CN106244596A

CN106244596A - 一种水稻种子休眠基因OsDOG1L3及其应用

Info

Publication number: CN106244596A
Application number: CN201610782601.1A
Authority: CN
Inventors: 万建民; 江玲; 王茜; 吴涛; 杨春艳; 刘世家; 刘喜; 陈亮明; 田云录; 赵志刚
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2016-08-29
Filing date: 2016-08-29
Publication date: 2016-12-21

Abstract

本发明公开了一种水稻种子休眠基因OsDOG1L3及其应用。本发明从强休眠水稻N22中分离和克隆到同源的DOG1基因，并将其命名为OsDOG1L3，发明人将OsDOG1L3基因组的全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌浸染转化水稻无休眠品种南粳35，发现上述基因可以使无休眠品种南粳35的休眠性增强。

Description

一种水稻种子休眠基因OsDOG1L3及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，，具体涉及一个调控水稻种子休眠基因OsDOG1L3及其应用。

背景技术

种子休眠是指具有正常生活力的种子在适宜的环境条件(光照、温度、水分、氧气等)下不能萌发的现象。作物中，特别是水稻和小麦，在收获前如果遇到高温阴雨天气，常常会发生穗发芽现象，严重影响作物的产量和品质，给农业生产带来巨大损失。而种子休眠的强弱直接决定种子是否会发生穗发芽现象。

影响种子休眠的因素有很多，环境因素主要有温度、湿度、光照及空气等。温度是影响水稻种子休眠的主要外部因素，温度主要影响籽粒成熟过程中休眠诱导物的形成，在种子发育期间，高温下形成的籽粒休眠程度低或无休眠，而低温下形成的籽粒休眠性会增强。水分也是影响种子休眠性强弱的重要因素。随着种子成熟度的增加，种子休眠界点水分会降低，一定湿度的环境下可以破除种子休眠；同时研究发现水分只会影响刚收获种子的休眠性。种子休眠性也受到光的影响，如红光可以促进发芽，而远红光和蓝光对发芽起抑制作用。在二氧化碳过多，氧气不足的情况下，水稻种子的胚芽能够正常生长，但胚根的生长表现不正常。一般认为，杂交稻种子在二氧化碳超过30％的情况下会进入休眠状态。内在因素主要有，后熟作用，种皮障碍，植物激素调节以及休眠相关基因的作用。干的成熟的禾谷类种子在一个特定温度(种子收获时的温度)下贮存一段时间(一般为几个月)后休眠会被打破，这就是因为后熟作用的效果。内源激素中的脱落酸(ABA)和赤霉素(GA)是调节种子发芽和休眠的主要因素。其中GA₃可以解除种子休眠，促进种子萌发，而ABA抑制种子萌动，诱导休眠。GA与ABA在种子发育过程当中具有拮抗作用。种子休眠是由多个基因控制的，近年来通过QTLs的定位与克隆的方式分离出了一些新的种子休眠基因。DELAY OF GERMINATION1(DOG1)是拟南芥中第一个被克隆的休眠QTL位点，它编码一个未知功能的蛋白。除了这种正向遗传学的基因克隆方式，越来越多的研究者利用反向遗传学的方法，通过转录组及蛋白组数据分析来获得所需要的基因。迄今，水稻休眠基因的定位和克隆取得了一定的进展，但是水稻种子休眠的调控机制还不清楚，这就需要我们定位和克隆更多的休眠基因来进一步的揭示种子休眠的机制。

发明内容

本发明的目的在于公开一种水稻种子休眠相关基因OsDOG1L3，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，含738bp。其基因组序列与CDS序列相同。

本发明的第二个目的还提供所述水稻种子休眠相关基因OsDOG1L3的编码的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有245氨基酸。

编码所述蛋白的基因优选为如下1)或2)或3)所述的DNA分子：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码植物种子休眠性相关蛋白的DNA分子。

含有以上任一所述基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。

所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区均具有类似功能。

使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或组成型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素启动子(Ubiquitin)，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体可为在用限制性内切酶KpnI和SpeI双酶切载体pCAMBIA1390的重组位点***所述基因(OsDOG1L3)得到的重组质粒。将含有OsDOG1L3的pCAMBIA1390命名为pCAMBIA1390-OsDOG1L3，该重组表达载体能够过表达所述基因OsDOG1L3。

含有以上任一所述基因(OsDOG1L3)的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。

扩增所述基因(OsDOG1L3)全长或任一片段的引物对也属于本发明的保护范围，所述的引物对优选Primer1/Primer2、Primer3/Primer4。

本发明所述基因(OsDOG1L3)，所述蛋白，所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

一种培育水稻种子适度休眠性的方法，是将所述基因导入无休眠水稻品种中，得到休眠性增强的转基因水稻；所述无休眠水稻品种的发芽率接近100％的水稻；所述休眠性增强的转基因水稻的发芽率低于80％的转基因植物。

本发明所述方法优选将所述基因通过所述重组表达载体导入无休眠水稻中。

一种培育种子休眠性增强的转基因植物的方法，是过表达目的植物中本发明所述基因，得到休眠性增强的转基因植物；所述目的植物为携带所述基因的植物。

有益效果：

本发明从强休眠水稻N22中分离和克隆到同源的DOG1基因，并将其命名为OsDOG1L3，发明人将OsDOG1L3基因组的全长cDNA连接到过表达载体启动的表达载体上，利用农杆菌浸染转化水稻无休眠品种南粳35，发现上述基因可以使无休眠品种南粳35的休眠性增强。利用本基因通过植物基因工程技术获得具有适度休眠性的品种，从而使恶劣条件下的稻米品质和稻种质量得到保证。

附图说明

图1为水稻与拟南芥DOG1氨基酸序列比对图。

图2为过表达载体pCAMBIA1390质粒图谱。

图3为转基因过表达植株的发芽情况。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1、水稻OsDOG1L3基因的序列分析以及克隆与载体构建

一、水稻休眠基因的序列分析及克隆

通过生物信息学分析，发明者在水稻N22中克隆获得了水稻的OsDOG1L3基因如SEQID NO.1所示。水稻的OsDOG1L3基因位于第一条染色体上。OsDOG1L3的开放阅读框为738bp，编码245aa如SEQ ID NO.2所示。

根据找到的水稻OsDOG1L3基因序列设计引物，进行克隆，克隆方法如下：

(1)DNA的提取:

①取0.2克左右的水稻幼嫩叶片，置于2.0ml Eppendorf管中，管中放置一粒钢珠，把装好样品的Eppendorf管在液氮中冷冻5min，置于2000型GENO/GRINDER仪器上粉碎样品1min。

②加入660μl提取液(含100mM Tris-Hcl(PH 8.0)，20mM EDTA(PH 8.0)，1.4MNaCl,0.2g/ml CTAB的溶液)，漩涡器上剧烈涡旋混匀，冰浴30min。

③加入40μl 20％SDS，65℃温浴10min，每隔两分钟轻轻上下颠倒混匀。

④加入100μl 5M NaCl，温和混匀。

⑤加入100μl 10×CTAB，65℃温浴10min，间断轻轻上下颠倒混匀。

⑥加入900μl氯仿，充分混匀，12000rpm离心3min。

⑦转移上清液至1.5mL Eppendorf管中，加入600μl异丙醇，混匀，12000rpm离心5min。

⑧弃上清液，沉淀用70％(体积百分含量)乙醇漂洗一次，室温凉干。

⑨加入100μl 1×TE(121克Tris溶于1升水中，用盐酸调PH值至8.0得到的溶液)溶解DNA。

⑩取2μl电泳检测DNA质量，并用DU800分光光度仪测定浓度(Beckman InstrumentInc.U.S.A)。

(2)OsDOG1L3基因的克隆:

OsDOG1L3引物序列：

上游引物Primer1：ATGCCGGCGTCGTACCTGCAG(SEQ ID NO.3)

下游引物Primer2：CTAGAGGCCCCGCCGGCCGCCGT(SEQ ID NO.4)

以上述提取的DNA产物作为模板进行PCR扩增；

PCR反应体系(50μl)用KOD酶扩增(购自TOYOBO公司)：DNA～200ng，上游引物(10pmol/ul)1.5ul，下游引物(10pmol/ul)1.5ul，2x PCR Buffer for KOD FX 25ul，dNTPs(2mM)10ul，KOD FX(1.0U/ul)1ul，ddH₂O补足，共50ul。

PCR反应程序：94.0℃变性2min；98.0℃变性10s、55℃退火30s、68℃延伸1min，共循环35次；68℃延伸7min；10℃保存。PCR反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪中进行。

反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，检测到目的条带后，切胶并进行胶回收，取上述产物与pEASY-T1克隆载体进行连接，操作步骤按照全式金司的产品pEASY-T1说明书进行。然后连接产物使用热激法转化大肠杆菌DH5α菌株(购自Tiangen公司)，在含有氨苄青霉素的LB平板上生长过夜。挑取白色单个菌落LB液体培养基中培养。提取质粒DNA并进行序列测序。

二、过表达载体构建

以正确的带有OsDOG1L3基因的质粒为模板，进行PCR扩增获得OsDOG1L3(N22)基因，PCR引物序列如下：

Primer3(下划线所示的序列为Kpn I重组位点)：

5'—TGCACTAGGTACCATGCCGGCGTCGTACC—3'(SEQ ID NO.5)

Primer4(下划线所示的序列为Spe I重组位点)：

5'—CGTTAACACTAGTCTAGAGGCCCCGCCGG—3'(SEQ ID NO.6)

上述引物位于SEQ ID NO.2所示基因的编码区起始位置和编码区终止子位置，扩增产物包含了该基因的完整编码区，将PCR产物回收纯化。采用HD Cloning Kit重组试剂盒(Takara公司)将PCR产物克隆到载体pCAMBIA1390(图2)中。

In-Fusion重组反应体系(10μL)：PCR产物10-200ng，经Kpn I和Spe I双酶切回收pCAMBIA1390载体50-200ng，5×In-Fusion HD Enzyme Premix 2μL，Deionized water to10μL。枪头吹打混匀后将混合体系50℃反应15min后置于冰上，取2μL反应体系用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(Tiangen公司)。将全部转化细胞均匀涂布在含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上。37℃培养12-16h，挑取克隆阳性克隆，进行测序。

序列测定结果表明，PCR反应获得的片段包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，编码245个氨基酸残基组成的蛋白质(SEQ ID NO.2)。将SEQ ID NO.3所示的蛋白命名为OsDOG1L3(N22)。

实施例2、过表达转基因植物的获得和鉴定

一、重组农杆菌的获得

用电击法将pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)转化农杆菌EHA105菌株(购自美国英俊公司)，得到重组菌株，提取质粒进行PCR及酶切鉴定。将PCR及酶切鉴定正确的重组菌株分别命名为EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)。

二、转基因植物的获得

将EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)转化水稻南粳35，具体方法为：

(1)28℃培养EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)16小时，收集菌体，并稀释到含有100μmol/L的N6液体培养基(Sigma公司，C1416)中至浓度为OD₆₀₀≈0.5，获得菌液；

(2)将培养至一个月的南粳35水稻成熟胚胚性愈伤组织与步骤(1)的菌液混合侵染30min，滤纸吸干菌液后转入共培养培养基(N6固体共培养培养基，Sigma公司)中，24℃共培养3天；

(3)将步骤(2)的愈伤接种在含有100mg/L巴龙霉素(Phyto TechnologyLaboratories公司)的N6固体筛选培养基上第一次筛选(16天)；

(4)挑取健康愈伤转入含有100mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第二次筛选，每15天继代一次；

(5)挑取健康愈伤转入含有50mg/L巴龙霉素的N6固体筛选培养基上第三次筛选，每15天继代一次；

(6)挑取抗性愈伤转入分化培养基上分化；

得到分化成苗的T₀代阳性植株。以南粳35为阴性对照。

四、转基因植株的鉴定

1、PCR分子鉴定

将步骤三获得的T₀代阳性植株提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用pCAMBIA1390上SEQ ID NO.2***位点左边界附近的引物Primer3和SEQ ID NO.2上的引物Primer4作为引物对进行扩增(Primer3：5'—TGCACTAGGTACCATGCCGGCGTCGTACC—3'(SEQID NO.5)和Primer4：5'—CGTTAACACTAGTCTAGAGGCCCCGCCGG—3'(SEQ ID NO.6))，扩增长度764bp。PCR反应体系：DNA(20ng/ul)2ul，Primer5(10pmol/ul)2ul，Primer6(10pmol/ul)2ul，10xBuffer(MgCl₂free)2ul，dNTP(10mM)0.4ul，MgCl₂(25mM)1.2ul，rTaq(5u/ul)0.4ul，ddH₂O 10ul，总体积20ul。扩增反应在PTC-200(MJ Research Inc.)PCR仪上进行：94℃3min；94℃30sec，55℃45sec，72℃1min，35个循环；72℃5min。

用试剂盒(北京Tiangen公司)纯化回收PCR产物。PCR产物用1％的琼脂糖电泳检测。(N22)植株。

2、表型鉴定

将T₀代转EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)植株、南粳35和N22种植在南京农业大学水稻试验站，对抽穗35天的转基因植株进行收种，进行休眠表型的鉴定。南粳35植株发芽率约为97％，转入转EH-pCAMBIA1390-OsDOG1L3(N22)的转基因植株发芽率出现分离，其中Y2906-1-5的发芽率约为13％，Y2907-1-9的发芽率约为39％(图3)。

Claims

1.一个调控水稻种子休眠的基因OsDOG1L3，其特征在于：来源于水稻，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1编码的蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.编码权利要求2所述蛋白的基因，其特征在于：其选自如下1)或2)或3)或4)的DNA分子：

1)SEQ ID NO.1所示的DNA分子；

2)SEQ ID NO.2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；

4)与1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码水稻种子休眠性蛋白的DNA分子。

4.含有权利要求1或3所述基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于：所述重组表达载体是在pCAMBIA1390载体的Kpn I和Spe I双酶切位点之间***权利要求1或3所述基因得到的重组质粒。

6.扩增权利要求1所述基因的全长及其任意片段的引物对，优选Primer1/Primer2和Primer3/Primer4；所述的Primer1序列如SEQ ID NO.3所示，所述的Primer2序列如SEQ IDNO.4所示，所述的Primer3序列如SEQ ID NO.5所示，所述的Primer4序列如SEQ ID NO.6所示。

7.权利要求1或3所述基因，权利要求2所述蛋白，权利要求4所述重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌中的至少一种在植物育种中的应用。

8.一种培育水稻种子适度休眠性的方法，是将权利要求1或3所述基因导入无休眠水稻品种中，得到休眠性增强的转基因水稻；所述无休眠水稻品种的发芽率接近100％的水稻；所述休眠性增强的转基因水稻的发芽率低于80％的转基因植物。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：权利要求1或2所述基因通过权利要求4或5所述重组表达载体导入无休眠水稻中。

10.一种培育种子休眠性增强的转基因植物的方法，是过表达目的植物中权利要求1或3所述基因，得到休眠性增强的转基因植物；所述目的植物为携带权利要求1或3所述基因的植物。