CN113604470B - 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用 - Google Patents

一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113604470B
CN113604470B CN202110938622.9A CN202110938622A CN113604470B CN 113604470 B CN113604470 B CN 113604470B CN 202110938622 A CN202110938622 A CN 202110938622A CN 113604470 B CN113604470 B CN 113604470B
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
yarrowia lipolytica
campesterol
promoter
yield
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110938622.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113604470A (zh
Inventor
孟永宏
苟元元
郭建琦
牛永洁
杨璐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shaanxi Healthful Biological Engineering Co ltd
Original Assignee
Xi'an Healthful Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xi'an Healthful Biotechnology Co ltd filed Critical Xi'an Healthful Biotechnology Co ltd
Priority to CN202110938622.9A priority Critical patent/CN113604470B/zh
Publication of CN113604470A publication Critical patent/CN113604470A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113604470B publication Critical patent/CN113604470B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/39—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts
    • C07K14/395—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from yeasts from Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/001—Oxidoreductases (1.) acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P33/00—Preparation of steroids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y103/00—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3)
    • C12Y103/01—Oxidoreductases acting on the CH-CH group of donors (1.3) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.3.1)
    • C12Y103/01021—7-Dehydrocholesterol reductase (1.3.1.21)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明涉及一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用。本发明提供的强启动子TEF30，可用于构建解脂亚罗酵母重组菌株，经验证，所得重组解脂亚罗酵母T30pED在摇瓶发酵中菜油甾醇最高产量达到664.1mg/L(33.21mg/g DCW)，在5L发酵罐中菜油甾醇最高产量达到1305.2mg/L(68.73mg/g DCW)，显著高于野生型启动子菌株产量而具有突出的产业应用意义。

Description

一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法 及其应用
【技术领域】
本发明涉及重组解脂亚罗酵母，特别是用于提高解脂亚罗酵母菌(Yarrowialipolytica)中DHCR7基因表达量的强启动子TEF30，还涉及含有所述强启动子的高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED的构建方法，以及所述重组解脂亚罗酵母的应用。
【背景技术】
甾体药物是广泛存在于自然界动植物体内的一类特殊的多元环萜类化合物，具有多种生理活性和用途，尤其在医学领域，是一类重要的临床药物，具备显著的抗肿瘤、抗炎抗敏、抗菌抗病毒等作用。目前，甾体药物生产方式主要包括化学合成、植物提取和生物合成。化学合成法的生产工艺复杂，产物收率低，同时环境污染严重，使该方法不具有相应的经济价值。植物提取法得到的大多是植物甾醇的混合物，难以分离成高纯度和高收率的单体应用于科学研究或者生产上。相较于动植物提取和化学合成法，生物合成法显现出越来越明显的优势。微生物生长周期短，其生长繁殖不易受环境因素的影响，而且微生物可以用基因工程的手段进行改造，通过发酵这些工程菌株得到目标产物。
菜油甾醇是甾体药物的一种重要合成前体，也是植物来源的主要甾醇之一。菜油甾醇的制备多采用植物提取的方式。该方法操作过程繁琐并且收率低，无法用于生产。菜油甾醇与微生物来源的主要甾醇(麦角甾醇)的区别在于C7-8和C22-23位是饱和单键，这种相似性为微生物法生产菜油甾醇提供了可行性的理论基础。近年来，越来越多的研究采用微生物法生产菜油甾醇，但是产量仍然达不到理想水平。杜昊星等人以解脂亚罗酵母为宿主，敲除了C-22去饱和酶编码基因ERG5，表达了来自非洲爪蟾的7-脱氢胆固醇还原酶编码的基因DHCR7获得菜油甾醇产量最高为106mg/L(Hao-Xing Du et al.Engineering Yarrowialipolytica for Campesterol Overproduction.[J].PLoS ONE,2017,11(1))。谭思远的论文中也以解脂亚罗酵母为宿主，敲除了ERG5基因同时游离表达了来自非洲爪蟾的DHCR7基因获得菜油甾醇的最高产量为480ug/g DCW，当DHCR7基因拷贝数为2的时候产量最高达到560ug/g DCW(谭思远.重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇的研究[D].陕西师范大学,2018.)。中国发明专利申请CN 107083338A公开了表达来自斑马鱼的DHCR7基因且敲除ERG5基因，菜油甾醇产量为362.9mg/L(19.3mg/g DCW)，当在此基础上过表达乙酰CoA代谢相关基因POX2时，发酵得到菜油甾醇的产量达到942mg/L(36.5mg/g DCW)。现有技术发现，在利用酵母细胞生产菜油甾醇的过程中，只通过表达DHCR7基因和敲除ERG5基因的手段无法达到高产的目的，另外由于其合成途径中关键酶7-脱氢胆固醇还原酶DHCR7活性不高，导致菜油甾醇的产量被限制。因此，菜油甾醇合成工艺还需不断探索与创新。
【发明内容】
本发明的目的是克服菜油甾醇产量低的缺陷，通过改造解脂亚罗酵母菌中麦角固醇合成途径以提高菜油甾醇产量，在现有敲除ERG5基因的研究基础上构建启动子突变文库，筛选强启动子实现DHCR7基因的过表达，提高DHCR7酶活性，从而提高解脂亚罗酵母菜油甾醇的产量。
为了实现上述目的，本发明提供强启动子TEF30，其核酸序列如SEQ ID No.2所示。
强启动子TEF30是由野生型启动子TEF经过易错PCR技术突变后通过筛选和验证得到的，野生型启动子TEF的核酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明还提供上述强启动子TEF30在提高解脂亚罗酵母菌(Yarrowialipolytica)中DHCR7基因表达量的应用。
本发明还提供上述强启动子TEF30在提高解脂亚罗酵母菌(Yarrowialipolytica)菜油甾醇产量中的应用。
基于此，本发明提供一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED的构建方法，所述方法包括以下步骤：
(1)构建EGFP基因表达载体pJN44-EGFP
EGFP序列经合成后连接在通用质粒pUC57上，通过带酶切位点引物EGFP-F-HindⅢ/EGFP-R-SalⅠ，以合成质粒pUC57为模板，扩增得到EGFP片段，分别以HindⅢ/SalⅠ为酶切位点双酶切pJN44载体和EGFP片段并连接，获得重组质粒pJN44-EGFP，所得重组质粒pJN44-EGFP通过引物EGFP-F-HindⅢ/EGFP-R-SalⅠ鉴定正确；
(2)构建含有EGFP基因表达载体pJN44-EGFP的重组解脂亚罗酵母polf-ERG5--EGFP+
将步骤(1)的重组质粒pJN44-EGFP用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，得到重组解脂亚罗酵母polf-ERG5--EGFP+，所得重组解脂亚罗酵母polf-ERG5--EGFP+经PCR鉴定正确；
(3)构建含强启动子TEF30的EGFP基因重组质粒T30pJN44-EGFP
权利要求1所述的强启动子TEF30经限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶切后，与经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的表达载体pJN44-EGFP连接，获得含强启动子TEF30的EGFP基因重组质粒T30pJN44-EGFP；
(4)构建含重组质粒T30pJN44-EGFP的重组解脂亚罗酵母TpEE
将步骤(3)的重组质粒T30pJN44-EGFP用限制性酶Sma I酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，所得重组解脂亚罗酵母TpEE，经PCR鉴定正确；
(5)构建含强启动子TEF30的lacZ基因重组质粒T30pJN44-lacZ
lacZ基因经限制性内切酶HindⅢ/SalⅠ双酶切后，与经HindⅢ/SalⅠ双酶切后的表达载体T30pJN44-EGFP连接，获得含强启动子TEF30的lacZ基因重组质粒T30pJN44-lacZ；
(6)构建含重组质粒T30pJN44-lacZ的重组解脂亚罗酵母TpEZ
将步骤(5)的重组质粒T30pJN44-lacZ用限制性酶Sma I酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，所得重组解脂亚罗酵母TpEZ，经PCR鉴定正确；
(7)构建含有强启动子TEF30的DHCR7基因重组质粒T30pJN44-DHCR7
将同时经XmaⅠ和SalⅠ双酶切后的DHCR7片段和步骤(5)得到的重组质粒T30pJN44-lacZ连接，获得含强启动子TEF30的重组质粒T30pJN44-DHCR7；
(8)构建含有重组质粒T30pJN44-DHCR7的重组菌株T30pED
将步骤(7)的重组质粒T30pJN44-DHCR7经酵母转化试剂盒的方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-中，获得重组解脂亚罗酵母T30pED，所得重组解脂亚罗酵母T30pED经PCR鉴定正确。
在本发明中，DHCR7基因来自斑马鱼，其序列编号为GenBank:BC055631.1；基因EGFP序列来自克隆载体p15A-HNS-GFP，其序列编号为GenBank:MN623123.1(gFP部分)；lacZ序列来自大肠杆菌BL21，其序列编号为GenBank:CP035822.1。
在本发明中，解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-可参考《重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇的研究》(谭思远)中公开的技术方案；pJN44载体可参见《重组解脂亚罗酵母合成微生物油脂的研究(董桂茹)中的记载。
本发明还提供上述构建方法得到的重组解脂亚罗酵母T30pED产菜油甾醇的方法，其特征在于将重组解脂亚罗酵母T30pED菌种在30℃、200r/min条件下活化后，挑取单菌落接入10mL/50mL的小瓶液体YPD种子培养基中，在30℃、200r/min条件下摇瓶培养24h；然后，以2％的接种量转接至50mL/250mL的液体YPD培养基中，在30℃、200r/min条件下发酵48h，然后收集细胞转移至50mL/250mL的液体YPD培养基中，在30℃、200r/min条件下进一步发酵96h；收集细胞，提取菜油甾醇。
本发明还提供上述构建方法得到的重组解脂亚罗酵母T30pED产菜油甾醇的方法，其特征在于将重组解脂亚罗酵母T30pED在5L发酵罐中在进行高细胞密度发酵，维持发酵罐中糖含量为30g/L，发酵6天后收集菌体，处理菌液，对所取样品测定其中菜油甾醇的产量；
发酵罐中的培养基组成为：葡萄糖4％，(NH4)2SO4 1.51％，YNB0.85％，KH2PO41.25％，MgSO4·7H2O 0.25％，尿嘧啶1％，酵母粉0.2％；
发酵条件为：培养温度维持在28℃，初始转速设置为200r/min，待菌体生长进入对数生长期，将转速设置为400r/min，进入平稳期后基连转速与溶氧量，转速设置在200-800r/min维，持溶氧量在20％，用10mol/L的KOH溶液维持pH为5.5直至发酵结束。
本发明通过构建TEF启动子突变文库，筛选出强启动子TEF30，构建解脂亚罗酵母重组菌株，提高7-脱氢胆固醇还原酶活性，使得重组菌株在摇瓶发酵中菜油甾醇最高产量达到664.1mg/L(33.21mg/g DCW)，在5L发酵罐中菜油甾醇最高产量达到1305.2mg/L(68.73mg/g DCW)，在野生型启动子菌株产量372.5mg/L(20.6mg/g DCW)的基础上提高了2.34倍，显著优于目前现有技术记载中的最高产量942mg/L(36.5mg/gDCW)。
【附图说明】
图1为含突变启动子的重组解脂亚罗酵母工程菌PCR鉴定结果；
图2为含第二报告基因lacZ重组菌株PCR鉴定结果；
图3为表达DHCR7基因重组菌株PCR鉴定结果；
图4为突变启动子相对荧光强度与β-半乳糖苷酶活性比较。
【具体实施方式】
以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度的“％”均为质量百分比，用于说明用量比例的“：”均为质量比。
YPD培养基：葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨2％，1.7％的琼脂粉，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
YPD液体培养基：葡萄糖2％，酵母粉1％，蛋白胨2％，于121℃高压蒸汽灭菌20min。
发酵罐中的培养基：葡萄糖4％，(NH4)2SO4 1.51％，YNB 0.85％，KH2PO4 1.25％，MgSO4·7H2O 0.25％，尿嘧啶1％，酵母粉0.2％。
本发明涉及以下引物：
表1引物信息
Figure BDA0003213868390000061
实施例1TEF启动子突变文库的构建与筛选
1.第一报告基因EGFP重组菌株构建及相对荧光强度的检测
1.1第一报告基因EGFP表达载体的构建
从NCBI上下载EGFP序列(GenBank:MN623123.1)，送生工合成，连接在通用质粒pUC57上，设计带酶切位点引物EGFP-F-HindⅢ/EGFP-R-SalⅠ，以合成质粒pUC57为模板，扩增得到EGFP片段，分别以HindⅢ/SalⅠ为酶切位点双酶切pJN44载体和EGFP片段并连接上获得重组质粒pJN44-EGFP。重组质粒用引物EGFP-F-HindⅢ/EGFP-R-SalⅠ鉴定，目的片段EGFP大小为732bp，与合成片段大小一致，表明重组质粒构建成功，可用于转化解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-(也写作重组解脂亚罗酵母pE)。
1.2第一报告基因重组菌株pEE的构建及验证
将构建好的重组质粒pJN44-EGFP用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，构建重组菌polf-ERG5--EGFP+(也写作重组解脂亚罗酵母pEE)。为了检测基因线性化后片段是否整合到宿主染色体上，分别挑取多个pEE单菌落为模板进行菌落PCR。
酵母转化使用Epigenetics公司的酵母转化试剂盒(Frozen-EZ YeastTransformation II Kit购自Epigenetics公司)，具体操作如下：
(1)将待转化的宿主菌在YPD培养基上活化，于28℃培养1天；
(2)挑取单菌落接种于2mL YPD液体培养基中，于28℃培养细胞生长至对数期(OD为0.8-1.0)；
(3)4000×g离心4min收集菌体，弃上清；
(4)加入500uL solution I洗清细胞，离心2min，弃上清；
(5)加入50uL solution II重悬菌体，加入5μL线性化之后回收的质粒，混合均匀；
(6)加入500uL solution III旋涡振荡，于28℃160r/min的摇床中培养4h，每隔一个小时旋涡振荡数秒；
(7)取适量菌液涂到SD-LEU培养基上，于28℃培养箱中培养2-4天，得到的单菌落待PCR验证。
菌落PCR过程如下：
PCR反应体系：
Figure BDA0003213868390000071
PCR程序：
Figure BDA0003213868390000081
1.3第一报告基因重组菌株pEE的相对荧光强度的检测
重组菌株pEE和原始菌株pE经YPD培养后，菌体收集用去离子水洗一次，经PBS重悬后取样品250uL至96孔板，使用多功能酶标仪检测EGFP荧光强度(激发波长:488nm，发射波长:505nm)，并检测OD600，检测EGFP荧光强度时，以不表达EGFP基因的原始菌株pE作为对照去除背景干扰。比荧光强度F/OD600(RFU/OD600)为荧光强度值比上对应细胞密度OD600。根据测定结果计算菌株的相对荧光强度，利用菌株的相对荧光强度来检测TEF启动子在解脂亚罗酵母工程菌pE中能否成功表达，以及EGFP基因是否可以作为构建TEF启动子文库的报告基因。
2.TEF启动子的突变
以质粒pJN44为模板，TEF-F-BamHⅠ/TEF-R-HindⅢ为引物，利用易错PCR技术对TEF启动子进行突变，得到TEF启动子突变片段TEFp，经限制性内切酶BamHⅠ/HindⅢ双酶切，将突变的TEF启动子混合片段与经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的载体pJN44-EGFP连接，获得重组混合质粒。将重组混合质粒用限制性酶Sma I酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，待长出单菌落，随机挑选30个单菌落进行菌落PCR鉴定转化子，阳性克隆PCR条带理论大小约732bp。
易错PCR反应体系
Figure BDA0003213868390000082
Figure BDA0003213868390000091
易错PCR反应程序
Figure BDA0003213868390000092
如图1所示，结果表明，含突变启动子的重组解脂亚罗酵母工程菌TpEE构建成功。
3.TEF启动子突变文库的构建和筛选
3.1 TEF启动子突变文库菌株的第一次筛选
利用多功能酶标仪检测全部重组菌株TpEE转化子的荧光强度(500个)，与野生型启动子重组菌株pEE对比，排除掉荧光强度没有变化的转化子，只保留荧光强度发生显著变化的转化子150个。然后再在荧光强度处于相同的水平的转化子中挑取1个转化子来构建TEF启动子突变文库，展示启动子强度的变化范围与趋势，一共挑选出30个转化子构建TEF启动子突变文库，并进行荧光强度及OD600检测和相对荧光强度计算。
在TEF启动子突变文库中，1号TEF突变子的活性最低，为野生型TEF强度的10％；30号TEF突变子的活性最高，为野生型TEF强度的160％。从TEF启动子突变文库中分别挑选5,7,12,18,22,27,29,30号突变子进行后续实验分析。其中，编号为5,7,12,18突变TEF启动子的强度均低于野生型TEF启动子，分别依次为64RFU,115RFU,133RFU,165RFU，与野生型TEF启动子相比分别降低了72.17％,50.00％,42.17％,28.26％。编号为22,27,29,30的突变TEF启动子强度均高于野生型TEF启动子，分别依次为287RFU,345RFU,398RFU,421RFU，与野生型TEF启动子相比分别提高了1.25,1.50,1.73,1.83倍，如图1所示。
3.2 TEF突变启动子强度的第二次筛选
为保证TEF启动子强度检测的准确性，利用大肠杆菌BL21中的lacZ基因作为第二报告基因，进一步确定5,7,12,18,22,27,29,30号突变子相对于野生TEF启动子的强度。lacZ基因是编码β半乳糖苷酶常用的报告基因，利用5,7,12,18,22,27,29,30号突变子表达lacZ基因，构建重组菌株，检测重组菌株的β半乳糖苷酶的酶活，即可再次确定突变子的强度。
3.2.1第二报告基因lacZ表达载体的构建
以大肠杆菌BL21基因组为模板，lacZ-F-HindⅢ/lacZ-R-SalⅠ为引物，扩增编码β半乳糖苷酶的lacZ基因，得到长度为3087bp的lacZ基因片段，分别以HindⅢ/SalⅠ为酶切位点双酶切pJN44和lacZ片段并连接获得重组质粒pJN44-lacZ。重组质粒用引物lacZ-F-HindⅢ/lacZ-R-SalⅠ鉴定，目的片段lacZ大小与合成片段大小一致，表明重组质粒pJN44-lacZ构建成功，可用于转化解脂亚罗酵母工程菌pE。
以上述筛选到的9个突变子菌株基因组为模板，用含酶切位点的引物TEF-F-BamHⅠ和TEF-R-HindⅢ扩增突变启动子TEF5,TEF7,TEF12,…,TEF30，分别用BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，与经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的重组质粒pJN44-lacZ连接，获得含突变启动子的重组质粒T5pJN44-lacZ，T7pJN44-lacZ，…，T30pJN44-lacZ，重组质粒经PCR鉴定，片段大小一致，表明重组质粒构建成功，可用于转化解脂亚罗酵母工程菌pE。
3.2.2第二报告基因lacZ重组菌株的构建及验证
将构建好的重组质粒pJN44-lacZ，T5pJN44-lacZ，T7pJN44-lacZ，…，T30pJN44-lacZ分别用限制性酶SmaI酶切线性化，采用酵母转化试剂盒方法转入解脂亚罗酵母工程菌polf-ERG5-，构建重组菌pEZ，T5pEZ，T7pEZ，…，T30pEZ。分别挑取多个单菌落进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示。。
3.2.3β-半乳糖苷酶酶活性测定
用以下方法检测重组菌株pEZ及上述含突变启动子的重组菌株T5pEZ，T7pEZ，…，T30pEZ的β-半乳糖苷酶酶活性。比较各重组菌株β-半乳糖苷酶酶活性，验证是否与荧光强度趋势一致：
(1)在试管中准确分装5mL的YPD培养基，接种酵母菌株一环，在30℃摇床中180r/min振荡培养12h；
(2)将5mL菌液完全倾倒至分装有45mL的YPD培养基的150mL规格的锥形瓶中，在30℃摇床中振荡培养4h；
(3)将菌液分装至离心管中，用无菌的去离子水清洗菌体2次，检测待测菌液的OD600值；
(4)在2mL的离心管中依次加入100uL的菌液，900uL的Z-Buffer,100uL氯仿，50uL的0.1％SDS溶液，利用漩涡震荡仪高速漩涡震荡lOs后，30℃下170r/min震荡2min。在离心管中加入200uL的ONPG溶液，30℃下170r/min震荡反应20min(此时溶液会变为黄色)，加入300uL的1M Na2CO3溶液终止反应；
(5)将离心管12000r/min离心2min，测定上清液的OD550和OD420的吸光值。
酶活计算公式：酶活＝1000×[A420-(1.75-A550)]/t×0.1×A600
结果显示，由相对荧光强度低于野生型TEF启动子的5,7,12,18号突变子构建的重组菌株T5pEZ，T7pEZ，T12pEZ，T18pEZ的β-半乳糖苷酶酶活性也都低于野生型TEF启动子重组菌株pEZ，分别为pEZ的25.10％，39.92％，65.02％，78.19％，而由相对荧光强度高于野生型TEF启动子的22,27,29,30号突变子构建的重组菌株T22pEZ，T27pEZ，T29pEZ，T30pEZ的β-半乳糖苷酶酶活性分别提高了25.10％，44.86％，67.49％，76.13％，结果均与第一报告基因EGFP的相对荧光强度趋势一致。其中重组菌株T30pJN44的β-半乳糖苷酶酶活性与相对荧光强度均表现最高，因此将30号突变启动子认定为强启动子进行后续研究。
实施例2：提高菜油甾醇产量的解脂亚罗酵母重组菌株的构建：表达DHCR7基因重组菌株构建
用于表达的目的基因DHCR7来自于斑马鱼，得到的序列由南京金丝瑞进行密码子优化，如SEQ No.3所示，利用宿主中偏爱密码子替换利用率低的稀有密码子，简化基因转录后mRNA的二级结构，去除不利于高效表达的模体，加入有利于表达的模体，调整GC含量，使目的基因能在宿主中高效表达，分别将经XmaⅠ和SalⅠ双酶切后的DHCR7片段与pJN44和T30pJN44片段连接，获得pJN44-lacZ和T30pJN44-lacZ重组质粒，分别通过PCR鉴定后将重组质粒经酵母转化试剂盒的方法转入解脂亚罗酵母工程菌pE中，获得重组菌株pED和T30pED，挑取多个单菌落进行菌落PCR鉴定，鉴定方法同前，结果如图3所示。
实施例3：重组菌株的发酵实验
1.重组菌株摇瓶发酵
分别将表达DHCR7基因的重组菌株pED和T30pED菌种活化后，挑取单菌落接入10mL/50mL的小瓶液体YPD种子培养基中，30℃，200r/min条件下培养24h。然后，以2％的接种量转接至50mL/250mL的液体YPD培养基中,30℃,200r/min条件下发酵48h,接着收集细胞转移至50mL/250mL的液体YPD培养基中进一步发酵96h。收集细胞，进行菜油甾醇的提取与检测。
菜油甾醇提取方法：
(1)将1mL发酵液置于厌氧管中，加入胆甾烷醇标准品100uL(4mg/mL的储液稀释100倍)；
(2)加入3mol/L的氢氧化钾甲醇溶液2.5mL，于90℃皂化，每20min取出厌氧管震荡数秒，100min后取出冷却试管；
(3)待试管冷却后，加入2mL蒸馏水，2mL正己烷，在漩涡振荡器上震荡试管5min，静置待分层；
(4)待反应液分层后，取含样品的正己烷层于衍生化瓶中，加入100uL的衍生化试剂(99uL BSTFA+1uL TMCS)，在70℃下反应60min，冷却后于4℃保存直至气质分析。
菜油甾醇检测方法：
(1)色谱柱：Rtx-5MS(30m×0.25μm×0.25μm)
(2)色谱条件：进样口温度为290℃，柱箱初始温度为100℃，分流比为10:1，进样量1uL，载气为高纯氦气，流量为1.2mL/min；程序升温：初始温度为100℃，以30℃/min的速率升至280℃保持15min。
(3)质谱条件：离子源为EI源，电离能为70eV，离子源温度为230℃，接口温度为250℃，分析甾醇混合标准品时用SCAN模式采集数据，选定特征离子后，数据采集方式为SIM模式，其中胆甾烷醇、麦角固醇和菜油甾醇的特征离子分别选择为m/z 75、m/z 337、m/z129。
2.重组菌株发酵罐发酵
重组菌株pED和T30pED在5L发酵罐中采用高细胞密度发酵技术扩大培养，培养基用发酵培养基并添加2g/L的酵母粉、1.25％的KH2PO4和0.25％的MgSO4·7H2O。发酵初始条件根据文献报道以及前期摇瓶发酵实验结果设置为：培养温度维持在28℃，初始转速设置为200r/min，待菌体生长进入对数生长期，将转速设置为400r/min，进入平稳期后基连转速与溶氧量，转速设置在200-800r/min维持溶氧量在20％，pH用10mol/L的KOH溶液维持在5.5左右。发酵初期，发酵罐中糖含量维持在30g/L，发酵过程中持续监测发酵罐中的糖含量，并采用葡萄糖流加技术维持发酵罐中葡萄糖的量。培养过程中，每隔8h取样保存于-80℃待测定。每隔4h取样测定OD600的数值，监测细胞的生长情况。在此条件下发酵6天后，收集菌体，处理菌液，对所取样品测定其中菜油甾醇的产量。
经GC-MS检测，菜油甾醇产量如表1所示：含强启动子的菌株T30pED摇瓶发酵产量达到664.1.1mg/L(33.21mg/g DCW)，5L发酵罐发酵产量最大达到1305.8mg/L(68.73mg/gDCW)，在野生型启动子菌株(pED菌株)的基础上提高了2.34倍，大幅提高了菜油甾醇产量。
表1重组菌株pED和T30pED发酵实验菜油甾醇产量比较
Figure BDA0003213868390000141
综上所述，本发明筛选出的强启动子TEF30用于构建解脂亚罗酵母重组菌株，所得重组解脂亚罗酵母T30pED在摇瓶发酵中菜油甾醇最高产量达到664.1mg/L(33.21mg/gDCW)，在5L发酵罐中菜油甾醇最高产量达到1305.2mg/L(68.73mg/g DCW)，在野生型启动子菌株产量372.5mg/L(20.6mg/g DCW)的基础上提高了2.34倍，显著优于当前目前技术记载的最高产量，具有突出的产业应用意义。
序列表
<110> 西安海斯夫生物科技有限公司
<120> 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 206
<212> DNA
<213> 解脂亚罗酵母菌启动子TEF(Yarrowia lipolytica)
<400> 1
tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccggac gcaaaataga ctactgaaaa 60
tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa aagaccaccg tccccgaatt 120
acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca cccgaaatcg ttaagcattt 180
ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 206
<210> 2
<211> 206
<212> DNA
<213> 解脂亚罗酵母菌强启动子TEF30(Yarrowia lipolytica)
<400> 2
tagtttcttt gtctggccat ccgggtaacc catgccgtac gaacgataga ctactgaaaa 60
tttttttgct ttgtggttgg gactttagcc aagggtataa aagaccaccg tccccgaatt 120
acctttcctc ttcttttctc tctctccttg tcaactcaca cccgaaatcg ttaagcattt 180
ccttctgagt ataagaatca ttcaaa 206
<210> 3
<211> 1437
<212> DNA
<213> 优化的斑马鱼DHCR7(Unknown)
<400> 3
atgatggcct ctgaccgagt gcgaaagcga cacaagggat ctgctaacgg agcccagacc 60
gtcgagaagg agccctctaa ggagcccgcc cagtggggcc gagcctggga ggtggactgg 120
ttctctctgt ctggagtgat cctgctgctg tgtttcgccc ccttcctggt ctccttcttc 180
atcatggcct gcgaccagta ccagtgttct atttctcacc ccctgctgga cctgtacaac 240
ggagatgcca ccctgttcac catctggaac cgagccccct ctttcacctg ggccgccgcc 300
aagatctacg ccatctgggt gaccttccag gtggtgctgt acatgtgcgt gcccgacttc 360
ctgcacaaga tcctccccgg ctacgtggga ggagtgcagg acggcgcccg aacccccgcc 420
ggactgatca acaagtacga ggtgaacggc ctccagtgct ggctgatcac ccacgtcctg 480
tgggtgctga acgcccagca cttccactgg ttctctccca ctatcatcat cgacaactgg 540
atccccctcc tgtggtgcac caacatcctg ggctacgccg tgtctacctt cgctttcatt 600
aaggcctacc tgttccccac taaccccgag gactgtaagt tcaccggcaa catgttctac 660
aactacatga tgggcatcga gttcaacccc cgaatcggca agtggttcga cttcaagctg 720
ttcttcaacg gacgacccgg catcgtggcc tggaccctga ttaacctgtc ctacgctgcc 780
aagcagcagg agctgtacgg atacgtgacc aactccatga tcctggtgaa cgtcctgcag 840
gccgtgtacg tggtggactt cttctggaac gaggcctggt acctgaaaac cattgacatt 900
tgtcacgacc acttcggatg gtacctgggc tggggcgact gcgtgtggct gcccttcctg 960
tacaccctcc agggcctgta cctggtgtac aaccccatcc agctgtccac cccccacgcc 1020
gccggcgtgc tgatcctggg cctggtgggc tactacatct tccgagtgac caaccaccag 1080
aaggacctgt tccgacgaac cgagggcaac tgttccatct ggggcaagaa gcccaccttc 1140
attgagtgtt cttaccagtc tgccgacggc gccatccaca agtccaagct gatgacctct 1200
ggcttctggg gcgtggcccg acacatgaac tacaccggag acctgatggg atctctggcc 1260
tactgcctgg cctgcggcgg caaccacctg ctcccctact tctacatcat ctacatgacc 1320
atcctgctcg tgcaccgatg catccgggac gagcaccgat gctctaacaa gtacggcaag 1380
gactgggagc gatacaccgc cgccgtgtct taccgactgc tgcccaacat cttctaa 1437

Claims (3)

1.强启动子TEF30，其核酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.含有权利要求1所述强启动子TEF30的重组解脂亚罗酵母，其特征在于，所述重组解脂亚罗酵母高效表达SEQ ID No.3所示的DHCR7基因。
3.权利要求1的强启动子TEF30在提高解脂亚罗酵母菜油甾醇产量中的应用。
CN202110938622.9A 2021-08-16 2021-08-16 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用 Active CN113604470B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110938622.9A CN113604470B (zh) 2021-08-16 2021-08-16 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110938622.9A CN113604470B (zh) 2021-08-16 2021-08-16 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113604470A CN113604470A (zh) 2021-11-05
CN113604470B true CN113604470B (zh) 2022-04-12

Family

ID=78308712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110938622.9A Active CN113604470B (zh) 2021-08-16 2021-08-16 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113604470B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110628737B (zh) * 2019-10-14 2022-06-07 南京农业大学 一个调控黄瓜矮化性状相关基因及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190881A (zh) * 2016-07-26 2016-12-07 天津大学 菌株及其构建方法、应用
CN107083338A (zh) * 2017-05-15 2017-08-22 天津大学 重组菌株及其构建方法与在产菜油甾醇中的应用
CN112980711A (zh) * 2021-03-18 2021-06-18 陕西师范大学 利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106190881A (zh) * 2016-07-26 2016-12-07 天津大学 菌株及其构建方法、应用
CN107083338A (zh) * 2017-05-15 2017-08-22 天津大学 重组菌株及其构建方法与在产菜油甾醇中的应用
CN112980711A (zh) * 2021-03-18 2021-06-18 陕西师范大学 利用强启动子高效全合成羟基酪醇的重组解脂亚罗酵母菌的构建方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Advances in synthetic biology of oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for producing non-native chemicals;Farshad Darvishi等;《Applied Microbiology and Biotechnology》;20180528;第102卷;第5925-5938页 *
Engineering Yarrowia lipolytica for Campesterol Overproduction;Du Hao-Xing等;《PLoS ONE》;20160111;第11卷(第1期);文章编号e0146773 *
重组解脂亚罗酵母合成微生物油脂的研究;董桂茹;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》;20180715(第07期);第B019-562页 *
重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇;谭思远等;《中国油脂》;20180820;第43卷(第08期);第109-114页 *
重组解脂亚罗酵母合成菜油甾醇的研究;谭思远;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 工程科技Ⅰ辑》;20190115(第01期);第B014-657页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113604470A (zh) 2021-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111434773B (zh) 一种高产檀香油的重组酵母菌及其构建方法与应用
CN106754993B (zh) 一种基因、重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用
CN110747178B (zh) 雷公藤细胞色素p450氧化酶在制备松香烷型二萜化合物中的应用
CN113604470B (zh) 一株高产菜油甾醇的重组解脂亚罗酵母T30pED、其构建方法及其应用
CN113416748A (zh) 一种合成***二酚的表达载体、异源表达方法及应用
CN116987603A (zh) 一种高产***萜酚酸的重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用
CN114606147B (zh) 一种同时增强和抑制酿酒酵母7-脱氢胆固醇合成中多个关键基因的方法
CN108929884B (zh) 通过合成生物学手段异源生物合成灵芝酸的方法
CN108034667A (zh) 一种红色红曲霉α-淀粉酶基因、其制备方法及应用
CN104830888B (zh) 一种新的新金色分枝杆菌表达体系及其在转化植物甾醇合成add中的应用
CN109136119B (zh) 微生物及其用途
CN114717124B (zh) 一株高产麦角甾醇的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用
CN110684795A (zh) 紫色红曲菌comp50904_c4基因过表达菌株的构建方法
CN111118052A (zh) 重组酿酒酵母菌及其构建方法以及生产羟基脂肪酸的应用
CN110628788A (zh) 紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法
CN113846111B (zh) 紫色红曲菌comp53355_c10基因过表达菌株的构建方法及其应用
CN114214219B (zh) 一种利用甲酸根助力游离脂肪酸生产的基因工程菌
CN113493758B (zh) 一株缩短发酵周期的产酪醇重组大肠杆菌及其应用
CN109777814B (zh) 神经酰胺合成酶基因在调控灵芝三萜生物合成中的应用
CN112646834A (zh) 一种羽扇豆醇衍生物及其合成方法和应用
CN107903227B (zh) 琥珀酸酐类化合物、与其相关的基因和蛋白及其制备方法
CN112795587A (zh) 一株产表面活性素的大肠杆菌工程菌及其构建方法与应用
CN114196641B (zh) 一种甾体C14α羟化酶、表达载体和工程菌及其应用
CN117327715B (zh) 一种假马齿苋P450酶基因BmCYP068及其应用
CN114410674B (zh) 一种提高衣藻半萜含量的转基因***及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220621

Address after: 712100 C1, torch Park, free trade street, Yangling Demonstration Zone, Xi'an City, Shaanxi Province

Patentee after: SHAANXI HEALTHFUL BIOLOGICAL ENGINEERING Co.,Ltd.

Address before: 710100 804, block a, Huihang Plaza, Hangtuo Road, aerospace base, Chang'an District, Xi'an City, Shaanxi Province

Patentee before: XI'AN HEALTHFUL BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

TR01 Transfer of patent right