CN104611255A

CN104611255A - 一株高凝聚性戊糖片球菌及其在净化水体中副溶血性弧菌中的应用

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Publication number: CN104611255A
Application number: CN201410780421.0A
Authority: CN
Inventors: 杨振泉; 高璐; 饶胜其; 靳彩娟
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2014-12-17
Filing date: 2014-12-17
Publication date: 2015-05-13
Anticipated expiration: 2034-12-17
Also published as: CN104611255B

Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株从发酵豆制品中筛选出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。本发明的戊糖片球菌F28-8（Pediococcus pentosaceus），于2014年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.9956。本发明的戊糖片球菌具有高凝聚活性，可用于水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理，而避免使用化学抑菌剂和抗生素来进行水体减菌和净化处理，为养殖和暂养水体中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同时有利于预防副溶血性弧菌引起的水生动物疾病和食源性疾病的传播。

Description

一株高凝聚性戊糖片球菌及其在净化水体中副溶血性弧菌中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株从发酵豆制品中筛选出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），广泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海产品引发食物中毒的重要病原菌，也是水产动物细菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生动物弧菌病、降低水体中副溶血性弧菌载量的重要手段是使用抗生素及化学制剂，但随之导致耐药性细菌产生及抗生素残留等问题，对食品安全造成重大影响，因此亟需开发新的手段来进行水体减菌和净化处理。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理，而避免使用化学抑菌剂和抗生素来进行水体减菌和净化处理，为养殖和暂养水体中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同时有利于预防副溶血性弧菌引起的水生动物疾病和食源性疾病的传播。

本发明从发酵豆制品卤水中分离出一株戊糖片球菌F28-8（Pediococcus pentosaceus），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9956，保藏日期为2014年11月13日，菌种的分类命名为戊糖片球菌，Pediococcus pentosaceus。

本发明中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物学特性：

（1）形态特征：戊糖片球菌F28-8革兰氏染色结果为阳性，细胞呈圆球形，成对或四联排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。

（2）菌落特征：戊糖片球菌F28-8在MRS 固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。

（3）生理生化特征：过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，不发酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、***糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可从纤维二糖、七叶苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。

（4）对副溶血性弧菌具有强烈的凝聚性和抑菌性。

本发明从发酵豆制品中的戊糖片球菌中分离出戊糖片球菌分离株，通过测定其对副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，筛选出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通过电镜来观察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微观结构，测定其对水体中致病性副溶血性弧菌存活率的影响来考察其对水体中副溶血性弧菌净化效应，具体包括以下步骤：

（1）菌株复苏培养戊糖片球菌F28-8接种5 mL MRS液体培养基，tdh基因阳性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接种 LBS液体培养基，备用。

（2）抑菌能力测定用琼脂孔扩散法，通过测定戊糖片球菌菌株无细胞提取液对副溶血性弧菌在LBS固体平板上的抑菌圈的大小来检测其抑菌能力。

（3）共凝聚能力测定调节戊糖片球菌的菌悬液的浓度，将调好浓度的戊糖片球菌悬液与相应的副溶血性弧菌菌悬液各取混合，测定吸光值，记作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液作为对照，按照以下公式：{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100来计算细菌共凝聚率，其中Ap和Av分别为戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌悬液在600 nm处测所测的A值。

（4）凝聚细胞的电镜观察吸取自凝聚2 h的未混合戊糖片球菌的菌悬液样品进行扫描电镜，吸取共凝聚2 h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌悬液样品进行扫描电镜，分别观察细胞的结构和凝聚特征。

（5）凝聚过程中副溶血性弧菌存活细胞测定将戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌悬液在37℃混合静置培养2 h、12h、24h、60h、96h后，分别吸取样品中上层和下层溶液通过选择性TCBS琼脂平板测定体系中的细菌浓度。

本发明的有益效果是：

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），是乳酸菌中的一个种，广泛分布于蔬菜、干酪、香肠等传统发酵食品中，是公认的具有安全性的微生物。该菌代谢糖类产生乳酸，并产生IIa类片球菌素，对病原菌及腐败微生物产生强烈的抑制效应，其中一些菌株具有提高动物天然免疫能力、促进健康以及抵抗病原菌的侵袭等益生特性，以戊糖片球菌及其代谢产物研发新型抑菌剂和微生态制剂对食品和环境中弧菌净化控制以及弧菌病的生物防治具有潜在价值和广阔前景。

本发明的戊糖片球菌F28-8对致病性副溶血性弧菌具有较强的抑菌性能、共凝聚能力，其抑菌活性对氧化氢酶、蛋白酶以及高温条件均不敏感，因此可应用范围广。电镜显示该菌具有独特的细胞表面结构和细胞粘聚方式，易于自凝聚形成大的团簇，并与副溶血性弧菌形成紧密的共凝聚物，从而对水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理。水体中的副溶血性弧菌经戊糖片球菌F28-8的共凝聚作用后，上层悬液和凝聚物中的可培养细胞均显著减少。

附图说明

图1：不同凝聚性的戊糖片球菌细胞的扫描电镜结果。

图2：戊糖片球菌共凝聚对水体中副溶血性弧菌可培养细胞数的影响。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明实施例所用培养基和试验条件为本领域常规培养基和试验。除非特别说明，本发明实施例所用试剂均为市购。

实施例1菌株复苏培养

将戊糖片球菌保种液于0℃解冻，无菌吸取200 μL保种液接种于10 mL的 MRS液体培养基中，在37℃厌氧条件下培养24 h，取培养物划线接种于MRS固体平板上，在37℃厌氧培养24 h，然后挑取单菌落接种于5 mL 的MRS液体培养基，在37℃厌氧条件下培养24 h，备用。

将tdh基因阳性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接种于LBS液体培养基，在37℃振荡培养16 h；取培养物划线于TCBS平板，在37℃培养20 h，挑取单菌落接种5 mL LBS液体培养基，在37℃恒温振荡条件下培养12 h，备用。

实施例2 抑菌能力测定

戊糖片球菌F28-8、Y27-4 、Y45-30、H13,、H6、H10和F3的抑菌能力对比测定：

在70℃、100℃、121℃不同温度下分别将戊糖片球菌培养物12000g离心15 min，取上清液，通过0.22 μm的微孔滤膜除菌，获得戊糖片球菌培养物无细胞提取液。使用琼脂孔扩散法对菌株无细胞提取液的抑菌能力进行测定：用无菌生理盐水将副溶血性弧菌的菌悬液稀释到10⁸ CFU /mL，移取1 mL菌悬液于LBS固体平板中，涂布均匀，于超净工作台中晾干15 min，用打孔器在平板中均匀打直径为10 mm的小孔，每孔加入200μL戊糖片球菌培养物无细胞提取液和用9 mg /mL过氧化氢酶、1 mg /mL蛋白酶K和1 mg /mL胰蛋白酶处理。将三个不同条件70℃、100℃、121℃下处理的菌株分别各做3孔平行，室温扩散5 h，然后放置于37℃下培养过夜，用游标卡尺进行测量并记录抑菌圈直径。将MRS液体培养基用乳酸调节pH到与作为对照的受试菌株无细胞提取液的pH相同，并比较不同处理组的抑菌效果。

本研究试验中的7株戊糖片球菌的代谢产物对致病性副溶血性弧菌ATCC33847都显示了强烈的抑制效应，抑菌圈直径在21.0 mm至25.5mm之间，是同pH乳酸对照的1.1至1.3倍，其中F28-8具有最强的抑菌作用。培养上清经过氧化氢酶、胰蛋白酶、蛋白酶K以及加热处理后抑菌效果有不同程度的降低，但残留抑菌效果仍在75-96%之间，结果表明戊糖片球菌F28-8代谢产生的有机酸是对副溶血性弧菌生长抑制作用的主要因素，过氧化氢产生以及细菌素等蛋白质类抑菌成分作用相对较小。

实施例3 共凝聚能力测定

戊糖片球菌F28-8、Y27-4 、Y45-30、H13,、H6、H10和F3的共凝聚能力对比测定：

将戊糖片球菌菌株培养物5000g离心10 min，收集菌体，用生理盐水洗涤两次，用生理盐水调整受试菌株悬液浓度，使其在600 nm波长下吸光值约为0.4，即A600=0.4。将调好浓度的戊糖片球菌悬液与相应的副溶血性弧菌菌悬液各取2 mL混合于15 mL带刻度的试管中，涡旋120s，37℃静置2 h，吸取1 mL上层溶液于600 nm下测定吸光值，记作Amix，每个混合液平行做3管重复，以不加戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液作为对照，计算细菌共凝聚率。细菌共凝聚率按照以下公式：{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100计算，其中Ap和Av分别为戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌悬液在600 nm处测所测的A值。

试验结果表明戊糖片球菌具有明显促进致病性副溶血性弧菌聚集的能力，但共凝聚能力具有显著的菌株差异性。不同戊糖片球菌与副溶血性弧菌 ATCC33847的共凝聚率在14.8-37.6%之间，共凝聚率大小顺序为：F28-8, Y27-4 > Y45-30>H13, H6，H10> F3，所有菌株均显著高于不加戊糖片球菌的对照组（P<0.01），其中F28-8和Y27-4共凝聚率最高，分别为37.5%和36.9% 显著高于其它菌株（P<0.01），从而为水体中副溶血性弧菌的净化和减菌化处理提供了候选菌株。

实施例4 凝聚细胞的电镜观察

戊糖片球菌菌株F28-8和H13对副溶血性弧菌ATCC33847的共凝聚作用对比测定：

吸取自凝聚2 h的未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液样品进行扫描电镜，吸取共凝聚2 h的戊糖片球菌F28-8或H13和副溶血性弧菌的混合菌悬液样品进行扫描电镜，分别观察细胞的结构和凝聚特征，步骤如下：吸取自凝聚或共凝聚菌悬液样品的下层溶液1mL，加入等体积5%的戊二醛溶液固定过夜；双蒸水洗涤3次，每次15min；用50%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水；乙酸乙酯和无水乙醇等比例混合作用30 min，离心弃上清;乙酸乙酯作用30 min，离心弃上清；沉淀重悬于乙酸乙酯溶液中，样品加入点样盘中，烘干；镀膜，上镜观察。

试验结果如附图1所示，高凝聚性菌株F28-8的菌体细胞牢牢地黏结在一起，易于形成大的菌团，见附图1（A），而低凝聚性菌株H13细胞比较分散，只有少量细胞黏着在一块，见附图1（B），视野中大的菌团较为少见。在细胞聚集方式上，H13细胞表面比较光滑，无突起结构，细胞间主要通过四连体或者二联体四端连接，容易形成链状或片状，而F28-8细胞表面更为粗糙，附着有突起结构，细胞聚集不仅通过四端黏结，而且通过侧面叠加连结，形成大的立体团簇，见附图1（C）、（D）。菌株F28-8和H13对副溶血性弧菌ATCC33847的共凝聚物扫描结果见附图1（E）、（F）。在共凝聚物中，F28-8使ATCC33847紧密地堆积在一起，形成的凝集物紧密结实，见附图1（E），而H13凝聚ATCC33847细胞则比较松散，见附图1（F），易于重新悬浮。结果表明戊糖片球菌对副溶血性弧菌的共凝聚能力与菌株的表面结构及细胞凝聚的紧密程度有关。前期报道认为不同种属乳酸菌对致病菌促凝聚作用可能与细胞表面的多糖和蛋白有关，但对种内菌株间促凝聚能力的差异机制目前尚不明确，本研究通过对比戊糖片球菌高凝聚性菌株与低凝聚性菌株细胞形态，表明菌株表面微观结构及粘聚方式多样性可能导致促凝聚能力差异性。

实施例5 凝聚过程中副溶血性弧菌存活细胞测定

戊糖片球菌菌株F28-8和H13凝聚过程中副溶血性弧菌存活细胞对比测定：

按照乳酸菌与致病菌共凝聚测定方法制备起始浓度为戊糖片球菌悬液9.1Log₁₀CFU/mL及副溶血性弧菌5.5 Log₁₀CFU/mL的戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌悬液，以不加戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液作为对照，戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌悬液在37℃静置2 h、12h、24h、60h、96h后，分别吸取样品中上层和下层溶液各1 mL，用无菌生理盐水10倍稀释后涂布TCBS平板，每个稀释度取200 μL涂布3个平板，将TCBS平板于37℃培养24 h。培养结束后选择菌落数在30-300之间的稀释度，用3个平板上菌落数的平均值计算体系中细菌浓度。

试验结果如附图2所示，对照组中的可培养细胞数随放置时间的延长缓慢下降，而经过菌株F28-8和H13共凝聚处理均显著加剧了体系中可培养细胞数的下降，见附图2，附图2（A）、（B）分别为起始浓度为9.1 Log₁₀CFU mL^-1的副溶血性弧菌共凝聚后上层悬液和下层凝聚物中可培养细胞数的变化；附图2（C）、（D）分别为起始浓度为5.5 Log₁₀CFU mL^-1的副溶血性弧菌上层悬液和下层凝聚物可培养细胞数的变化；图中数据点为3次重复的结果，表示为平均值±标准差。

起始浓度为9.1 Log₁₀CFU mL^-1的副溶血性弧菌菌悬液经F28-8凝聚作用2 h，上层悬液中的可培养细胞比对照组低1.8 Log₁₀CFU mL^-1，在24 h低于对照组2.7 Log₁₀CFU mL^-1，在作用60 h下降最多，低于对照3.1 Log₁₀CFU mL^-1；而低凝聚菌株H13作用2 h, 24 h, 和60 h后分别低于对照组0.9，2.0和2.5 Log₁₀CFU mL^-1，减菌效果显著低于F28-8（P<0.05），但在96 h后F28-8和H13的减菌效果没有显著差异（P>0.05），均低于对照2.6 Log₁₀CFU mL^-1，见附图2（A）。起始浓度为5.5 Log₁₀CFU mL^-1的的副溶血性弧菌菌悬液经过戊糖片球菌处理也导致了可培养细胞的显著减少，下降趋势与高浓度悬液一致，但减菌效果较弱，在作用24h后F28-8处理组比对照组降低了1.3 Log₁₀CFU mL^-1，而H13处理降低了0.8 Log₁₀CFU mL^-1，见附图2（C）。对下层悬液中（包含凝集物）副溶血性弧菌的分析结果显示凝集物中的残存细胞数也显著低于对照组，高浓度悬液在12 h后显著低于对照，见附图2（B）；而低浓度悬液在60 h后显著低于对照组，见附图2（D）。

结果表明在共凝聚体系中戊糖片球菌不仅能够通过共凝聚作用使悬浮在水体中的副溶血性弧菌细胞粘结在一起形成大的絮凝体通过沉降而去除，而且在絮凝体中戊糖片球菌也能够产生抑菌物质导致副溶血性弧菌失活，达到水体中副溶血性弧菌的减菌效果。尽管乳酸菌在培养基中形成的代谢产物的抑菌和杀菌作用在前期研究中已有报道，但水环境中由于营养物的限制，乳酸菌产生的代谢产物种类和数量有限，凝集物的形成有利于乳酸菌产生的抑菌物质近距离发挥作用，戊糖片球菌通过共凝聚作用缩小细胞间的作用距离可能是水体环境中发挥杀菌作用的重要途径。

Claims

1.一株戊糖片球菌F28-8（Pediococcus pentosaceus），于2014年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9956。

2.权利要求1所述菌株在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。