CN106399148A - 一种泌铵固氮菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种泌铵固氮菌及其应用。泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL‑4A，已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCC No.12588，其16S rRNA基因部分序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的固氮菌GXGL‑4A具有很好的微生物固氮能力，在无氮的Ashby培养基中，其固氮酶活性232.94±8.82nmol C2H4/(mL·h)。此外，本发明的固氮菌K.radicincitans GXGL‑4A具有良好的泌铵能力，在无氮Ashby固体培养基上培养4天后，测得的胞外铵态氮含量为2.51μg/mL。该菌具有荚膜，能抵抗不良外界环境条件如紫外线、干旱等，且对玉米、水稻等作物的生长具有明显的促进作用。可用于制备微生物菌肥，减少氮肥施用量，以达到增产并防止水体富营养化、保护环境等作用。

Description

一种泌铵固氮菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株有分泌氨态氮特性、且能促进玉米、水稻等作物生长的固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A及其应用。
背景技术
氮是生物体中蛋白质、叶绿素和核酸等各种关键有机分子的基本组成元素，也是在植物生长发育过程中必不可少的营养元素。在农业生产中，氮是衡量土壤营养成分状况和土壤肥力情况的重要标识。由于生物每年从土壤中带走大量的无机氮，且水也会淋冲掉很大一部分可溶性氮，为了补充土壤中氮元素的损失，最方便也是最有效的方法是使用工业化学氮肥。据***粮食及农业组织(FAO)2002的统计，每年粮食增产的40％是靠施用化肥取得的。我国是全球最大的化肥生产和消费国，2002年全球化肥总使用量为1.42亿吨，我国为4.34×103万吨，超过全球总化肥用量的1/3，居世界之首。而在氮肥的使用上，全国平均氮肥施用量达到158kg/hm2，占全球氮肥消费量的60％(FAO，1995)。然而，在作物生产中氮肥的利用率仅仅是33％，剩下的67％被浪费掉，相当于全球每年损失了159亿美元。
化学肥料对促进作物生长、提高粮食产量起着巨大的作用，但长期过量施用化学肥料，会导致土壤肥力下降和土壤退化，引起荒漠化的加剧。同时，造成土壤生态环境的恶化、生态功能的下降，产生如酸雨、水体富营养化、臭氧层耗竭、雾霾的形成、全球性变暖、饮用水和食物中硝酸盐积累等系列问题。这些环境问题对我国农业有着巨大的负面影响，也对世界农业的健康可持续发展构成了一定的威胁。
大气中氮气约占80％，但植物不能直接利用，而固氮微生物却可以将空气中的氮转化为植物可用的氨，称之为微生物固氮过程。这个过程是通过固氮菌体细胞内的多种固氮酶，在常温和常压的条件下，将空气中的氮气(N2)还原成氨(NH3)。固氮微生物的固氮作用促进了整个生态***中氮元素的流动和循环，也是地球化学循环的一部分。FAO 1995年的统计结果表明每年由微生物固定的氮素总量约为2×106吨，若施用尿素则需要4×108吨，可为全球3/4的植物提供氮素。由此可见微生物固氮作用是陆地生态***中最大的天然绿色氮肥厂。与生物固氮相比，工业合成氨条件苛刻，要在高温、高压下进行，这个消耗了大量的能源的过程中还将产生大量污染物，对人类生存的环境造成越来越大的威胁。同时，产生的高浓度氮氧化物更导致全球性变暖问题的加重。此外，多余的氮氧化物会随着雨水流入河流湖泊最终汇入海洋，形成水体富营养化，产生赤潮，水体缺氧导致大量的鱼类死亡，水体养殖业遭受严重的损失，并对给水环境到来巨大的危害。因此，通过固氮微生物的固氮过程、固氮相关基因及固氮突变体的研究，对降低工业化肥使用量、提高全球粮食产量、减轻水土污染、平衡自然生态、以及促进农业的可持续发展都有非常重要的意义。
豆科植物与根瘤菌的结瘤固氮方式是最典型也是研究最为深入的生物固氮模式。但由于该模式具有高度的宿主专一性，而无法广泛地作用于其他作物。因此，能够与非豆科植物进行联合固氮的固氮微生物，成为生物固氮研究的重点。对不利环境条件(如干旱、紫外线照射)适应性更强的非豆科植物的内生联合固氮菌具有良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一株泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A及其应用。Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌分离自玉米根际，属于非豆科植物联合固氮菌，具有良好的固氮和泌铵能力，且对玉米、水稻等均有良好的促生作用。该菌菌体外被荚膜，对不良环境的适应性强，是可应用的重要潜在固氮促生菌。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明的Kosakonia radicincitans GXGL-4A已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所；保藏登记号为CGMCC No.12588。其属于γ-变形菌纲，肠杆菌目(Enterobacteriales)。拉丁名：Kosakonia radicincitans。菌株名：GXGL-4A。
泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的16S rRNA基因部分核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
上述联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的获取方法，包括以下步骤：
A、采集非豆科植物玉米、甘蔗等的样品，包括根际土壤及根系、茎芽，从中分离富集固氮菌；
B、在Ashby培养基(无氮)上进行初筛和复筛；
C、固氮菌的微生物学形态观察和扫描电镜鉴定；
D、菌株的16S rRNA PCR扩增和DNA测序；
E、nifH基因的PCR扩增及测序。
步骤A的具体方法是，从上海、广东、广西、江西等地的玉米和甘蔗地里采集健康植株的根系、根际土壤及健康茎芽，分别装入聚乙烯塑料瓶中，于4℃冰箱保存。然后，对根系和茎芽样品进行磨碎和梯度稀释，在无氮Ashby培养基上分离富集固氮菌。具体包括以下步骤：
(1)根际土壤固氮菌的分离
用天平称5g附着在玉米或甘蔗根际的土壤，放入装45mL无菌水的三角瓶中，在180r/min、28℃摇床上振荡30min后在室温静置10min，上清液即10-1混合菌体稀释液。再用无菌水将上清液进行10倍系列稀释，各取各倍数稀释液的0.1mL涂布于Ashby无氮固体平板。
(2)根部组织固氮菌的分离
取根系，用水洗净并沥干水分。将之于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，再于加入1滴表面活性剂的5％～20％NaClO溶液中浸泡5～10min。然后再次在70％酒精中浸泡30s，无菌水冲洗5次。最后一次冲洗的无菌水涂布于LB固体平板。如无菌落生长说明消毒彻底，反之则重新取样分离。将灭菌的材料及10mL磷酸缓冲液放入灭菌的研钵内研磨，磨碎后静置5min，取上清液1mL作为原始液，用无菌水做10倍系列稀释，再分别取0.1mL涂布于Ashby无氮平板。
步骤B的具体方法是，配制Ashby培养基(1L中含有甘露醇10.0g、NaCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、MgS04·7H2O 0.2g、CaS04·2H2O 0.1g、CaC03 5.0g，pH 7.0，蒸馏水配制。固体培养基加入15～20g琼脂)121℃、灭菌20min。用无菌水对样品做10倍系列稀释，再分别取0.1mL候选固氮菌涂布于Ashby无氮平板，28℃恒温箱培养2～3d后，选取菌落形态不同的单菌落，反复进行平板划线分离，最终得到纯菌落，经液体培养后保存于-20℃备用。
步骤C的具体方法是：
(1)常规形态学观察：收集到的固氮菌接种于LB固体平板，28℃恒温培养12～24h后，出现的单菌落，观察其大小、形态、表面、边缘、颜色、***形状、透明度、菌落周围及培养基的颜色等。
(2)扫描电镜鉴定：固氮菌接种LB液体培养基过夜培养，吸取1mL菌液入已灭菌的1.5mL的离心管，室温4000r/min离心2min，吸出上清液，加无菌水重悬沉淀，然后立即吸取少量菌液于铜板上，置于空气中干燥，干燥固定后的样品用扫描电镜(Tecnai G2spirit Biotwin，120kV Bio-TEM)观察固氮菌形态。
步骤D的具体方法是，使用细菌基因组提取纯化试剂盒提取固氮菌基因组DNA，以之为模板DNA，根据16S rRNA保守序列设计引物，扩增目的片段，电泳分离纯化、回收目的DNA片段，测序。具体步骤如下：
(1)PCR扩增所用引物为27F和1492R7：
27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'；所用引物由上海生工生物工程公司合成。
(2)PCR反应体系包括：2×Taq Master Mix 12.5μL、正向引物27F(10μmol/L)1.0μL、反向引物1492R(10μmol/L)1.0μL、dd H2O 9.5μL、模板DNA 1.0μL，总体积25μL。其中，2×Taq Master mix为北京康维试剂生物技术公司产品。组成为：0.1U Taq polymerase/μL、500μmol/L dNTP each、20mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)、100mmol/L KCl、3mmol/L MgCl2、其它稳定剂与增强剂。
(3)PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性1min、55℃退火1min、72℃延伸1.5min，30个循环；最后在72℃延伸10min。PCR扩增产物约为1.2kb，在1.2％琼脂糖凝胶上电泳检测，目标条带经回收纯化后测序。
步骤E的具体方法是，提取固氮菌基因组DNA，作为模板DNA，根据nifH基因的保守序列设计引物，nifH PCR扩增引物为：P1(5'-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3')、P2(5'-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3')，扩增目的片段，经电泳分离纯化、回收目的DNA片段，测序。
本发明的Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌能显著促进玉米、水稻等的生长，具有很好的固氮活性和泌铵性能。
所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A用于制备微生物菌肥，改良贫瘠土壤，减少氮肥施用量，提高作物产量，防止水体富营养化，保护环境生态。
与现有固氮菌相比，本发明的优点在于：
(1)固氮能力更强。K.radicincitans GXGL-4A菌株在无氮培养基上固氮酶活性达到232.94±8.82nmol C2H4/(mL·h)，而对照菌株瓦斯兰德固氮菌Azotobactervinelandii CGMCC 1.1005固氮酶活性仅为76.79±12.52nmol C2H4/(mL·h)，GXGL-4A菌株相比瓦斯兰德固氮菌更能适应无氮环境，有更好的固氮能力。
(2)泌铵特性便于作物能直接吸收利用。K.radicincitans GXGL-4A能将氨态氮分泌到胞外可被宿主植物直接吸收利用。
(3)荚膜的存在使得K.radicincitans GXGL-4A固氮菌具有更好的抗逆能力，在干旱、紫外照射等不良环境中能更好地存活。以上这些特性对于将该菌开发成优良的微生物菌剂是非常有利的。
附图说明
图1是Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌的电镜照片；
图2是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的整株对比图；
图3是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的茎叶对比图；
图4是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的根对比图；
图5是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的整株对比图；
图6是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的茎叶对比图；
图7是固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的根部对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
本发明的Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌的获得：从广西桂林的玉米植株根上分离并在无氮的Ashby培养基上经反复筛选鉴定得到的菌种。革兰氏染色呈阴性，能利用蔗糖、葡萄糖、甘露醇和柠檬酸盐作为碳源，吸收葡萄糖时可产酸产气。该菌厌氧或兼性厌氧，可还原硝酸盐。甲基红(M.R)试验、产吲哚试验显示阴性，接触酶实验显示阳性。菌落形态多为圆形或椭圆型，表面光滑湿润，呈粘稠状，浅黄色或无色，在无氮培养基上程透明状。菌落直径大小随生长时间不同，从1-2mm至4-6mm不等。电镜下观察为杆状，有荚膜，能分泌铵和胞外多糖类黏性物质。端生鞭毛，易脱落。菌体大小约为1.5μm×0.5μm，单个或常见2个菌体细胞串联在一起。
该Kosakonia radicincitans GXGL-4A固氮菌已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC。地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物所；保藏登记号为CGMCC No.12588。其属于γ-变形菌纲，肠杆菌目(Enterobacteriales)。拉丁名：Kosakonia radicincitans。菌株名：GXGL-4A。
下面结合实施例和附图进一步说明本发明：
实施例1：菌株的筛选及获得
取根系，用水洗净并沥干水分。将之于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，再于加入1滴表面活性剂的5％～20％NaClO溶液中浸泡5～10min。然后再次在70％酒精中浸泡30s，无菌水冲洗5次。最后一次冲洗的无菌水涂布于LB固体平板。如无菌落生长说明消毒彻底，反之则重新取样分离。将灭菌的材料及10mL磷酸缓冲液放入灭菌的研钵内研磨，磨碎后静置5min，取上清液1mL作为原始液，用无菌水做10倍系列稀释，再分别取0.1mL涂布于Ashby无氮平板，28℃恒温箱培养2～3d后，选取菌落形态不同的单菌落，反复进行平板划线分离，得到纯菌落，经镜检和分子鉴定确认该菌株属于Kosakonia radicincitans种，菌株命名为Kosakonia radicincitans GXGL-4A。
实施例2：菌株的显微镜检及电镜观察
无菌条件下接种环挑取Kosakonia radicincitans GXGL-4A，涂于载玻片上，制片并革兰氏染色，在显微镜下观察菌体形态。
用LB液体培养基过夜培育菌株，吸取1mL菌液入已灭菌的1.5mL的离心管，室温4000r/min离心2min，吸出上清液，加无菌水重悬沉淀，然后立即吸取少量菌液于铜板上，置于空气中干燥，干燥固定后的样品用扫描电镜(Tecnai G2spiritBiotwin，120kV Bio-TEM)观察固氮菌形态。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的电镜图如图1所示，其中A显示串联的菌体，B显示了示菌体外被荚膜，C示单鞭毛。
实施例3：菌株泌铵特性的鉴定
将GXGL-4A菌株在LB培养基中于37℃、180r/min培养过夜，培养液按10-5倍稀释后涂布至Ashby无氮固体培养基上生长4d。在无氮条件下，固氮菌GXGL-4A会利用空气中的氮气进行固氮作用，并将其固定的部分氮最终以氨态氮形式分泌到胞外。因此，可用移液枪(无菌条件下，用单片刀切去Tip头部)吸取略带粘稠的分泌物，加入10倍体积的无菌水稀释后，稀释液通过0.45μm无菌滤膜除菌，收集到无菌Eppendorf管中即为待测样品。样品中氨态氮的浓度采用靛酚蓝-分光光度法进行测定。
(1)氨态氮含量标准曲线的制作
配制标准液：精确称取0.2358g(NH4)2SO4溶于水，定溶至100mL，获得含氨态氮量为500mg/L原液，稀释10倍得氨态氮含量为50mg/L的标准液。
配制检测试剂：1.25％亚硝基铁***溶液(二水亚硝基铁***0.362 2g，加水定溶至25mL)，溶液A(苯酚5.00g，1.25％亚硝基铁***溶液2.0mL，加水定溶至500mL)，溶液B(NaOH 2.50g，柠檬酸三钠2.0g，NaClO 3.5mL，加水定容至400mL)。
按照表1依次加入各种试剂，充分混合后，放入37℃水浴显色20min，取出后用水冷却至室温，在637nm下测定其OD值。
表1氨态氮含量标准曲线的制作
实施例4：菌株对玉米生长的促进作用
(1)玉米种子的消毒与催芽
将“宁玉721”玉米种子在蒸馏水中浸泡4小时，再用无菌水彻底冲洗干净。然后，移至75％乙醇中处理2min，无菌水清洗2次后，再用5％的NaC1O浸泡5min，无菌水清洗2次。将消毒的玉米种子用纱布包起来后置于培养皿中，于28℃在暗处萌发3d。每天观察发芽情况，并及时换水。
(2)固氮菌的培养
将固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A在LB培养基中于37℃、160r/min振荡培养至对数后期或稳定期前期测量OD值(OD600为0.8-1.0)，在Centrifuge5804R(高速离心机8000r/min)离心10分钟。然后，用无菌水洗涤菌体2次，再用无菌水稀释为不同浓度的稀释液。依次设置为104(cfu/ml)、106(cfu/ml)、108(cfu/ml)3个浓度梯度，对照组和每个浓度梯度分别设3个重复。
(3)玉米苗接种固氮菌的方法
将有机基质与栽培土壤按照1:1(V:V＝1:1)的比例均匀混合，将萌发芽玉米种子植入花盆，出苗期间隔一天同一时间段浇水和观察统计出苗情况。出苗后，将大小长势基本一致的“宁玉721”玉米苗移栽到聚乙烯塑料花盆(直径20cm、高20cm)里，花盆中装有按1∶1混合的沙土和有机基质，肥力较为贫瘠。每个品种种12盆，每盆3株。3天后，实验组于播种出苗(展出1-2片真叶)后第1天、第5天、第9天、第13天、第17天、第21天、第25天于玉米根颈部施加固氮菌Kosakoniaradicincitans GXGL-4A(每株1毫升)，对照组每株玉米加等量无菌水，培养期间浇清水以保持土壤湿润。第1组(104cfu/ml)：栽培土壤中不混合玉米固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，将培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakoniaradicincitans GXGL-4A菌液浓度为104cfu/ml接种处理。第2组(106cfu/ml)：培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A菌液浓度为106cells/ml接种处理。第3组(108cfu/ml)：培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakonia radicincitansGXGL-4A菌液浓度为108(cfu/ml)接种处理。对照组：培养期间浇灌无菌水(每株1毫升)处理，作为对照试验。每组3盆总12株。施用玉米固氮菌Kosakoniaradicincitans GXGL-4A处理6次后，将植株编号，并小心地从花盆里取出。拍照，测生物量包括株高、根长、根鲜重、茎叶鲜重、植株鲜重等。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的整株对比图如图2所示，图2中从左到右依次为对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理组。从图2可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其玉米苗整株生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的茎叶对比效果如图3所示，图3中从左到右依次是对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理，从图3可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其玉米苗茎叶生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的根对比效果如图4所示，图4中从左到右依次是对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理，从图4可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其玉米苗根部生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种“宁玉721”玉米苗后的株高(cm)、根长(cm)、根鲜重(g)、茎叶重(g)、植株鲜重(g)的具体数据如表2所示。
表2不同处理下“宁玉721”玉米品种生物量的比较
注：同一列不同小写字母表示在P<0.05上达显著水平，不同大写字母表示在P<0.01上达显著水平。
实施例5：菌株对水稻生长的促进作用
(1)水稻种子消毒和催芽
将水稻“CBB23”种子在蒸馏水中浸泡4小时，用蒸馏水彻底冲洗干净。然后，移至75％乙醇中处理2min，无菌水清洗2次后，再用5％的NaC1O浸泡5min，无菌水清洗2次。将消毒的水稻种子置于培养皿中，于28℃在暗处萌发4d，每天观察发芽情况和换水。
(2)固氮菌的培养
将固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A在LB培养基中于37℃、160r/min振荡培养至对数后期或稳定期前期，测量OD值(OD600为0.8-1.0)。在Centrifuge5804R高速离心机8000r/min离心10分钟。然后，用无菌水洗涤菌体2次，再用无菌水稀释为不同浓度的稀释液。依次设置为104(cfu/ml)、106(cfu/ml)、108(cfu/ml)3个浓度梯度，对照组和每个浓度梯度分别设3个重复。
(3)水稻苗接种固氮菌的方法
将有机基质与栽培土壤按照1:1(V:V＝1:1)的比例混合均匀，将发芽水稻种子植入花盆，出苗期间每天同一时间段浇水(中午12点)和观察统计出苗情况。移栽：将大小长势基本一致的水稻CBB23小苗移栽到聚乙烯塑料花盆(直径20cm、高20cm)里，花盆中装有按1∶1混合的沙土和有机基质，肥力较为贫瘠。水稻CBB23品种种12花盆，每花盆3株，种好让移栽的水稻CBB23小苗完全扎根，3天后实验组于播种出苗(展出1-2片真叶)后第1天、第5天、第9天、第13天、第17天、第21天、第25天于水稻茎基部施加固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A(每株1毫升)，对照组每株水稻加等量无菌水，培养期间中午12点浇灌清水以保持土壤湿润。第1组(104cfu/ml)：栽培土壤不混合玉米固氮菌Kosakoniaradicincitans GXGL-4A，将培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakonia radicincitansGXGL-4A，菌液浓度为104cfu/ml，接种处理。第2组(106cfu/ml)：培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，菌液浓度为106cfu/ml，接种处理。第3组(108cfu/ml)：培养期间浇灌玉米固氮菌Kosakonia radicincitansGXGL-4A，菌液浓度为108cfu/ml，接种处理；对照组：培养期间浇灌无菌水(每株1毫升)处理，作为对照试验。每组3盆，共计12株。固氮菌Kosakoniaradicincitans GXGL-4A处理6次后，将水稻植株编号，并小心地从土壤里取出幼苗，用水洗净水稻植株根部土壤，拍照，测量株高、根长、根鲜重、茎叶鲜重及植株鲜重等。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的整株对比图如图5所示，图5中从左到右依次为对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理组。从图2可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其水稻CBB23整株生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的茎叶对比效果如图6所示，图6中从左到右依次是对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理，从图6可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其水稻CBB23茎叶生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的根对比效果如图7所示，图7中从左到右依次是对照组、104cfu/ml、106cfu/ml、108cfu/ml固氮菌处理，从图7可以看出，接种的固氮菌溶度越高，其水稻CBB23根部生长越旺盛。
固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A接种水稻CBB23后的株高(cm)、根长(cm)、根鲜重(g)、茎叶重(g)、植株鲜重(g)的具体数据如表3所示。
表3不同处理下水稻“CBB23”品种生物量的比较
注：同一列不同小写字母表示在P<0.05上达显著水平，不同大写字母表示在P<0.01上达显著水平。
通过以上实施例可以看出，所述泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A具有以下特性：
(1)优势的固氮能力
K.radicincitans GXGL-4A菌株在无氮培养基上能够有效地还原乙炔，固氮酶活性达到232.94±8.82nmol C2H4/(mL·h)，而对照菌株瓦斯兰德固氮菌Azotobactervinelandii CGMCC 1.1005固氮酶活性仅为76.79±12.52nmol C2H4/(mL·h)，结果表明GXGL-4A菌株相比瓦斯兰德固氮菌更能适应无氮环境，有更好的固氮能力。
(2)良好的泌铵性能
采用靛酚蓝-分光光度法测定固氮菌K.radicincitans GXGL-4A在无氮环境中的泌铵活性。在Ashby无氮培养基上培养4天后，固氮菌的胞外分泌的氨态氮含量为2.51mg/L，表明有良好的泌铵性能。
(3)对作物生长具有显著的促进作用
采用单因素(接种浓度)多组试验，重复3次，以无菌水处理为对照，考察固氮菌K.radicincitans GXGL-4A对玉米品种“宁玉721”及水稻品种“CBB23”植株生长的促进作用。结果表明采用108(cfu/ml)浓度处理的“宁玉721”玉米株高为69.6±2.486cm，对照仅为60.6±2.576cm，差异达到极显著；固氮菌处理的根鲜重为4.9±0.465g，对照为4.7±0.365g，差异达到显著水平；茎叶重固氮菌处理的为23.3±0.713g，而对照为15.0±0.786g，差异达到显著水平；植株鲜重固氮菌处理的为28.2±1.136g，对照为21.9±2.494g，差异达到极显著水平。在水稻品种“CBB23”上的实验结论与玉米品种“宁玉721”上的相同，证实固氮菌K.radicincitans GXGL-4A对水稻和玉米等作物的生长有显著的促进作用。
(4)具有荚膜，能抵抗干旱、紫外线等不良的环境条件
电镜观察结果显示固氮菌K.radicincitans GXGL-4A菌体外被厚荚膜，这一结构特点赋予其抵抗干旱、紫外线等不良的环境条件的能力。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，已于2016年6月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.12588。
2.根据权利要求1所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其特征在于，其16S rRNA基因部分序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其特征在于，所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A具有荚膜。
4.根据权利要求1或2所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其特征在于，所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A具有固氮能力，
所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A在无氮培养基上能够有效地还原乙炔，固氮酶活性达到232.94±8.82nmol C2H4/(mL·h)。
5.根据权利要求1或2所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其特征在于，所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A具有泌铵性能，
所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A在Ashby无氮培养基上培养4天后，固氮菌的胞外分泌的氨态氮含量为2.51mg/L。
6.根据权利要求1或2所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A，其特征在于，所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A对作物生长具有促进作用。
7.如权利要求1所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的应用，其特征在于，所述的泌铵固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A用于制备微生物菌肥。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086042A (zh) * 2016-06-30 2016-11-09 上海交通大学 固氮菌铵载体基因、突变体、固氮菌铵载体突变株及应用
CN112219485A (zh) * 2020-10-12 2021-01-15 昆明理工大学 一种用于高寒高海拔地区土壤改良的土壤微生物培养方法
CN113122462A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 上海交通大学 一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法
CN113462602A (zh) * 2021-07-09 2021-10-01 浙江工业大学 促根生科萨克氏菌zjph202011及其应用
CN114350688A (zh) * 2021-12-28 2022-04-15 上海交通大学 guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103525830A (zh) * 2013-09-30 2014-01-22 中国农业科学院生物技术研究所 一种可增强固氮菌泌铵能力的基因
CN104593302A (zh) * 2015-01-19 2015-05-06 山西农业大学 道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法
CN105400715A (zh) * 2015-11-30 2016-03-16 北京林业大学 一种自生固氮菌mbc4及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103525830A (zh) * 2013-09-30 2014-01-22 中国农业科学院生物技术研究所 一种可增强固氮菌泌铵能力的基因
CN104593302A (zh) * 2015-01-19 2015-05-06 山西农业大学 道地黄芪固氮菌新菌株t16及发酵液的制备方法
CN105400715A (zh) * 2015-11-30 2016-03-16 北京林业大学 一种自生固氮菌mbc4及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BEATRICE BERGER ET AL.: "K-radicincitans, a beneficial bacteria that promotes radish growth under field conditions", 《AGRON. SUSTAIN. DEV.》 *
李琼洁 等: "玉米联合固氮菌Kosakonia radicincitans GXGL-4A的分离鉴定与固氮特性研究", 《微生物学通报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106086042A (zh) * 2016-06-30 2016-11-09 上海交通大学 固氮菌铵载体基因、突变体、固氮菌铵载体突变株及应用
CN113122462A (zh) * 2019-12-30 2021-07-16 上海交通大学 一种提高带荚膜细菌的遗传转化率的方法
CN112219485A (zh) * 2020-10-12 2021-01-15 昆明理工大学 一种用于高寒高海拔地区土壤改良的土壤微生物培养方法
CN112219485B (zh) * 2020-10-12 2021-08-20 昆明理工大学 一种用于高寒高海拔地区土壤改良的土壤微生物培养方法
CN113462602A (zh) * 2021-07-09 2021-10-01 浙江工业大学 促根生科萨克氏菌zjph202011及其应用
CN113462602B (zh) * 2021-07-09 2022-05-24 浙江工业大学 促根生科萨克氏菌zjph202011及其应用
CN114350688A (zh) * 2021-12-28 2022-04-15 上海交通大学 guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用
CN114350688B (zh) * 2021-12-28 2024-03-15 上海交通大学 guaA基因、质粒、菌株在表达固氮菌嗜铁素中的应用

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