CN104862319A - 控制植物分枝的拟南芥基因AtTIE1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了控制植物分枝的拟南芥基因AtTIE1及其应用。所述AtTIE1基因编码序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的植物调控因子或其同功能的衍生蛋白质。在拟南芥中表达该基因可以增加拟南芥植株的分枝数目。AtTIE1基因在植物形态建成的优化中有重要的应用价值，利用该基因进行分子育种有望培育出具有实际生产应用价值的理想株型的植物。

Description

控制植物分枝的拟南芥基因AtTIE1及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种控制植物分枝的拟南芥基因及该基因的用途。

背景技术

分枝是植物的重要特性，在很大程度上，分枝影响植物的形态建成。单子叶植物的分蘖是一种特殊的分枝。在农业生产中，适宜的分蘖数目与粮食作物的高产密切相关。

植物的分枝来源于叶腋中的侧芽。尽管侧生分生组织与茎顶端分生组织具有同样的发育潜力，但是侧芽经常形成具有更少叶片的休眠芽。一旦环境条件适合，休芽便可以被激活，形成分枝（Journal of experimental botany,2007,vol.59:67-74）。分枝发育的调控赋予植物对于持续变化的环境条件的可塑性，这一过程受到严格而精细的调控。

分枝的形成过程大致分为两个阶段：腋芽处侧生分生组织的起始和侧芽的发生（Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,vol.100:11765-11770）。侧芽在什么位置发生以及侧芽是发育成分枝还是处于休眠状态受到多种内源和外源信号的调控，这些信号从其被感知的部位转导到侧芽（The Plant cell,2007,vol.19:458-472）。在信号转导途径中，植物激素发挥着重要的作用。其中，生长素、细胞***素和独脚金内酯对于调控侧生分生组织的起始和侧枝的发育的作用最为重要。

生长素是第一个被报道与分枝调控相关的植物激素。1934年，人们发现植物的顶端能够抑制侧枝的发生，这种现象称为“顶端优势”。这种现象至少在一定程度上受到生长素的调控，因为阻止生长素的极性运输或者移除植物的顶端都能促进侧芽的发生，并且这种促进作用可以被外加的生长素抑制。但是，很多实验证明生长素调控侧枝发育的作用是间接的。诸多研究表明生长素可能通过下调细胞***素的合成、限制细胞***素向芽运输来抑制分枝发育。同时独脚金内酯通过影响主茎中生长素的运输能力来调节侧芽的生长。

在侧枝发育的调控中，多个转录因子参与激素的信号转导过程和其他调控过程，从而行使着重要的功能。拟南芥REV编码一个第三类homeodomain-zip蛋白。它是侧生分生组织起始所必需的，并且可能在已知的分生组织的调节因子，如SHOOT MERISTEMLESS（STM）和CLAVATA1（CLV1）的上游发挥作用（Development,1995,vol.121:2723-2735;The PlantJournal,vol.2001,25:223-236）。LAS是一个GRAS家族的转录调节因子，在营养生长阶段调控侧生分生组织的起始。las突变体在营养生长时期，叶腋处几乎不能形成侧生分生组织。LAS可能在REV的上游行使作用（Proceedings of the National Academy of Sciences,2003,vol.100:11765-11770）。R2R3MYB基因编码的REGULATORS OF AXILLARY MERISTEMS1(RAX1)，RAX2和RAX3在拟南芥营养生长和生殖生长中均参与调控侧生分生组织的发育。R2R3MYB基因家族不同成员的突变体控制着不同发育阶段的侧生分生组织的形成（The Plant Cell,2006,vol.18:586-597;The Plant Cell,2006,Vol.18,598–611）。拟南芥ROX基因编码一个bHLH家族转录因子，在营养生长早期rox突变体的侧芽形成受到抑制。ROX在水稻中的同源基因LAX PANICLE(LAX)和番茄中的同源基因BA1同样参与侧生分生组织的形成（The PlantJournal,2012,vol.71:61-70）。此外，有研究表明TCP家族转录因子也参与植物分枝的调控。TB1基因分别在玉米和水稻中负调控侧枝的形成，在其功能缺失突变体中玉米和水稻的分枝数目显著增加（Genetics,1995,vol.141:333-346;The Plant Journal;2003,vol.33:513-520）。BRC1基因编码一个拟南芥TCP家族转录因子，在侧芽发育过程中发挥重要作用。BRC1的活性与侧芽的产生成负相关关系，并且专一地影响侧芽的发育。BRC1响应环境和内源的信号，从而控制侧芽发生。生长素和MAX途径通过BRC1来促进侧芽的休眠（The Plant Cell,2007,vol.19:458-472）。

尽管人们已经在植物分枝调控机制的研究中取得了一定进展，但是其调控机制仍然存在很多没有阐明的问题。本发明研究表明AtTIE1作为一个正调控因子调控拟南芥分枝发育。这在一定程度上加深了人们对于植物分枝调控机制的理解。在模式植物拟南芥中深入研究分枝发育的调控机制可能为作物育种提供一定的借鉴。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制植物分枝的拟南芥基因及其编码蛋白，用于改良植物的株型。

本发明所提供的影响分枝数目的基因，名称为AtTIE1，来源于拟南芥（Arabidopsisthaliana），编码下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No:1氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)所述蛋白质相同的功能。序列表中的SEQ ID No:1由193个氨基酸残基组成，其N端含有一个核定位信号KRGK（28-31位氨基酸残基）、一段碱性区域（29-45位氨基酸残基）和一个螺旋结构（47-57位氨基酸残基），C端末尾含有一个EAR转录抑制基序（188-193位氨基酸残基）。所述取代、缺失或添加的一至十个氨基酸残基可以是非保守区域中的氨基酸残基，其改变不会对该蛋白的功能产生影响。对氨基酸残基进行取代、缺失或添加的方法，以及对蛋白功能的检测均是本领域技术人员所熟知的，通常是利用基因工程的手段对其编码基因进行突变，然后再表达出相应的蛋白并检测其功能。

本发明的控制植物分枝的拟南芥基因AtTIE1的核酸序列可以是其cDNA序列，也可以是基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上一致性且编码相同功能蛋白的DNA序列。序列表中SEQ ID NO:2所示的是AtTIE1基因的cDNA序列，SEQ ID NO:3所示的是AtTIE1基因的基因组DNA序列。

本发明还提供了包含上述核酸序列以及与该核酸序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。在较佳的实施方案中，所述表达调控序列包括组成型高表达的调控序列，例如花椰菜花叶病毒35S启动子。

本发明的另一目的是提供一种改变植物分枝数目和改造植物株型的方法。

应用AtTIE1基因可影响拟南芥等植物的分枝数目，其方法可以是将AtTIE1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述AtTIE1基因在植物中表达，得到分枝数目改变的转基因植物。

在上述改变植物分枝数目和改造植物株型的方法中，所述AtTIE1基因既可为所述基因的cDNA序列，也可为所述基因的基因组DNA序列，或者是与这些序列具有90％以上一致性且编码相同功能蛋白的DNA序列。与所述序列具有90％以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列，是将所述基因的cDNA或基因组DNA序列用已知的方法进行分离和/或修饰和/或设计得到的。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用（例如，反义或共抑制技术）中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法，以及测试这些发生变化的基因的有效性的方法均是本领域技术人员熟知的。

本发明AtTIE1基因或其同源序列可通过植物表达载体导入植物组织、细胞或器官。用于构建所述植物表达载体的出发载体可为任意一种可用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体或可用于植物微弹轰击的载体等，如Gateway系列载体（如pB7FWG2等）、pBin系列载体（如pBin19等）、pJim系列载体（如pJim19等）、pCAMBIA系列载体（如pCAMBIA1301等）、per8、pX6或其它衍生植物表达载体，所述出发载体还可为可在原核生物中复制的载体，如pENTR/D-TOPO载体、pUC系列载体或pBluescript系列载体等。

使用本发明AtTIE1基因或其同源序列构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型或诱导型启动子。所述组成性表达启动子可为花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米Ubiquitin启动子或水稻actin1启动子等；所述诱导型启动子可为受低温、干旱、ABA、乙烯、盐碱或化学等诱导的启动子。上述启动子可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必须与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等）、具有抗性的抗生素标记物（新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因、潮霉素磷酸转移酶（Hygromycin phosphotransferase）基因、庆大霉素标记物或卡那霉素标记物等）或是抗化学试剂标记基因（如抗除莠剂基因）等。经上述方法进行筛选后还可采用Southern、PCR或点杂交等分子检测手段对转基因植株进行检测，以确定其是否转化有目的基因。

携带有本发明AtTIE1基因或其同源序列的植物表达载体可通过使用原生质体-化学介导法(Ca2+、PEG)、Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、花粉管导入、微注射、电激、基因枪、农杆菌介导等常规生物学方法中的任何一种或几种方法的组合转化植物细胞、组织或器官，并将转化的植物细胞、组织或器官培育成植株；所述组织和器官可包括宿主植物的果荚、愈伤组织、茎尖、叶片和种子等。

本发明将编码AtTIE1基因的核酸序列在拟南芥中过量表达，并统计转基因植物的分枝数目发现，AtTIE1基因具有增加拟南芥分枝数目的功能。因此，本发明所提供的AtTIE1基因在植物形态建成的优化中有重要的应用价值，利用该基因进行分子育种有望培育出具有实际生产应用价值的理想株型的植物。

附图说明

图1显示了实施例3通过实时定量PCR检测TIE1-GFP融合基因在转基因株系3-6和野生型植株中的表达水平。

图2显示了实施例3中TIE1-GFP融合基因过量表达的转基因株系3-6和野生型具有代表性的植株的分枝表型，图中所示植株均为成熟植株。

图3显示了实施例3中TIE1-GFP融合基因过量表达的转基因植株和野生型植株茎生叶的分枝表型。

图4显示了实施例3中TIE1-GFP融合基因过量表达的纯合转基因植株和野生型植株总分枝数统计结果，其中，纵坐标轴显示的分枝数为10株具有代表性的植株总分枝数的平均值，正负误差线表示其标准差，总分枝数包括主茎、莲座叶和茎生叶叶腋中所有长出的一级分枝和高级分枝。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russell,David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold Spring Harbor）。

实施例1、基因的克隆和植物表达载体的构建

（一）AtTIE1基因cDNA序列的克隆：

AtTIE1基因的基因组DNA序列、cDNA序列和氨基酸序列从The Arabidopsis InformationResource拟南芥基因组数据库中获得（http://www.arabidopsis.org/）。

根据TIE1基因的CDS序列设计基因特异的PCR引物：

F1:5'-CACCATGGGTAGTAGTTTTTTCGGGAGAC-3'（SEQ ID NO:4）；

R1:5'-CAATCTCAATTCCAAATCTAGC-3'（SEQ ID NO:5）。

利用这对引物从拟南芥（Arabidopsis thaliana）Colombia生态型的cDNA文库（本实验室自行构建）克隆得到不含终止密码子的TIE1基因的CDS序列。

（二）过量表达TIE1-GFP融合基因的入门载体的构建

PCR产物通过TOPO反应连入pENTR/D-TOPO载体（Invitrogen公司），筛选带有正向***片段（基因的ATG靠近M13F测序引物）载体并测序，测序正确的质粒命名为TOPO-TIE1，用于构建TIE1-GFP融合基因过量表达的植物表达载体。

（三）TIE1-GFP融合基因过量表达载体的构建

为了构建TIE1-GFP融合基因过量表达的植物表达载体，本发明利用载体TOPO-TIE1与植物表达终载体pB7FWG2进行LR反应，将两种质粒混合后，加入LR clonase（Invitrogen公司），22℃反应1小时，产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，使用花椰菜花叶病毒35S启动子上的正向引物35SF和TIE1基因克隆反向引物R1进行PCR筛选，从筛选得到的阳性克隆中提取带有AtTIE1基因序列的载体质粒，测序验证正确后得到过量表达TIE1-GFP融合基因的载体用于转化野生型拟南芥植株。

实施例2、组成型表达TIE1-GFP融合基因的转基因拟南芥的获得

（一）用于转化的拟南芥植物的获得：

选取饱满的拟南芥Colombia生态型种子，首先利用70%的乙醇进行表面消毒，再利用15%的次氯酸钠水溶液进行灭菌，无菌水洗涤5次后，均匀地点在1/2MS固体培养基上，4℃倒置培养2天后，置于22℃光照培养箱中长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养7天左右，转移至土中，置于22℃温室长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养，直至植物抽薹长出花序。

（二）农杆菌转化

将含有TIE1-GFP融合基因的植物过量表达载体用电击法转化农杆菌GV3101感受态细胞，涂布于带有50μg/mL壮观霉素、50μg/mL庆大霉素和50μg/mL利福平的固体LB培养基上，28℃黑暗培养约2天，用花椰菜花叶病毒35S启动子上的正向引物和TIE1基因克隆反向引物R1筛选长出的单菌落；得到的阳性克隆用含有50μg/mL壮观霉素、50μg/mL庆大霉素和50μg/mL利福平的液体LB培养基28℃震荡培养，再转接至200ml含有50μg/mL壮观霉素、50μg/mL庆大霉素和50μg/mL利福平的液体LB培养基28℃震荡培养16小时用于拟南芥转化。

（三）花浸法转化拟南芥

将28℃震荡培养16小时后的农杆菌菌液室温下3000rpm离心15分钟，悬浮于含有0.03%的表面活性剂silwet的1/2MS侵染液中，倒入喷壶后喷施拟南芥尚未打开的花苞，待全部花苞沾满菌液后，用玻璃板盖住盛有转化后植物的塑料箱，22℃保湿培养24小时后揭开玻璃板，继续于22℃温室长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养，直至种子成熟。

（四）拟南芥阳性转化植株的筛选

收获转化后植株的种子，首先利用70%的乙醇进行表面消毒，再利用15%的次氯酸钠水溶液进行灭菌，无菌水洗涤5次后，均匀地点在含有50μg/mL卡那霉素的固体1/2MS培养基上，4℃倒置培养2天后，置于22℃光照培养箱中长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养7天左右，挑选正常生长的绿色小苗，转移至土中，置于22℃温室长日照（16小时光照/8小时黑暗）培养，直至收获T1代转基因种子。

（五）纯合转基因植株的获得

将T1代转基因种子按照（四）中所述的方法种植，收获T2代种子；再将T2代种子以同样的方法进行筛选，后代全部为正常健壮的绿色小苗的株系即为纯合株系，将用于后续的表型观察和分枝数目统计实验。

实施例3、组成型表达TIE1-GFP融合基因增加拟南芥的分枝数目

（一）转基因拟南芥和野生型拟南芥中TIE1-GFP融合基因表达水平的检测

剪取野生型和转基因拟南芥植株的叶片，用Trizol试剂（Invitrogen）提取总RNA，DNaseI（TaKaRa）处理消化DNA后，使用逆转录试剂盒（Promega）进行逆转录，得到转基因植株和野生型植株的cDNA。根据TIE1-GFP融合基因的DNA序列设计基因特异的实时定量PCR引物realF和realR，通过RT-PCR检测TIE1-GFP融合基因在转基因植株中的表达水平。

内参基因选用拟南芥的UBQ10基因（引物使用realF2和realR2），各引物序列如下：

realF：5'-TCTCAGCCTCACAGAGCACCAAGTT-3'（SEQ ID No:6）；

realR：5'-CCGGTGGTGCAGATGAACTTCAG-3'（SEQ ID No:7）；

realF2：5'-TCCGGATCAGCAGAGGCTTA-3（SEQ ID No:8）；

realR2：5'-TCAGAACTCTCCACCTCAAG-3'（SEQ ID No:9）。

RT-PCR检测TIE1-GFP融合基因在野生型和转基因拟南芥株系中的表达情况如图1所示，其中3-6为分枝表型的TIE1-GFP融合基因过量表达的转基因株系号。图2展示了野生型和AtTIE1-GFP融合基因过量表达株系3-6的成熟植株的分枝表型，可以看到转基因株系的分枝数目（包括主茎、莲座叶和茎生叶叶腋中长出的一级分枝和高级分枝）明显增加。图3显示了转基因植株和野生型植株茎生叶的分枝表型，TIE1-GFP融合基因过量表达的转基因植株茎生叶的叶腋中经常会出现1个以上的二级分枝，并且二级分枝上还会出现更高级的分枝，而野生型植物的茎生叶叶腋处则通常只有一个分枝。

（二）TIE1-GFP融合基因转基因拟南芥分枝数目的统计

选取稳定遗传的T3代植株种植到土中，当植株生长成熟后检测TIE1-GFP融合基因转基因植株和野生型植株中TIE1-GFP融合基因的表达水平，选取表达水平上调明显的植株拍照并统计总分枝数。这里的总分枝数包括主茎、莲座叶和茎生叶叶腋中所有长出的一级分枝和高级分枝。统计分枝数时选取10株具有代表性，计算其总分枝数的平均值和标准差。统计结果如图4所示，转基因植株的总分枝数明显高于野生型的分枝数。

本发明通过花浸法转化拟南芥，获得TIE1-GFP融合基因过表达的转基因拟南芥，通过表型分析和分枝数目统计发现过量表达TIE1能够增加拟南芥植株的分枝数目。该基因编码的蛋白质产物为植物转录调控因子，该基因的产物可以增加拟南芥的分枝数目，具有用于培育理想株型植物的应用价值。

Claims (9)

1.拟南芥AtTIE1基因在改变植物分枝数目和改造植物株型中的应用，所述AtTIE1基因编码

下述蛋白质(i)或(ii)：

(i)序列表中的SEQ ID No：1所示氨基酸序列的蛋白质；

(ii)序列表中的SEQ ID No：1氨基酸序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加

而衍生的蛋白质，并且所衍生的蛋白质具有与(i)所述蛋白质相同的功能。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述AtTIE1基因的序列是该基因的cDNA序列或基因组DNA序列。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述AtTIE1基因的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo:2或SEQ ID No:3所示。

4.如权利要求1～3任一所述的应用，其特征在于，将所述AtTIE1基因导入植物细胞、组织或器官，再将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，使所述AtTIE1基因在植物中表达，得到分枝数目改变的转基因植物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述AtTIE1基因通过植物表达载体导入植物细胞、组织或器官。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体是pB7FWG2。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体包含所述AtTIE1基因序列和与该基因序列操作性相连的表达调控序列。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体通过一种增强型、组成型或诱导型启动子驱动所述AtTIE1基因的表达。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体中，用花椰菜花叶病毒35S启动子驱动所述AtTIE1基因的表达。