CN115927436A - 一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种合成24‑表麦角固醇真菌的构建方法及其应用。将甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因或其突变体基因重组表达到产麦角固醇的真菌体内，构建得到合成24‑表麦角固醇的菌株；通过DWF1的定向进化提高其在真菌中对非天然底物24(28)‑脱氢麦角固醇的还原能力，结合高密度发酵，24‑表麦角固醇的产量提高至841.2mg/L；采用增强酯化、水解从而提升甾醇平衡的合成生物学策略，提高真菌内向24‑表麦角固醇的代谢流，并优化DWF1、ACC1基因的启动子、过表达ERG5，提高24‑表麦角固醇在甾醇中的比例，结合高密度发酵，使24‑表麦角固醇的产量提高至2.76g/L。

Description

一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用
技术领域
本发明涉及一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用，本发明在真菌中，通过基因编辑，获得了产24-表麦角固醇的重组真菌菌株，涉及合成生物学技术领域以及酶工程领域。
背景技术
油菜素内酯类化合物(Brassinosteroids，BRs)是一类在植物中具有高生理活性的天然类固醇内酯/酮物质，被认为是第六类植物激素。其在种子萌发、根系生长、繁殖等植物生长过程中起着至关重要的作用；同时，能够与其他植物激素相协调，调节植物氧化自由基的代谢、乙烯合成和根向重力反应，提高植物对如干旱、高盐、极端温度等苛刻环境的抗逆性。作为BRs中生物活性最高的化合物，油菜素内酯(Brassinolide，BL，又称芸苔素内酯)(图1)具有巨大的农业和工业应用潜力。
然而，由于油菜素内酯在植物中含量极少，即使在含量较高的花粉与种子中，含量仅仅是在1-100ng/g(鲜重)，远远不能满足研究以及农业应用的需求；考虑到BRs的结构复杂性，前人提出并尝试了基于天然甾醇的半合成方法。在半合成BL的尝试中，从海洋中一类稀有无脊椎动物(Crinoidea sp.)分离得到的海百合甾醇被认为是最佳的合成前体(图2)(M.J.Thompson,et al,Steroids,1981(38),567)，但是，海百合甾醇的稀缺性尤甚BL，不足以应用于BL的工业化合成。另外，前人也曾尝试借由较易获得的甾醇为底物，如麦角固醇或豆甾醇，氧化侧链生成甾醛，通过连接手性配件，，构建与BL相同手性的侧链，尤其是24-C的手性，合成BL(Fung,S.and Siddall.J.B,J.Am.Chem.Soc.,1980(102),6580；M.Sakakibara,et al,Heterocycles,1982(17),301；T.C.McMorris,et al,J.Chem.Soc.,Perkin Trans,1996(1),295；A.L.Hurski,et al,Org.Biomol.Chem.,2015(13),1446)，但由于合成步骤多、成本高、污染大等原因，都未实现工业化生产。鉴于天然BL的不可及性，研究人员转而研制活性相对较低但可以大量生产的其他BRs。迄今为止，有两种BRs已经在农业得到广泛的应用，即24-表油菜素内酯(24-Epi-brassinolide，EBL)和28-高油菜素内酯(28-Homo-brassinolide，HBL)(图1)，其半合成的前体分别是麦角固醇(T.C.Mcmorris,etal,J Org Chem,1993(58),2338)和豆甾醇(T.C.Mcmorris,et al,Phytochemistry,1994(36),585)(图2)。
近年来，合成生物学的发展为利用微生物细胞工厂高效、低成本生产复杂的天然产物(如BL)提供了可能性。然而BL的生物合成途径并没有完全阐明(图3)，因此，通过合成生物学，改造生长迅速且培养成本低廉的微生物，使其能大量合成具有与海百合甾醇相同侧链的甾醇，用以工业化生产BL，在当前情况下是最可行、最具应用前景的技术方案。
相较于目前已经规模生产的两种BR之一的EBL，BL的结构差别仅在于侧链24-C的手性，而这一手性结构源自于EBL的半合成前体麦角固醇。因此，本发明拟通过合成生物学手段对酵母的麦角固醇合成途径进行改造，使其转而合成24-表麦角固醇，后者就可以方便地用以合成BL。酵母麦角固醇合成途径中决定24-C手性的反应是ERG4催化的Δ24(28)不对称还原，通过比较各种植物和微生物甾类合成途径相关酶类的底物结构和反应手性选择性，我们发现用植物油菜素内酯合成途径中的甾醇Δ24(28)还原酶DWF1替代ERG4最有可能使酵母由麦角固醇合成转向24-表麦角固醇合成；同时，由于二者天然底物在结构上的较大差异，需要对DWF1进行改造以提高其对非天然底物的催化活性；其次，采用增强酯化、水解从而提升甾醇平衡的合成生物学策略，提高酵母内向24-表麦角固醇的代谢流；最后，进一步调整合成途径相关基因的表达水平，达到满意的24-表麦角固醇产量。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种合成24-表麦角固醇菌株的构建方法与应用。
本发明为达到上述目的所采用的技术方案是：
本发明首先提供了一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法，其包括如下步骤：将甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因或其突变体基因重组表达到产麦角固醇的真菌体内，构建得到合成24-表麦角固醇的菌株。
作为本发明的优选方案，所述产麦角固醇的真菌是产麦角固醇的真核微生物或其ERG4基因敲除的突变体，优选的是酵母科(Saccharomycetaceae)、菌核菌科(Sclerotiniaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)真核微生物或上述真核微生物的ERG4基因敲除的突变体，特别优选的是敲除ERG4基因的酿酒酵母。
作为本发明的优选方案，所述的DWF1突变体基因的获得方式包括如下步骤：
以植物来源的甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因为模板，在0.02-0.12mM Mn2+下进行易错PCR，构建DWF1突变体文库；
将DWF1突变体文库与线性化质粒pRS42H共转化ERG4敲除的产麦角固醇的真菌菌株，涂布在含有50-200μg/mL Hyg B的固体培养基上；将生长的菌株挑取至含有50-200μg/mL Hyg B以及ERG4敲除菌株生长抑制剂的培养基中培养；
挑取能够生长的菌株，接种至含有50-200μg/mL Hyg B的培养基中培养，进行液相分析，从而得到催化活性提高的DWF1突变体。
进一步的，所述的ERG4敲除菌株生长抑制剂为0.01wt％-0.05wt％十二烷基磺酸钠、2μg/mL-20μg/mL制霉菌素、10μg/mL-100μg/mL氟康唑中的一种或多种。
进一步的，所述的DWF1基因来源于产油菜素内酯类化合物的植物，优选为来源于唇形科、十字花科桑科植物，优选的是油菜素内酯类化合物含量较高的植物，特别优选的是匍匐筋骨草(Ajuga reptans,Ar)。
作为本发明的优选方案，所述构建方法进一步包括：使所得到的菌株通过CRISPR/Cas9编辑技术，在基因组16Ty3位点整合构建的ARE2、YEH1、YEH2表达盒序列SEQ ID NO.7，从而过表达ARE2、YEH1、YEH2基因，增强甾醇的酯化储存和水解释放的平衡。
作为本发明的优选方案，所述构建方法进一步包括：通过CRISPR/Cas9编辑技术，在ACC1基因的启动子处重组整合SEQ ID NO.8，替换ACC1基因启动子，过表达DWF1基因或其突变体基因，并通过CRISPR/Cas9编辑技术，在15Ty2位点整合构建的ERG5表达盒序列SEQID NO.9，过表达ERG5基因，从而在增强24-表麦角固醇合成的同时，提高24-表麦角固醇在甾醇中得的比例。
进一步的，所述DWF1基因编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
所述DWF1突变体基因为能编码下列氨基酸序列之一的基因：
(1)序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸序列；
(2)序列表中SEQ ID NO.3的氨基酸序列；
(3)序列表中SEQ ID NO.4的氨基酸序列；
(4)序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列；
(5)序列表中SEQ ID NO.6的氨基酸序列；
其中，序列表中SEQ ID NO.2的氨基酸序列编码的甾醇Δ24(28)还原酶命名为ArV143G，相对于野生型其第143位缬氨酸突变为甘氨酸；序列表中SEQ ID NO.3的氨基酸序列编码的甾醇Δ24(28)还原酶命名为ArM235T，相对于野生型其第235位甲硫氨酸突变为苏氨酸；序列表中SEQ ID NO.4的氨基酸序列编码的甾醇Δ24(28)还原酶命名为ArS306P，相对于野生型其第306位丝氨酸突变为脯氨酸；序列表中SEQ ID NO.5的氨基酸序列编码的甾醇Δ24(28)还原酶命名为ArY338H，相对于野生型其第338位酪氨酸突变为组氨酸；序列表中SEQID NO.6的氨基酸序列编码的甾醇Δ24(28)还原酶命名为Ar207，相对于野生型其第143位缬氨酸突变为甘氨酸，第306位丝氨酸突变为脯氨酸，第338位酪氨酸突变为组氨酸；
进一步的，所述植物来源甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因，来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana，At)、匍匐筋骨草(Ajuga reptans，Ar)、白菜(Brassica rapa,Br)或***(Cannabis sativa,Cs)。
进一步的，所述质粒为pRS42H质粒。
进一步的，所述产麦角固醇的真菌为酿酒酵母。
本发明还提供了一种合成24-表麦角固醇真菌，所述菌株通过上述的构建方法构建而成。
本发明还提供了上述的合成24-表麦角固醇真菌在生产24-表麦角固醇中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明提供了一种合成24-表麦角固醇真菌菌株的构建方法，所得的菌株可以提高24-表麦角固醇产量。本发明还提出了进一步优化的构建方法，使得所得的菌株增强24-表麦角固醇的合成能力的同时，还可以提升24-表麦角固醇在甾醇中得的比例。本发明建立了一种用于甾醇Δ24(28)还原酶(DWF1)催化活性改造的高通量筛选方法，通过该筛选方法，筛选得到4个点：V143G、M235T、S306P、Y338H，并通过组合突变的方式，得到最佳突变组合Ar207(ArDWF1V143G/S306P/Y338H)，使得24-表麦角固醇的合成效率得到明显提高，同时，借助基因编辑，在进一步提高24-表麦角固醇产量的基础上，还提升了24-表麦角固醇在甾醇中得的比例，为工业化发酵生产24-表麦角固醇提供了良好基础，同时，为BL的半合成提供了一种良好的前体。
本发明通过过表达甾醇酰基化酶ARE2、水解酶YEH1、YEH2，同时增强甾醇的酯化储存和水解释放，从而建立一个新的甾醇平衡，将酵母内的甾醇合成能力提升至一个新的阶段，是菌株YQE231的两倍。
本发明利用同源重组技术，将Ar207和ACC1的启动子替换成更强的启动子，同时，过表达ERG5，提高Ar207、ACC1和ERG5的表达水平，不仅增强了24-表麦角固醇的合成能力，还提升了24-表麦角固醇在甾醇中得的比例，从而减少了后期的纯化压力。
本发明所构建的菌株YQE734，通过高密度发酵，24-表麦角固醇的产量提高到至2.76g/L，相较于菌株YQE231提高了3.28倍。
附图说明
图1为油菜素内酯、24-表油菜素内酯、28高油菜素内酯结构图；
图2为分别以麦角固醇、豆甾醇、海百合甾醇、24-表麦角固醇合成24-表油菜素内酯、28高油菜素内酯和油菜素内酯合成图；
图3为植物中油菜素内酯的生物合成途径；
图4为24-表麦角固醇在酿酒酵母中的合成途径；
图5为工业菌株CICC4746与模式菌株BY4741的生长曲线；
图6为麦角固醇的标准曲线；
图7为不同SDS浓度下，具有产麦角固醇/24-表麦角固醇不同产量的菌的生长抑制情况，以确定适合高筛的SDS浓度；
图8为高筛获得的四个突变体(ArV143G、ArM235T、ArS306P、ArY338H)以质粒形式在模式菌株中的相对酶活；
图9为组合突变后，整合至工业菌株基因组后，24-表麦角固醇的产量；
图10为质粒(pRS42H)图谱。
图11为pEB-Y1A2Y2质粒图谱。
图12为pRS42H-PGAL1-Ar207质粒图谱。
图13为pRS42H-PCIT2-ERG5质粒图谱。
图14为结合过表达甾醇酰基化酶ARE2、水解酶YEH1、YEH2、替换Ar207和ACC1的启动子、过表达ERG5对24-表麦角固醇以及其前体产量的影响。YQE231代表出发菌株，作为对照组；YQE717代表甾醇酰基化酶ARE2、水解酶YEH1、YEH2过表达菌株；YQE729代表在YQE717基础上Ar207和ACC1的启动子替换菌株；YQE734代表在YQE729基础上ERG5过表达菌株。
图15为YQE734的高密度发酵图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
本发明培养基如下：
(1)YPD培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡糖糖)，固体培养基加入2％琼脂粉，115℃灭菌，用于酿酒酵母活化和预培养。
(2)YPD(HygB/G418)培养基(1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡糖糖，100μg/mL HygB，200μg/mL G418)，固体培养基加入2％琼脂粉，115℃灭菌，用于筛选KanMX标记。
(3)LB培养基(1％氯化钠，1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉)，固体培养基加入2％琼脂粉，121℃灭菌，用于大肠杆菌活化和预培养。
(4)LB(Amp)培养基(1％氯化钠，1％胰蛋白胨，0.5％酵母粉,100μg/mL氨苄青霉素)，固体培养基加入2％琼脂粉，121℃灭菌，用于含有质粒的大肠杆菌培养。
本发明的构建方法所针对的菌株对象可以是任意的产麦角固醇的真菌，麦角固醇是自然界中真菌细胞膜的组成成分，真菌基本上都产麦角固醇。典型的，可以选用酿酒酵母。本实施例中以工业酿酒酵母CICC1746为主要的实验对象，但也可以选择其他酿酒酵母或产麦角固醇的真菌。以下工业酿酒酵母(菌株编号：CICC1746)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，模式菌株BY4741购自美国ATCC菌种保藏管理中心。
本发明所使用质粒pRS42H图谱如图10所示；
本发明所使用质粒pEB-Y1A2Y2图谱如图11所示；
本发明所使用质粒pRS42H-PGAL1-Ar207图谱如图12所示；
本发明所使用质粒pRS42H-PCIT2-ERG5图谱如图13所示；
实施例1：构建ERG4敲除酵母菌株YQE101、YQE102
以工业酿酒酵母CICC1746基因组为模板，通过引物erg4Δ-U-F(SEQ ID NO.10)/erg4Δ-U-R(SEQ ID NO.11)进行PCR扩增得到ERG4位点上游449bp同源臂片段erg4Δ-U，引物erg4Δ-D-F(SEQ ID NO.12)/erg4Δ-D-R(SEQ ID NO.13)进行扩增得到ERG4位点下游446bp同源臂片段erg4Δ-D；通过重叠延伸PCR，将扩增得到的2个片段连接起来，得到Kerg4片段；通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述Kerg4片段转化模式菌株BY4741以及工业酿酒酵母菌株CICC1746；利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在ERG4-gRNA(SEQ ID NO.59)的引导下对ERG4位点进行双链断裂切割DNA，通过含有100μg/mL Hyg B和200μg/mL G418的YPD培养基筛选转化阳性克隆获得ERG4位点敲除的YQE101(BY4741；erg4Δ)、YQE102(CICC1746；erg4Δ)；
实施例2：构建产24-表麦角固醇的酿酒酵母菌株YQE224
以生工生物工程(上海)股份有限公司合成的带有来源于Ajuga reptans的甾醇Δ24(28)还原酶ArDWF1质粒为模板，通过引物VArDWF1-F(SEQ ID NO.16)/VArDWF1-R(SEQ IDNO.17)进行PCR扩增得到ArDWF1片段；通过无缝克隆将ArDWF1片段连接到已线性化的pRS42H质粒上，得到基因表达质粒pRS42H-ArDWF1；以质粒pRS42H-ArDWF1为模板，通过引物Dor.-16Ty1-PTEF1(SEQ ID NO.14)/Dor.-16Ty1-PADH2(SEQ ID NO.15)进行PCR扩增得到ArDWF1表达框；通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述ArDWF1表达框转化YQE102；利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在16Ty1-gRNA(SEQ ID NO.60)的引导下对16Ty1位点进行双链断裂切割DNA，构建得到产24-表麦角固醇的YQE224，通过YPD摇瓶发酵验证与液相检测，其24-表麦角固醇产量达到13.97mg/L；
实施例3：ArDWF1催化活性改造高通量筛选方法的建立
在敲除基因ERG4后，酵母细胞，如YQE101、YQE102，因缺乏24(28)位双键的还原酶，将会积累24(28)-脱氢麦角固醇为甾醇合成途径最终的产物，而由于麦角固醇的缺乏，酵母细胞将会对生长环境表现出一定的生长缺陷，表现为对抗生素、金属离子以及SDS的耐受减弱；而24-表麦角固醇在结构上与麦角固醇相比，仅24-C手性存在差异，因此，可以根据耐受减弱的程度，将生长情况与24-表麦角固醇的浓度相偶联，作为高通量筛选的方法。为确保筛选过程的灵敏性和准确性，首先对实验中可能影响的因素进行优化。
首先是菌株的选择，由于工业菌CICC1746与模式菌BY4741在生长情况上存在明显的差异(图5)，为了方便于筛选方法的构建，选用模式菌BY4741的ERG4敲除菌YQE101为高筛的宿主菌；其次，为确定最佳的SDS筛选浓度，测定产不同量麦角固醇/24-表麦角固醇的菌株(YQP1：BY4741带有质粒pRS42H；YQP2：YQE101带有质粒pRS42H；YQP3：YQE101带有质粒pRS42H-AtDWF1，来源于拟南芥Arabidopsis thaliana；YQP4：YQE101带有质粒pRS42H-ArDWF1)，在不同SDS浓度下的生长抑制情况，图6与图7所示，选择100μg/mL HygB+0.025％SDS的YPD作为高筛条件。
实施例4：突变体文库的构建与高通量筛选
以ArDWF1编码基因为模板，通过引物Ep-ArDWF1-F(SEQ ID NO.18)/Ep-ArDWF1-R(SEQ ID NO.19)在0.07mM Mn2+下进行易错PCR，构建ArDWF1的突变体文库；同时，使用限制性内切酶Hind III和BamH I线性化质粒pRS42H，通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述ArDWF1突变体文库与线性化好的pRS42H以mol比6:1共转化YQE101，ERG4敲除菌株YQE101的同源重组酶将ArDWF1突变体文库与线性化好的pRS42H连接成一个完整的质粒，通过含有100μg/mL潮霉素B(Hyg B)以及0.01％十二烷基磺酸钠(SDS)的平板筛选阳性克隆获得ArDWF1突变质粒重构成功的酿酒酵母菌株；将携带有ArDWF1突变质粒重构成功的酿酒酵母菌株挑取至含有100μg/mL Hyg B以及0.025％ SDS的2mL YPD(葡萄糖2％w/v，酵母提取物1％w/v，蛋白胨2％w/v))的24孔板中，培养3天；挑取菌浓(OD600)有明显提高的菌液，接种至含有100μg/mL Hyg B的5mL YPD试管中，培养4天，进行液相复筛。因突变体以游离质粒的形式在模式菌株中表达，需要培养基中添加抗生素以维持质粒，而这会对菌体的生长有一定的影响，故以24-表麦角固醇与24(28)-脱氢麦角固醇的比值定义为相对DWF1活力，作为主要的比较对象。如图8所示，最终获得4个相对DWF1活力比野生型ArDWF1明显提高的突变体(ArV143G、ArM235T、ArS306P、ArY338H)。
实施例5：ArDWF1的组合突变
以重组质粒pRS42H-ArDWF1为模板，将获得的4个相对DWF1活力比野生型ArDWF1明显提高的突变点V143G、M235T、S306P、Y338H，进行组合突变；V143G对应的引物为Ar-V143G-F(SEQ ID NO.20)/Ar-V143G-R(SEQ ID NO.21)，M235T对应的引物为Ar-M235T-F(SEQ IDNO.22)/Ar-M235T-R(SEQ ID NO.23)，S306P对应的引物为Ar-S306P-F(SEQ ID NO.24)/Ar-S306P-R(SEQ ID NO.25)，Y338H对应的引物为Ar-Y338H-F(SEQ ID NO.26)/Ar-Y338H-R(SEQ ID NO.27)；以组合突变后的质粒为模板，通过带有50bp同源臂的引物Dor.-16Ty1-PTEF1(SEQ ID NO.14)/Dor.-16Ty1-PADH2(SEQ ID NO.15)进行PCR扩增得到ArDWF1组合突变表达框，通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，转化至ERG4敲除的工业酵母YQE102中，借助CRISPR-cas9基因编辑工具，整合至基因组上，得到菌株YQE231。如图9所示，通过YPD摇瓶发酵验证与液相检测，确定最佳组合突变体Ar207(V143G/S306P/Y338H)，其24-表麦角固醇产量达到46.72mg/L，较野生型ArDWF1，产量提高了334.4％。
实施例6：发酵、后处理与液相检测
将成功编辑的转化子分别划线YPD平板，30℃培养48h，挑单克隆接种5mL YPD液体培养基，30℃、220rpm培养96h，培养结束后，收集500μL发酵液，离心去上清，加入600μL乙醇-KOH溶液(50％乙醇中加入25％[w/v]KOH)，充分涡旋后，沸水浴皂化处理1h，冷却至室温，加入400μL水以及800μL石油醚，充分涡旋后，取上层石油醚萃取液500μL真空抽干，加入500μL无水乙醇重溶，0.22μm PVDF滤膜过滤至液相检测瓶内插管中，作为检测样品。样品中的代谢产物通过Agilent1160高效液相分析代谢产物含量，色谱柱型号为Thermo C-18column(ODS Hypersil,4.6×250mm,5μm)，检测波长为280nm，分析柱稳维持恒定30℃，流动相为：甲醇:乙腈＝80:20，使用麦角固醇标准品配置的溶液制作标准曲线，定量分析。
实施例7：一种构建ARE2、YEH1、YEH2过表达菌株的方法
用于构建ARE2、YEH1、YEH2过表达菌株的质粒pEB-Y1A2Y2，其构建步骤如下：
以质粒pRS42H为模板，用引物pEB-TADH2-R(SEQ ID NO.28)和pEB-PTEF1-F(SEQ IDNO.29)扩增获得PTEF1-HindIII-BamHI-TADH2片段；以酿酒酵母CICC1746基因组为模板，用引物pEB-PTDH3-F(SEQ ID NO.30)和pEB-PTDH3-R(SEQ ID NO.31)扩增获得PTDH3-XhoI-AflII片段，用引物pEB-TCYC1-F(SEQ ID NO.32)和pEB-TCYC1-R(SEQ ID NO.33)扩增获得XhoI-AflII-TCYC1片段，用引物pEB-PFBA1-F(SEQ ID NO.34)和pEB-PFBA1-R(SEQ ID NO.35)扩增获得PFBA1-EcoRI-BlnI片段，用引物pEB-TPGK1-F(SEQ ID NO.36)和pEB-TPGK1-R(SEQ ID NO.64)扩增获得EcoRI-BlnI-TPGK1片段，片段之间有同源序列，利用重叠延伸PCR融合片段并使用
Figure BDA0003968187120000101
-Blunt Simple Cloning Vectors试剂盒，构建得到pEB
以酿酒酵母CICC1746基因组为模板，用引物VYEH1-F(SEQ ID NO.37)和VYEH1-R(SEQ ID NO.38)扩增获得YEH1片段，用引物PTDH3-ARE2(SEQ ID NO.39)和ARE2-TCYC1(SEQ IDNO.40)扩增获得ARE2片段，用引物PPBA1-YEH2(SEQ ID NO.41)和YEH2-TPGK1(SEQ ID NO.42)扩增获得YEH2片段，通过酶切重组，构建得到pEB-Y1A2Y2。
ARE2、YEH1、YEH2过表达菌株的构建，其具体步骤如下：
(1)通过带有50bp同源臂的引物Dor.-16Ty3-1-TADH2(SEQ ID NO.43)/Dor.-16Ty3-1-TPGK1(SEQ ID NO.44)进行PCR扩增得到ARE2、YEH1、YEH2表达盒；
(2)并通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述ARE2、YEH1、YEH2表达盒转化酿酒酵母菌株YQE231以及YQE102；
(3)利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在16Ty3-gRNA(SEQ ID NO.61)的引导下对16Ty3位点进行双链断裂切割DNA，整合到酿酒酵母基因组上，涂布HygB/G418平板，筛选阳性克隆菌株。
(4)从平板上挑选出单菌落，在摇瓶中过夜培养，提取基因组，PCR验证ARE2、YEH1、YEH2表达盒是否整合到基因组上的16Ty3位点。
(5)根据PCR验证结果，筛选出阳性克隆，构建得到YQE717(YQE231；16Ty3::TADH2-YEH1-PTEF1-PTDH3-ARE2-TCYC1-PFBA1-YEH2-TPGK1)以及YQE103(YQE102；16Ty3::TADH2-YEH1-PTEF1-PTDH3-ARE2-TCYC1-PFBA1-YEH2-TPGK1)。
(6)通过发酵、后处理与液相检测，如图14所示，YQE717在总甾醇产量以及24-表麦角固醇产量上有明显的提高，在摇瓶水平，总甾醇产量和24-表麦角固醇产量分别达到了220.07mg/L和71.04mg/L，分别是菌株YQE231的2.09倍和1.53倍。
实施例8：ARE2、YEH1、YEH2转录水平测定。
将出发菌株(YQE231)和过表达菌株(YQE717)培养在在液体YPD培养基中。在摇瓶发酵过程中第12小时、24小时、36小时、48小时和72小时分别取1mL发酵液。
用RNA提取试剂盒TRIzol(invitrogen)提取各个样品的总RNA。使用反转录试剂盒(TOYOBO)去除基因组DNA并反转录获得cDNA。实验操作按试剂盒说明书进行。
以ACT1基因为内参，对ARE2、YEH1、YEH2做实时荧光定量PCR，获得扩增曲线，记录CT值。用2-△△CT计算ARE2、YEH1、YEH2的相对转录水平。
实施例9：替换ACC1以及ArDWF1突变体Ar207启动子的菌株。
用于替换ACC1以及ArDWF1突变体Ar207的启动子的质粒pRS42H-PGAL1-Ar207，其步骤如下：
以pRS42H-Ar207为模板，用引物R-pRS42H-207-F(SEQ ID NO.45)和R-pRS42H-207-R(SEQ ID NO.46)反向扩增获得去除启动子的片段，以CICC1746基因组为模板，用引物PGAL10-GAL1-F(SEQ ID NO.47)和PGAL10-GAL1-R(SEQ ID NO.48)扩增获得PGAL10-PGAL1片段。通过重组，构建得到pRS42H-PGAL1-Ar207。
替换ACC1以及ArDWF1突变体Ar207启动子的菌株的构建，其具体步骤如下：
(1)通过带有50bp同源臂的引物Dor.-PACC1-PGAL10(SEQ ID NO.49)/Dor.-PACC1-TADH2(SEQ ID NO.50)进行PCR扩增得到PGAL10-PGAL1-Ar207表达盒；
(2)并通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述PGAL10-PGAL1-Ar207表达盒转化酿酒酵母菌株YQE103；
(3)利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在PACC1-gRNA(SEQ ID NO.62)的引导下对ACC1启动子PACC1位点进行双链断裂切割DNA，整合到酿酒酵母基因组上，涂布HygB/G418平板，筛选阳性克隆菌株。
(4)从平板上挑选出单菌落，在摇瓶中过夜培养，提取基因组，PCR验证PGAL10-PGAL1-Ar207表达盒是否整合到基因组上的ACC1启动子PACC1位点。
(5)根据PCR验证结果，筛选出阳性克隆，构建得到YQE729。
(6)通过发酵、后处理与液相检测，如图14所示，YQE729在24-表麦角固醇产量上有明显的提高，在摇瓶水平，24-表麦角固醇达到了160.84mg/L，为YQE717的2.26倍。
实施例10：一种构建ERG5过表达菌株的方法
用于构建ERG5过表达菌株的质粒pRS42H-PCIT2-ERG5，其步骤如下：
以pRS42H-Ar207为模板，用引物R-pRS42H-207-F和R-pRS42H-207-R反向扩增获得去除启动子的片段，以CICC1746基因组为模板，用引物PCIT2-F(SEQ ID NO.51)和PCIT2-R(SEQID NO.52)扩增获得PCIT2片段。通过重组，构建得到pRS42H-PCIT2-Ar207。
以pRS42H-PCIT2-Ar207为模板，用引物R-PCIT2-R(SEQ ID NO.53)和R-TADH2-F(SEQID NO.54)反向扩增，得到骨架片段，以CICC1746基因组为模板，用引物ERG5-F(SEQ IDNO.55)和ERG5-R(SEQ ID NO.56)扩增得到ERG5的片段，通过重组，构建得到pRS42H-PCIT2-ERG5
ERG5过表达菌株的构建，其具体方法如下：
(1)通过带有50bp同源臂的引物Dor.-15Ty2-F(SEQ ID NO.57)/Dor.-15Ty2-R(SEQ ID NO.58)进行PCR扩增得到ERG5表达盒；
(2)并通过醋酸锂/PEG3350化学转化方法，将上述ERG5表达盒转化酿酒酵母菌株；
(3)利用CRISPR-Cas9基因编辑工具，在15Ty2-gRNA(SEQ ID NO.63)的引导下对15Ty2进行双链断裂切割DNA，整合到酿酒酵母YQE729基因组上，涂布HygB/G418平板，筛选阳性克隆菌株。
(4)从平板上挑选出单菌落，在摇瓶中过夜培养，提取基因组，PCR验证ERG5表达盒是否整合到基因组上的15Ty2位点。
(5)根据PCR验证结果，筛选出阳性克隆，构建得到YQE734。
(6)通过发酵、后处理与液相检测，如图14所示，YQE734在24-表麦角固醇在总甾醇中的比例有明显的提高，在摇瓶水平，24-表麦角固醇在产量171.31mg/L的基础上，其比例提升至75.44％，是YQE729的1.27倍。
实施例11：改造菌株发酵罐发酵验证
将单菌落接种到5mL YPD培养基中，30℃、220rpm下培养24h，以2％的接种量(v/v)接种至2个50mL YPD的摇瓶中。培养20h后，将2个摇瓶中的培养液接种至2L生物反应器中(发酵罐培养基配方10g/L D-葡萄糖、10g/L(NH4)2SO4、8g/L KH2PO4、3g/L MgSO4、0.72g/LZnSO4·7H2O、10mL/L微量金属溶液和12mL/L维生素溶液，接种后发酵初始体积为1L)。
发酵罐参数设定：温度设定为30℃，补加氨水控制pH维持在5.0，通过调节搅拌速率(300rpm至950rpm)和气流速率(1vvm至3vvm)，将溶氧保持在>25％的饱和度。在初始培养基中的碳源利用完后，根据拟指数补料模型，将含有500g/L葡萄糖和12mL/L维生素溶液的补料液补料到发酵罐中；当罐中菌体OD600长至200左右时，以6mL/h的速率流加无水乙醇直至发酵结束。拟指数补料阶段的补料速率FS由以下等式确定：
Figure BDA0003968187120000131
式中，X0、V0和S为初始生物量密度(gDCW/L)、初始培养体积(L)和培养基中的葡萄糖浓度(g/L)；YX/S是细胞生物量对葡萄糖的产率(gDCW/g葡萄糖)；μ是比生长速率(h-1)；m是维持系数(g葡萄糖/gDCW/h)，t是开始补料后的时间(h)。比生长速率设定为0.12h-1，YX/S设定为0.5，m设定为0.05。
发酵结束后，HPLC检测YQE734菌株的24-表麦角固醇产量，检测结果显示(图15)，带有组合突变后的Ar207菌株YQE734，在2L发酵罐产24-表麦角固醇产量为2.76g/L，相较于出发菌株提高了3.28倍。为该菌株工业化产24-表麦角固醇奠定良好的基础。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法，其特征在于，将甾醇Δ24(28)还原酶DWF1或DWF1突变体基因重组表达到产麦角固醇的真菌体内，构建得到合成24-表麦角固醇的菌株。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述产麦角固醇的真菌是产麦角固醇的真核微生物或其敲除了ERG4基因的突变体，优选的是酵母科(Saccharomycetaceae)、菌核菌科(Sclerotiniaceae)、枝孢霉科(Cladosporiaceae)、肉座菌科(Hypocreaceae)、发菌科(Trichocomaceae)、曲霉菌科(Aspergillaceae)、白蘑科(Tricholomataceae)真核微生物或上述真核微生物的ERG4基因敲除的突变体，特别优选的是敲除ERG4基因的酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的DWF1突变体基因的获得方式包括如下步骤：
以植物来源的甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因为模板，在0.02-0.12mM Mn2+下进行易错PCR，构建DWF1突变体文库；
将DWF1突变体文库与线性化质粒pRS42H共转化ERG4敲除的产麦角固醇的真菌菌株，涂布在含有50-200μg/mL Hyg B的固体培养基上；将生长的菌株挑取至含有50-200μg/mL HygB以及ERG4敲除菌株生长抑制剂的培养基中培养；
挑取能够生长的菌株，接种至含有50-200μg/mL Hyg B的培养基中培养，对培养得到的菌体进行皂化处理、萃取并液相分析，筛选出酶活提高的菌株；提取酶活提高菌株的质粒，对质粒进行测序分析，从而得到催化活性提高的DWF1突变体序列。
4.根据权利要求1或3所述的构建方法，其特征在于，所述的甾醇Δ24(28)还原酶DWF1基因来源于产油菜素内酯类化合物的植物，优选的是来源于唇形科、十字花科、桑科植物，特别优选的是来源于匍匐筋骨草(Ajuga reptans,Ar)。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的ERG4敲除菌株生长抑制剂为0.01wt％-0.05wt％十二烷基磺酸钠、2μg/mL-20μg/mL制霉菌素、10μg/mL-100μg/mL氟康唑中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法进一步包括：使权利要求1所述方法得到的菌株通过CRISPR/Cas9编辑技术，在基因组16Ty3位点整合构建的ARE2、YEH1、YEH2表达盒序列SEQ ID NO.7，从而过表达ARE2、YEH1、YEH2基因，增强甾醇的酯化储存和水解释放的平衡。
7.根据权利要求1或6所述的构建方法，其特征在于，所述构建方法进一步包括：权利要求1或6所述方法得到的菌株通过CRISPR/Cas9编辑技术，在ACC1基因的启动子处重组整合SEQ ID NO.8，替换ACC1基因启动子，过表达DWF1基因或其突变体基因，并通过CRISPR/Cas9编辑技术，在15Ty2位点整合构建的ERG5表达盒序列SEQ ID NO.9，过表达ERG5基因，从而在增强24-表麦角固醇合成的同时，提高24-表麦角固醇在甾醇中得的比例。
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述DWF1基因为编码如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的基因；所述DWF1突变体基因为编码如下任一氨基酸序列的基因：SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6。
9.一种合成24-表麦角固醇真菌，其特征在于，所述菌株通过权利要求1-8任一项所述的构建方法构建而成。
10.一种权利要求9所述的合成24-表麦角固醇真菌在生产24-表麦角固醇中的应用。
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WO2024114495A1 (zh) * 2022-11-28 2024-06-06 宁波新比欧生物科技有限公司 一种合成24-表麦角固醇真菌及其构建方法与应用

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2008209729B2 (en) * 2007-01-30 2013-05-09 Cropdesign N.V. Plants having enhanced yield-related traits and a method for making the same
JP5889200B2 (ja) * 2009-12-03 2016-03-22 ディーエスエム アイピー アセッツ ビー．ブイ． 酵母による非酵母ステロールの生成
JP2012239412A (ja) * 2011-05-18 2012-12-10 Kirin Holdings Co Ltd ステロイド骨格の２４位を還元する酵素をコードする遺伝子
CN112813129B (zh) * 2021-02-05 2023-09-08 江南大学 利用区室化提高酵母菌中7-脱氢胆固醇产量的方法
GB202116694D0 (zh) * 2021-11-19 2022-01-05 Univ Oxford Innovation Ltd
CN115927436A (zh) * 2022-11-28 2023-04-07 浙江大学 一种合成24-表麦角固醇真菌的构建方法与应用

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024114495A1 (zh) * 2022-11-28 2024-06-06 宁波新比欧生物科技有限公司 一种合成24-表麦角固醇真菌及其构建方法与应用

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