CN109439565A - 一株戊糖片球菌菌株、其微生态制剂及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一株戊糖片球菌菌株、其微生态制剂及其制备方法，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO：M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001。由该菌株通过相应方法制成的适用水产养殖的微生态制剂混合于饲料后，对淡水鱼类进行喂食，能快速抑制嗜水气单胞菌等鱼类病原菌对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的感染，其保护率≥70%，同时也能改善淡水鱼类肠道菌群结构、促进淡水鱼类的生长、提高淡水鱼类的免疫力。

Description

一株戊糖片球菌菌株、其微生态制剂及其制备方法

技术领域

本发明涉及水产微生物技术领域，具体涉及一株戊糖片球菌菌株、其微生态制剂及其制备方法。

背景技术

我国养殖水域面积辽阔，随着人们对蛋白资源食物的需求增大，水产养殖行业的发展越来越受到重视。根据《中国水产养殖市场调查与发展前景研究报告（2018年版）》显示，我国水产养殖以淡水养殖为主，其产量占比超过60%，淡水养殖以鱼类为主，占淡水养殖总产量的88%以上。近年来，随着国家对农业环境保护的重视，水产精养鱼池面积迅速扩展，相应精养鱼池的病害爆发越来越严重，成为制约鱼类水产养殖可持续发展的技术瓶颈。

目前，已报道的淡水鱼类病害主要以细菌性病害为主，尤为严重的是，嗜水气单胞菌病害导致鱼类减产损失严重，近两年暴发率达50%以上，鱼类减产损失率达20%～30%，每年造成的直接经济损失超过百亿元之巨。

现有淡水养殖鱼类病害的防控技术措施，主要是利用抗生素、化学药物、益生菌和疫苗，其中使用化学药物是鱼类病害防控的主要手段，虽然有一定效果，但是，化学药物的长期大量使用会导致病原菌产生耐药性，影响生态环境和导致水产品农药残留。益生菌是微生物中的一大类，其生长繁殖速度快，周期短，而且在生长过程中能产生一些代谢产物，这些代谢产物能抑制病原菌的繁殖，和病原菌达到某种生态和微生态平衡，同时某些代谢产物能促进鱼类生长。疫苗在水产养殖病害防治中效果也较佳，目前我国用的最多的是灭活疫苗，现阶段疫苗的制备造价和如何对水产动物进行免疫，一直是大量推广使用的瓶颈。

目前，水产养殖行业常用的微生态制剂益生菌有芽胞杆菌、乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌等，由于芽胞杆菌的芽胞具有耐高温、耐酸碱等优势，使得芽孢杆菌加工更方便，应用范围更广。乳酸菌能够产生有机酸、过氧化氢、双乙酰、细菌素等，是鱼类病原菌的天然抑菌产物，同时乳酸菌还能产生益生元，促进动物体生长发育。乳酸菌作为肠道益生菌，它能定殖在动物肠壁上，恢复和增强肠道稳态发挥作用，从而起到维持宿主免疫稳态、帮助宿主拮抗病原微生物和促进宿主对营养物质的吸收作用，进而达到促进动物生长，防治疾病的目的。

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）作为乳酸菌的一种，属于乳杆菌科、片球菌属，是一种典型的乳酸菌，可以发酵糖产酸以及IIa类片球菌素等物质，具有杀灭病原菌及腐败微生物的功能。近年来，乳酸菌类戊糖片球菌作为微生态制剂在国际上养殖领域受到高度重视。2013年，中华人民共和国农业部第2045号公告《饲料添加剂品种目录(2013)》中规定，戊糖片球菌是可作为微生态制剂直接饲喂养殖动物的饲料级微生物添加剂菌种。

CN 102132788 B公开了一种水产养殖用橙色粘球菌微生态制剂的制备及应用方法，包括以下步骤：（1）取一株橙色粘球菌JCH-04，保藏号为CGMCCNo.2893，菌株在CY 培养基上30℃培养3 天，在发酵培养基中30℃、180rpm摇瓶培养5 天；（2）从斜面挑取一环菌种接种于CY 液体培养基中试管30℃培养3 天，再将接种于装有发酵培养基试管中30℃培养3天；（3）将步骤（2）的液体菌种接种于装有发酵培养基三角瓶中30℃、180rpm 摇瓶培养5天；（4）将步骤（3）的摇瓶培养菌液用0.2μm 微滤膜过滤浓缩成500 亿CFU/mL 菌液，获得的浓缩菌液为微生态制剂，对该微生态制剂的稳定性并没有提及。

现有微生态制剂在运输、使用和保存过程中易失活，稳定性差，从而降低其生物活性作用；有些菌株进入消化道后，不能有效抵抗盐酸、胆汁酸等的作用，从而无法长时间定植肠道发挥功能；微生态制剂预防效果好于治疗效果，但作用慢，需长时间连续使用，成本相应增加等不利因素和技术制约。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株戊糖片球菌新菌株，该戊糖片球菌菌株兼性厌氧生长，对高温有较好的耐受力，进入消化道后，能有效抵抗盐酸、胆汁酸等的作用，能较长时间定植肠道发挥功效。

本发明进一步要解决的技术问题是，提供一种对鱼类病原菌抑菌效果好，能提高鱼类免疫力和促进鱼类生长，并且菌株耐热性强，稳定性好，被鱼体吸收后，能够迅速抑制鱼类病原菌的生长，对草鱼、鲫鱼等淡水鱼类的抗嗜水气单胞菌感染防治效果尤其显著，有利于菌剂运输和延长货架期的适用于水产养殖鱼类疾病防治的微生态制剂。

本发明更进一步要解决的技术问题是，提供一种所述微生态制剂的制备方法。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一株戊糖片球菌菌株，2018年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学），菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001；拉丁文学名：Pediococcus pentosaceus SL001。

本发明进一步解决其技术问题所采用的技术方案如下：一种适用于水产养殖的微生态制剂，由菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109的戊糖片球菌SL001发酵制成。其中的抑菌活性物质对蛋白酶不敏感，在高温中稳定，在运输、使用和保存过程中不易失活，稳定性好；能抑制淡水鱼类病原菌的生长，能改善鱼类肠道菌群结构，对鱼类生长有促进作用，并能提高鱼类的免疫力。

进一步，所述戊糖片球菌SL001微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

进一步，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

进一步，所述淡水鱼类为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

本发明更进一步解决其技术问题所采用的技术方案是：一种适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，包括以下步骤：

（1）接种活化：将戊糖片球菌SL001保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为MRS液体培养基，所述活化培养条件：温度30～40℃，装液量为容器体积的10～30％，厌氧静置培养12～16 h；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按1～2%的接种量接种到培养基装液量为65～70%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养；所述第一次扩大培养的发酵培养基配方：葡萄糖15～20 g/L、鱼粉蛋白胨3～5 g/L、大豆蛋白胨1～4 g/L、牛肉浸膏 5～10g/L、酵母粉 10～15 g/L、MgSO₄•7H₂O 0.3～0.5 g/L、MnSO₄•5H₂O 0.1～0.2 g/L、柠檬酸铵1～2 g/L、乙酸钠 2～3 g/L、吐温-80 1～2 mL/L；所述第一次扩大培养的培养条件：初始pH为6.2～6.4，控制温度为30～40℃，培养12～15h，整个培养过程无需通气，每隔6～8 h搅拌一次，每次2～5 min，OD600为3.0～5.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述第一次扩大培养得到的种子液按8～10%接种量接种到培养基装液量为70～75%的500 L发酵罐中，第二次扩大培养的发酵培养基配方同步骤（2）所述第一次扩大培养的发酵培养基配方，第二次扩大培养的培养条件：初始pH为6.2～6.4，控制温度为30～40℃，整个培养过程无需通气，每隔6-8 h搅拌一次，每次2～5 min，OD600为3.0～5.0，直至发酵罐内pH=3.4～4.0时终止发酵；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，得到微生态液体制剂，或经喷雾干燥后得到微生态固体制剂。

本发明之利用戊糖片球菌SL001制备微生态制剂拌入饲料中投喂淡水鱼类时，按1×10⁹～1×10¹¹ cfu/g比例拌入或喷洒添加到饲料中或按照鱼类体重的1%～3%进行投喂添加饲料。

本发明有益效果：（1）通过16S rRNA基因及全基因组测序鉴定该菌株为戊糖片球菌新菌株（菌种保藏号：CCTCC NO: M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001，拉丁学名：Pediococcus pentosaceus SL001），与NCBI数据库中已公布的戊糖片球菌序列同源性最高达99%；（2）利用戊糖片球菌制备的微生态制剂具有提高鱼类免疫力、抗菌效果好、能促进鱼类生长和抗逆性强等特点；（3）利用戊糖片球菌SL001制备的微生态制剂能在鱼类肠道中定殖，能改善鱼类肠道菌群结构，调节微生态平衡，在微生态位点减少肠道中潜在病原菌的定殖；（4）利用戊糖片球菌SL001制备的微生态制剂的制备方法简单，生产成本低廉，可规模化生产，能部分代替抗生素的使用，投喂淡水鱼类不会产生毒副作用，具有良好的应用前景。

生物材料保藏情况说明

本发明之戊糖片球菌菌株于2018年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：中国 武汉 武汉大学），菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001；拉丁文学名：Pediococcus pentosaceus SL001。

附图说明

图1是戊糖片球菌SL001经16S rRNA基因及全基因组测序，并和NCBI数据库已公布的戊糖片球菌序列进行比对结果图；

图2戊糖片球菌SL001发酵上清液体外抑菌测试结果图，图中a：抑菌平板观察；b：抑菌圈大小；

图3 戊糖片球菌SL001扫描电镜观察图；

图4 戊糖片球菌SL001耐热性测试结果图；

图5 戊糖片球菌SL001抑菌活性物质理化性质分析结果图；

图6 戊糖片球菌SL001发酵上清液高效液相色谱分离特征图；

图7 戊糖片球菌SL001发酵上清液高效液相色谱分离活性物质抑菌试验结果图；

图8 荧光定量PCR检测影响草鱼肌肉细胞生长相关基因表达结果图，图中： PA是第一组、DB是第二组；

图9 戊糖片球菌SL001制备的微生态制剂对草鱼肠道微生物组的影响分析结果图；

图10 戊糖片球菌SL001制备的微生态制剂对草鱼免疫因子表达的影响分析结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明。

本发明实施例所使用的培养基能够商购得到或者根据“微生物培养基手册”（Microbiology Culture Media Manual）的记载制备得到，所用试剂均通过常规商业途径获得。

本发明之戊糖片球菌新菌株，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001；拉丁文学名Pediococcuspentosaceus SL001。

本发明所述戊糖片球菌SL001菌株兼性厌氧生长，对高温有一定的耐受力，其菌株发酵液中的抑菌活性物质对蛋白酶不敏感，在高温中稳定，经16S rRNA基因及全基因组测序，并和NCBI数据库已公布的戊糖片球菌序列进行比对，结果显示最高相似度为99%（参见图1）。

本实施例所述适用水产养殖的微生态制剂，由菌种保藏号为CCTCC NO: M2018109，戊糖片球菌SL001发酵制成；该微生态制剂能抑制淡水鱼类病原菌的生长，能改善鱼类肠道菌群结构，对鱼类生长有促进作用，并能提高鱼类的免疫力。

本发明之戊糖片球菌SL001分离鉴定和研究方法如下：

（一）戊糖片球菌新菌株筛选及对鱼类病原菌的抑菌试验

从我国海南省大东海附近海滩采集土壤样品，经梯度稀释，将稀释液涂布于MRS平板上，37 ℃厌氧培养24 h后，从平板上挑取13株细菌进行划线进一步纯化，之后将纯化好的细菌接入MRS肉汤中37 ℃厌氧发酵培养48 h，离心收集发酵上清液，选择6株鱼类病原菌为指示菌，分别为：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila G1）、维氏气单胞菌（Aeromonas veronii X005）、温和气单胞菌（Aeromonas sobria B002）、迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda EIB202）、格式乳球菌（Lactococcus garvieae B010）、类志贺邻单胞菌（Plesiomonas Shigelloide B008），用牛津杯法对上述病原菌进行抑菌试验（参见图2），发现一株细菌对6种鱼类病原菌具有良好的抑菌效果，故将该株细菌命名为SL001。

（二）利用16S rRNA基因进行鉴定

菌株接种于MRS肉汤培养基中，37 ℃厌氧静置培养培养12 h，离心收集菌体，利用细菌基因组提取试剂盒（上海生工生物技术有限公司生产）提取细菌基因组，利用16S rRNA基因扩增引物。

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；

1492R：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

以上述引物扩增16S rRNA基因，序列预期长度约为1500 bp。

PCR反应体系（20 μL）：2 μL Ex Taq Buffer（10×），1.6 μL dNTP Mixture（2.5mmol/L），上游引物0.6 μL（10 μmol/L）、下游引物 0.6 μL（10 μmol/L），模板 1 μL，0.2 μLTaKaRa Ex Taq（5 U/μL），14 μL H2O。

PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；30个循环：95 ℃，45 sec；55 ℃，45 sec；72℃，1.5 min；72 ℃，10 min。

16S rRNA基因PCR产物经1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测并回收。然后将纯化后的PCR产物用pMD-18T vector进行连接，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，进行氨苄抗性筛选，挑取阳性转化子后提取质粒送上海生工生物技术有限公司测序。

（三）菌株细胞形态观察、生理生化试验及细菌耐热性测定

该菌株在MRS平板上菌落呈圆形、表面湿润、边缘齐整的乳白色，通过扫描电镜观察，菌体表现为二联或者四联球状（参见图3）。参照《伯杰氏细菌鉴定手册》，对该菌株进行了糖发酵试验、明胶液化试验、接触酶试验、硝酸盐还原试验、运动性试验等，结果如表1。

表1戊糖片球菌SL001的细菌生理生化试验

注：表格中 “+”表示阳性，“-”表示阴性。

菌株在MRS肉汤中37 ℃厌氧培养至对数生长期（约12 h），将菌液分装至若干1.5mL离心管中，分别在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃水浴15 min，随后涂布于MRS平板中，在37 ℃厌氧培养24 h之后计菌落数（参见图4），结果显示在80 ℃之前，菌体还有良好的活性。

（四）戊糖片球菌SL001抑菌活性物质的理化性质及分离

将戊糖片球菌SL001菌株48 h发酵上清液（12000 rpm， 30 min离心）分别经30 ℃、60℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃、121 ℃及50 mg/mL胃蛋白酶处理30 min后，各取100 μL用于抑菌试验（参见图5），利用相同pH的PBS溶液（PL；乳酸调节）和MRS肉汤作为对照。

另取戊糖片球菌SL001菌株48 h发酵上清液（12000 rpm，30 min离心），经1.5倍体积乙腈过夜沉淀，离心后取上清，冷冻干燥机中冻干，用水复溶，过滤之后利用超高效液相色谱（Agilent 1290 Infinity；柱子为ZORBAX SB-C18（4.6×150 mm，5μm））初步分离（参见图6）。流动相为ddH2O和乙腈，流速1 mL/min，色谱洗脱程序为：0～4 min乙腈0%，4～5 min乙腈0%～4%，5～6 min乙腈4%，6～6.5 min乙腈4%～5%，6.5～7 min乙腈5%，7～7.5 min乙腈5%～6%，7.5～9 min乙腈6%，9～9.5 min乙腈6%～8%，9.5～11 min乙腈8%，11～11.5 min乙腈8%～10%，11.5～15 min乙腈10%，15～30 min乙腈10% ～100%，检测波长分别为215nm。将收集到的组分在真空浓缩仪中冻干，除去乙腈，加入ddH₂O溶解，然后进行抑菌活性检测（参见图7）。

本实施例利用戊糖片球菌SL001制备微生态制剂的方法，包括以下步骤：

（1）接种活化：将戊糖片球菌SL001保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为MRS液体培养基，所述活化培养条件：温度为37℃，培养基装液量为容器体积的15％，厌氧静置培养12h；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按2%的接种量接种到培养基装液量为70%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养；所述第一次扩大培养的发酵培养基配方为：葡萄糖20 g/L、鱼粉蛋白胨5 g/L、大豆蛋白胨3 g/L、牛肉浸膏 7 g/L、酵母粉 13 g/L、MgSO₄•7H₂O 0.4 g/L、MnSO₄•5H₂O 0.2 g/L、柠檬酸铵 1 g/L、乙酸钠3 g/L、吐温-80 2 mL/L；所述第一次扩大培养的培养条件：初始pH为6.3，控制温度为37℃，培养12h，整个培养过程无需通气，每隔6 h搅拌一次，每次2 min，OD₆₀₀为4.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述第一次扩大培养得到的种子液按10%接种量接种到培养基装液量为70%的500 L发酵罐中进行第二次扩大培养，第二次扩大培养的发酵培养基配方同步骤（2）所述第一次扩大培养的发酵培养基配方，所述第二次扩大培养的培养条件：初始pH为6.3，控制温度为37℃，培养12h，整个培养过程无需通气，每隔6 h搅拌一次，每次2 min，OD₆₀₀为4.0，直至发酵罐内pH=3.7时终止发酵；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，得到微生态液体制剂，后经喷雾干燥后得到微生态固体制剂。

应用实例1：将上述戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂草鱼后，对草鱼生长的影响分析：

（1）将健康草鱼（体重32.1±16 g）随机分成2组，每组50条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h，试验开始时称量草鱼的初始体重。

（2）第一组：将添加有1×10⁹ cfu/g戊糖片球菌SL001制备的微生态制剂的饲料投喂草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天；第二组：将灭菌的饲料喂食草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%喂食，连续投喂30天。

（3）待试验结束时，称量草鱼的体重，利用公式：WGR (%) = 100 × (Wt-W0) /W0；SGR (%) =100 × (lnWt−lnW0) / T计算草鱼生长性能指标，式中WGR：体重增加率；SGR：对数体重率；Wt：试验结束时鱼平均体重；W0：试验开始时鱼平均体重。结果见表2。

表2 戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂对草鱼生长性能的影响

注：表格中PA：试验组；DB：对照组。

（4）随后随机挑选5条进行解剖，取其肌肉组织，利用荧光定量PCR检测影响生长的基因表达情况（参见图8），即：MSTN-1、MSTN-2（肌肉抑制素基因）和IGF-1、IGF-2（胰岛素增长因子）。

应用实例2：将上述戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂草鱼后，对草鱼肠道微生物组的影响分析：

（1）将健康草鱼（体重29.8±11 g）随机分成2组，每组40条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h。

（2）第一组：将添加有1×10⁹ cfu/g戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂的饲料投喂草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天；第二组：将灭菌的饲料投喂草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天。

（3）待试验结束时，每组随机挑选6条进行解剖，取其肠道，进行高通量测序，结果显示，通过上述实施例制备的戊糖片球菌新菌微生物制剂能够快速抑制气单胞菌和弧菌在肠道中繁殖，促使潜在益生菌增加显著（参见图9）。

应用实例3：将上述戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂草鱼后，对草鱼免疫效果的影响分析：

（1）将健康草鱼（体重30.1±10 g）随机分成2组，每组20条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h。

（2）第一组：将添加有1×10⁹ cfu/g戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂的饲料喂食草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天；第二组：将灭菌的饲料喂食草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天。

（3）待试验结束时，每组随机挑选3条进行解剖，取其肝脏及脾脏组织，提取总RNA，利用荧光定量PCR检测试验组（PA）及对照组（DB）的免疫因子表达量，发现在试验组中的免疫因子表达量显著高于对照组鱼（参见图10）。

应用实例4：将上述戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂草鱼后，对抗病原菌嗜水气单胞菌对草鱼的感染分析：

（1）将健康草鱼（体重50.5±12 g）随机分成2组，每组50条。试验采用曝气72 h的自来水，水温控制在20 ℃～23 ℃，试验开始前暂养草鱼停食48 h。

（2）第一组：将添加有1×10⁹ cfu/g戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂的饲料喂食草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天；第二组：将灭菌的饲料喂食草鱼，每天喂食2次，每次按照体重1%给食，连续投喂30天。

（3）喂养30天后，对每条草鱼注射0.1 mL，1×10⁶ cfu/mL的病原菌嗜水气单胞菌，连续观察10天，统计累计死亡率见表3，从表3可知通过上述实施例制备的戊糖片球菌新菌微生物制剂能够快速抑制病原菌嗜水气单胞菌的繁殖，对草鱼的保护力达到80%～90%。

表3 戊糖片球菌新菌SL001制备的微生态制剂拌料饲喂草鱼后对草鱼保护力试验结果

注：表格中数据为累计死亡率。

序列表

<110> 湖南师范大学

<120> 一株戊糖片球菌新菌株、其微生态制剂的制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1488

<212> DNA

<213> 戊糖片球菌新菌株(Pediococcus pentosaceus)

<400> 1

gaaggaattg cgggagctat aatgcaagtc gaacgaactt ccgttaattg attatgacgt 60

acttgtactg attgagattt taacacgaag tgagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 120

taacctgccc agaagtaggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg tataacagag 180

aaaaccgcat ggttttcttt taaaagatgg ctctgctatc acttctggat ggacccgcgg 240

cgtattagct agttggtgag gtaaaggctc accaaggcag tgatacgtag ccgacctgag 300

agggtaatcg gccacattgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga ggcagcagta 360

gggaatcttc cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaagggt 420

ttcggctcgt aaagctctgt tgttaaagaa gaacgtgggt aagagtaact gtttacccag 480

tgacggtatt taaccagaaa gccacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta 540

ggtggcaagc gttatccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcggt cttttaagtc 600

taatgtgaaa gccttcggct caaccgaaga agtgcattgg aaactgggag acttgagtgc 660

agaagaggac agtggaactc catgtgtagc ggtgaaatgc gtagatatat ggaagaacac 720

cagtggcgaa ggcggctgtc tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc 780

gaacaggatt agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgattactaa gtgttggagg 840

gtttccgccc ttcagtgctg cagctaacgc attaagtaat ccgcctgggg agtacgaccg 900

caaggttgaa actcaaaaga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta 960

attcgaagct acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc ttctgacagt ctaagagatt 1020

agaggttccc ttcggggaca gaatgacagg tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt 1080

gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat tactagttgc cagcattaag 1140

ttgggcactc tagtgagact gccggtgaca aaccggagga aggtggggac gacgtcaaat 1200

catcatgccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggatggtac aacgagtcgc 1260

gagaccgcga ggttaagcta atctcttaaa accattctca gttcggactg taggctgcaa 1320

ctcgcctaca cgaagtcgga atcgctagta atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg 1380

ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac accatgagag tttgtaacac ccaaagccgg 1440

tggggtaacc ttttaggagc tagccgtcta atgtgaaaag ttatttta 1488

Claims (6)

1.一株戊糖片球菌菌株，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109，分类命名为：戊糖片球菌SL001；拉丁文学名：Pediococcus pentosaceus SL001。

2.一种适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，由权利要求1所述菌种保藏号为CCTCC NO: M 2018109的戊糖片球菌SL001发酵制成。

3.根据权利要求2所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂为液体制剂或固体制剂。

4.根据权利要求2或3所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述水产养殖的动物为淡水鱼类。

5.根据权利要求4所述适用于水产养殖的微生态制剂，其特征在于，所述淡水鱼为草鱼、鲫鱼或鲤鱼。

6.一种如权利要求2或3所述适用于水产养殖的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）接种活化：将戊糖片球菌SL001保藏斜面菌种转接到活化斜面培养基上活化过夜，得到活化好的种子液；所述活化斜面培养基为MRS液体培养基，所述活化培养条件：温度30～40℃，装液量为容器体积的10～30％，厌氧静置培养12～16 h；

（2）第一次扩大培养：将步骤（1）所述活化好的种子液按1～2%的接种量接种到培养基装液量为65～70%的50 L发酵罐中进行第一次扩大培养；所述第一次扩大培养的发酵培养基配方：葡萄糖15～20 g/L、鱼粉蛋白胨3～5 g/L、大豆蛋白胨1～4 g/L、牛肉浸膏 5～10g/L、酵母粉 10～15 g/L、MgSO₄•7H₂O 0.3～0.5 g/L、MnSO₄•5H₂O 0.1～0.2 g/L、柠檬酸铵1～2 g/L、乙酸钠 2～3 g/L、吐温-80 1～2 mL/L；所述第一次扩大培养的培养条件：初始pH为6.2～6.4，控制温度为30～40℃，培养12～15h，整个培养过程无需通气，每隔6～8 h搅拌一次，每次2～5 min，OD₆₀₀为3.0～5.0；

（3）第二次扩大培养：将步骤（2）所述第一次扩大培养得到的种子液按8～10%接种量接种到培养基装液量为70～75%的500 L发酵罐中，第二次扩大培养的发酵培养基配方同步骤（2）所述第一次扩大培养的发酵培养基配方，第二次扩大培养的培养条件：初始pH为6.2～6.4，控制温度为30～40℃，整个培养过程无需通气，每隔6-8 h搅拌一次，每次2～5 min，OD₆₀₀为3.0～5.0，直至发酵罐内pH=3.4～4.0时终止发酵；

（4）浓缩收集：放罐后，浓缩，收集，得到微生态液体制剂，或经喷雾干燥后得到微生态固体制剂。