CN103525830A

CN103525830A - 一种可增强固氮菌泌铵能力的基因

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Publication number: CN103525830A
Application number: CN201310459866.4A
Authority: CN
Inventors: 平淑珍; 赵仲麟; 燕永亮; 陆伟; 林敏�
Original assignee: Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Beijing Green Nitrogen Biotechnology Co ltd
Priority date: 2013-09-30
Filing date: 2013-09-30
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-09-30
Also published as: CN103525830B

Abstract

本发明涉及一种可增强固氮菌泌铵能力的基因。通过突变实验得到具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的基因，将其转入可泌铵的斯氏假单胞菌A1561菌得到的菌株，经实验证实，具有比A1561菌株更高的固氮及泌铵能力。本发明的基因可应用于生产提供氮肥的微生物肥料。

Description

一种可增强固氮菌泌铵能力的基因

技术领域：

本发明涉及一种可增强固氮菌泌铵能力的基因。

背景技术：

生物固氮的研究有助于增产粮食且不污染环境。泌铵菌向胞外环境分泌铵，为宿主植物提供一定量的氮素。

目前泌铵菌对于植物的促生作用的研究多局限于实验室环境下，应用于大田环境还要从以下几个因素对其进行改良：1）提高泌铵菌的根际定殖能力；2）结合态氮是抑制固定大气氮的主要因素，高铵条件下提高泌铵菌的固氮能力和耐铵能力；3）在土壤微生物菌群中使泌铵菌成为优势菌群；4）提高固氮能源的供给及优化其组成。

斯氏假单胞菌A1501（Pseudomonas stutzeri A1501）是一株联合固氮菌，于1980年分离于我国南方水稻田。该菌株虽然具有明显的固氮能力，但它们固定的氮素主要用来满足自身的生长需要，而提供给植物的氮素有限。特别是在外界有铵的情况下，所固定的氮就更少，甚至停止固氮及泌铵，这就限制了联合固氮菌的开发及在农业生产中的应用。

中国专利申请200910236131.9提供了一种重组泌铵菌，通过对斯氏假单胞菌A1501进行基因改造，缺失铵转运载体蛋白amtB1、amtB2基因，同时转入固氮酶正调节基因(nif A)，该菌株命名为1561/pVA3，具有一定的泌铵能力。但对于固氮酶正调节基因(nif A)进行突变，以提高其固氮和泌铵能力，获得高效固氮的泌铵菌还未见报道。

本文中所称的“斯氏假单胞菌”，亦可称为“施氏假单胞菌”。

发明内容:

本发明的目的是用基因重组的手段对固氮酶正调节基因(nif A)进行突变，并将其转入斯氏假单胞菌A1561菌，开发新的高效泌铵的联合固氮基因，以提供具有应用潜力的微生物菌肥。

本发明通过突变实验得到具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的nif AM基因，突变的基因可提高斯氏假单胞菌A1561泌铵量，并得到高效泌铵的联合固氮菌，证实了上述发现。

nif AM基因的获得及菌株构建具体方法如下：

1.基因克隆

提取斯氏假单胞菌A1501的基因组，以所提取的基因组为模板，通过PCR方法获得nifA基因。以nif A基因为模板，易错突变方法突变nif A基因。

2.载体构建

按常规方法克隆（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）。克隆了固氮酶调节基因(nif AM)，nif AM核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

将含有完整的nif AM的DNA片段连接到pVK100，构建了组成型表达质粒pVKAM。

3.三亲接合

通过三亲本接合将不能自我转移的质粒导入受体菌中。

4.重组子的筛选及鉴定

挑出部分长出的菌落连续转三次平板后，进行菌落PCR鉴定。之后，对泌铵情况进行鉴定。

经采用靛酚蓝比色法进行测铵试验，并与菌株A1561、1561/pVA3相比较（见实施例3），证实用本发明构建的联合固氮菌株可高效泌铵，进而可为农作物提供氮肥，是一种潜在的微生物肥料。

附图说明：

图1为nif AM基因同源片段的扩增结果；

图2为大肠杆菌重组载体pVKAM的物理图谱；

图3为工程菌1561/pVA3、A1561、1561/pVKAM泌铵比较。横坐标为培养天数，纵坐标为铵浓度。

序列表说明

1、SEQ ID NO:1nifAM的核苷酸；

2、SEQ ID NO:2是从SEQ ID NO:1推导出的nif AM编码的氨基酸序列。

具体实施方式

以下实验中所用的实验材料说明及来源如下：

菌株与载体：

大肠杆菌菌株E.coli JM109购自Novagen公司；

斯氏假单胞菌A1561：由野生斯氏假单胞菌A1501缺失amtB1、amtB2基因后得到，来源于中国农业科学院生物技术所；

1561/pVA3菌株：为1561菌株中转入nif A基因（见中国专利申请200910236131.9），来源于中国农业科学院生物技术所；

pVK100载体：由Knauf等人于构建,见杂志Plasmid1982年，8:45-54，以下实验用载体来源于中国农业科学院生物技术所。

酶与试剂盒：

限制性内切酶，连接酶，Taq酶为NEB公司产品。

基因组提取试剂盒为天根生化公司产品。

生化试剂：IPTG、X-Gal、SDS等试剂为Sigma公司产品。

培养基：大肠杆菌培养基为LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）。A15限制性培养基：磷酸二氢钾0.4g，磷酸氢二钾0.1g，氯化钠0.1g，七水硫酸镁0.2g,一水硫酸锰0.01g，一水硫酸铁0.01g，钼酸钠0.01g，乳酸钠6ml，硫酸铵0.4g定容至1000ml，调pH6.8。用于液体培养，28℃摇床，180-200rpm，培养16～18h。A15无氮培养基：A15限制性培养基中除去硫酸铵。

实施例中其它未注明具体条件的实验方法，按照常规方法进行，如Sambrook等人的方法，分子克隆按(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1nifAM基因的获得

提取斯氏假单胞菌A1501的基因组。以所提取的基因组为模板，进行PCR扩增。所使用的引物根据nifA基因的5’和3’端序列合成，2个引物序列分别为：

5’CCGAAGCTTTCAGATCTTGCGCATATGA3’和

5’CCGAAGCTTACGGTGCATATCGATAGC3’，

通过PCR方法获得完整的nifA基因，并包含nifA基因编码区上游约70bp的一段核苷酸序列，长为1.6kb的目的片段。以nifA基因为模板，使用Labest易错PCR突变试剂盒，突变nifA基因。获得突变后基因（图1），命名nifAM。

实施例2用nifAM构建基因工程菌1561/pVKAM及验证

用Hind III酶切并回收nifAM片段，与同样酶切的穿梭载体pVK100连接。Tc^sKm^r抗性筛选，提取质粒，Hind III及EcoR I酶切鉴定，重组质粒pVKAM图谱见图2。

分别将供体菌pVKAM，受体菌1561，帮助菌pRK2013按着1：1：1的比例混合，通过三亲结合的方法，将重组质粒pVKAM转入1561中，然后进行卡那霉素（Km），四环素（Tc）抗性筛选。随机选取3个三亲结合子，提取质粒验证pVKAM是否转入1561中。受体菌1561为前期获得的突变株，缺失了amtB基因。

提取质粒后，以质粒DNA为模板，进行PCR验证，得到1.6kb的片段，以提取1561的空质粒为阴性对照；同时将质粒通过EcoR I和Hind III酶切验证，分别切出两条带，从而得到了重组的工程菌，命名为1561/pVKAM。

实施例3nif AM泌铵作用验证比较

1、实验目的

通过定量比较转入nif AM基因的改造菌株与出发菌A1561、1561/pVA3的泌铵作用，验证nif AM基因的功能；

2、实验对象

实验菌株：转入nif AM基因的工程菌1561/pVKAM（实施例2得到的）；

2种对照菌株：出发菌A1561、转入nif A基因的工程菌A1561/pVA3。

3、实验方法

3.1NH₄ ⁺浓度的测定按照靛酚蓝比色法(Bender et al.1977)，具体操作如下：

1）配制A溶液、B溶液

A溶液(100ml):5g苯酚；0.025g Na-nitroprusside(Na₂Fe[CN]₅NO·2H₂O)；

B溶液(100ml):62.5ml1M NaOH;3.3ml NaOCl(有效氯5.25%)。

2）绘制NH4+浓度标准曲线

配制NH₄ ⁺的系列稀释液（系列稀释1M的NH₄ ⁺为0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,2.0mM；加入A、B溶液反应20min后，在OD₆₂₅比色）

3）分别取100μl实验菌和两种对照菌的细菌培养上清液，加入100μl A溶液后再加入100μl B溶液，20min后观察反应液颜色，通过与NH₄ ⁺浓度标准曲线的颜色深浅相比，判断是否存有NH₄ ⁺及其浓度。

4）将实验菌1561/pVKAM和两种对照菌分别接种于半固体无氮限制性培养基（1000ml,KH₂PO₄0.4g,K₂HPO40.1g,NaCl0.1g,MgSO₄.7H₂O0.2g,MnSO4.H₂O0.01g,Fe₂(S0₄)₃.H2O0.01g,Na₂MoO₄.H₂O0.01g,C₃H₅NaO₃6ml，加入0.1%—0.2%的琼脂,pH6.8）中，在充满N₂，0.5%O₂，30℃条件下培养15天后，采用乙炔还原法分别测定两种菌的固氮酶活，并用靛酚蓝法分别检测实验菌株和两种对照菌培养基中的泌铵量和pH值。

以上实验均重复3次以上。

3.2固氮活性测定，采用乙炔还原法测定，具体操作如下：

使用SP－2305型气相色谱仪测定。将待测的各菌株同时活化，保持生长状态一致；将活化后的各菌株接入含相应抗生素的液体A15培养基，30℃振荡培养20h。测定各菌株的OD600值。从每个试管中取出适量菌液，4,000g，4℃离心10min，收集菌体。

用生理盐水洗涤菌体两次，充分悬浮于无氮A15液体培养基中，使OD600＝1.0；每个小三角瓶加入9ml无氮A15液体培养基，接入1ml菌液，使菌液终浓度为OD600＝0.1；将每个小三角型瓶塞入胶塞，注入纯氩气，同时排出空气。然后注入0.5%体积的氧气和10%体积新制的乙炔，30℃剧烈振荡培养，胁迫4h。每隔1h从每个小血清瓶中用微量进样器取出0.25ml气体用气相色谱法测定乙烯含量，根据各样品乙烯峰的高低来比较其固氮酶活性高低。以上实验均重复3次以上。

固氮酶活=记录仪上乙烯峰的面积×（试管气相体积/进样量）/（1nmol标准乙烯峰的面积×反应时间）

4、实验结果

1）固氮酶活

在固氮条件下，含nif AM基因的改造菌1561/pVKAM的固氮酶活为19.06U/mg，对照菌1561/pVA3的固氮酶活14.24U/mg，对照菌A1561的固氮酶活为7.41U/mg，1561/pVKAM为A1561固氮酶活的2.57倍。

2）培养基pH

培养20天后，发现对照菌A1561培养基未显蓝色，即没有分泌铵，铵浓度为0，pH值7.10；而1561/pVKAM的培养基显蓝色，且泌铵量达到6.96mM,其培养基呈弱碱性（pH值=7.48）；1561/pVA3的培养基显蓝色，且泌铵量达到5.15mM,其培养基呈弱碱性（pH值=7.42）。研究结果表明1561/pVKAM较1561/pVA3具有更强的固氮活力，并且能向细胞外分泌更多的铵。

结果如图3、表1所示。

表1三种菌泌铵作用比较

以上研究结果表明：1561/pVKAM的固氮活力和向细胞外分泌铵的能力高于A1561，也高于1561/pVA3，且有显著性差异。

5、实验结论

本发明得到的突变固氮酶正调节基因nif AM基因具有较强的固氮活力和高效泌铵作用，由其得到的工程菌株1561/pVKAM的泌铵作用高于1561菌株中转入未突变的nif A基因的1561/pVA3菌株。

Claims

1.一种可增强固氮菌泌铵能力的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.含权利要求1所述基因的重组质粒。

3.权利要求2所述的质粒在生产具有固氮功能菌肥中的应用。

4.含权利要求1所述基因的载体。

5.用权利要求4所述的载体转化的宿主细胞。

6.含权利要求1所述基因的重组工程菌株。

7.权利要求6所述的菌株，是将权利要求1所述基因转入斯氏假单胞菌A1561菌得到。

8.权利要求6或7所述菌株在生产具有固氮功能菌肥中的应用。

9.权利要求1所述基因编码的蛋白，具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

10.权利要求9所述蛋白在生产具有固氮功能菌肥中的应用。