CN113462602A

CN113462602A - 促根生科萨克氏菌zjph202011及其应用

Info

Publication number: CN113462602A
Application number: CN202110776859.1A
Authority: CN
Inventors: 王普; 孔祥鑫; 桂铅; 于双嵘
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2021-07-09
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2041-07-09
Also published as: CN113462602B

Abstract

本发明为促根生科萨克氏菌ZJPH202011及其应用，提供了一株可用于催化4'‑溴‑2,2,2‑三氟苯乙酮不对称还原制备(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇的新菌种，采用该菌种催化制备(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇具有催化底物浓度高，产物光学纯度较高等优点。与现有报道水平相比，此方法利用野生型菌株催化获得的产物的对映体过量值高，e.e.值大于90.66％，且微生物菌株易培养，来源丰富，转化过程中不需要添加昂贵的辅酶，具有成本低，转化过程绿色和环境友好等特点。本发明通过采用促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)ZJPH202011细胞为催化剂对4'‑溴‑2,2,2‑三氟苯乙酮进行还原，当底物浓度为30mM时，目的产物(R)‑1‑(4‑溴苯基)‑2,2,2‑三氟乙醇的e.e.值＞93.82％，产率达75.54％。

Description

促根生科萨克氏菌ZJPH202011及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株微生物新菌种—促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)ZJPH202011，及其在催化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇中的应用。

(二)背景技术

(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的化学结构式为：

(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇是合成色氨酸羟化酶(TPH)抑制剂和JANUS激酶(JAK)抑制剂的重要中间体。其中，TPH抑制剂通过阻断5-羟色胺的合成来调节外周血清素水平，可用于减轻由化疗引起的恶心呕吐和治疗肠易激综合征，其代表药物为LX1031。作为一种口服药物，LX1031是一种局部作用的TPH抑制剂，该药物能改善患者的腹痛、痉挛、便秘、腹泻等症状，是用于治疗肠易激综合征和其他胃肠疾病的有效药物。

JAK抑制剂可阻断JAK/STAT通路，进而影响细胞的***、增殖与分化和免疫调节，可治疗类风湿性关节炎、部分癌症及血液***疾病，其代表药物为Odanacatib。Odanacatib是组织蛋白酶K(CatK)(一种在破骨细胞中大量表达的半胱氨酸蛋白酶) 选择性和可逆性抑制剂，主要用于治疗骨质疏松症。虽然该药物由于在临床研究中发现会增加患者中风的风险而被停止开发，但寻找该药物的新用途仍在进行，Jon J. Vermeire等人在寻找治疗钩虫病药物的过程中，发现Odanacatib可减少73％的体内蠕虫数，同时使寄生虫体内的半胱氨酸蛋白酶活性降低51％，这为开发治疗钩虫病的低剂量药物及替代品提供了新的可能。此外，OVAA在一篇专利中，以Odanacatib结构为母核进行结构修饰，开发出多种CatK抑制剂，其中CatK4及CatK5表现出较强的生理活性。

(三)发明内容

本发明目的是提供一株微生物新菌种—促根生科萨克氏菌(Kosakoniaradicincitans)ZJPH202011，以及该菌株在催化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇中的应用。本发明提出的利用促根生科萨克氏菌ZJPH202011全细胞催化制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的新方法，同传统的化学法相比，其反应条件温和，具有绿色环保、成本低等特点，同酶催化相比，无需添加昂贵的辅助因子，具有更高的催化产率。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种新菌株—促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)ZJPH202011，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月11日，保藏编号：CCTCC NO:M 2021714，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

此外，本发明还提供一种所述促根生科萨克氏菌ZJPH202011在催化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇中的应用。

进一步，所述的应用为：以促根生科萨克氏菌ZJPH202011经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在25-37℃、150-250rpm条件下(优选30℃、 200rpm)进行反应，反应结束后，获得含(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化液；所述辅助底物为以下一种或多种：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、异丙醇、甲醇、赖氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺。

进一步，所述含(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化液按如下方法进行分离纯化：将含(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化液用等体积的乙酸乙酯萃取，离心收集乙酸乙酯萃取相后，经旋转蒸发仪浓缩去除溶剂乙酸乙酯，即得到产物粗提液；将用石油醚浸泡过的硅胶装于层析柱中制备得到硅胶层析柱，再以石油醚：乙酸乙酯＝8:1(v/v)的洗脱剂平衡硅胶柱，将获得的产物粗提液上样于硅胶柱，然后以石油醚：乙酸乙酯＝8:1(v/v)为洗脱剂进行洗脱，收集合并含有目标产物的洗脱液，经旋转蒸发仪蒸干，即得(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇产物。

进一步，所述底物的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为2-10g/L(优选2.5-7.6g/L)，所述湿菌体的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为100-600g/L(优选100-500 g/L)；所述辅助底物的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为30-200g/L(优选50-150 g/L)。

优选的，所述辅助底物为甘油，最优选的甘油用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为600g/L。

进一步，所述磷酸盐缓冲液优选磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液，最优选磷酸钾缓冲液。

进一步，本发明所述湿菌体按如下方法获得：

1)斜面培养：挑取促根生科萨克氏菌ZJPH202011单菌落接种至第一次斜面培养基中，30-37℃培养24h，挑取第一次斜面培养基上生长的菌落再次接种至第二次斜面培养基中，30-37℃培养24h，得到经斜面培养两次后的斜面菌种(所得斜面菌种置于4℃冰箱保存)；所述第一次斜面培养基和第二次斜面培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L， NaCl 1g/L，MgSO₄ 0.244g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5；

2)种子培养：从步骤1)中所得的经斜面培养两次后的斜面菌种挑取一满环接入种子培养基中，25-37℃、150-250rpm培养10～15h(优选30℃，200rpm培养12h)，获得种子液；所述种子培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；

3)发酵培养：以体积浓度6％-15％(优选10％)的接种量将种子液接种至发酵培养基中，25-37℃、150-250rpm发酵培养24-32h(优选30℃、200rpm培养24h)；发酵培养结束后，将所得发酵液离心，所得沉淀用0.1M，pH 7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液洗涤，再次离心后获得所述湿菌体，即为含有可催化底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮生物还原的酶源细胞；所述发酵培养基中各组分终浓度组成为：蔗糖25g/L， (NH₄)₂SO₄ 5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，溶剂为水，pH6.5。

本发明所述转化液的分析检测方法为：反应结束后，将转化液用等体积(含内标十四烷)的乙酸乙酯终止反应并振荡萃取30min，静置后取上层萃取液，并采用气相色谱法进行分析检测，最终计算得出目的产物的产率及对映体过量值(e.e.值)。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一株可用于催化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的新菌种，采用该菌种催化制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇，具有催化底物浓度高，产物光学纯度较高等优点。与现有报道水平相比，此方法利用野生型菌株催化获得的产物对映体过量值高，e.e.值大于90.66％，且微生物菌株易培养，来源丰富，转化过程中不需要添加昂贵的辅酶，具有成本低，转化过程绿色和环境友好等特点。本发明通过利用促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)ZJPH202011细胞为催化剂对4'-溴-2,2,2- 三氟苯乙酮进行还原，当底物浓度为30mM时，目的产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值＞93.82％，产率达75.54％。

(四)附图说明

图1为底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇和(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的气相检测色谱图(含内标十四烷)。

图2为促根生科萨克氏菌ZJPH202011菌株不对称还原反应萃取液的气相检测色谱图(含内标十四烷)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明实施例中底物、辅助底物、均以缓冲液体积计量。

实施例1：菌株筛选与鉴定

1、菌种来源：促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)ZJPH202011系从山西省汾阳市演武镇的玉米田土样中经分离筛选获得，具体筛选方法如下：

初筛：称取2g土样加入装有100mL质量浓度为0.9％的生理盐水的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm摇床中振荡30min，之后取2mL土样悬液加入到装有100mL 种子培养基的250mL锥形瓶中，30℃，200rpm，培养24h。待培养液变混浊后，取 2mL菌液转接至装有100mL富集培养基的250mL锥形瓶中培养3-5d。富集培养基以4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮为唯一碳源，其终浓度组成为：4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮10 mM，(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，NaCl1.0g/L，MgSO₄ 0.244g/L，溶剂为水， pH 6.5。

复筛：将经上述步骤获得的富集培养液用生理盐水进行梯度稀释至10^-5、10^-6后，吸取100-200μL稀释液涂布至分离平板上，30℃静置培养2-3d；待长出菌落后，挑取形态不同的菌落并划线接种至分离平板上，30℃静置培养1-3d；挑取单菌落接种至种子培养基中，30℃，200rpm培养12h得到种子液；之后以体积浓度为10％的接种量将种子液转接至发酵培养基中，30℃，200rpm培养24h。发酵结束后，将发酵液8000rpm离心10min后，获得湿菌体，即为含酶源细胞。

生物转化反应过程：将100g/L含酶源细胞，10mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮(以缓冲液体积计)，100g/L葡萄糖(辅助底物)加入至装有10mL磷酸缓冲液(0.1M， pH 7.0)的磨口锥形瓶中，30℃，200rpm生物转化24h后得到转化产物。

上述的种子及发酵培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄ 0.244g/L，溶剂为水，pH 6.5。分离平板培养基组成同富集培养基，另外再加入20g/L的琼脂。营养琼脂平板培养基组成同种子培养基，另外再加入20g/L的琼脂。

转化反应结束后，转化液用等体积的含内标十四烷的乙酸乙酯进行萃取，离心后取上层萃取液用于分析检测，采用手性气相色谱法测定转化液中目标产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的产率和对映体过量值(e.e.值)。

底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇和(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇标准品的气相色谱图(含内标十四烷)见图1。通过菌种筛选，得到具有较高对映体过量值(e.e.值＞90.66％)和较高产率的微生物菌株ZJPH202011，利用该菌株经生物还原后的反应萃取液的气相色谱图(含内标十四烷)见图2。

气相色谱条件：安捷伦7820A气相色谱仪，Varian CP-Chirasil-Dex CB毛细管气相色谱柱(25m×0.25mm×0.25μm)，FID检测器。载气为高纯氮气，流量为2mL/min，进样口温度和检测器温度均为250℃，升温程序：142℃保持0min，1℃/min升至152℃，保持0min，进样量1μL，分流比15:1。

气相色谱法分析检测：检测转化反应结束后的产物浓度及残留底物的浓度，并计算底物的转化率、产物产率和e.e.值。

产率计算方法为：

绘制标准曲线：配制终浓度为50mM的底物及产物标准品溶液，之后经稀释制得浓度分别为10、15、20、25、30、40mM的溶液，分别采用气相色谱进行检测。将所得色谱图积分得到峰面积，以底物或产物峰面积与十四烷的峰面积之比为横坐标，以底物或产物的浓度与十四烷的浓度之比为纵坐标绘图并线性回归拟合，绘制标准曲线。得到底物标准曲线方程：y＝2.1833x+0.0395，R²＝0.9983；产物标准曲线方程： y＝1.767x+0.1912，R²＝0.9991。

产物产率计算公式如下：

产率(％)＝C_p/C₀×100％公式1 式中C_p为反应结束后(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的浓度，C₀为4'-溴-2,2,2- 三氟苯乙酮的初始浓度。

产物的光学纯度由对映体过量值(enantiomeric excess,e.e.)来表征。计算公式为：

式中C_R和C_S分别为R-构型和S-构型的1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇摩尔浓度。

2、菌株ZJPH202011的培养特征如下：

筛选所得菌株ZJPH202011的形态特征：在营养琼脂平板上，观察菌株 ZJPH202011的菌落外观形态、色泽、生长速度等基本特征。在营养琼脂平板上菌落呈黄色圆形，生长快，中心突起，菌落边缘整齐，表面光滑，液体培养呈浑浊态；采用光学显微镜观察经染色后的微生物细胞形态，单个菌体呈短杆状。

分子生物学鉴定：委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行菌株ZJPH202011的16S rDNA测序。以提取到的细胞总DNA为模板，利用通用引物NL1与NL4扩增菌株的16SrDNA，再将PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳。经测序确认所述菌株 ZJPH202011的16SrDNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。SEQ ID NO.1： CTCAGATTGAACGCTGGCGGCAGGCCTAACACATGCAAGTCGAACGGTAGCAC AGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAA ACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACG TCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAG ATGGGATTAGCTAGTAGGCGGGGTAATGGCCCACCTAGGCGACGATCCCTAGCT GGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTA CGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCA TGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGG AAGGCGGTACGGTTAATAACCGTGCTGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGG AATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCC CCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTGGAGTCTCGTAGA GGGAGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATAC CGGTGGCGAAGGCGGCCTCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGT GGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGAT TTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACC GCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCG CACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG GTCTTGACATCCACAGAACCTGGCAGAGATGCCGGGGTGCCTTCGGGAACTGT GAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAG TCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGCCGGGAACT CAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCA TCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAG AAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATT GGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGA ATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGG GAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTGTGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGT

将菌株ZJPH202011的16S rDNA序列(SEQ ID NO.1)在NCBI网站 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行同源性比对(BLAST)，结果表明：菌株 ZJPH202011与Kosakonia radicincitans strain DSM 107547菌株(GenBank登录号： No.CP040392.1)的序列同源性为93％。

根据菌株ZJPH202011的形态学特征并结合分子生物学鉴定，将该菌株鉴定为促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)，命名为促根生科萨克氏菌(Kosakoniaradicincitans)ZJPH202011，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6 月11日，保藏编号：CCTCC NO：M 2021714，保藏地址：中国，武汉，武汉大学， 430072。

实施例2：湿菌体的获得

斜面培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄ 0.244g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5；

种子培养基组成：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；

发酵培养基组成：蔗糖25g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，KH₂PO₄ 2g/L，溶剂为水，pH 6.5。

1)斜面培养：挑取促根生科萨克氏菌ZJPH202011单菌落接种至斜面培养基中，30℃培养24h，挑取斜面培养基上的单菌落再接种培养24h，重复两次后所得斜面置4℃冰箱保存；

2)种子培养：斜面菌种挑取一环后接入100mL种子培养基中，30℃、200rpm 培养12h，获得种子液；

3)发酵培养：以体积浓度10％的接种量将10mL种子液接种到100mL发酵培养基中，装液量为100mL/250mL锥形瓶，30℃、200rpm培养24h。发酵结束后，将发酵液离心，所得沉淀用0.1M，pH 7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液洗涤，离心后获得湿菌体，即为含可用于催化底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮生物还原的酶源细胞。

实施例3：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮作为底物，再加入以缓冲液体积计为100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于 30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，测定结果如下：产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇浓度为9.23mM，(S)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇浓度为0.37mM，底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮残留浓度为9.26mM，将上述检测结果经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为92.26％，产率为 46.14％，底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮的转化率为53.70％。

实施例4：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮作为底物，加入以缓冲液体积计为10％(v/v)的异丙醇作为辅助底物，置于 30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为93.55％，产率为43.36％。

实施例5：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮作为底物，加入以缓冲液体积计为50g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为95.03％，产率为50.64％。

实施例6：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮作为底物，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为94.47％，产率为74.53％。

实施例7：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.1M，pH 6.5)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮作为底物，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为95.46％，产率为49.42％。

实施例8：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.05M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的底物4'-溴 -2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃， 200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为93.77％，产率为68.98％。

实施例9：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于100mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的底物4'-溴 -2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于30℃， 200rpm的摇床中转化24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为94.81％，产率为74.89％。

实施例10：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的底物4'-溴 -2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于37℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得， (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为94.95％，产率为78.52％。

实施例11：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为50g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的底物4'-溴-2,2,2- 三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于37℃，200rpm 的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得，(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为96.63％，产率为52.42％。

实施例12：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为150g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为20mM的底物4'-溴 -2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于37℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得， (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为94.12％，产率为76.81％。

实施例13：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为150g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为30mM的底物4'-溴 -2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于37℃， 200rpm的摇床中反应19h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得， (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为93.91％，产率为68.71％。

实施例14：

将按照实施例2方法所得的湿菌体重悬于10mL磷酸钾缓冲液(0.2M，pH 7.0)中，湿菌体加量以湿重计为150g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为30mM的底物4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮，加入以缓冲液体积计为600g/L的甘油作为辅助底物，置于37℃， 200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法进行分析检测，经计算可得， (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为93.82％，产率为75.54％。

实施例15：

1)选取阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJPH1903，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019821，保藏日期为2019年10月14日。该菌种已在先前的专利申请(公开号：CN110982757A，公开日：2020年4月10日)中公开。菌种的培养方法和含酶源细胞的制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN110982757A，公开日：2020年4月10日)。

2)将按先前所述方法培养所得的湿菌体重悬于10mL磷酸盐缓冲液(0.1M，pH 7.0)中，湿菌体以湿重计浓度为100g/L缓冲液；加入以缓冲液体积计为10mM的4'-溴-2,2,2- 三氟苯乙酮作为底物，加入100g/L的葡萄糖作为辅助底物，置于30℃，200rpm的摇床中反应24h。采用实施例1的检测方法检测，并计算产物(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值和产率。

结论：阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)ZJPH1903转化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮为 (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为13.77％，产率为55.44％。

实施例16：

1)选取小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)ZJPH1308，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2014645，保藏日期为2014年12月14日，地址：中国武汉，武汉大学，430072。该菌种已在先前的专利申请 (公开号：CN104893989A，公开日：2015年9月9日)中公开。菌种的培养方法和含酶源细胞的制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN104893989A，公开日：2015年9 月9日)。

结论：小孢根霉须状变种(Rhizopus microsporus var.rhizopodiformis)ZJPH1308不能转化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮制备得到(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇。

实施例17：

1)选取红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2013年12月11日，保藏地址：中国，武汉，武汉大学，430072，保藏编号：CCTCC NO：M2013650。该菌种已在先前的专利申请(公开号： CN103773724A，公开日：2014年5月7日)中公开。菌种的培养方法和含酶源细胞的制备过程依据先前的专利申请(公开号：CN103773724A，公开日：2014年5月7日)。

结论：红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)XS1012转化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮为 (R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的e.e.值为41.36％，产率为63.30％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 促根生科萨克氏菌ZJPH202011及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1474

<212> DNA

<213> 促根生科萨克氏菌(Kosakonia radicincitans)

<400> 1

ctcagattga acgctggcgg caggcctaac acatgcaagt cgaacggtag cacagagagc 60

ttgctctcgg gtgacgagtg gcggacgggt gagtaatgtc tgggaaactg cctgatggag 120

ggggataact actggaaacg gtagctaata ccgcataacg tcgcaagacc aaagaggggg 180

accttcgggc ctcttgccat cagatgtgcc cagatgggat tagctagtag gcggggtaat 240

ggcccaccta ggcgacgatc cctagctggt ctgagaggat gaccagccac actggaactg 300

agacacggtc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag 360

cctgatgcag ccatgccgcg tgtgtgaaga aggccttcgg gttgtaaagc actttcagcg 420

gggaggaagg cggtacggtt aataaccgtg ctgattgacg ttacccgcag aagaagcacc 480

ggctaactcc gtgccagcag ccgcggtaat acggagggtg caagcgttaa tcggaattac 540

tgggcgtaaa gcgcacgcag gcggtctgtc aagtcggatg tgaaatcccc gggctcaacc 600

tgggaactgc attcgaaact ggcaggctgg agtctcgtag agggaggtag aattccaggt 660

gtagcggtga aatgcgtaga gatctggagg aataccggtg gcgaaggcgg cctcctggac 720

gaagactgac gctcaggtgc gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt 780

ccacgccgta aacgatgtcg atttggaggt tgtgcccttg aggcgtggct tccggagcta 840

acgcgttaaa tcgaccgcct ggggagtacg gccgcaaggt taaaactcaa atgaattgac 900

gggggcccgc acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga tgcaacgcga agaaccttac 960

ctggtcttga catccacaga acctggcaga gatgccgggg tgccttcggg aactgtgaga 1020

caggtgctgc atggctgtcg tcagctcgtg ttgtgaaatg ttgggttaag tcccgcaacg 1080

agcgcaaccc ttatcctttg ttgccagcgg tccggccggg aactcaaagg agactgccag 1140

tgataaactg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tggcccttac gaccagggct 1200

acacacgtgc tacaatggcg catacaaaga gaagcgacct cgcgagagca agcggacctc 1260

ataaagtgcg tcgtagtccg gattggagtc tgcaactcga ctccatgaag tcggaatcgc 1320

tagtaatcgt gaatcagaat gtcacggtga atacgttccc gggccttgta cacaccgccc 1380

gtcacaccat gggagtgggt tgcaaaagaa gtaggtagct taaccttcgg gagggcgctt 1440

accactttgt gattcatgac tggggtgaag tcgt 1474

Claims

1.促根生科萨克氏菌ZJPH202011，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2021年6月11日，保藏编号：CCTCC NO: M 2021714，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。

2.如权利要求1所述的促根生科萨克氏菌ZJPH202011在催化4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮不对称还原制备(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述的应用为：以促根生科萨克氏菌ZJPH202011经发酵培养获得的湿菌体为酶源细胞，以4'-溴-2,2,2-三氟苯乙酮为底物，加入辅助底物，以pH 6.0-8.0的磷酸盐缓冲液为反应介质构成转化体系，在25-37℃、150-250rpm条件下进行反应，反应结束后，获得含(R)-1-(4-溴苯基)-2,2,2-三氟乙醇的转化液；所述辅助底物为以下一种或多种：葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、甘油、异丙醇、甲醇、赖氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述底物的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为2-10g/L。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述湿菌体的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为100-600g/L。

6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述辅助底物的用量以所述磷酸盐缓冲液的体积计为30-200g/L。

7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述辅助底物为甘油，甘油的用量以所述磷酸盐缓冲液体积计为600g/L。

8.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液或磷酸钠缓冲液。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为磷酸钾缓冲液。

10.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法获得：

1)斜面培养：挑取促根生科萨克氏菌ZJPH202011单菌落接种至第一次斜面培养基中，30-37℃培养24h，挑取第一次斜面培养基上生长的菌落再次接种至第二次斜面培养基中，30-37℃培养24h，得到经斜面培养两次后的斜面菌种；所述第一次斜面培养基和第二次斜面培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄ 0.244g/L，琼脂20g/L，溶剂为水，pH 6.5；

2)种子培养：从步骤1)中所得的经斜面培养两次后的斜面菌种挑取一满环接入种子培养基中，25-37℃、150-250rpm培养10～15h，获得种子液；所述种子培养基中各组分终浓度组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCl 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶剂为水，pH 6.5；

3)发酵培养：以体积浓度6％-15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，25-37℃、150-250rpm发酵培养24-32h；发酵培养结束后，将所得发酵液离心，所得沉淀用0.1M，pH7.0的K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液洗涤，再次离心后获得所述湿菌体；所述发酵培养基中各组分终浓度组成为：蔗糖25g/L，硫酸铵5g/L，K₂HPO₄ 2g/L，溶剂为水，pH 6.5。