CN113801817B - 解磷菌3-1及在溶解磷酸盐上的应用 - Google Patents

解磷菌3-1及在溶解磷酸盐上的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业和微生物技术领域，公开了一株高耐盐耐重金属镉的解磷菌3‑1及其应用。所述菌株为路氏肠杆菌（Enterobacterludwigiistrain 3‑1）3‑1于2021年6月18日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2021734。本发明的解磷菌（Enterobacterludwigiistrain 3‑1）3‑1具有溶磷、固氮、产植物生长激素、促进植株生长的作用，可应用于高盐度和高重金属浓度的土壤。将其应用于土壤和植物幼苗，可显著提高土壤有效磷的含量，大幅度增加植株的株高、湿重、干重和根茎长度，对农业生产及可持续发展具有重要的意义。

Description

解磷菌3-1及在溶解磷酸盐上的应用
技术领域
本发明涉及农业种植与微生物学领域，具体涉及一株解磷菌及其应用。
背景技术
磷是植物生长发育所必需的元素，不仅是植物体内重要化学物质的组成部分，还具有提高植物抗逆性和适应外界环境的能力。若土壤中的磷素缺乏，将严重影响植物的各项生命活动。所以磷是除氮之外限制植物生长最重要的营养要素。据报道，我国耕地土壤中约有74％的面积缺磷，植物可利用的有效态无机磷只占土壤总磷的2％～3％，为保证农业生产需投入大量磷肥。但研究表明磷肥的当季利用率只有10％～20％，总的利用率不超过25％，原因是施入土壤的磷素极易被土壤矿物质以吸附态或交换态固定，形成难溶性磷酸盐而富集在土壤中。目前，我国农田农业土壤盈余己经达到282×104t。长期投入磷肥造成土壤板结、酸化和肥力下降，带来严重的水体污染和土壤污染。因此，减少化肥的使用，提高土壤磷素的利用，对农业生产及可持续发展具有重要的意义。
解磷微生物可以将土壤中的难溶磷转化为植物可以吸收利用的有效磷，其在农作物根际中大量存在，与植物互利共生，能分泌生长激素，促进植物根的发育，利于植物的生长。也可以在土壤受污染环境下对重金属进行固定和活化，提高植物抗病能力。所以解磷微生物的应用可以成为缓解土壤缺磷和重金属污染问题的有效途径。
发明内容
为了克服现有技术上的问题和不足，本发明提供了一株具有溶磷作用、耐盐、耐重金属镉的路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，即一株解磷菌3-1。本发明从磷矿土中分离出一株解磷菌3-1，能在高盐高重金属镉的环境下生存，并能在土壤中定植，显著促进上海青生长。
解磷菌3-1，于2021年6月18日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021734，分类名称为路氏肠杆菌(Enterobacterludwigii strain 3-1)。
本发明的另一目的在于提供上述解磷菌3-1在溶解土壤中难溶性无机磷中的应用。
所述解磷菌3-1在溶解土壤难溶性磷酸盐上的应用。
或者，所述解磷菌3-1在制备溶解土壤难溶性磷酸盐的药物上的应用。
所述的难溶性磷酸盐包括磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁中的一种或多种。
本发明的另一目的在于提供上述解磷菌3-1在提高土壤中有效磷含量中的应用。
本发明从磷矿土壤中分离出一株高耐盐耐重金属的解磷菌3-1，所述菌株分类为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021734。
所述解磷菌3-1能够在较高的盐度值(质量浓度为12％及以下)和重金属镉浓度(350mg/L及以下)的环境下生存。
所述路氏肠杆菌Enterobacter ludwigii strain 3-1具有如下形态和生理生化特征：
所述路氏肠杆菌Enterobacter ludwigii strain 3-1在LB培养基上28℃培养24h后，菌落呈圆形，微乳白色，边缘整齐，光滑湿润，中间***，直径2-3mm；显微镜下呈革兰氏阴性，细胞形态为杆状，不产芽孢；该菌株能以葡萄糖、蔗糖、和乳糖作为碳源生长，甲基红和VP反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，明胶水解阳性。
所述路氏肠杆菌Enterobacter ludwigii strain 3-1可用作农用微生物菌剂，直接施用于缺磷和植物根系土壤。
进一步地优选，所述路氏肠杆菌Enterobacter ludwigii strain 3-1具有较高的溶磷能力，能够在较高盐度值和较高重金属镉的环境下生存。
本发明还请求保护上述路氏肠杆菌3-1在如下任何一方面的应用：
(1)在溶磷中的应用；或者作为溶磷试剂上的应用；
(2)在溶解土壤中难溶性磷中的应用；所述的难溶性磷为磷酸三钙、磷酸铝或磷酸铁中的一种或多种；优选地，所述的难溶性磷为磷酸三钙；
(3)在提升土壤有效磷含量中的应用，并促进植物生长。
与已有技术相比，本发明的增益之处在于：
本发明的解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1具有高耐盐、耐重金属镉、溶磷、促进植物生长的有益效果，该菌可施用于盐碱地和受重金属污染农田，将土壤中难溶性磷转化为植物可吸收利用的磷酸盐，增加土壤和植物根际速效磷含量，促进植物生长，能有效缓解土壤板结、酸化问题，增强土壤肥力，将其作为微生物菌剂施用于农田中，可减少化肥使用，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例2中解磷菌3-1在含磷酸三钙的固体培养基上形成的溶磷圈图。
图2为实施例4中解磷菌3-1的***发育树。
图3为实施例5中解磷菌3-1的耐盐活性图。
图4为实施例5中镉对解磷菌3-1的抑制浓度图。
图5为实施例7中土壤中不添加解磷菌3-1的CK空白图与添加解磷菌3-1的定殖数量图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作出进一步详细阐述，所述实施例的给出仅用于解释本发明，并未对本发明的使用范围进行限制。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为可从商业途径得到的试剂和材料。
液体无机磷筛选培养基①：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 30mg，MnSO4·H2O 30mg，水1000mL，pH 7.0-7.5。
液体无机磷筛选培养基②：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，磷酸铁5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 30mg，MnSO4·H2O 30mg，水1000mL，pH 7.0-7.5。
液体无机磷筛选培养基③：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，磷酸铝5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 30mg，MnSO4·H2O 30mg，水1000mL，pH 7.0-7.5。
固体无机磷筛选培养基：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，磷酸三钙5.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeSO4·7H2O 30mg，MnSO4·H2O 30mg，水1000mL，pH 7.0-7.5，琼脂粉20g。
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10g，氯化钠5.0g，水1000mL，pH 7.0-7.2，固体培养基添加1.5％的琼脂粉。
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g，氯化钠10g。
蒙金娜培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO4 0.5g，MgSO4·7H2O 0.3g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，FeSO4·7H2O 0.03g，MnSO4·4H2O 0.3g，卵磷脂0.2g，CaCO3 5.0g，酵母膏0.4g，水1000mL，pH 7.0-7.5。
金氏(King)培养基：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，水1000mL，pH 7.0-7.2。
阿须贝(Ashby)氏无氮培养基：甘露醇10g，KH2PO4 0.2g，NaCl 0.2g，MgSO4·7H2O0.2g，CaSO4 0.1g，CaCO3 5.0g，琼脂20g，水1000mL。
SPOT比色液：0.5mol/L FeCl3 1mL，H2SO4 30mL，超纯水50mL。
S2比色液：4.5g FeCl3，H2SO4 1mL，定容至1000mL。
实施例1解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1的分离、筛选
1、菌株初筛
土壤样品采自湖北省宜昌市磷矿(北纬N：31°13’55”，东经E：111°15’36”)土壤，装入无菌袋中带回实验室，4℃保存。称取10g新鲜土样加入90mL无菌生理盐水中，100r/min振荡15min，置入28℃培养箱培养24h。富集后取上清稀释到10-3、10-4、10-5三个梯度，分别取每个稀释度的液体350μL涂布于无机磷筛选固体培养基上，每组3个平行。倒置于28℃培养箱培养4-5d，观察透明圈。挑取有透明圈的菌落反复划线纯化培养，纯化后挑取单菌落转接至牛肉膏蛋白胨培养基斜面4℃保藏备用。
经中国典型培养物保藏中心保藏，得到高耐盐耐重金属的解磷菌3-1，所述菌株分类为路氏肠杆菌(Enterobacter ludwigii)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021734。
实施例2
溶磷无机磷能力测定
用去离子水配制100mL固体无机磷筛选培养基，121℃、30min灭菌后倒入一次性平板中，冷却后备用。将实施例1中保藏的解磷菌3-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养24h，取10μL解磷菌3-1的种子液用点接种法接种到的固体无机磷筛选培养基平板上，28℃培养箱中静置培养。7d后观察测定其菌落的菌圈和溶磷圈大小，计算溶磷指数：(溶磷圈-菌圈)/菌圈。
分别以磷酸三钙、磷酸铁、磷酸铝为唯一磷源配制液体无机磷筛选培养基①②③，每种磷源设置3个重复。将实施例1中保藏的解磷菌3-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养24h，取1mL种子液8000r/min离心5min，去上清，在离心管中加入1mL无菌水抽打至均匀，接入无机磷液体培养基①②③，28℃、200r/min摇床发酵培养5d。每天取2mL发酵液12000r/min离心10min，用钼锑抗比色法以未接种的发酵液离心后的上清液为空白对照，在700nm波长处测定吸光度，并根据以下公式计算可溶性磷增量：
Figure GDA0004023403030000041
A—发酵液上清液所测得吸光值；a—磷标准曲线的截距，本试验为-0.0177；b—磷标准曲线的斜率，本试验为0.505；V0—比色管定容体积，50mL；V1—发酵液上清液体积，2mL。
结果如表1和表2所示。
表1解磷菌3-1在磷酸三钙平板上的解磷情况
Figure GDA0004023403030000051
表2解磷菌3-1对三种不同无机磷源的分解能力
Figure GDA0004023403030000052
试验结果表明解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1的磷酸三钙溶磷指数为1.22，图1为解磷菌3-1在含磷酸三钙的固体培养基上形成的溶磷圈图。5天内对磷酸三钙的最大分解能力为55.73mg/L，对磷酸铁的最大分解能力为41.97mg/L，对磷酸铝的最大分解能力为37.41mg/L。
实施例3
溶解有机磷能力测定(卵磷脂为有机磷)
将实施例1中保藏的解磷菌3-1接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃、200r/min摇床培养24h，取1mL种子液8000r/min离心5min，去上清，在离心管中加入1mL无菌水抽打至均匀，接入蒙金娜培养基，28℃、200r/min摇床发酵培养5d。取2mL发酵液12000r/min离心10min，上清液用钼锑抗比色法测定可溶性磷含量。
表3解磷菌对卵磷脂的分解能力
Figure GDA0004023403030000053
结果表明解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1对卵磷脂的分解能力为2.16mg/L。
实施例4
解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1的鉴定-形态特征
将解磷菌3-1用无菌水制备成1×108cfu/mL的菌悬液，取5μL菌悬液以点接种法接种到LB培养基平板上，于28℃培养1d。结果显示菌落呈圆形，微乳白色，边缘整齐，光滑湿润，中间***；在电子显微镜下该菌呈革兰氏阴性，细胞形态为杆状，不产芽孢。
生理生化特性
参照细菌鉴定手册对菌株生理生化特性进行测定。
结果显示，该菌株能以葡萄糖、蔗糖和乳糖作为碳源生长，甲基红和VP反应呈阳性，淀粉水解呈阴性，明胶水解阳性。
16S rDNA基因序列分析
使用细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0提取菌株DNA。以菌株DNA为模板，采用细菌16S rRNA基因通用引物27F(5’-AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTTGTT ACGACTT-3’)进行PCR扩增。
扩增反应体系：模板7μL，dNTP 4μL，5×Ps Buffer 10μL，引物1(27F)2μL，引物2(1492R)2μL，PrimerSTAR HS酶0.5μL，dd H2O 24.5μL。
反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1.5min，循环30个周期；72℃延伸10min；最后4℃保持。
用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，选取电泳条带单一，片段大小合适的扩增样品送至武汉生工生物公司进行测序。测序结果在NCBI上进行序列比对。菌株3-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示。
鉴定结果：菌株鉴定为肠杆菌属，与Enterobacter ludwigii相似度99.79％，***发育树如图2所示。
所述解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1的保藏信息：保藏日期：2021年6月18日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号：CCTCC M2021734，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
实施例5
解磷菌3-1抗性测定-耐盐度活性测定
采用含有质量分数为0％、3％、6％、9％、12％、15％及18％ NaCl梯度的牛肉膏蛋白胨培养基，每个浓度3个平行，灭菌后接入解磷菌3-1，28℃培养24h，测定其600nm下的吸光度，观察生长状况。结果如图3所示，从图3中可以看出，解磷菌(Enterobacter ludwigiistrain 3-1)3-1可耐受的盐度值较高，范围较广，在氯化钠浓度0％～6％范围均可正常生长，浓度增加到9％时生长受到抑制，当氯化钠浓度大于15％时，解磷菌3-1几乎停止生长。
重金属镉耐受性测定
浓度为10g/L的Cd2+按照50、100、150、200、250、300、350、400mg/L的梯度配制含不同镉离子浓度的牛肉膏蛋白胨培养基，以接种到不含重金属镉的牛肉膏蛋白胨培养基为CK。在28℃、200r/min的摇床中震荡培养2d后取出，取3mL菌液用紫外分光光度计在660nm下测定吸光值，OD值与空白组做比较，确定菌株的抑制浓度和致死浓度。结果如图4所示，从图4中可以看出，解磷菌(Enterobacter ludwigii)3-1的重金属镉致死浓度为350mg/L，具有较强的耐受能力。
实施例6
土壤溶磷能力测定
设置不接菌的常规土壤(CK)(土壤基本理化性质，有效磷10.6mg/kg，全磷114.26mg/kg)，接菌的常规土壤(P-3-1)处理，每处理设置3个重复。分别称取上述常规土壤500g于500mL的烧杯中，烧杯四周用锡箔纸遮光处理，向(P-3-1)土壤中添加浓度为1×108CFU/mL的用无菌水配制的3-1菌悬液50mL，充分混匀，对照使用等量的无菌水。于28℃培养，培养20d取样按照碳酸氢钠法测定土壤中有效磷含量。
结果表明，不接菌处理土壤中有效磷含量为12.6mg/kg，接菌处理土壤中有效磷含量为19.9mg/kg。与CK相比，解磷菌(Enterobacter ludwigii strain 3-1)3-1使土壤中有效磷的含量提高了57.94％。
实施例7
土壤定植率试验
设置不接菌的常规土壤(CK)，接菌的常规土壤(P-3-1)处理，每处理设置3个重复。分别称取上述常规和灭菌的土壤500g于500mL的烧杯中，烧杯四周用锡箔纸遮光处理，向(P-3-1)土壤中添加浓度为1×108CFU/mL的用无菌水配制的3-1菌悬液50mL，充分混匀，对照使用等量的无菌水，在0、5、10、15、20、25、30、35、40d时，取3盆中不同位置的土壤混合，检测土壤中解磷菌数量。以处理平皿中有溶磷圈的减去对照平皿中有溶磷圈的为存活数，计算定殖率。
图5结果表明，在没有栽培作物的情况下，解磷菌(Enterobacter ludwigiistrain 3-1)3-1的定殖率比较理想，10d时定植率在44.6％，到25d时下降到7.0％，40d时下降到0.2％，在没有外源养分进入的情况下，40d定植率还能达到0.2％，说明其定植能力较强。
由上述各表数据可知，以上实施例仅为本发明的优选技术方案，并非对本发明范围的限制，本领域的技术人员可以对上述实施例中的说明与技术方案进行不同形式的修改和变动。在不违背本发明精神和原则的基础上，所作的任何修饰、改进、同等替换，均应保护在本发明的权利保护范围之内。
序列表
<110>三峡大学
<120>解磷菌3-1及在生产植物生长激素上的应用
<130>
<160> 1
<210> 1
<211> 1401
<212> DNA
<213>解磷菌3-1
<400> 1
GCTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGTGTTGAGGTTAATAACCTCAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGAGAACTTACCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTCTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTATGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGGTGAA

Claims (4)

1.一株解磷菌3-1，于2021年6月18日保藏于武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2021734，分类名称为路氏肠杆菌（Enterobacterludwigiistrain）3-1。
2.根据权利要求1所述解磷菌3-1在溶解土壤难溶性磷酸盐上的应用。
3.根据权利要求1所述解磷菌3-1在制备溶解土壤难溶性磷酸盐的药物上的应用。
4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的难溶性磷酸盐包括磷酸三钙、磷酸铝、磷酸铁中的一种或多种。
CN202111123705.9A 2021-07-20 2021-09-24 解磷菌3-1及在溶解磷酸盐上的应用 Active CN113801817B (zh)

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