接种量为10％、转速180r/min的条件下发酵96h。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明以实验室筛选保藏的菌种作为出发菌株，采用栀子粉作为唯一碳源组成的发酵培养基，分别从接种量、底物浓度、装液量、转化时间等几方面进行单因素实验分析，从而确定京尼平苷转化的最佳条件，有效地提高了产量，此方法为大量低价工业化生产β-葡萄糖苷酶和京尼平提供一条可行途径，这种生产方法降低了生产成本，提高了生产效率，不仅具有经济效益，还具有一定的社会效益。

2、本发明基于微生物具有多方面的产酶能力，能够利用体内的酶***完成重要的催化及代谢功能的独特优点，采用体外微生物发酵法模拟体内肠道微生物转化的方式对京尼平苷进行有效的转化而生成京尼平，即利用本实验室所筛选保藏的β一葡萄糖苷酶的高产菌在优化条件下发酵中药桅子，不仅可以降低生产成本，使β-葡萄糖苷酶广泛应用于药物生产过程中，而且使桅子的有效成分京尼平苷在体外可控条件下实现规模转化。

3、本发明利用本实验室筛选保藏的β-葡萄糖苷酶的高产菌发酵中药栀子，通过单因素实验优化，确定微生物转化得到产物京尼平的最佳条件，一方面在温和条件下水解其中的京尼平苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，另一方面利用现代微生物发酵工程技术使桅子的有效成分京尼平苷在体外可控条件下实现规模转化，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

附图说明：

图1为本发明的发酵液产物TLC分析图，其中：1、京尼平标准品；2、栀子粉溶液；3、Y-1发酵液；4、Y-2发酵液；5、Y-3发酵液；6、Y-4发酵液；

图2为本发明京尼平标品的高效液相色谱图；

图3为本发明利用黑曲霉转化发酵得到产物京尼平的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

一、土壤的确定

土样取自天津武清养牛场多年堆积牛粪的土壤，以1％的桅子浸液做酶反应底物，配以土豆培养基配方形成初筛培养基，利用栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后生成京尼平与甘氨酸反应生成蓝色，判断是否存在产β-葡萄糖苷酶真菌菌株，工艺为：

(1)菌种初筛：土壤经预处理后取1mL至盛有(25mL/250mL)富集培养基中培养，28℃，180r/min，培养36h；

富集培养基的组成以g/100mL计为：(NH₄)₂SO₄0.3，MgSO₄·7H₂O 0.05，NaCl0.2，KH₂PO₄0.1，纤维素0.5，氨苄霉素适量，115℃灭菌30min；

保藏培养基：PDA琼脂斜面固体培养基；

初筛培养基组成以g/100mL计为：PDA中加入栀子粉水浸液1，甘氨酸1，培养72h后放入50℃培养箱中保温6h；

经过初筛(含有栀子苷的PDA平板)，有四株菌株在初筛平板中有蓝色显色圈，说明这四株菌能够产生β-葡萄糖苷酶，将这四株菌命名为Y-1，Y-2，Y-3，Y-4；

(2)菌种复筛：初筛获得的菌种以栀子粉作为碳源发酵，利用DNS法测定酶活

种子培养基组成以g/100mL计为：可溶性淀粉2.0，葡萄糖1.0，KH₂PO₄0.1，MgSO₄0.1，NaNO₃0.2，酵母膏0.5，pH 4；

液体发酵培养基组成以g/100mL计为：麦麸粉3.0，(NH₄)₂SO₄0.2，KH₂PO₄0.2，CaCl₂0.04，MgSO₄·7H₂O 0.04，pH自然；

测得Y-1，Y-2，Y-3，Y-4的酶活以IU计为：0.3262，0.2463，0.3947，0.9410。

二、菌种的筛选、鉴定、及发酵条件的优化

1、β-葡萄糖苷酶产生菌的筛选

(1)取土样平摊于一干净的纸上，从四个角和中央各取一点土，混匀后，取10g土样，加入90mL无菌水，装入盛有玻璃珠的三角瓶中，振摇片刻，将菌分散。取1mL悬浮液放入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸三次，并振摇使之充分混匀，取1mL至盛有(25mL/250mL)富集培养基中培养，28℃，180r/min，培养36h。

将菌液接用三区划线的方法接种于含有抗生素的PDA平皿中，放入28℃培养箱中培养4d，获得单菌落，在培养皿中加入抗生素可以抑制细菌生长，从而达到筛选真菌的目的。

(2)将获得的单菌落接于初筛培养基上，培养72h后放入50℃培养箱中保温6h，取出。挑选出有蓝色显色圈的单菌落接至PDA斜面培养基。

初筛培养基组成以g/100mL计为：PDA中加入栀子粉水浸液1，甘氨酸1，培养72h后放入50℃培养箱中保温6h；

(3)选用生长正常、孢子丰富的斜面孢子加一定量的无菌水，打散孢子后，用显微镜计数，并调节为每毫升孢子(1.00+0.05)×10⁸个，接入发酵培养基，利用DNS法测定酶活力。

(4)用移液枪吸取1mL样品(枪头剪口)于EP管中，15000转/分离心5min；取栀子粉1g，加水溶解至100mL容量瓶中，取2mL，加入pH4.8的乙酸缓冲液1.0mL，混匀后再加入发酵液样品溶液1.0mL，50℃水浴40min，取样品点样，利用TLC法分析。

2、菌种的鉴定

(1)菌落形态观察：将斜面菌点接至有PDA培养基的平皿中，于28℃培养2d，观察菌落形态。

(2)菌体形态观察：真菌的水浸片观察：在载玻片上加一滴无菌水，用解剖针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝(菌体)，先置于50％乙醇中浸一下以吸取脱落的孢子，再放在载玻片上的无菌水中，用解剖针小心的将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜(40×)下观察，必要时换高倍镜观察。

(3)菌株的18S rDNA鉴定：

a.基因组DNA的提取，本实验的引物采用18S rDNA通用引物。

b.采用25μL的PCR扩增体系：

c.用于扩增目的基因的PCR条件：

通过将18S rDNA序列的扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，得到其大小为1800bp左右，符合使用霉菌18S rDNA引物的预期扩增结果。最终选取最好的条带进行回收，将回收的DNA送至北京六合华大基因科技股份有限公司测序。通过Nucleotide BLAST分析，与黑曲霉菌株的18S rDNA序列同源性为99％，可初步确定Y-4菌株为黑曲霉。

筛选出的黑曲霉菌种的保藏信息如下：名称为黑曲霉Y-4，其分类命名为黑曲霉Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC NO.5141，保藏日期：2011年8月16日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

3、黑曲霉Y-4发酵桅子条件的优化

(1)培养基成分：将含有3％京尼平苷的栀子粉按照不同的比例与去离子水混合进行配置，使料水比以g/mL计为：5％、10％、15％、20％、25％，煮沸、过滤，pH自然；

(2)发酵时间的确定：在温度为28℃、pH7.0、料水比为10％、装液量为20％，接种量1mL，转速180r/min的条件下分别发酵48、72、84、96、108、120h，按HPLC法测定发酵液中京尼平的含量；

(3)接种量的确定：在温度为28℃、pH7.0、料水比为10％、装液量为20％、转速180r/min的条件下接种量分别为1mL、2mL、4mL的条件下发酵120h，按HPLC法测定发酵液中京尼平的含量；

(4)装液量的确定：在温度为28℃、pH7.0、料水比为10％、接种量1mL、转速180r/min的条件下装液量分别为30mL、50mL、70mL、90mL的条件下发酵120h，按HPLC法测定发酵液中京尼平的含量；

(5)发酵料水比的确定：在温度为28℃、pH7.0、装液量为20％、接种量1mL、转速180r/min的条件下，料水比分别为5％、10％、15％、20％、25％的条件下发酵120h，按HPLC法测定发酵液中京尼平的含量；

通过单因素实验优化、HPLC检测确定确定黑曲霉发酵转化京尼平苷的最佳发酵条件为：发酵时间96h，接种量为10％，250mL三角瓶中装液量50mL，料水比10％。

4、产物鉴定及转化率的测定分析

用单因素实验确定的各因素最佳条件进行发酵，然后取发酵液样品1mL于EP管中，加入等体积的乙酸乙酯萃取，12000r/min离心5min，HPLC法检测发酵液中京尼平苷转化率：取上清液于另一EP管，待乙酸乙酯完全挥发后，于甲醇∶水＝45∶55溶解，然后用HPLC法检测。

色谱条件：ODS-2HPERSIL C18色谱柱(4.6mm×250mm，5.0μm)，甲醇、去离子水超声15min脱气，流动相甲醇∶水＝45∶55；检测波长为238nm；流速1mL/min；柱温为25℃；进样量20μL。

精密称取京尼平1.00mg置于1.5mL的EP管中，加甲醇∶水＝45∶55溶解，精确吸取20、40、60、80、100μL的对照品溶液到1.5mL的EP管中，并用甲醇∶水＝45∶55溶液稀释至100μL，然后吸取20μL进行测定。以峰面积(Y)对含量(X)做回归计算。结果表明，在0.2～1mg/mL范围内，京尼平有良好的线性关系，回归方程为：Y＝7868.9X-389.19，R²＝0.963。

京尼平的产物TLC法分析：以栀子粉溶液、京尼平标准溶液作为对照品溶液，分别点样5μL于GF254薄层板(50×100mm)，以醋酸乙酯(乙酸)：石油醚(1∶1)为展开剂，紫外灯254nm下检测。

三、利用黑曲霉Y-4转化发酵制备京尼平的方法，步骤如下：

(1)培养基的配置：斜面培养基(PDA)(1000mL)：马铃薯200g切块，加1000mL水煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL，加葡萄糖20g，琼脂20g，溶化后分装，115℃灭菌，15min；

摇瓶发酵培养基：将50g栀子粉溶于500mL去离子水中，使料水比为(g/ml)10％，煮沸、过滤，pH自然，分装到10个250mL的三角瓶中，121℃灭菌，20min；

(2)种子制备：将保存的黑曲霉Y-4孢子接种于斜面培养基上，置28℃恒温箱培养3天，获得母斜面，选用生长正常、孢子丰富的斜面孢子加一定量的无菌水，打散孢子后，用显微镜一一记数，并调节为每毫升孢子(1.00±0.05)×10⁸个，接入摇瓶发酵培养基；

(3)微生物转化制备京尼平：在温度为28℃、pH7.0、料水比为10％、装液量为50ml、接种量为10％、转速180r/min的条件下发酵96h，按HPLC法测定发酵液中京尼平的含量，并计算其转化率。分析测定转化率，转化率为14％。

Claims (3)

1.一种β-葡萄糖苷酶产生菌，其特征在于：名称为黑曲霉Y-4，其分类命名为黑曲霉Aspergillus niger，保藏编号为CGMCC NO. 5141，保藏日期：2011年8月16日，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种利用如权利要求1所述β-葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法，其特征在于：步骤如下：

⑴将保存的黑曲霉Y-4孢子接种于斜面培养基上，置25-30℃恒温箱培养1-5天，获得孢子，用无菌水溶解孢子获得孢子液，将孢子液接入摇瓶发酵培养基；

所述摇瓶发酵培养基：将栀子粉溶于去离子水中，使料水比为g/ml：10%；

所述斜面培养基为PDA培养基；

⑵转化制备京尼平：在温度为25-30℃、pH7.0、装液量为45-55ml、接种量为8-12%、转速150-200r/min的条件下发酵80-110h；

所述黑曲霉Y-4孢子液的浓度为每毫升孢子（1.00士0.05）×10⁸个。

3.根据权利要求2所述的β-葡萄糖苷酶产生菌转化制备京尼平的方法，特征在于：所述转化制备京尼平的条件为：温度为28℃、pH7.0、装液量为50ml、接种量为10%、转速180r/min的条件下发酵96h。

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