CN114672492B - 一种调控水稻株型的基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新发现的水稻基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1,该基因能够减少未驯化完全的水稻品种的无效分蘖,用于改良水稻株型和提高产量。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域,具体地说,涉及一种新发现的水稻基因EBT1及其在调控水稻分蘖和株型中的应用。
背景技术
农作物为人类在地球上的生存繁衍提供了最基本的保障,是人类长期的经验累积和智慧结晶。作物驯化是将野生种驯化为能够适应栽培环境并满足人类需求的过程[1]。据估计,到2050年,主要农作物产量需要以每年2.4%的速度增长,才能满足粮食供应需求。水稻(Oryza sativa L.)是重要的粮食作物,也是重要的驯化作物,世界上大约有50%以上的人口以水稻为主食,中国是水稻生产与消费大国,水稻对于我国粮食安全和可持续发展至关重要[2]。普通野生稻(Oryza rufipogon)和亚洲栽培稻(Oryza sativa L.)是稻属二倍体类型AA genome中研究水稻驯化和进化最为典型的遗传材料[3]。研究表明,亚洲栽培稻由普通野生稻驯化而来,粳稻是由一小部分野生稻在中国南方驯化而来,而籼稻是由驯化的粳稻与一些当地的野生稻杂交获得的,并由中国扩散到东亚和南亚等地区[4]。在这漫长的驯化过程中,种子落粒性降低[5,6],从匍匐生长到直立生长[7,8],种壳颜色[9]等都发生了变化。水稻驯化相关基因的克隆对于研究水稻的起源和分子演化以及不同作物之间平行驯化规律具有重要意义。
野生稻通常比栽培稻生活在更为恶劣的生态环境中,这使得野生稻天然携带了一系列应对不良环境的抗逆基因,而在驯化过程中,人类选择了对生产有利的性状,不断在优中选优,固定了有利的等位基因,使这些有利等位基因附近区段的遗传多样性急剧下降,从而降低了栽培稻的遗传多样性[10]。因此,在人类选择相关有利产量性状的同时,也丢失了一些有利环境适应的基因。高产、优质和耐胁迫一直是育种工作的终极目标,挖掘出更多野生稻优质环境适应性基因以及驯化基因仍具有重要研究意义。
水稻的株型与产量息息相关,株型影响单位面积产量,对农业机械化等农业实践具有重要意义。国际水稻研究所(International Rice Research Institute,IRRI)提出了一种“新株型”或“理想株型”,其特点为几乎不存在无效分蘖、每穗粒数多以及茎较粗壮[11]。这些复杂的农艺性状由多个QTL调控,包括控制分蘖的IPA1/WFP[12,13]、控制每穗粒数的Gn1a[14]、控制每穗粒数、株高和抽穗期多效性控制基因Ghd7[15]等。在这些基因中,IPA1/WFP对水稻株型具有深远影响,并大大影响水稻籽粒产量。IPA1基因编码OsSPL14,一种SQUAMOSA启动子结合的蛋白结构域转录因子,受OsmiR156和OsmiR529的调控。OsmiR156识别位点的点突变可减弱OsmiR156介导的IPA1抑制,从而产生分蘖减少、株高增加、抗倒伏能力增强和籽粒产量增加的理想水稻株型[12]。此外,qWS8/ipa1-2D QTL的功能研究揭示了IPA1表达水平提高的不同机制。在超级稻甬优12及相关品种中,IPA1启动子的天然串联阵列通过促进开放染色质结构与减弱IPA1的表观遗传抑制作用,从而提高IPA1的表达[16]。因此,增大的IM、一次枝梗原基较多和一次穗枝梗较多使得水稻产量较高。IPA1表达水平与产量相关性状的***分析表明,IPA1以剂量依赖的方式对分蘖数与穗分枝具有相反作用。因此,微调IPA1的表达可产生最佳的高产作物株型。有趣的是,不同的miRNA和泛素化修饰在转录后和蛋白质水平上调控IPA1功能具有组织特异性。在茎尖中,IPA1转录本主要由OsmiR156靶向,而在幼穗中则主要由OsmiR529靶向。此外,环指E3连接酶IPA1INTERACTING PROTEIN1通过K63连接的多聚泛素化作用来稳定茎尖的IPA1,但它通过K48连接的多聚泛素化作用促进了穗IPA1的降解[17]。IPA1还能够激活D53的表达,其编码SL信号转导途径的一个关键靶点。通过它们之间的相互作用,D53抑制了IPA1的转录激活功能,表明IPA1是参与SL信号转导的转录因子之一,并在SL诱导的D53表达的反馈调节中起关键作用[18]。这些发现揭示了IPA1的一种依赖于互作的机制和调控网络,为水稻高产育种提供了丰富的遗传资源和手段。
发明内容
在水稻研究中,我们利用实验室已构建的一套低丰度测序的籼稻背景广陆矮4号(GLA4)和偏粳稻背景的普通野生稻(W1943)杂交后产生的重组自交系,定位到与株型相关的QTLs,借助重组自交系,结合表型考察和图位克隆的方法,定位到一个控制水稻成熟后期分蘖的基因EBT1(ENDLESS BRANCHES AND TILLERS)。近等基因系NIL-EBT1主要在水稻籽粒成熟后期表现出多分蘖,节上长枝,分枝不育为***叶,据统计,后期出现的次生分蘖有数百个,而GLA4在成熟后会在倒二节上长出新的1个可育穗子,并能二次收种。该基因编码一个串联的小RNA(OsmiR156b/c),根据以往的研究,miR156是调控植物年龄进程的重要分子,存在于所有陆生植物中。miR156的表达受到年龄调节,其含量随着植物生长而逐渐降低。过量表达miR156的转基因拟南芥呈现出幼态化,叶片小、呈圆形,叶边缘光滑、缺刻少,开花延迟等滞幼表型;相反,降低miR156的活性则促使拟南芥提前进入成年期,开花坐果。因此,miR156是调控植物年龄进程的一个充要条件[19-22]。miR156靶标一类称为SQUAMOSAPROMOTER BINDING PROTEIN-LIKE(SPL)的转录因子,与miR156的表达特征相反,SPL表达量随植物生长发育逐渐上升。
野生稻型EBT1在水稻成熟后期叶片中的表达量高于GLA4,miR156的下游靶基因有以下10个,SPL2,SPL4,SPL7,SPL11,SPL12,SPL13,SPL14,SPL16,SPL17,SPL18,其中SPL14是“理想株型”IPA1基因,由于miR156表达量出现紊乱,下游靶基因SPL家族基因也受到了影响,根据双分子荧光互补(Bimolecular Fluorescent Complimentary,BiFC)实验,发现SPL14与MADS1互作,SPL14与SNB互作,而MADS1与SNB都控制花器官发育以及叶发育。通过互补,过表达和基因敲除等转基因实验进一步证实了EBT1能够影响水稻成熟后期次生分蘖,次生分蘖不育的性状。考察实验室现有野生稻、地方品种材料发现,在一些野生稻及地方品种中仍存有此表型,地方品种呈现出半驯化状态,这又为后续的研究提供了重要的参考价值,可以通过编辑这个基因使得半驯化的地方品种减少无效不育分蘖,提高产量。这一研究发现构成了本发明的基础。具体而言,本发明包括如下技术内容。
本发明的第一个方面提供了一种影响水稻成熟后期分蘖的基因,该基因通过下游SPL基因家族来调控水稻分蘖和株型,本文中命名为EBT1(ENDLESS BRANCHES ANDTILLERS),其核苷酸序列与SEQ ID NO:1具有≥90%、≥92%、≥95%、优选≥98%,更优选≥99%的同源性。
上述基因EBT1的核苷酸序列优选为SEQ ID NO:1,其来源于野生稻W1943(Oryzarufipogon W1943)。
本发明的第二个方面提供了包含上述基因的载体。该载体是用于将所述基因整合入水稻基因组的质粒。
可选地,上述载体的骨架质粒为pCAMBIA系列。例如,该骨架质粒可以为pCAMBIA1300。
本发明的第三个方面提供了一种农杆菌,其转化了上述的载体。该农杆菌用于介导将包含上述EBT1基因的载体导入水稻中,完成转基因操作。所述农杆菌选自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)。
本发明的第四个方面提供了上述载体在调控水稻分蘖率或株型中的用途、尤其是提高未驯化完全的水稻分蘖率和改善株型中的用途。
具体地,可以采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将上述的EBT1基因整合入水稻基因组中。
上述的基因整合可以通过农杆菌介导的质粒转化来实现。
上述基因编辑技术可以采用CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas相关的转座***INTEGRATE***或者CAST***。
上述INTEGRATE***是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting,引导RNA辅助靶向的转座元件***);CAST***是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase,CRISPR相关转座酶)。
上述的EBT1基因通过下游SPL基因家族来调控水稻分蘖和株型。
上述待进行基因改造的水稻例如是未驯化完全的水稻品种。
实验表明,本发明新发现的水稻EBT1基因具有多效性,其通过下游靶基因SPL基因家族来控制分蘖数、花器官、叶片形态,使得整个株型发生改变,最终影响产量。提示EBT1基因能够用于改良未驯化完全的地方水稻品种,提高水稻产量,具有广阔的开发应用前景。
附图说明
图1中a、b分别展示了GPSL43和GPSL19这两种材料的基因型。其中红色代表栽培稻GLA4的基因型,蓝色代表野生稻W1943基因型。GPSL43在1号染色体的4.5-20.5Mb处是W1943基因型,而GPSL19是分别在1号染色体4-5Mb和4号染色体2-30Mb和32-34Mb是W1943基因型。图1中c是EBT1基因定位图。
图2显示了的GLA4和GPSL43株系表型照片及统计柱形图。其中,a:抽穗期(headingstage);b:成熟阶段(maturation stage);c:成熟穗(ripening panicle);d:主分蘖(tiler);e-f:次生分蘖(metamorphosis secondary tiler);g:GLA4和GPSL43主分蘖数统计;h:GLA4和GPSL43的剑叶宽度统计;i:GLA4和GPSL43的每穗粒数统计;j:GLA4和GPSL43的次生分蘖统计。
图3显示了GLA4和GPSL43中基因EBT1敲除情况和表型对比照片。其中,a:EBT1以及上游序列在GLA4和GPSL43中的位置及变异情况;b:红色三角形虚线代表基因EBT1敲除靶点,方框表示已敲除区域;c:GLA4和GPSL43表型图和敲除EBT1后GPSL43株系表型对比照片。在GPSL43中对EBT1敲除后使水稻后期无效不育分蘖消失。
图4显示了在GLA4中EBT1过表达和互补材料表型对比照片。其中,a:从左至右分别为GLA4,T1-OX-EBT1,T0-OX-EBT1植株的表型,小图为GLA4和过表达的穗子表型;b:EBT1互补植株以及在田间种植时的表型,最右边显示茎上长节。
图5显示了EBT1基因应用。其中,a:处于半驯化状态的地方栽培稻HP139和HP468的表型。b:含有EBT1基因栽培稻BIL271与含有驯化基因14W61植株杂交及其后代F1表型;c:预期结合相关驯化基因后栽培稻返祖野生稻的模式图。
图6是本发明构建的互补质粒pCAMBIA1300-EBT1(互补载体pW1943::gEBT15k和pW1943::gEBT16.5k)的结构示意图,以pCAMBIA1300为骨架,EBT1自身上游分别约3.5kb和5kb序列作启动子,转化过程中以潮霉素作筛选标记。
具体实施方式
本发明克隆的水稻株型基因EBT1,该基因控制水稻后期生长次生分蘖的数目,次生分蘖不育,主分蘖每穗粒数极大降低;野生稻中EBT1的过量表达导致一系列下游控制粒型、分蘖靶基因的表达异常进而影响表型;同时野生稻基因型的后期分蘖芽能进行无性繁殖。一些半驯化的地方品种携带野生稻型EBT1而具有该表型,因此可以通过导入栽培稻型的EBT1,从而改良半驯化的地方品种,使之减少无效后期不育分蘖达到更高产量。
研究发现,EBT1基因促进水稻后期不育分蘖爆发式生长,降低每穗粒数,增加水稻无性繁殖能力。野生稻中含有此基因的高表达基因型,大部分栽培稻不具有这种表型,但在一部分地方栽培稻中依然存在,因此可以通过杂交育种把此基因从栽培稻导入到一些未驯化完全的地方品种,改良现有的地方品种。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于举例说明目的,而不是对本发明的限制。此外应理解,在阅读了本发明的构思之后,本领域技术人员对其作出的各种改变或调整,均应落入本发明的保护范围内,这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
本文的实施例中,如果对于反应温度或操作温度没有做出具体说明,则该温度通常指室温(15-30℃)。
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由北京擎科生物技术有限公司和中国科学院国家基因研究中心完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译,科学出版社,北京,2002)进行。
可根据相关试剂盒说明书操作。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件比如PCR条件。
实施例
1.材料:
本实验中用于EBT1定位的亲本材料为次生分蘖正常的亚洲栽培籼稻广陆矮4号(GLA4)和次生分蘖***发育的替换系GPSL43。其中GPSL43是以广陆矮4号(GLA4)为背景,1号染色体某15MB左右片段被普通野生稻W1943(Oryza rufipogon W1943)替换的单片段替换系。籼稻广陆矮4号(GLA4)和粳稻品种日本晴(Nipponbare)用于遗传转化和功能研究。
2.表型考察
分别在两个时期考察水稻的分蘖数,水稻抽穗后,在田间数每个号各10株的分蘖数,统计结果;在籽粒成熟后期,分别考察群体的次生分蘖数,由于W1943基因型的植株具有次生分蘖不育的情况,可以将其解剖在体式镜下观察。
3.基因定位
设计Indel引物和SNP引物,其中Indel的设计:将野生稻W1943和GLA4的目标区域进行序列比对,选取大于20bp的***或缺失序列,用NCBI-primer design进行引物设计,PCR产物通过4%琼脂糖凝胶电泳进行差异检测。SNP引物设计:当定位到较小的区域时,没有合适的Indel引物,根据W1943与GLA4序列中的SNP位点差异,设计引物,PCR产物大小在500-700bp之间且SNP位点尽量位于序列中间,PCR扩增产物通过测序的方法来区分不同基因型。
4.实时定量PCR
将水稻分成各个时期和组织进行取材,分别在播种后10天,20天,30天,40天,50天,60天,70天,80天,90天,100天,110天,120天取叶片,节间,幼穗等组织,新鲜植物组织或者-80℃冻存的组织用Trizol Reagent提取。总RNA样品中的DNA经过DNA酶消化后,用Invitrogen的SuperScriptTM II Reverse Transcriptase进行反转录为cDNA第一链,进一步为实时定量PCR的模版。定量PCR采用Takara公司的Premix Ex TaqTM试剂盒,在Applied Biosystems 7500 real time PCR仪上进行。
5.EBT1转基因载体的构建
5.1 EBT1-CP互补载体的构建
以野生稻W1943基因组为模板,分别扩增EBT1基因上游3.5kb和5kb,全长分别为5kb和6.5kb,采用重组连接的方法连入利用pCAMBIA1300载体并转GLA4。得到质粒pCAMBIA1300-EBT1,如图6所示。该质粒包含5kb或6.5kb的EBT1基因序列、位于该基因上游的3.5kb和5kb启动子、潮霉素抗性基因。5kb和6.5kb这两个序列都有相同的表型,且类似于过表达EBT1的表型,鉴于目前还未找到起作用的变异位点,不能下结论。
5.2 CR-EBT1基因敲除载体的构建
根据CRISPR/Cas9***识别前导序列的特异性,在pri-miR156c上和pri-miR156b上各设计了gRNA位点。载体的构建过程参照以前发表的文献[23]。
实验结果
图位克隆鉴定EBT1基因
在考察表型时,我们观察到片段替换系GPSL43与GPSL19(图1中a、b)都有次生分蘖异常,节上长枝的现象,因此把候选区域确定在1号染色体。我们选择GPSL43与GLA4回交并自交构建的分离群体,在4.51-10.405之间设计了7对indel分子标记,将EBT1定位在4.51-5.08之间,同时挑选4.51-5.08之间为H的扩大群体种植,设计了2对SNP分子标记,定位在4.51-4.73之间后,总共获得了6株H型,种植后继续上marker,最终定位在1号染色体4.61-4.69范围内(图1中c)。
针对这一性状的表型考察(图2中a、b、c、d、e、f),GLA4和GPSL43在抽穗期无明显差异,主分蘖数无差异。在成熟阶段,整个株型都有差异,后期长出成簇的分蘖,具有grass-like的表型,并且是节上长节,另外花序发育异常,不能正常结实,而GLA4的次生分蘖可正常结实。由统计结果(图2g、h、i、j)可知,GPSL43在成熟后期能长出70多个小分蘖。
我们通过水稻功能基因组注释数据库RAP-DB(The Rice Annotation ProjectDatabase,https://rapdb.dna.affrc.go.jp/)检索发现,在1号染色体4.61-4.69区域内,共有9个基因(参见表1),据相关文献报道,玉米Corngrass1基因前面***一个逆转座子导致植株营养生长时期延长,节上长节并生根,而Corngrass1就编码一个串联的miR156b/c[24]。另外,过表达miR156e,miR156f也有多分蘖的表型[25-27]。因此,我们将候选基因定为Os01g0187200。
表1.在80kb中的9个基因功能预测
EBT1基因的遗传转化验证
为了证实基因定位结果,验证候选基因是否会调控水稻后期无效分蘖,我们进行了遗传转化研究,并结合转基因植株的表型进行分析判断。
1.EBT1在GPSL43中进行CRISPR/Cas基因敲除转化
因为GPSL43是籼稻GLA4背景,转化比较困难,实验室没有成熟的籼稻转化体系,所以我们将构建好载体后交给武汉伯远公司做转化。我们设计了两个靶点进行敲除,分别在OsmiR156b和OsmiR156c上(图3中b红色三角形代表选择的靶点位置)。转化得到的苗用基因特异引物对转基因植株进行检测,获得基因敲除突变株系,并在T1代和T2代对表型和基因型进行了确认。
转化的结果显示,在GPSL43背景下对EBT1进行CRISPR/Cas9基因敲除后,得到两种大片段缺失的基因型,pri-miR156b/c的大片段缺失和pri-miR156c的片段缺失,这使得pri-miR156b/c转录后无法形成完整的pre-miR156b/c茎环结构。与GPSL43相比,GPSL43-EBT1CRISPR#1和GPSL43-EBT1CRISPR#2都没有节上长节,而长出来的次生分蘖和GLA4类似,可育还可以收第二次种。另一方面,造成几个碱基缺失的植株表型并未受到影响,因此可以得到的结论是:大片段的缺失才会影响EBT1的功能,GLA4和GPSL43中EBT1编码区的差异并不会影响表型(图3中a、c)。
2.在GLA4中过表达EBT1的遗传转化
在GLA4的背景下,用Ubiquitin(Ubi)作为启动子驱动GLA4编码区的CDS,得到的T0代苗有超过一半以上营养生长阶段延长且多分蘖不育,能在适宜条件下,存活三季;其余皆为杂合状态,T1代中有分离,过表达的表型稳定(图4中a)。
3.在GLA4中EBT1的互补遗传转化
在基因组上,EBT1的前后两个基因间隔近16kb,在这一区域内,我们并不能准确知道EBT1的启动子具体有多大,且在距离EBT1上游1485bp处有一个1462bp的逆转座子,因此我们构建了两个不同大小的互补材料,分别将GPSL43中包含EBT1共5kb和6.5kb的互补片段克隆到pCAMBIA1300骨架载体,构建互补载体pW1943::gEBT15k和pW1943::gEBT16.5k(图6),把构建成功的互补载体转化GLA4,并利用潮霉素抗性基因引物对转基因植株进行了阳性检测。在T0代我们共获得24个阳性株系,全部矮小多分蘖且不育(图4中b)。
EBT1基因的应用
1.EBT1基因改良地方品种
我们调查实验室现有的栽培稻材料,432份GP和651HP材料,其中有4份HP材料出现类似于GPSL43的表型(图5中a),这4份HP材料属于我国的地方品种,推测是半驯化状态水稻。栽培水稻在合适的温度下仍然会重新进行下一轮生命循环,这种现象和野生稻比较相似,但是在野外环境下受冷气候的制约比较难实现多年生长。在传统农业生产中,水稻结束第一轮生长周期留下的倒桩所产生的再生稻可以帮助农民实现水稻产量的提高。因此,我们希望通过基因编辑的手段使其无效分蘖减少或者使无效不育分蘖重新可育,而达到更高产量,改良地方半驯化品种。
2.EBT1基因使栽培稻返祖野生稻
我们还提出通过杂交的方式将株高基因sd1[28,29],匍匐基因prog1[7]、tig1[8]导入到含有EBT1基因的BIL群体中,尝试人工创造野生稻。在BIL群体中,我们挑选了以上五株,其中BIL138、BIL271、BIL85都携带sd1基因以及TAC1基因(图5中b),并且都具有super-branches的表型。这个是我们对聚合这些基因后表型的一个设想(图5中c),在自然状态下野生稻相比较栽培稻有超强的无性繁殖的能力,匍匐状态可以使多节间的野生稻植株在节间处长出不定根实现无性繁殖。若将该基因导入到栽培稻,另外聚合sd1、PROG1等基因后,希望能回答野生稻可以通过OsmiR156b/c协同其他匍匐多节间实现无性繁殖的问题。
3.EBT1基因禾本科植物中平行进化的作用
在其他品种的野生稻中也观察到这多分蘖,节上长节的表型。另外在一些禾本科植物中也发现这个表型的广泛存在,在单子叶植物中,EBT1基因是个串联的miR156b/c,双子叶中并无排布,借助于EBT1基因的分析,有可能找到禾本科植物平行进化的证据。
总结
本发明克隆了具有多效性的基因EBT1,该基因通过下游靶基因SPL基因家族来控制分蘖数,花器官,叶片形态,使得整个株型发生改变,最终影响产量。该基因是从野生稻和栽培稻杂交后代群体里克隆得到的,对于阐述驯化过程具有重要意义。该基因的过量表达,使植株营养生长时期延长,在野生稻中,该基因随年龄的增长而下降,但当成熟后期,该基因又被激活表达,使得野生稻重新生长出幼小分蘖,可以无性繁殖。而在一些地方品种栽培稻中,还保留EBT1的野生稻基因型,若能通过杂交育种把此基因从栽培稻导入到一些未驯化完全的地方品种,则可以改良现有的地方品种。
上述实验结果提示EBT1基因能够用于改良未驯化完全的地方水稻品种,提高水稻产量,具有广阔的开发应用前景。
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28.A.Sasaki*,M.A.,M.Ueguchi-Tanaka*,H.Itoh*,A.D./>K.Ishiyama§,T./>M.Kobayashi§,G.S./>H.Kitano||,M.Matsuoka*,A mutantgibberellin-synthesis gene in rice.science,2002.
29.TakeshiK.N.,Rico/>Diane R.Wang3*§,TomoyukiFuruta2,Masanari Nakamori2,Takuya Kitaoka2,Keita Adachi2,Anzu Minami2,Yoshinao Mori2,Kiyoshi Mashiguchi1,Yoshiya Seto1||,Shinjiro Yamaguchi1,MikikoKojima4,Hitoshi Sakakibara4,5,Jianzhong Wu6,Kaworu Ebana7,Nobutaka Mitsuda8,Masaru Ohme-Takagi8,9,Shuichi Yanagisawa10,Masanori Yamasaki11,RyusukeYokoyama1,Kazuhiko Nishitani1,Toshihiro Mochizuki12,Gen Tamiya13,14,Susan R.Motoyuki/>Ethylene-gibberellin signaling underliesadaptation of rice to periodic flooding.science,2018.
序列表
<110> 中国科学院分子植物科学卓越创新中心
<120> 一种调控水稻株型的基因及其应用
<130> SHPI2010671
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6563
<212> DNA
<213> Oryza rufipogon W1943
<400> 1
caatttgttc tgtggcacac acgaaacaaa gccagccatc agtagatagc aacactatat 60
ataattacca aaaactttta ttaggcatat atgcagatga tttaaatatg ctgaaaacac 120
aacactcata tataatattg tgatacattc atgaatttgc tttcgatcga ataattcatt 180
tgcataactt acagcaagct gttcggacac agctactgta aaagtaattg ttgcaagaat 240
ccagattgtt taacaaatgc tactcaaatc ttgtagttga aatttgcagg caataacaag 300
atgattatat tgtaaaagtg gattcttggg atgcactaca cgtatgatag ataatttaat 360
cgatcatcat atcgctatcg gtgacatgat caaccacatg gttaatctag ctgggaaaaa 420
agagtttaca aagttaacca tatatatgtt cgatcgaatt gaagaaaatt ccgcagcttt 480
gcatccgcaa cccactaaaa acatattgta atgaagtaat taatcagcag ccagcagcat 540
atcgaatggc aagaggatgg gaataatagt tagtccttgt atatattaat aatcctttat 600
ataggattac gtatagaatg atggtgatta attttgctga ggattcccac caacggcgtc 660
gttggtgatg caagccactg gcgtaagtta gtttgtgtga atctgacaat taaactcgat 720
ctctccacat gtcattacct aataagaagt cgtcaaattg ctgacaatgt ggctaaattt 780
gggaggggtg tgaaaaggca tgtggcctag tagttgtttt ttttttaata atggaaatgg 840
gttacatctc cggcctctgc ccataggcac acagccaaaa agtccagaag tgaatagaaa 900
agaggttaaa aaaggcgaga tgagacaaac ccccaacttc tgtcgataat atgatatact 960
aaaatcatgt ttttttttta aaatcacgta gagtctatca cgaaattctg tagataccac 1020
gccatctaaa ctggagtaaa agttccttgg ctactaattt caagcgtgta gcaccattgc 1080
tcatagtatc ctgttgttcc tgtgaaagca tcatacacca agagtggagc taattggaac 1140
acatgaagat aatctgcatg atgttagaca tttttttatg gttaaaaacc atatcattac 1200
ggcaacgcca aattgaccaa catatagcac tagctctaaa taaaatcatt tttttatggg 1260
tctaggcact ccccttagcc agttaccaaa aatatcttat gcattatggg gagggggaat 1320
attgaaggca aagaagacac atcgccaagc aaaacgtgca acatgacagt caaagaaaaa 1380
atgttggatg gtctcttgtg tattacaaaa acaacattgc ttgtttcccc tccattttct 1440
ctttatgagg ttatctttcg tcaagattac ttttttgtga agaaaccaca taaatacttt 1500
gatttttagt ggtgccttta ccttccataa gatcctcttg tggattctta cattggaatt 1560
gatgatcgta ttatacatgg atttgaccga aaaatggcca tttttatata gcgaccaaat 1620
aaagcaatcc ttttcatttg acagggttat gttagctagt cgagaaatca aatcattcca 1680
ctcaactaac tttggtccta caattgatcg tcggaataaa acattcaacg gtgttgtgct 1740
cataacctct gccaaactag aatgtctctt tcgaaccaca ttgtacaaag aaggatattg 1800
atatttgagt ggttgcaagc ccaaccatgt gtcttcccaa aatcttattt ccatcccatt 1860
accagattta aaagatccat actgaaaaaa ttgatctttt actttcatta ggccagccca 1920
aaattgggat gttcctggtt tgtgtgacat gtgagagggg gttacctttt aagtacttgt 1980
tgcgcaaaag gttttgccat aggccatcac cattaagaag cttgaatagc catttgctca 2040
acaaacatct attcgtgata tcaagattta ggacacccag tccaccttga tcttttgacc 2100
ggtatatata atcccatttt gttaacctat atttcttttt ctggctatca ctgctccaga 2160
aaaagctcga tcggtagtaa tccagtcttt gaagtacacc tcgaggtatt tcaaaaaata 2220
ataacatgaa catgggaagg ttccgaaaga accgagttaa gaagaaccaa tctcccacca 2280
taggagttat ttttgccctt ccatgtgcta agttttcttt gaaacatatt ctccacacat 2340
ttccaatcag aatttctgag ttttcgatag tgtatgggga ttcctaggta tctgaatgga 2400
aaggaatcag aattacaacc aaacagttat ctatattggt cctccatttc cttagctccc 2460
ccaaagcaga aaatttcact tttatgaaaa tttattttca gccccgagag atgttcaaac 2520
acacaaagaa tggccttcat gttttttgct tgttcaaaat accgcatata ttcggttgga 2580
tttagaggcc aggtaaaaaa aaactttctc taaaaacaat tttgggaggg gtatattaaa 2640
ttgatttggt tgtcaaaata tgttcctcgg tctgtcctgc tacaatatat taaccatgct 2700
aatgaagaac tgaatgactt gtgaaatatg ttcctcggtc tgtcctataa tatattaacc 2760
gtgctaatga actgaatgac ttgtgattat tattggaggg cacaaatgaa ttaattgaat 2820
actagtataa agctgaaaaa tggaattgaa aatattagtt catccacacc gttctattca 2880
ttggaaaaga acaaattgaa tcctgaaaat ttccgttggg gagggagatc tagataagaa 2940
caatagagag gtcagagagg aatggtgcgt gacatggggt gattggatag agtcggcggt 3000
ggggcagata tgcacatgtg tgtcaggtta aatttggttt agaattacaa ggcgcattgg 3060
gagaagctac tgcttgcaat tgcaccgccg tttacatggc ttttgatcag agattcagag 3120
cgtgcagcta gcagagcact ccatgcagga gtagtcatga ctcatgactc atgagtagtc 3180
aagccttcag caatggacca tgcatgtccc atatagctgg aaagaagaaa gattcttgca 3240
tataatgtcg acacagatag tgctatatgc gaattcatga tcaacttttg atcagtagtt 3300
cattttatgt atatatataa ttatactccc tccgtctcat aattaatata agggatttta 3360
aagggatgta acattttcta gtactatgaa tttggataaa gagcttatcc agatttatag 3420
tactaataaa tattatatcc cttcaaaatc ccttatattt taggacagat ggagtatatt 3480
gtatacactt ttcttttttg ctatatatta atcctatgta atagtcgaaa gattatattt 3540
tagctgtgaa ttaacagaaa gaagtttatt ttctgtaatg ttgtggactg tatgatcgat 3600
gcatgcatat atatggtcca tccaagctgt agtaggctcc aaagcaagct tatctcgttc 3660
atgtgtcaag cttgtcccac ataggagaag agatgtcgag atggaagaga gaagctaggc 3720
tataggcagc tactacggtc gataccagta gctaggttgg tgacaagaaa attaattaat 3780
taattcatct tctctgttgt tacatcaatc ggccaatggc ggcatctccc cgtttattcc 3840
attcaaacgg aaactgccca agtaacccat cctttccatc tcctataaat accgtaccat 3900
ctcctccaca gctcaccatc caaatcaaca gtaatgttct acagttagtg agatgtagag 3960
agagatatgg ctagctaatc catgagagag atctagatag agagagggag agatgatcag 4020
ttcttcagaa gaggctacta ctagctatct agcttcatgt ttaactcttc ttggtttgtg 4080
tttttgtgtg cttgttggag ttgttaggag gaagagaggg gtgagaggtg aggctgacag 4140
aagagagtga gcacacatgg tgactttctt gcatgctgaa tggactcatg cttgaagcta 4200
tgtgtgctca cttctctctc tgtcagccat ttgatctctc tttctctctt tctccctcat 4260
gtgttatact gttctctcat atctatcttc tttgaggtag taatatactt gagcaaatta 4320
agctgcttaa ttatttgtgt atgatgatca gctgctgatc cggcctcatt tcttgcatat 4380
atgagatcag tttcaaccac aaccacatac atgcttgttc attttttttc acaaagaaag 4440
agaacagttt aatttaattt cttggggttt ttggatcagt taatttgtct tgagagggga 4500
agagatctct atgggttttg gaggtctgac agaagagagt gagcacacac ggtgctttct 4560
tagcatgcaa gagccatgct gggagctgtg cgtgctcact ctctatctgt cagccgttca 4620
ccatgcccaa tatgattaat ctccttctct cagttgacag taatttcttt gccagatctc 4680
ctgttaaatt ttctgcctag ctagctatta tgcacatgct tattatgatg agcttgccaa 4740
tatcatctcc acggcaaaac acaaactagc tatgatttga ttcattatat ttcttttcgc 4800
tgtttaatta attatatgca ggcatacact agctagtttc cagctagtac aaagacgaga 4860
cgaggtcgtt ctgacgattt tcatagtcgt cagaagaagg tgtgcattgg tttaattttt 4920
gttcttggct gtcagactag atcatctctg aatgatcaag agccggatca aataattatt 4980
gtgagcaccg aaatcgatca tgcgtactct ctctgtgaag tatttctgag aaataatatg 5040
agtgtagcta gtatatatac tcttgaaggg tgtctaatta attggggtct ctagctagct 5100
ccttctctga atctgtccat gaattgaatc tactatgtat gtgctggtgc ttactgttat 5160
ttcatgtact acatataatt gataaattaa tcaatttagg ctttcagttt ctttaatttg 5220
tgagcacaag tttacattat attgtaattg gaatctgttg caagtactat atactgtttt 5280
tttatgcata gcagttgaga aatagaatcc aatatacttg tgcaagttat tctatgccac 5340
cttaattaat tacttcttcc tagtaatgaa gtgctagctt cgatctttca atattacctg 5400
tcaatcttaa tttatacttg tttaatttga ctgtaatttg ccagctagaa ttaaatgtac 5460
attaaattga attcttcagt gttgttcttg tgaagttaaa ataatttctg aacattcacc 5520
cctctataat catttgtcta tatagaaaaa gcatgaagca attctaatca catggagttg 5580
tctagatcaa acaattaatt aatcaatcat caatcaaacc aaagacgtgt aaggtcatat 5640
aatacaaatt taacttgaca agttaatgag tagaagatgt atgcaacgat attttccccg 5700
tagcttatac tactgtcgat atatgcgtgt gaccatagtt cacaagccct gtattttatg 5760
atttcaaatg ttcgttcata catatgccct actacaaaag cccttattga caccgattga 5820
gaaccgacca taaataccga tcgattttcc agccggtgtc aatttaacgg tactaatgca 5880
caaccatata ggtaccgatt ttagaatcaa cgcctataga gattatctgc tatttgtgac 5940
tatgtgctat ttgctatttt tgaaacatgg agcaattaat ctgttataat aatcggatcg 6000
gatgaacaag ttgaaacaaa aagggtccaa attaagccat gcaggttttt gctatatagt 6060
cgagctgtgt tgatagttgt aaaaaaaaaa aaaaaactgt gttcatctaa actgtgttga 6120
aatcgtgaaa gtacccaaga aaaaaaatcg aaaaagaagc ccaagttggg gcaatgcagg 6180
cacacgcacg gcggatggat ggtccggtcc acatgtgtga gaagggaagc tccacgttcc 6240
tccggccaat tcagataatt gggccgtgat aattcatttc gcatgacagt aagtctattt 6300
tgcctccctc ttcttgcttc tggttgaacc acagccctca acagcaaaac cgggtacaac 6360
gtctccccca tcttcgaaat atggtggaaa ggtgttacac ccggttttgc agttgagaga 6420
tgcaattcga tcagcagcaa tagttcagag atgtataatg gacttattcg tttctcagga 6480
aaatatttct tctacttagc ttcatctggg cttcatcctt ttggggcaat ctctgtttga 6540
gacagcatct cagctatgca tgg 6563
Claims (7)
1.一种调控水稻分蘖和株型的基因,其核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
2.包含如权利要求1所述基因的载体。
3.如权利要求2所述的载体,其特征在于,骨架质粒为pCAMBIA1300。
4.一种农杆菌,其转化了如权利要求2或3所述的载体。
5.如权利要求1所述的基因、或者如权利要求2或3所述的载体在调控水稻分蘖率或株型中的用途。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,采用质粒转化、同源重组技术或者基因编辑技术将如权利要求1所述的基因整合入水稻基因组中。
7.如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述基因编辑技术采用CRISPR-Cas9***、CRISPR-Cpf1***、CRISPR-Cas转座***。
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Citations (2)
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CN107058321A (zh) * | 2017-04-13 | 2017-08-18 | 中国农业科学院作物科学研究所 | miR156及其前体在调控小麦分蘖数中的应用 |
-
2020
- 2020-12-24 CN CN202011545246.9A patent/CN114672492B/zh active Active
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Non-Patent Citations (5)
Title |
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Molecular evolution and selection of a gene encoding two tandem microRNAs in rice;Sheng Wang等;《FEBS Letters》;第581卷(第24期);第4789-4793页 * |
Oryza sativa Indica Group cultivar RP Bio-226 chromosome 1 sequence ,GenBank: CP012609.1;Madhavi Reddy等;《NCBI》;CDS部分 * |
水稻tree1增变表型的分子遗传学研究;胡兴明;《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)》;第32页3.1第1段,第33页3.2第1段 * |
水稻小RNA的基因组分布和分子进化研究;王晟;《中国博士学位论文全文数据库(电子期刊)》;A006-48 * |
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