CN106190894B - 一株戊糖片球菌g11及其筛选与应用 - Google Patents

一株戊糖片球菌g11及其筛选与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株戊糖片球菌G11及其筛选与应用，其保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：2016248。该戊糖片球菌G11对复方新诺明和头孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌均具有抑菌活性。具备一定的抗逆性、产酶能力，无血细胞溶解性，对绝大多数抗生素无耐药性，经浸浴试验验证对宿主无害，而且还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物死亡率，是一株值得开发的益生菌株。

Description

一株戊糖片球菌G11及其筛选与应用
技术领域
本发明涉及一株戊糖片球菌，尤其涉及一株对拟穴青蟹具有益生活性的戊糖片球菌G11及其筛选与应用。
背景技术
拟穴青蟹(Scylla paramamosain) ，简称青蟹，属广盐广温性的海水经济甲壳动物, 主要分布于我国东南沿海地区, 是粤东特别是汕头主要的海水养殖品种，具有生长快、个体大、适应性和抗病能力强、耐干露、易运输、肉味鲜美独特、营养丰富等特点, 颇受国内外生产者和消费者的青睐。近年来青蟹病害特别是病毒性病（如青蟹杆状病毒病，呼肠孤样病毒病）、细菌性病和寄生虫病等给我省乃至全国青蟹养殖业造成了严重的经济损失。如自2004年秋冬以来，广东青蟹养殖发生了前所未有的突发性病害，尤其是育肥过程中，膏蟹的死亡率在70 %以上。2005～2006年广东南水青蟹育肥死亡率在90 %以上。2006、2007年的病害仍然严重，发病情况和发病时间与前2年基本相同。4年来，仅汕头牛田洋围垦区群众青蟹养殖就减产了60％，估计每年经济损失达5000万元以上。汕头市青蟹养殖面积10万余亩；其中牛田洋围垦区3万多亩。青蟹病害发病迅速、范围广，主要爆发于每年的9-11月份。
一般认为，青蟹属甲壳类无脊椎动物，不具备特异性免疫***，其免疫以非特异性免疫为主，故运用疫苗防治青蟹病害的可靠性和广泛性目前尚存在争论。迄今为止，国内外许多学者从青蟹病原、青蟹免疫防御机制和养殖环境等多方面进行了大量的研究和探索，在青蟹病害治疗方面取得了许多进展，但是这些研究很难从根本上解决青蟹的病害问题。因此，寻找“以防为主”的生态学防治方法，被认为是解决目前青蟹养殖疾病，提高青蟹品质的一条有效途径。
使用益生菌进行青蟹的生态健康养殖，是提高青蟹免疫力，预防青蟹病害特别是细菌性病害的有效途径之一。目前已有报道的水产益生菌有乳酸菌属、双歧杆菌属、弧菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌、硝化菌、光合菌等。乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌等已作为饵料添加剂应用于水产动物，起到很好的防治疾病和增进健康的作用。为陆生生物设计的微生态制剂应用于水产养殖中，不一定能尽快成为优势菌而进行微生态调节，而且，这些微生物很容易随着时间而逐渐消亡。益生菌目前已应用在对虾、贝类及其他海洋水产养殖动物上，但是适用于虾贝的益生菌并不一定在青蟹养殖中起作用或作用效果不明显。开发针对青蟹的益生菌种，对青蟹高密度及健康生态养殖模式意义重大。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一株戊糖片球菌G11及其筛选培养与应用解决现有技术存在的问题。
为了实现上述的目的，采用如下的技术方案：
一株戊糖片球菌G11 Pediococcus pentosaceus G11，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为中国武汉大学，保藏日期为2016年5月5日，其保藏编号为CCTCCNO：M2016248，分类命名为戊糖片球菌G11 Pediococcus pentosaceus G11。
进一步的，所述戊糖片球菌G11对复方新诺明和头孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌均具有抑菌活性。所述戊糖片球菌G11对复方新诺明和头孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌均具有抑菌活性。此外戊糖片球菌G11具备一定的抗逆性、产酶能力，无血细胞溶解性，对绝大多数抗生素无耐药性，安全性高，分泌卵黄卵磷脂酶及酸性物质（有机酸），革兰氏阳性，pH耐受性高，在pH=4时仍有11.24%的活菌率。经浸浴试验验证对宿主无害，而且还能够提高机体的免疫力。
一种戊糖片球菌G11的筛选培养方法，主要包括以下步骤：
（1）菌株分离于养殖池塘的水样；
（2）采用MRS培养基稀释涂平板，28℃恒温静置培养24h；
（3）挑选单菌落，过夜摇菌液，将其加入涂布了副溶血弧菌平板上的牛津杯内，选择抑菌效果最好的菌株，并加甘油，-80℃保种。
进一步的，步骤（1）所述菌株分离于养殖池塘的水样的方法为：采样样品用灭菌生理盐水做梯度稀释涂布MRS平板， 28℃培养 2-3 d，在MRS培养基上挑选单菌落，摇菌液，采用牛津杯法，检测对副溶血弧菌抑菌效果最好的菌株，将其重新划平板，分离纯化保种。
一种戊糖片球菌G11在抑制副溶血弧菌生长中的用途。
一种戊糖片球菌G11在制备益生菌制剂中的用途。
一种益生菌制剂，含有上述的戊糖片球菌G11。
一种菌粉，采用上述戊糖片球菌G11制备的。
上述菌粉作为饲料添加剂的用途。
一种青蟹饲料，含有上述戊糖片球菌G11，所述戊糖片球菌G11活菌数为1×108 - 1×109cfu/g。
与现有技术相比，本发明提供了一株戊糖片球菌G11，该戊糖片球菌G11对复方新诺明和头孢他啶具有耐受性；所述戊糖片球菌G11对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌均具有抑菌活性。而且还能够提高机体的免疫力，其应用前景广泛，可以将其应用于益生菌制剂，也可以将其制成菌粉，作为饲料添加剂添加到饲料中，用来抑制动物体内致病菌生长，降低动物死亡率，是一株值得开发的益生菌株。
附图说明
图1为本发明菌株G11的扫描电镜照片；
图2为本发明菌株G11的***进化树；
图3为本发明菌株G11对青蟹病原菌副溶血弧菌的抑菌效果图片；
图4为G11对嗜水气单胞菌，溶藻弧菌，金黄色葡萄球菌，乙型链球菌牛津杯抑菌实验图；
图5为本发明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激时血液中ALF基因的表达情况；
图6为本发明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激时血液中LYS基因的表达情况；
图7为本发明菌株G11在青蟹副溶血弧菌刺激时血液中CAT基因的表达情况；
图8为饲料中添加本发明菌株G11接受副溶血弧菌刺激后3天内的累积成活率。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。
实施例
1、菌株的分离筛选和鉴定
菌株分离于养殖池塘的水样（该养殖池塘的青蟹生长良好，且无病害发生）。梯度稀释涂布MRS平板，在MRS培养基上挑选单菌落，摇菌液，采用牛津杯法，检测对副溶血弧菌抑菌效果最好的菌株，将其重新划平板，分离纯化保种。
为鉴定菌株采用扫描电镜观察细胞形态以及测试菌株的部分生理生化反应，扫描电镜如图1所示，初步确定该菌株为戊糖片球菌。
进一步通过16SrDNA序列分析采用的引物为通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') 和1492R(5'-TACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR，克隆并测序。NCBI网站中Blast比对发现，其中一株与Pediococcus pentosaceus DSM 20336 同源性最高（99.74%），确定为Pediococcus pentosaceus G11（以下简称G11）。其***进化树如图2所示。
2、菌株的抑菌试验
抑菌实验：将菌株MRS培养基培养，采用牛津杯法，检测对拟穴青蟹养殖的常见弧菌的抗菌效果。按照抑菌圈的大小评估其抑菌效果。从图3可以看出，G11对副溶血弧菌有抑菌效果。从图4可以看出G11对嗜水气单胞菌，溶藻弧菌，金黄色葡萄球菌，乙型链球菌均具有显著抑菌活性。
药敏性试验：所选的抗生素有：阿莫西林、青霉素、四环素、奥格门汀、恩诺沙星、万古霉素、头孢唑啉、米洛环素、多粘菌素B、头孢苄氨、新霉素、复方新诺明、氯霉素、头孢他啶、丁胺卡那霉素、头孢呋辛、麦迪霉素、氨苄西林、庆大霉素、红霉素、苯唑西林。G11只对复方新诺明和头孢他啶耐受性高，具有很高的安全性。
饲料中添加G11饲养幼蟹实验：青蟹养殖选用25±1g的幼蟹160只，将青蟹分为两类（喂养添加戊糖片球菌G11 约1×108 - 1×109cfu/g的饲料及无戊糖片球菌G11添加的饲料），每类设4组，每组20只幼蟹。分别饲喂饲料12天后，投喂添加了副溶血弧菌的饲料（浓度为1.99×1010 cfu/g；从牛田洋青蟹养殖区分离，本实验室保存）3天。
1). 利用实时荧光PCR(real time PCR)方法检测饲喂添加益生菌15天后受副溶血弧菌刺激的免疫应激情况，从图5、图6和图7中可以看出，发现处理组免疫基因抗脂多糖因子(anti-lipopolysaccharide factor Precursor, ALF, FJ013272.1) 、过氧化氢酶（catalase, CAT, FJ774660.1）、溶菌酶（lysozyme, LYS, 304441008）表达显著高于对照组。
2). 记录3天内的死亡情况。从图8中可以看出，与对照组（正常饲料组）相比，喂养添加G11的量为1×108 - 1×109cfu/g饲料的青蟹组的3天内的累积存活率显著高于对照组(比空白对照组高31.94%)。
上述结果显示，戊糖片球菌G11在拟穴青蟹的养殖中具有显著的益生效应，对青蟹养殖常见的副溶血弧菌预防效果显著，是一株值得开发的益生菌株。
以上所揭露的仅为本发明的较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 汕头大学
<120> 一株戊糖片球菌G11及其筛选与应用
<130> 2016
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1040
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gggtatggtc gggactctag agattagagt ttgatcctgg ctcaggatga acgctggcgg 60
cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact tccgttaatt gattatgacg tacttgtact 120
gattgagatt ttaacacgaa gtgagtggcg aacgggtgag taacacgtgg gtaacctgcc 180
cagaagtagg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gtataacaga gaaaaccgca 240
tggttttctt ttaaaagatg gctctgctat cacttctgga tggacccgcg gcgtattagc 300
tagttggtga ggtaaaggct caccaaggca gtgatacgta gccgacctga gagggtaatc 360
ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt 420
ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg tttcggctcg 480
taaagctctg ttgttaaaga agaacgtggg taagagtaac tgtttaccca gtgacggtat 540
ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag 600
cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg tcttttaagt ctaatgtgaa 660
agccttcggc tcaaccgaag aagtgcattg gaaactggga gacttgagtg cagaagagga 720
cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca ccagtggcga 780
aagcggctgt ctggtctgca actgacgctg agctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 840
agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg gtttccgccc 900
ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 960
actcaaaaga ttgacggggc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttatcg agctacgcga 1020
gactaccagt ctgacatctc 1040
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
taccttgtta cgactt 16

Claims (6)

1.一株戊糖片球菌G11，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：2016248。
2.根据权利要求1所述戊糖片球菌G11，其特征在于，所述戊糖片球菌G11对复方新诺明和头孢他啶具有耐受性；对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、溶藻弧菌、金黄色葡萄球菌和乙型链球菌均具有抑菌活性。
3.根据权利要求1所述戊糖片球菌G11在制备益生菌制剂中的用途。
4.一种益生菌制剂，其特征在于，所述益生菌制剂含有如权利要求1所述戊糖片球菌G11。
5.一种菌粉，其特征在于，所述菌粉是采用如权利要求1所述戊糖片球菌G11制备的。
6.一种青蟹饲料，其特征在于，所述饲料含有如权利要求1所述戊糖片球菌G11，所述戊糖片球菌G11活菌数为1×108-1×109cfu/g。
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