CN117757658A - 一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株戊糖片球菌JS35及其应用，本发明的菌株具有优异的耐酸性、耐热性、耐醇性、耐胆酸性能。本发明利用戊糖片球菌JS35发酵桑叶粉，桑叶粉的总还原力提高50.7%，羟基自由基清除能力是未发酵桑叶的3.26倍，DPPH自由基的清除能力提高28.7%，总酚含量提高44.1%，γ‑氨基丁酸含量是未发酵桑叶粉的18.77倍。本发明利用戊糖片球菌发酵获得的产品的乳酸含量分别可增加6.5%和17.6%，γ‑氨基丁酸含量可增加46.8%和218.7%，总抗氧化能力分别提高10.3%和34.8%。利用高脂线虫模型，添食上述添加JS35菌的米醋，发现该产品具有极显著的降脂和抗衰老作用。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其运用。
背景技术
随着国民生活水平的提高和生活方式的改变，肥胖、高血糖、高血压等慢性代谢疾病的发病率增加，膳食功能因子对慢性代谢性疾病的积极调控作用引起了广泛关注。微生物发酵是有效增加膳食中功能因子的方法，其中乳酸菌是广泛使用的发酵菌株，其发酵过程不仅可以改善食品原料的加工特性、定向转化原料中的活性成分，还带来其自身代谢所产生的特定功能成分。近年来，乳酸菌发酵带来的健康效益受到越来越多的关注，同时具有优良发酵特性的乳酸菌是宝贵的菌种资源，其挖掘、保藏及开发利用是一个长期性的工作。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)隶属链球菌科片球菌属，兼性厌氧，革兰氏阳性菌，能发酵葡萄糖产生乳酸，具有抑制致病菌的生长繁殖、增强免疫力等益生作用，是公认的安全菌。2014年，***第6号公告显示戊糖片球菌被列为新食品原料。中国发明专利CN202310222999公开了一株产乳酸能力较强的戊糖片球菌及其应用，菌株分离筛选自自然保护区中华蟾蜍肠道，产乳酸能力强、抗氧化能力强、能产多种短链脂肪酸，具有较好的体外降血糖、降胆固醇能力。但是，该专利实施例中菌株发酵、发酵液的制备都是在MRS培养基中获得，未提及菌株对食品原料、饲料原料的发酵能力及产物特性。中国发明专利CN202010064690.2公开了一株具有高黏附能力及降血脂功效的戊糖片球菌PP04的制作方法，戊糖片球菌PP04对Caco2细胞的黏附率为79.06％，制备的发酵豆乳具有降血脂的功能。该发明专利强调了菌株对Caco2细胞的黏附率及其益生作用，其运用于制备降血脂豆乳，是该菌株和嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌混合发酵的作用，不能体现戊糖片球菌PPO4的独特性。中国发明专利CN202210958970公开了一株戊糖片球菌及其在南酸枣乳酸菌饮料发酵中的应用，该菌株用于南酸枣饮料低温发酵环境中，经过该菌株发酵后的南酸枣饮料增加了黄酮、总酚含量以及抗氧化活性。该专利保护的菌株及其运用场景是特定的，仅限于南酸枣乳酸菌饮料发酵。
因此，目前尚未有相关研究关于来源于家蚕中的戊糖片球菌，更没有关于该菌株对于桑叶粉的深加工中的应用，更未有其关于降解植酸增加γ-氨基丁酸、增强抗氧化性、改善风味方面的研究。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株具有耐酸、耐高温、耐醇和耐胆酸盐特性的来源于家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用。该菌株能发酵降解植酸、生成γ-氨基丁酸、增强原料的抗氧化性，菌株及其发酵液、发酵产品，具有降低甘油三酯沉积及抗衰老的作用，可运用于饲料、食品工业。
技术方案：本发明提供了一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌，其分类命名为戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年7月28日，保藏编号为CGMCC No.28048。
本发明内容还包括含有所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的发酵液或其发酵液的上清液。
本发明内容还包括所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的发酵液或其发酵液的上清液的制备方法，包括如下步骤：将戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JS35先接种于固体MRS培养基中进行厌氧培养，并接种于MRS液体培养基得到一级种子液，再接种于任意适合乳酸菌培养的液体培养基中发酵，发酵温度25-42℃，发酵时间12-20h的二级种子液即为发酵液；然后将二级种子液发酵12-72h过滤得上清液。
其中，所述MRS液体培养基包含0-2％谷氨酸钠，所述任意适合乳酸菌培养的液体培养基包含0-5％桑叶粉悬浊液。
本发明内容还包括一种制剂，所述制剂包含所述戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)JS35或其发酵液或其发酵液的上清液或其发酵液离心得到的菌泥。
本发明内容还包括一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的冻干菌粉，所述冻干菌粉包括所述的发酵液离心得到的菌泥。
本发明内容还包括一种戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的冻干菌粉的制备方法，包括以下步骤：将所述的发酵液离心保留沉淀，用生理盐水洗后再离心，菌泥进行真空冷冻干燥，得到冻干菌粉。
本发明内容还包括所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35、所述发酵液或其发酵液的上清液、所述的制剂或所述的冻干菌粉在以下(1)～(3)至少一项中的应用：
(1)制备降低甘油三酯的药品或保健品；
(2)制备动物饲料或饲料添加剂；
(3)制备食品或食品添加剂。
其中，所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的接种量为2～5％(种子液菌落数107～109CFU/mL)。
有益效果：与现有技术相比，本发明具备以下优点：
1、本发明自主获得了戊糖片球菌JS35，来自家蚕肠道，具有耐酸、耐热、耐醇、耐胆酸盐等特性，尤其是耐酸性和耐胆酸盐特性远远优于已报道的戊糖片球菌，在pH2.5条件下处理6h，存活率为94.67％；在0.3％胆盐浓度处理24h条件下，存活率为99.40％。
2、本发明利用戊糖片球菌JS35发酵桑叶粉，桑叶粉的总还原力可提高50.7％，羟基自由基清除能力是未发酵桑叶的3.26倍，DPPH自由基的清除能力提高28.7％，总酚含量提高44.1％，γ-氨基丁酸含量是未发酵桑叶粉的18.77倍。发酵桑叶粉的风味得到极大改善，产生了花香、果香等宜人的香气成分如苯甲醇、苯乙醇、金合欢醇等，并降低了桑叶粉中草青气的主要成分香叶基丙酮的相对含量。
3、本发明利用戊糖片球菌进行混菌发酵提高米醋的功能性成分、抗氧化能力和体内降脂作用。分别在醋酸发酵、封醅固体发酵过程添加戊糖片球菌JS35，获得产品的乳酸含量分别增加6.5％和17.6％，γ-氨基丁酸含量分别增加46.8％和218.7％，总抗氧化能力分别提高10.3％和34.8％。利用高脂线虫模型，添食上述JS35菌共发酵的米醋，发现该米醋具有极显著的降脂和抗衰老作用。
附图说明
图1戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的16S rDNA PCR扩增产物电泳图谱
图2不同菌株的产GABA能力；
图3戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35的16S rDNA分子鉴定及***发育树的构建；
图4戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35发酵桑叶粉的活性成分含量；
图5戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35发酵桑叶粉提取物的抗氧化活性；
图6实施例2的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35发酵桑叶粉的风味变化；
图7戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35共发酵制备米醋的乳酸和GABA含量变化；
图8戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35共发酵制备米醋的抗氧化性变化；
图9戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35共发酵制备米醋对高脂线虫脂质沉积的影响；
图10戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)JS35共发酵制备米醋对高脂线虫寿命的影响。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1菌株的筛选和鉴定
1)菌株的筛选：取新鲜蚕沙、家蚕中后部肠道内容物，在超净台中用无菌研钵稍加研磨后，加入到MRS液体培养基(胰蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母膏5g、柠檬酸氢二钠0.2g、葡萄糖2g、吐温80 0.1mL、乙酸钠0.5g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g)，于30℃培养24h。取1mL富集后菌液于9mL 0.85％生理盐水试管中进行梯度稀释，之后均匀涂布于含有1％ CaCO3的MRS平板上(胰蛋白胨1g、牛肉膏1g、酵母膏5g、柠檬酸氢二钠0.2g、葡萄糖2g、吐温80 0.1mL、乙酸钠0.5g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.058g、硫酸锰0.025g、1.5g琼脂粉)，37℃厌氧培养48h。根据乳酸菌形态特征、溶钙圈的大小挑取乳酸菌单菌落进行革兰氏染色和接触酶试验，取革兰氏阳性和接触酶阴性的菌株进一步划线纯化后，转接至斜面并编号，37℃厌氧培养48h，置于4℃保存，备用。
2)菌株的鉴定：将分离纯化后的菌种于MRS固体培养基上划线，37℃培养24-48h。观察菌落大小、形状、颜色以及边缘***状况，挑取单个菌落进行革兰氏染色，然后在显微镜下(100×10)观察菌体颜色形态。过氧化氢酶试验：从固体平板上挑取适量单菌落菌体，均匀涂于干净载玻片，滴加3％的过氧化氢溶液，观察气泡产生情况。需氧试验：将分离纯化后的菌株接种于MRS液体培养基，30℃静置培养18h后，观察生长情况。基因组DNA的提取：取30℃条件下活化16h的菌液1mL，12000rpm，离心2min，倒掉上清。加入560μL TE重悬菌体，加入20mg/mL蛋白酶K10μL，10％ SDS缓冲液30μL，37℃水浴1h。然后加入0.6mL酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)进行抽提，4℃，12000rpm，离心5min。取上清液加入0.6倍体积的异丙醇，-20℃放置10min。取出后4℃，12000rpm，离心5min，弃上清。加入1mL 70％乙醇，4℃，12000rpm，离心10min，弃上清。室温放置5min使乙醇挥发尽，加入20μL TE缓冲液，-20℃冰箱保存。分子生物学鉴定：菌株16SrDNA基因测序。引物片段：
正向引物27F(5’-AGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)
反向引物1492R(5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)
PCR反应体系(25μL)：
PCR扩增反应条件(30个循环)：
琼脂糖凝胶电泳验证样品条带，在UVI凝胶图像分析仪下观察结果如图1所示。
测序结果显示16SrDNA序列长度为1236bp，序列如下所示：
GGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAGAGAAGAACATGGGTAGTTAGTAACTGTATCGTCCAGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTCTTTTAAGTCTAATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGATTACTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGTAATCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAAGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGACAGCTCTAAGAGATTAAAGGTTCCCTTCGGGGACAGAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTCGCGAGACCGCGAGGTTAAGCTAATCTCTTAAAACCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAG
同源性分析和***发育树的构建：在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上用BLAST比对菌株的16S rDNA基因序列，与数据库中已知基因序列比对并找到同源性最高的菌种，最后利用MEGA 6.0程序进行同源性分析并构建***发育树。结果如图1所示，该序列与已知的戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)同源性达99％，推测该菌株为戊糖片球菌。
3)菌株的特性测定：菌株的产γ-氨基丁酸能力，将上述分离筛选得到的菌株接入MRS液体培养基中，放入30℃的培养箱中培养24h，然后按2％(v/v)的接种量接入含1％谷氨酸钠的MRS液体培养基中进行发酵试验，30℃培养发酵48h，检测发酵液中GABA含量，产量＞1mg/mL的各菌株如图2所示，其中JS35菌株的产GABA能力显著高于其它菌株。菌株耐热性鉴定，取对数期菌液(OD600≈0.5)并在56℃和60℃设定温度下水浴5min，随后立即冰浴5min，根据平板计数法测定活菌数，计算菌株Δlog值和存活率。菌株耐酸性鉴定，将对数期菌液8000rpm离心10min，菌泥用无菌PBS缓冲液洗涤两次，等体积重悬于pH 2.0、2.5和3.0的MRS液体培养基。30℃分别培养3h和6h。根据平板计数法测定活菌数，计算存活率。菌株耐胆盐鉴定，将对数期菌液离心并用无菌PBS缓冲液洗涤两次，将菌泥重悬于等体积含有0.0％和0.3％(w/v)的胆盐MRS液体培养基(pH 7.0)，30℃培养24h。根据平板活菌数计数法测定活菌数，计算菌株存活率。耐乙醇特性测定，将对数期菌液8000rpm离心10min，菌泥用无菌PBS缓冲液洗涤两次，等体积重悬于4％、6％和8％乙醇的MRS液体培养基。30℃分别培养3h和6h。根据平板计数法测定活菌数，计算存活率。具体结果如表1。戊糖片球菌JS35具有较好的耐热性，56℃条件下5min，其存活率仍超过99％；在pH3.0条件下6h，其存活率100％，pH 2.5的条件下6h仍能存活94.67％。同时，菌株JS35具有较强的耐胆酸盐能力，0.3％胆酸盐处理24h存活力99.40％，具有益生潜力；较好的耐乙醇能力，8％乙醇溶液6h测得存活率为53.72％。
表1戊糖片球菌JS35耐受特性
注：数据以平均数±标准差表示，同列不同字母表示差异显著(p<0.05)
将本发明筛选的表1性能最佳的菌株JS35，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏编号为CGMCC No.28048，保藏日期为2023年7月28日，保藏地址为中国北京。
实施例2戊糖片球菌JS35发酵桑叶粉
1、将新鲜桑叶清洗，去梗，剪碎，加少量清水匀浆后，-20℃冷冻后经冷冻干燥，打粉，过60目筛，获得桑叶粉。高压灭菌(121℃，20min)，备用；
2、将平板保存的戊糖片球菌JS35(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28048)活化，利用液体MRS培养基制备一级种子液，OD600达到0.6。桑叶发酵基质组成为：77.5％蒸馏水，20％桑叶粉，1％葡萄糖，1.5％谷氨酸钠，一级种子液的接种量为2％，37℃发酵48h。取出冻干得到发酵桑叶粉。
3、对得到的发酵桑叶粉进行总酚、总黄酮、γ-氨基丁酸含量的测定、抗氧化活性分析。
总酚含量测定：取1g样品加入40mL 70％乙醇溶液，在60℃提取1h，8000rpm，离心10min，收集上清液。沉淀中再加入40mL 70％乙醇溶液，在60℃下提取1h。两轮提取后,合并上清液，得到醇提物。将1mL提取物加入1mL Folin-Ciocalteu试剂和2mL 10％Na2CO3溶液，并用蒸馏水稀释至10mL。40℃水浴1h，测定760nm处吸光度，不同浓度没食子酸(0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/mL)制作标准曲线。
总黄酮的测定：将2mL提取物加入0.3mL 5％ NaNO2，摇匀后静置6min，加入0.3mL10％AlCI3溶液，摇匀后静置6min。再加入2mL的40mg/mL NaOH溶液。摇匀后用40％乙醇溶液定容至10mL。静置10min后测定510nm处的吸光度，不同浓度芦丁(0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mg/mL)制作标准曲线。
γ-氨基丁酸含量的测定：取1g样品加入40mL蒸馏水溶液，在60℃提取1h，8000rpm，离心10min，收集上清液。沉淀中再加入40mL 70％乙醇溶液，在60℃下提取1h。两轮提取后，合并上清液，得到水提物。取1.0mL水提物加入1.0mL 0.1mol/L四硼酸钠溶液、1.2mL 6％重蒸酚溶液和0.6mL 7％次氯酸钠溶液。剧烈振荡后，沸水浴10min，立即冰浴5min，待蓝绿色出现后加入2mL 60％乙醇。混匀后于640nm波长下测定吸光度，不同浓度GABA制作标准曲线。
植酸含量的测定：将1g发酵桑叶粉加入20mL10％ Na2SO4溶液中(含1.2％ HCl)，在室温下搅拌浸提2h。4000rpm，离心10分钟得上清液。将2mL提取物加入2mL 15％三氯乙酸中，混匀后在4℃下静置2h。将提取混合物以4000rpm离心10分钟。取2mL上清液，用0.75mol/L NaOH溶液调pH至6.0-6.5，并用蒸馏水稀释至30mL，混匀。将3mL稀释液与1mL 0.3％磺基水杨酸-0.03％ FeCl3的混合试剂，混匀后测定500nm处的吸光度，不同浓度植酸制作标准曲线。
DPPH清除率的测定：精确称取DPPH粉末用甲醇配制成0.16mg/mL的溶液，避光保存。按梯度稀释样品。取0.2mL样品提取液加入0.8mL甲醇，混匀，再加入1mL DPPH溶液，混合均匀，室温避光反应30min后，在517nm处测定吸光值，作为样品组(A517)；1mL DPPH溶液加入1mL甲醇作为对照组(Amax)；以0.2mL相同质量浓度的样品和1.8mL甲醇作为空白组(A0)。计算如公式：
羟基自由基清除实验：按梯度稀释样品(提取液)。在1.5mL离心管中依次加入300μL9mmol/L硫酸亚铁溶液，300μL 9mmol/L水杨酸乙醇溶液后，分别加入100μL样品溶液，然后加入300μL体积分数0.1％的过氧化氢溶液，混匀后37℃水浴30min，7000r/min离心3min，在510nm处测定吸光度值(A510)；以蒸馏水代替样品溶液作为对照组(Amax)；以蒸馏水代替H2O2作为空白组(A0)。计算如公式：
还原能力测定：将样品溶液100μL分别加入到1mL磷酸盐缓冲液(200mM，pH6.6)和1mL1％铁***溶液中，50℃水浴20min。加入1mL10％三氯乙酸，3000rpm，离心10min。取1mL上清液加入1mL蒸馏水和0.2mL 0.1％ FeCl3，室温反应10min，测定700nm处吸光度(A700)。
对比例1：
未发酵的桑叶(桑叶来自于桑品种育711，于10月至11月采集自江苏省镇江市国家桑树种质资源中心，自然干燥后用便携式高速破碎机粉碎，粉末分别通过40–100目筛，获得不同目数的桑叶粉，备用。)市售家用发酵乳酸菌剂(陕西正禾药业生物工程有限公司，戊糖片球菌100亿/g冻干粉菌剂)，采用与实施例2相同的方法测定总酚、总黄酮、γ-氨基丁酸含量的测定、抗氧化活性分析。
实施例3
1、将新鲜桑叶清洗，去梗，剪碎，自然晾晒干燥，打粉，过60目筛，获得桑叶粉。高压灭菌(121℃，20min)，备用；
2、将平板保存戊糖片球菌JS35(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28048)活化，利用液体MRS培养基制备一级种子液，OD600达到0.2。桑叶发酵基质组成为：60％蒸馏水，37.5％桑叶粉，1％葡萄糖，1.5％谷氨酸钠，一级种子液的接菌量为5％，30℃发酵96h。取出冻干得到发酵桑叶粉。
3、对得到的发酵桑叶粉进行总酚、总黄酮、γ-氨基丁酸含量的测定、抗氧化活性分析。测定方法同实施例2。
由图4可见，市售乳酸菌剂(陕西正禾药业生物工程有限公司，戊糖片球菌)和戊糖片球菌JS35均能提高桑叶粉总酚以及降低植酸含量，但是菌株JS35的作用更显著，实施例2样品可提高桑叶粉总酚44.1％，实施例3的样品可提高桑叶粉总酚33.5％，另外可以极显著提高GABA含量，实施例2样品GABA含量是未发酵桑叶粉样品的18.77倍，实施例3的GABA含量是未发酵桑叶的17.38倍。比较市售戊糖片球菌和JS35菌株发酵对桑叶粉的抗氧化能力的影响，由图5可见发酵样品的DPPH清除率、羟自由基清除率和总还原力均有显著提高，JS35菌株发酵样品的抗氧化能力优于市售菌剂发酵样品。实施例2发酵桑叶粉的总还原力提高50.7％，羟基自由基清除能力是未发酵桑叶的3.26倍，DPPH自由基的清除能力提高28.7％；实施例3发酵桑叶粉的总还原力则提高43.7％，羟自由基的清除能力是未发酵桑叶的3.24倍，DPPH自由基的清除能力提高25.9％。经过乳酸菌发酵，桑叶粉本身的草青味得到明显改善(见图6)。经气相色谱/质谱分析，实施例2制备的JS35发酵桑叶粉产生了具有甜香气味的苯甲醇、具有玫瑰香气的苯乙醇、具有水果香气的异匙叶桉油烯醇、具有花香气味的金合欢醇，同时降低了草青味主要贡献成分香叶基丙酮的含量。
实施例4
1、将平板保存戊糖片球菌JS35(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28048)活化，利用液体MRS培养基制备一级种子液，OD600达到0.6。准备液体发酵基质：96％蒸馏水，2％桑叶粉，1％葡萄糖，1％谷氨酸钠，并分别调节起始pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，灭菌待用。接入一级种子液菌量为2％，30℃发酵48h，测定OD600值，5000r/min离心5min，收集上清液，冷冻干燥，得上清液冻干粉。
2、以对比例1的市售乳酸菌粉为对照，菌粉按1g/1000mL比例直投式添加，不同pH条件下30℃发酵48h，测定OD600值，5000r/min离心5min，收集上清液，冷冻干燥，得上清液冻干粉。
3、对得到的上清液冻干粉按1∶100与蒸馏水复溶，进行GABA含量测定、羟自由基清除能力测定，测定方法同实施例2。
测定结果如表2所示。市售戊糖片球菌剂和本发明涉及JS35菌株相比，在pH3.0、4.0生长条件下生长状态相对较差，发酵48h后上清液的菌液浊度分别为0.25、0.43，而相同条件下JS35菌株的发酵液OD600分别为0.55、0.59。同时，上清液中功能成分含量检测显示，市售菌剂在上述发酵体系中没有较好的产GABA能力，而JS35可以利用上述体系在不同pH条件下均能较好地转化产出GABA。
由此可见，戊糖片球菌JS35可以用作一些低pH环境下的发酵菌株。
表2不同pH条件下JS35发酵上清液性能比较
实施例5
1、米醋制备基本实验步骤为：浸米、蒸饭、搭窝、冲缸、酒精发酵、投料(麸皮)醋酸发酵、封醅、煎醋；
2、具体操作：将平板保存戊糖片球菌JS35(实验室自主筛选，目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28048)活化，利用液体MRS液体发酵16h。发酵液离心，收集沉淀，生理盐水清洗沉淀，菌泥待用。糯米浸米15h。蒸饭30min，自然冷却至30℃左右时淋饭，然后加糖化酶水溶液(55℃，20U/g)，加0.8％黄酒曲，搅拌均匀打散，搭窝。在糯米饭中间掏出一个饭窝，搭成一个“喇叭口”，直接可见缸底，不让米粒落在窝底，盖上有孔的盖子，进行糖化发酵。当米酒的量与糯米饭的表面持平时冲缸，辅以搅拌。然后搅拌均匀后，接入0.2％戊糖片球菌JS35菌泥(g/g米)，轻轻搅动，盖上盖子，酒精发酵5d。按米重∶麸皮＝1∶1.7，米重∶醋酸菌剂＝1∶1.2，搅拌均匀，醋酸发酵9d。封醅20d。淋醋，煎醋。
3、对所得米醋进行乳酸含量测定、γ-氨基丁酸含量的测定、总抗氧化活性测定、高脂线虫模型评价米醋的抗衰老作用。
乳酸含量测定：采用高效液相色谱法测定发酵液中的乳酸含量。取煎煮过的醋液，4000×g离心10min，用0.22μm滤器过膜后备用。色谱柱：InertSustain C18；检测器：紫外检测器；流动相：4％甲醇和96％0.05mmol/L磷酸二氢钾(磷酸调pH为2.9)；流速：0.6mL/min；检测波长：210nm；柱温：27℃；进样量：10μL。
γ-氨基丁酸含量的测定：将样品10000r/min离心10min后，按照样品：NaHCO3为1：20的体积比混合，取混合液0.5mL，加入0.3mL的FDBN，密封摇匀，60℃水浴暗反应1h后，拿出冷却至室温，再加入0.5mL pH7.0的KH2PO4缓冲液，黑暗中放置15min，过0.22μm有机滤膜待用。采用Agilent Eclipse Plus-C18色谱柱(4.6mm×250mm)；柱温35℃，波长360nm，进样量5μL，流速1mL/min。流动相A为0.05mol/L的醋酸钠缓冲溶液(pH 5.7，体积分数2％冰醋酸调pH值，按照醋酸钠缓冲液：四氢呋喃＝95：5加入四氢呋喃)，流动相B为80％乙腈：0min到7min，A从82％至75％；14min，A至73％；17min，A至0％；20min，A至82％。
总抗氧化活力的测定步骤为：按照南京建成生物工程研究所总抗氧化能力检测试剂盒说明书进行操作。定义：在37℃时，每分钟每毫升样品使反应体系的吸光度(OD)值每增加0.01时，为一个抗氧化单位。计算公式：总抗氧化能力＝(A1-A2)/0.01/30×反应液总量/取液量×样品稀释倍数。
高脂线虫模型的建立及实验设计：配制含有10mg/mL胆固醇的NGM固体培养基，将同步化后的L1期幼虫转移至培养基上，48h后测定其甘油三酯含量，根据甘油三酯含量判定线虫高脂模型是否成功。线虫实验分组：正常组、高脂模型组、不同浓度处理组，将不同稀释度醋液与大肠杆菌OP50菌液以1：1比例(100μL，V/V)混合，涂布于含胆固醇的NGM培养基上，37℃烘干，置于4℃保存，正常组和模型组均用灭菌蒸馏水代替醋液即可。将同步化培养48h后的线虫在上述分组中分别培养，油红O染色观察培养5d各组线虫的脂质沉积。采用不同培养天数计算存活率，绘制生长曲线，表示线虫寿命的变化。
实施例6
1、米醋制备基本实验步骤：米醋制备基本实验步骤为：浸米、蒸饭、搭窝、冲缸、酒精发酵、投料(麸皮)、醋酸发酵、封醅、煎醋；
2、具体操作：将平板保存戊糖片球菌JS35(实验室自主筛选，目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28048)活化，利用液体MRS液体发酵24h。将发酵液按10％比例(V/V)再次接入含2％谷氨酸钠的MRS培养基静置培养24h，即得发酵液。糯米浸米15h。蒸饭30min，自然冷却至30℃左右时淋饭，然后加糖化酶水溶液(55℃，20U/g)，加0.8％黄酒曲，搅拌均匀打散，搭窝。在糯米饭中间掏出一个饭窝，搭成一个“喇叭口”，直接可见缸底，不让米粒落在窝底，盖上有孔的盖子，进行糖化发酵。当米酒的量与糯米饭的表面持平时冲缸，辅以搅拌，搅拌均匀后，盖上盖子，酒精发酵5d。按米重∶麸皮＝1∶1.7，米重∶醋酸菌剂＝1∶1.2，搅拌均匀，醋酸发酵9d。封醅10d后翻醅一次，按米重∶戊糖片球菌JS35的发酵液＝1∶0.5再添加乳酸菌JS35发酵液，继续封醅10d。淋醋，煎醋。
3、采用与实施例5的方法对所得米醋进行乳酸含量测定、γ-氨基丁酸含量的测定、总抗氧化活性测定以及高脂线虫模型评价米醋的降脂作用。
同时设置未添加乳酸菌作为对照组。具体操作：糯米浸米15h。蒸饭30min，自然冷却至30℃左右时淋饭，然后加糖化酶水溶液(55℃，20U/g)，加0.8％黄酒曲(g/g)，搅拌均匀打散，搭窝。在糯米饭中间掏出一个饭窝，搭成一个“喇叭口”，直接可见缸底，不让米粒落在窝底，盖上有孔的盖子，进行糖化发酵。当米酒的量与糯米饭的表面持平时冲缸，辅以搅拌，搅拌均匀后，盖上盖子，酒精发酵5d。按米重∶麸皮＝1∶1.7，米重∶醋酸菌剂＝1∶1.2，搅拌均匀，醋酸发酵9d。封醅10d后翻醅一次，继续封醅10d。淋醋，煎醋。
将JS35用于米醋的酿造，发现在醋酸发酵、封醅阶段接入适量的JS35菌株均可以提高米醋的乳酸含量和GABA含量，实施例5和实施例6获得的产品的乳酸含量分别比对照增加6.5％和17.6％(图7)，γ-氨基丁酸含量可增加46.8％和218.7％(图7)，总抗氧化能力分别提高10.3％和34.8％(图8)。利用高脂线虫模型，添食上述添加JS35菌的米醋，采用油红O染色法观察线虫体内的脂质沉积，发现实施例5和6获得的产品具有更好的降脂效果(图9)和抗衰老作用(图10)。从图9中可见，高脂饮食模型组脂质沉积更多，红色的脂滴数量多、体积较大，添食米醋组均可起到降低脂质沉积的作用，其中添加JS35菌株共发酵制备的产品具有更好的作用。从图10可见，添食实施例5和实施例6产品的线虫寿命显著延长，最大可比对照组分别延长4和6天，结果表明JS35菌株在提升米醋功能性方面具有潜在的应用价值。
Claims (9)
1.一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35，其分类命名为戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2023年7月28日，保藏编号为 CGMCC No.28048。
2.含有权利要求1所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35的发酵液或其发酵液的上清液。
3.权利要求2的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35的发酵液或其发酵液的上清液的制备方法，包括如下步骤：将戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35先接种于固体MRS培养基中进行厌氧培养，并接种于MRS液体培养基得到一级种子液，再接种于任意适合乳酸菌培养的液体培养基中发酵，发酵温度25-42℃，发酵时间12-24h的二级种子液即为发酵液；发酵时间12-72 h的二级种子液过滤即得上清液。
4.根据权利要求3所述的发酵液或其发酵液的上清液的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基包含0-2%谷氨酸钠，所述任意适合乳酸菌培养的液体培养基包含0-5%桑叶粉悬浊液。
5.一种制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求1所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35或权利要求2的发酵液或其发酵液的上清液或其发酵液的菌泥。
6.一种戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35的冻干菌粉，其特征在于，所述冻干菌粉包括权利要求2所述的发酵液离心得到的菌泥。
7.权利要求6所述的一种戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35的冻干菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求2所述的发酵液离心保留沉淀，用生理盐水洗后再离心，菌泥进行真空冷冻干燥，得到冻干菌粉。
8.权利要求1所述的戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35、权利要求2所述发酵液或其发酵液的上清液、权利要求5所述的制剂或权利要求6所述的冻干菌粉在以下（1）~（3）至少一项中的应用：
（1）制备降低甘油三酯的药品或保健品；
（2）制备动物饲料或饲料添加剂；
（3）制备食品或食品添加剂。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）JS35的接种量为2~5%。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311503713.5A CN117757658A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用 |
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| CN202311503713.5A CN117757658A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用 |
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| CN117757658A true CN117757658A (zh) | 2024-03-26 |
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ID=90309377
Family Applications (1)
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| CN202311503713.5A Pending CN117757658A (zh) | 2023-11-13 | 2023-11-13 | 一株来自家蚕肠道的戊糖片球菌及其应用 |
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| CN106222103A (zh) * | 2016-07-21 | 2016-12-14 | 陕西理工大学 | 一株产胞外多糖的戊糖片球菌及其应用 |
| KR20170134921A (ko) * | 2016-05-27 | 2017-12-07 | 다인바이오 주식회사 | 발효 뽕잎, 발효 뽕잎 추출물 및 이의 용도 |
| CN114085789A (zh) * | 2021-11-03 | 2022-02-25 | 中国农业大学 | 戊糖片球菌ma.wtpqj01及其应用 |
| CN115747111A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-03-07 | 四川大学 | 一株戊糖片球菌及其应用 |
-
2023
- 2023-11-13 CN CN202311503713.5A patent/CN117757658A/zh active Pending
Patent Citations (5)
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| KR20170134921A (ko) * | 2016-05-27 | 2017-12-07 | 다인바이오 주식회사 | 발효 뽕잎, 발효 뽕잎 추출물 및 이의 용도 |
| CN106190894A (zh) * | 2016-07-12 | 2016-12-07 | 汕头大学 | 一株戊糖片球菌g11及其筛选与应用 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 王志新等: "戊糖片球菌SBC5的功能特性研究及在发酵乳中的应用", 《食品与发酵工业》, vol. 49, no. 07, 27 April 2023 (2023-04-27), pages 118 - 125 * |
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