CN105969686A

CN105969686A - 一种抗青枯病的娄彻氏链霉菌菌株及其生物有机肥

Info

Publication number: CN105969686A
Application number: CN201610329907.1A
Authority: CN
Inventors: 石俊雄; 刘艳霞; 李想; 孟琳; 蔡刘体; 张恒; 邹焱
Original assignee: GUIZHOU JILONG ECOLOGY TECHNOLOGY CO LTD; Guizhou Institute of Tobacco Science
Current assignee: GUIZHOU JILONG ECOLOGY TECHNOLOGY CO LTD; Guizhou Institute of Tobacco Science
Priority date: 2016-05-18
Filing date: 2016-05-18
Publication date: 2016-09-28

Abstract

本发明公开了一种抗青枯病的拮抗菌，该菌株命名为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)L‑9，已于2013年09月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8264。本发明菌株L‑9表现出较强的拮抗青枯菌的性能，拮抗圈半径达到15mm。本发明为青枯病的生物防治提供新的微生物资源，克服了现有技术中的不足。

Description

一种抗青枯病的娄彻氏链霉菌菌株及其生物有机肥

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种抗青枯病的拮抗菌，具体涉及一种娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)L-9菌株，同时涉及该菌株在抗青枯病方面的应用。

背景技术

烟草青枯病是热带、亚热带地区烟草的主要病害之一，目前在中国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。近几年来，该病的发病和为害范围有向北方烟区扩展的趋势，在山东、河南、陕西及辽宁等省都有发生，局部地区为害较重。目前该病造成的损失已居各类病害的第4位。常用防治青枯病的策略包括化学农药、土壤改良、抗病品种、嫁接与轮作等，但效果均不稳定。此外，过量施用化学农药带来的环境污染和食品安全问题，引起人们广泛关注和担忧。因此，如何发展环境友好型的防病措施、实现减少农药用量、抑制病害发展、恢复土壤健康是目前亟需解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种抗青枯病的娄彻氏链霉菌菌株及其生物有机肥，为青枯病的生物防治提供新的微生物资源。

本发明所述的抗青枯病的拮抗菌，该菌株命名为娄彻氏链霉菌(Streptomycesrochei)L-9，已于2013年09月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.8264。

本发明的菌株L-9具有如下特性：

1、L-9在高氏一号固体培养基上，菌丝发达，乳白色略带褐色，中心呈黑色，气丝丰茂，绒状，灰色。基丝无色，有时转接后略带微红色调。

2、L-9表现出较强的拮抗青枯菌的性能，拮抗圈半径达到15mm。

3、采用细菌基因组DNA小量试剂盒(AxyPrep，美国)高盐沉淀法提取DNA。PCR扩增通用引物为27F/1541R。即正向引物：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3′。16S rRNA基因序列测序结果表明，L-9的16S rRNA基因序列为1488bp，序列在NCBI网站的Genbank在线序列比对结果显示，L-9与Streptomyces rochei的同源性在99％以上，根据形态特征和16S rDNA鉴定为娄彻氏链霉菌。

将本发明的菌株以5％的接种重量接入菜粕酶解的菜粕有机肥与牛粪堆肥以重量比1:1混合而成的有机肥中发酵培养，发酵培养条件为：温度30～45℃，含水量30～40％，时间4～5天，发酵完成后含水量达到34.9％，即为生物有机肥。该生物有机肥对青枯病有明显的防治效果。

附图说明

附图1为拮抗菌L-9的平板拮抗效果；

附图2为基于分离菌株和其亲缘关系相近菌株的16S rRNA基因序列构建的***发育树(邻接法)；

附图3为盆栽基质中茄科劳尔氏菌的数量；

附图4为盆栽基质中拮抗菌L-9的数量。

具体实施方式

实施例1本发明拮抗菌L-9的分离和鉴定

1.1 拮抗菌L-9的分离与筛选

从贵州省多处烟草青枯病发病田间采集未发病的烟株及根际土，低温保存，用于分离拮抗菌。对烟株样品的处理：取根茎组织，先用2％的次氯酸钠表面消毒2min，然后用灭菌后的去离子水洗润洗3～5次。对土壤样品或或处理后的烟株样品，按照稀释涂布平板法将土壤溶液或植株样品溶液稀释到10^-1～10^-6待用。

将土壤溶液或植株样品溶液均匀的涂布于高氏一号培养基上，在30℃黑暗条件下，培养24h后，待菌落长出后将青枯病病原菌Ralstonia solanacearum菌悬液均匀喷在平板上，进行培养观察。从土壤和烟株上分离、筛选到219株拮抗菌株，综合评估其拮抗圈大小、生长速度、贫营养下的生长情况、是否耐盐等相关指标，最后选取到一株拮抗菌L-9。常规鉴定结果显示，L-9在高氏一号固体培养基上，菌丝发达，乳白色略带褐色，中心呈黑色，气丝丰茂，绒状，灰色。基丝无色，有时转接后略带微红色调。L-9表现出较强的拮抗青枯菌的性能，拮抗圈半径达到15mm。

1.2 拮抗菌的16S rRNA基因鉴定及基因序列分析

采用细菌基因组DNA小量试剂盒(AxyPrep，美国)高盐沉淀法提取DNA。PCR扩增通用引物为27F/1541R。即正向引物：5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向引物：5′-AAGGAGGTGATCCA GCCGCA-3′。

16S rRNA基因序列测序结果表明，L-9的16S rRNA基因序列为1488bp，序列在NCBI网站的Genbank在线序列比对结果显示，L-9与Streptomyces rochei的同源性在99％以上，根据形态特征和16S rDNA鉴定为娄彻氏链霉菌(详见图2)。

1.3 菌株L-9生产方法

1.3.1 菌株一级种子液制备

L-9在高氏一号液体培养基中，30℃摇床中170rpm培养48h，制成一级种子液。

1.3.2 功能菌种L-9菌株一级种子扩大培养

经多次一级种子小试扩大培养试验，对L-9菌株一级种子扩大培养技术参数优化，初步形成以下中试生产技术参数。

培养基配方：PDA改良培养基1号；

发酵pH：消前7.2，消后7.0；

接种重量：1％；

培养温度：37度；

一级种子转速：160～170转/分钟；

培养时间：16～18h；

含菌量：2～3×10⁸cfu/mL。

1.3.3 功能菌种L-9菌株二级种子扩大培养

经多次二级种子小试扩大培养试验，对L-9菌株二级种子扩大培养技术参数优化，初步形成以下中试生产技术参数。

培养基配方：PDA改良培养基2号+0.1％消泡剂；

培养pH：消前7.2，消后7.0；

接种重量：5％；

培养温度：35℃；

二级培养转速：45～50Hz；

通气量：35～40m³/h；

压力：0.045～0.05MPa；

溶氧：80～85％；

培养时间：17～18h；

含菌量：1～2×10⁹cfu/mL。

1.3.4 功能菌种L-9菌株500L扩大培养

经多次扩大培养小试试验，对L-9菌株扩大培养技术参数优化，初步形成以下中试生产技术参数。

培养基配方：PDA改良培养基3号+0.15％消泡剂；

发酵pH：消前7.2，消后7.0；

接种重量：10％；

培养温度：32℃；

扩大培养转速：75～80Hz；

通气量：60～80m³/h；

压力：0.045～0.05MPa；

溶氧：前期60～75％，中期90～100％，后期75～100％；

培养时间：24～27h；

含菌量：4～5×10⁹cfu/mL(芽孢率≥90％)。

实施例2本发明生物有机肥的制备

将拮抗菌L-9培养在在高氏一号液体培养基中，30℃摇床中170rpm培养48h。有机肥为菜粕酶解的菜粕有机肥与牛粪堆肥以重量比1:1混合而成，经测定含有机质33.8％、氨基酸4.3％、N4.20％、P₂O₅2.26％、K₂O1.08％。将拮抗菌L-9培养液以5％的接种重量接入上述有机肥中，调节温度为30～45℃，含水量为30～40％，发酵4～5天，期间不断翻抛。发酵完成后含水量达到34.9％，即为生物有机肥(以下简称“BIO”)。

实施例3 BIO在育苗试验中抗青枯病的作用

供试品种：K326和红花大金元。

蚓粪育苗基质：制备方法见专利ZL200710202167.6。

3.1 试验设计

3.1.1 BIO对烟草发芽率的影响

每平板100粒K326种子或红花大金元种子，基质由常规育苗基质添加不同比例的蚓粪育苗基质与BIO组成，处理见表1.1，约铺1cm厚，每个处理5次重复，光照培养箱中25℃、75％水份中培养，定期测定出芽率。

表1.1 BIO对烟草种子萌发影响试验设计

3.1.2 BIO对烟草苗期生长的影响

根据BIO对烟草发芽率影响的结果，采用对烟草萌发没有抑制作用的比例(即蚓粪育苗基质68％、BIO 2％)施入烟草常规育苗基质。分别采用两种育苗方法，一种是常规的漂浮育苗，另一种考虑到BIO中拮抗菌的生长繁殖问题，采用黑色塑胶育苗盘在相对于漂浮育苗比较干旱的条件下育苗，即直接将黑色塑胶育苗盘置于育苗槽中，底部只存蓄1cm左右的水。试验处理见表1.2。

表1.2 BIO育苗处理

3.1.3 盆栽试验中BIO对烟苗生长的影响

按表1.3处理将烟苗移栽于新的育苗基质中，每盆10Kg育苗基质，每处理12次重复。向育苗基质中添加一定比例的发酵好的茄科劳尔氏菌菌悬液、BIO或菜粕有机肥，使Rs浓度达到10⁷cfu g^-1基质，而BIO和菜粕有机肥分别以每盆50g的比例加入。分别以育苗期对照基质－移栽健康基质和育苗期对照基质－病原菌基质两个处理作为对照。移栽当天采集不同基质样品，以后每隔10天采集一次根际基质并统计发病率、用荧光定量PCR方法测定基质样品中病原菌与拮抗菌的数量。

表1.3 BIO育苗盆栽处理

注：“-”前是育苗时的处理。“-”后是移栽后的处理，其中，CK表示空白对照处理，n表示基质育苗处理，p表示盆栽处理；+Rs表示在土壤中加入茄科劳尔氏菌；OF指未加入拮抗菌L-9的有机肥。

3.2 结果：

3.2.1 BIO对烟草发芽率的影响

出芽率检测结果见表2.1。与对照相比，当BIO浓度在2％以内时，烟草的发芽率与对照相比，无显著差异；当BIO浓度高于2％时，发芽率大大降低。

表2.1 BIO对烟草种子发芽率的影响

处理	CK	T1	T2	T3	T4	T5
							发芽率(％)	97.3	93.3	95.6	68.3	53.7	53.3

3.2.2 BIO育苗对烟草发芽率和土传青枯病发病率的影响

烟苗移栽后30天统计盆栽试验的发病率详见表2.2。从表2.2可以看出，K326青枯病的发病率普遍较低，因此只考察红花大金元的基质中病原菌与拮抗菌在不同时期的变化。

表2.2 不同处理对烟草土传青枯病发病率的影响

从图3中的30天取样结果可以看出，BIO2-BIOp+Rs HD(即旱培育苗，育苗和盆栽病土中都施入BIO)相对于其它处理，可以将病原菌数量降到最低。这一结果可能是由于育苗期间拮抗菌已经定殖在烟苗根际，因此，当盆栽试验基质中有病原菌的存在时，拮抗菌照样可以发挥作用，从一开始就能降低病原菌的数量，起到保护烟株的作用。

从图4可以看出，拮抗菌在基质中也会呈现一种先降后升的趋势。而相对于传统的漂浮育苗，旱培的拮抗菌更易生存，因此在烟苗移栽后其拮抗菌的数量也是最多的。育苗时就加入拮抗菌，比在烟苗移栽后加入拮抗菌的处理，拮抗菌可以更快地进入增长阶段，由此保证了拮抗菌在基质中的数量，这样对于拮抗病原菌就提供了有力的保障。

Claims

1.一种抗青枯病的拮抗菌，该菌株命名为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)L-9，已于2013年09月25日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8264。

2.根据权利要求1所述的菌株在抗青枯病中的应用。

3.一种生物有机肥的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述的菌株以5％的接种重量接入有机肥中发酵培养。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述有机肥为菜粕酶解的菜粕有机肥与牛粪堆肥以重量比1:1混合而成。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养条件为：温度30～45℃，含水量30～40％，时间4～5天，发酵完成后含水量达到34.9％。

6.根据权利要求3～5任一权利要求所述方法制备的生物有机肥在抗青枯病中的应用。