CN110982722A - 一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种高效合成α‑香树脂醇的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)构建的方法，属于生物工程领域。本发明首先对来源于苹果(Malus domestica)的α‑香树脂醇合酶进行半理性设计，通过关键氨基酸残基位点饱和突变与迭代突变获得一系列突变体，其中包括催化活性最高的MdOSC1突变体。然后将α‑香树脂醇合成途径中的关键基因过表达，同时过表达二酰甘油酰转移酶(DGA1)，提高酿酒酵母细胞中α‑香树脂醇的存贮能力。本发明所述方法构建的高产α‑香树脂醇酿酒酵母工程菌株，产量达到213.79mg/L，实现了酿酒酵母中α‑香树脂醇的高效生产，该工程菌在生产中具有重要意义。

Description

一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法及应用。
背景技术
α-香树脂醇是重要的乌索烷型五环三萜类化合物，具有多种常见的生物活性，包括抗肿瘤、抗炎、抗氧化、免疫增强和肝脏保护，且具有最强的抗增殖活性。作为植物次生代谢产物，α-香树脂醇在植物的叶片、果实及根茎中广泛分布，但积累量微小。传统的化学合成与植物源提取效率低、得率有限，且周期长，污染严重。随着合成生物学和代谢工程的迅速发展，构建异源基因整合的重组微生物工程菌可作为生产α-香树脂醇的解决方案以满足市场需求，具有可观的经济效益和社会效益。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为真核模式微生物，遗传背景清晰，基因操作简单，且具有完整的细胞内膜***，其内源的MVA途径能够为萜类化合物提供更多的合成前体，被认为是萜类合成的适宜底盘宿主。
截至目前，酵母已作为细胞工厂完成了大量的天然产物的生产。借助传统的代谢工程策略提高其产量，包括目标产物合成途径关键基因的过度表达、竞争途径的下调和平衡、途径中间体的利用等手段已被广泛应用，此外，提高酿酒酵母对疏水性化合物的储存能力可增加α-香树脂醇前体(3s)-2,3-氧化鲨烯的积累，有望提高α-香树脂醇的产量。
更为重要的是，α-香树脂醇合酶的催化活性极大影响了α-香树脂醇产量，故我们对α-香树脂醇合酶进行(半)理性设计和改造，以提高酶的催化活性与特异性。我们采用的半理性设计方法，基于晶体结构和计算模型创建一个相对于定向进化小而精准的突变库，把活性位点和底物结合位点周围的残基作为诱变的最佳候选，修饰在后产生催化活性或特异性提高的α-香树脂醇合酶。通过在酿酒酵母中引入α-香树脂醇合酶实现植物天然产物α-香树脂醇的微生物生产，将蛋白质工程与代谢工程结合，进一步优化酿酒酵母细胞工厂，提高α-香树脂醇产量，这些研究都为利用酿酒酵母高效生产植物天然产物提供有价值的参考资料。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法，包括高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建。
如权利要求书1,2,3所示，酶的半理性设计，包括：对来源于苹果的α-香树脂醇合酶MdOSC1(Malus domestica，GenBank注册序列号为ACM89977.1)进行半理性设计，借助在线工具Swiss-Model，以人源羊毛甾醇合酶(PDB:1W6K)的晶体结构为模板进行同源建模，同时利用在线工具Pub chem
(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)预测底物(3S)-2,3-氧化鲨烯的3D结构，利用Autodock1.5.6软件进行分子对接。
如权利要求书1,2,4所示，α-香树脂醇合酶突变体的构建，包括：完成α-香树脂醇合酶MdOSC1与底物(3S)-2,3-氧化鲨烯进行分子对接后，选择距离底物结合结构域较近的序列(353DQIHYEDENSRYITIGCVEKPLMML377)、催化结构域附近的序列(249LPFHPSKMFCYCRLTYLPMS268)、以及N末端部分序列(2WKIKFGEGANDPMLFSTNNFHGRQ25)作为突变位点，对其进行丙氨酸扫描突变。在突变后催化活性明显增强的氨基酸残基中，选择活性中心附近的非极性氨基酸残基P250、P373与活性中心外的极性氨基酸残基N11进行饱和突变。
如权利要求书1,2,5所示,高活性α-香树脂醇合酶突变体中一系列突变体的获得，包括：将催化活性较高的单点突变体N11I、P250N、P373A作为迭代突变体的候选突变位点，进一步组合，利用含有单点突变的α-香树脂醇合酶质粒为模板，构建α-香树脂醇合酶迭代突变体生成双突变体和三突变体，最终获得催化活性最高的α-香树脂醇合酶突变体MdOSC1-1。导入酿酒酵母原始菌株Insc1得到菌株aAM8，就在酿酒酵母中α-香树脂醇的产量而言，aAM8较导入MdOSC1基因的菌株MdOSC1提高了1310％。
如权利要求书6,7所示，构建过表达α-香树脂醇合成途径中的关键酶的高拷贝质粒：在pYYG载体上构建α-香树脂醇合酶突变体MdOSC1-1表达盒。
如权利要求书6,7所示，构建α-香树脂醇合成途径中的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶的过表达方法：构建PTEF1-HIS3-TADH1基因表达盒转化并整合到酿酒酵母Ⅻ染色体的rDNA位点，向其rDNA位点导入截短的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶表达盒PTDH3-tHMG1-THMG1和PTEF1-HIS3-TADH1。
如权利要求书9所示，构建在基因组高拷贝位点整合酿酒酵母内源性二酰甘油酰转移酶(DGA1)的重组菌株，具体为：以酿酒酵母INVSc1(MATa/MATαhis3Δ1leu2 trp1-289ura3-52)作为底盘宿主菌，通过同源重组技术向其Δ位点导入酿酒酵母内源性代谢相关基因二酰甘油酰转移酶(DGA1)表达盒，借此提高酿酒酵母对疏水性油脂类物质的储存能力，其中所构建的表达盒为“PADH1-DGA1-TDGA1”。
如权利要求书8,10所示，所构建重组菌株，包括上述6,7,9全部整合，最终得到MVA途径强化表达与产物存储能力强化的酿酒酵母工程菌aAM15。实验证明，通过同源重组的方法，获得的α-香树脂醇高产工程菌aAM15，α-香树脂醇产量达到213.79mg/L，比未进行蛋白质工程与代谢工程改造菌株提高了93.6倍。本发明为酿酒酵母中α-香树脂醇的高效生产提供了依据与指导。
本发明的酿酒酵母工程菌具有以下优点：
1、本发明中α-香树脂醇合酶的表达利用半乳糖诱导，从而实现在特定阶段生产α-香树脂醇，降低α-香树脂醇对酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞的伤害，提高产量。
2、本发明利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为底盘宿主，通过半理性设计改造α-香树脂醇合酶，获得催化活性大幅度提高的突变体MdOSC1-1，可应用于下游其他代谢产物(如熊果酸等)的高效合成。
3、本发明中酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)工程菌利用葡萄糖和半乳糖直接合成大量α-香树脂醇，实现了该种植物次生代谢产物在酿酒酵母中的高效合成，解决了早期化学合成和分离萃取产量低的问题，推动α-香树脂醇的工业化生产。
附图说明
图1为高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母细胞工厂的构建策略。
图2为利用Pymol软件对α-香树脂醇合酶MdOSC1和(3S)-2,3-氧化鲨烯对接模型进行分析。
图3为专利设计过程中构建的所有α-香树脂醇合酶MdOSC1突变体的产量情况。
图4是专利构建中的酿酒酵母工程菌株生产α-香树脂醇的气相质谱分析检测和产量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的PCR引物(表1)序列：
表1 PCR引物序列
Figure BDA0002333524810000031
实施例1 MdOSC1突变体筛选
为了对来自于苹果的野生型α-香树脂醇合酶MdOSC1进行分子对接，本研究利用PDB数据库(http://www.wwpdb.org)中已报道的人源羊毛甾醇合酶(PDB：1W6K)的X射线晶体结构作为同源蛋白质模板，通过在线工具SWISS-MODEL(http://www.swissmodel.expasy.org)对MdOSC1的3D结构进行同源建模。同时利用在线工具Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)预测底物(3S)-2,3-氧化鲨烯的3D结构，分别下载MdOSC1和(3S)-2,3-氧化鲨烯的结构文件，使用AutoDock 1.5.6进行分子对接模拟，分别导入MdOSC1和(3S)-2,3-氧化鲨烯的结构文件，其中(3S)-2,3-氧化鲨烯(PubChem CID：5459811)作为底物，按照以下程序进行操作：
Edit>Charges>Add Kollman Charges
Edit>Hydrogens>Add(Hydrogens)>Polar Only>OK
WithBondOrder
Yes
Grid>Macromolecule>choose>pdb name>Select Molecule
此操作若顺利打开文件，保存待对接分子文件(receptor)，保存格式为.pdbqt
Grid>Grid box>Spacing(angstrom)＝1
Number of points in x-dimension
Number of points in y-dimension
Number of points in z-dimension
以MdOSC1的底物结合结构域和催化结构域之间的区域作为分子对接中心，设置Grid box参数为80×80×80(x center，y center和z center)的分子对接区域，使晶格中心能够在蛋白质分子中心。打开终端，进入目的文件夹(进入方法：cd/下一级目录)，以默认安装路径为例，使用之前保存的α-香树脂醇合酶MdOSC1和(3S)-2,3-氧化鲨烯的结构文件.pdbqt以及Grid box参数.txt内信息作为参考，执行如下命令：C:\Program Files\TheScripps Research Institute\Vina>vina.exe–MdOSC1.pdbqt–Ligand.pdbqt–center_x–center_y–center_z–size_x–size_y–size_z–out Result–-&--&--，输入“Enter”确认，等待结果，同时生成分子对接打分表，按照对接可能性从高到低进行排序。
通过PyMOL软件对所创建的底物对接模型进一步分析，以检查和鉴定结合口袋(484DCTAE488)和MdOSC1的催化位点(256MFCYCR261)周围的关键氨基酸残基，选择底物结合结构域附近的序列(353DQIHYEDENSRYITIGCVEKPLMML377)、催化结构域附近的序列(249LPFHPSKMFCYCRLTYLPMS268)、以及N末端部分序列(2WKIKFGEGANDPMLFSTNNFHGRQ25)作为突变位点，利用丙氨酸扫描突变，分别将候选氨基酸残基位点突变为丙氨酸，转化酿酒酵母，GC-MS检测α-香树脂醇的产量，选择MdOSC1突变体中产量明显变化的突变体，再以MdOSC1单点突变体为模板，将催化活性较高的单点突变体进一步组合生成双突变体和三突变体，转化酿酒酵母，GC-MS检测α-香树脂醇的产量，筛选能进一步提高MdOSC1催化活性的迭代突变体。
实施例2 突变体MdOSC1-1高表达质粒构建
pYYG载体是基于pESC质粒进行截短的载体，通过去除质粒中的非必需序列以使质粒最小化，以pESC-Trp-MdOSC1-1质粒作为模板，上下游引物分别引入BamHI和XhoI酶切位点，PCR扩增MdOSC1-1基因，PCR反应体系见表2，PCR反应条件根据引物组成及扩增片段大小等实际情况具体设定。
表2 PCR反应体系
Figure BDA0002333524810000041
PCR反应条件：第二步到第4步，重复30个循环。
Figure BDA0002333524810000042
pYYG-Trp-MdOSC1-1质粒的构建：
利用BamHI和XhoI限制酶消化MdOSC1-1的PCR产物以及pYYG-Trp载体，并将目的片段***pYYG-Trp载体的相应位点，酶切体系见表3。反应结束后利用1％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳，DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。
表3 质粒酶切反应
Figure BDA0002333524810000043
反应条件：37℃反应2-6小时。
利用Thermo公司的T4 DNA连接酶将目的片段MdOSC1-1与pYYG-Trp载体片段进行连接，按照以下体系(表4)进行连接转化反应。
表4 质粒酶切反应
Figure BDA0002333524810000051
注意：各组分必须按照顺序加入，***片段与载体的摩尔数比为2-10:1。将各组分混匀，16℃水浴2h。反应结束后，将连接产物(10μl)转化大肠杆菌感受态细胞。菌落PCR筛选阳性克隆，并通过测序验证正确的克隆。成功构建的质粒用作点突变质粒构建的骨架。
实施例3 MVA途径中关键基因和二酰甘油酰基转移酶(DGA1)基因共表达
采用与构建质粒基因表达盒相同的方法组装代谢途径关键基因表达盒PTDH3-tHMG1-THMG1，同时以pESC-His质粒为模板，PCR扩增His筛选基因表达盒PTEF1-HIS3-TADH1。以酵母基因组DNA作为模板，PCR扩增rDNA位点同源臂。构建基因组组装菌株AM1所用引物见表5，引物下划线表示重叠区。
表5 基因表达盒ERG20,ERG9,ERG1基因组整引物
Figure BDA0002333524810000052
Figure BDA0002333524810000061
利用PCR组装基因表达盒PDGA1-DGA1-TDGA1，同时以pESC-Leu质粒为模板，PCR扩增Leu筛选基因表达盒PTEF1-HIS3-TADH1。以酵母基因组DNA作为模板，PCR扩增rDNA位点同源臂。所用引物见表6，引物下划线表示重叠区。
表6 基因表达盒tHMG1,DGA1基因组整引物
Figure BDA0002333524810000062
Figure BDA0002333524810000071
将PCR扩增获得的Leu和DGA1表达盒共同转化AM1酿酒酵母感受态细胞，利用SD-His-Leu固体培养基进行筛选，菌落PCR验证阳性工程菌AM2。
实施例4 高效合成α-香树脂醇的工程酿酒酵母的构建及产物检测
将实例2中构建的催化活性最高的MdOSC1突变体与实例3中构建的酿酒酵母底盘宿主菌结合，获得α-香树脂醇高产工程菌aAM15，将其单菌落接种于液体培养基中，30℃振荡培养24小时后，以体积比5％的接种量接于新的液体培养基，30℃振荡培养48小时，添加半乳糖至2g/L，连续培养5天。发酵结束后，离心5分钟收集菌体，悬浮于10毫升20％(w/v)氢氧化钾中，100℃煮沸10分钟裂解细胞，正己烷萃取，转移有机相并旋转蒸发至干燥。将粗样品在80℃下用N-甲基-N(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和吡啶进行烷基化。采用岛津GCMS-QP2010 PLUS(岛津)气相色谱-质谱分析体系，配以DB-5mS柱(安捷伦)，进行定性和定量分析。上样前初始温度为80℃，先以40℃/min的速率升温至280℃，保持5min，再以20℃/min速率升温至300℃的，保持10min，样品注入量设置为1μl，采用10:1分流模式，对产物进行检测。
序列表
<110> 北京理工大学
<120> 一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法
<130> 1
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2119
<212> DNA
<213> 苹果(Malus domestica)
<400> 1
atgtggaaga tcaagtttgg agagggtgca aatgacccta tgttgttcag cacaaacaac 60
ttccatggaa ggcagacatg ggagttcgac ccagatgcag gtaccgagga ggagcgagca 120
gaagttgaag ctgctcgtga gcatttctac caaaatcgct tcaaggtcca gcctagcagc 180
gacctcctat ggcgttttca gatactaaga gagaaaaact ttaaacaaga aattcctcca 240
gtaagagttg gggagggtga ggacattaca tatgatcagg ccacagctgc attcaggagg 300
gctgctacct tctggaatgc cttgcaatca ccccatggac attggcctgc tgaaaatgct 360
ggcccaaact tttacttccc tcccttggtc atggctgcat acattccagg atatctcaat 420
gttattttct ccgctgagca caagaaggaa atcttgcgtt acacatacaa ccatcaaaat 480
gaagatggtg gctggggact gcacatagcg gggcctagta tgatgtttac tacatgccta 540
aactactgta tgatgcgtat tctcggagat ggccccgatg gtggtcgtga caatgcctgt 600
gcaagggcac gaaagtggat tcttgaccgt ggtggtgcgt actattctgc atcatggggc 660
aaaacttgga tggcgattct tggtgtgtat gactgggaag gcagcaaccc aatgccccca 720
gaattctgga ctgggtcgac tctgcttcct tttcatccat caaaaatgtt ctgctactgt 780
aggttgactt acctacctat gtcttacttt tatgccacaa gatttgttgg cccaatcact 840
ccacttgttg aggaattgag acaagaaatt tactgtgaat cttacaacga aattaactgg 900
cctaaagtgc gccattggtg tgcaacagaa gataactact atccccatgg tcgtgtacaa 960
cgttttatgt gggacggttt ttacaatatc gtcgagcctc tcctaaaacg ctggcctttc 1020
aagaagatca gagacaatgc aattcaattc acaattgacc aaattcatta tgaagatgag 1080
aacagtcgtt acattacaat cggatgcgtg gaaaagccat tgatgatgct tgcttgctgg 1140
gccgaggatc ctagtggaga agctttcaag aagcatcttc ctagagttac cgattatatc 1200
tggctcggag aggatggaat caagatgcaa agttttggaa gccagtcatg ggattgtgct 1260
cttgtgattc aagctttgct tgctgggaat cttaatgctg aaatgggacc cacccttaag 1320
aaagcacacg aattcctcaa gatatctcag gtgaggatta atacatccgg tgactaccta 1380
tctcatttcc gtcacatttc aaagggcgca tggacattct ctgaccgtga tcatggatgg 1440
caagtgtcag attgcactgc agaagcactg aggtgttgct gcatttttgc aaatatgtcc 1500
ccagaagttg ttggtgagcc aatggaagct gagtgtatgt atgatgctgt caatgtcatc 1560
atgtctcttc aaagtccaaa tggtggtgta tcagcctggg agccaacagg agcaccaaaa 1620
tggttggagt ggctcaaccc tgtggagttt cttgaggacc ttgtcattga gtacgagtac 1680
atcgagtgca cttcatcttc gatccaggcc ttaacattgt ttaggaagtt gtaccctggc 1740
catagaagga aggagatcaa caatttcatc acaagggctg cagactacat tgaagacata 1800
cagtaccctg atggctcatg gtatggaaac tggggaatct gcttcgtgta tggtacatgg 1860
ttcgcaatca aagggctgga ggctgccggc aggacataca acaactgtga ggcagtgcgc 1920
aaaggtgtcg actttttgct caaaacacaa agggcagatg gtggctgggg agagcactac 1980
acctcatgca caaacaagaa atatacagct caagacagta caaatttagt ccaaactgca 2040
ctcggattaa tgggtctgat tcacggtcga caggctgaga gagatccaac tcctattcac 2100
cgggctgctg cggtgttaa 2119
<210> 2
<211> 1491
<212> DNA
<213> 白色念珠菌(Candida albicans)
<400> 2
atgagttcag ttaagtatga tgctattatt attggtgcag gggttattgg tcccaccatt 60
gcaactgctt ttgccagaca agggagaaag gttttgattg tggaaagaga ctggtccaag 120
ccagatagaa ttgttggaga gttgatgcaa ccggctggta tcaaggcatt aagagagttg 180
gggatgatca aagctattaa taatattagg gctgttgatt gtactgggta ctatatcaaa 240
tattatgacg agaccattac tatcccttat ccattgaaaa aagatgcctg tatcactaat 300
ccagtgaagc cagttcctga tgccgttgat ggtgtaaatg ataaattgga tagtgattcc 360
acattgaatg ttgatgactg ggattttgat gaaagagtac gtggggctgc atttcaccat 420
ggggatttcc ttatgaattt aagacaaatt tgtcgtgatg aaccaaatgt taccgcagtt 480
gaagcaacag taacaaagat tttgcgtgat cctctggatc ctaacacagt tattggtgtg 540
caaacaaaac aacccagtgg cactgttgat taccatgcaa agttgacaat cagttgtgat 600
ggtatttact ccaaattcag aaaggaatta agtcctacta atgttccaac cattggctct 660
tactttattg ggttgtattt gaagaatgct gaattaccag ctaagggcaa aggtcatgtg 720
ttattgggag gacatgcacc agcattgata tattcagtgt ccccaactga aacacgtgta 780
ttgtgtgttt atgtttcatc aaaacctcct tctgctgcta acgatgcagt ttacaagtat 840
ttgagagata acattttgcc agcaattcct aaagagactg ttcctgcttt taaggaagcc 900
cttgaagaaa gaaagtttag aatcatgcca aaccagtatc tttctgctat gaaacaaggt 960
agtgaaaacc ataaagggtt tatattgtta ggtgattctt taaatatgag acatccatta 1020
actgggggtg gtatgacagt tggtttaaat gatagtgtgt tattagcaaa attgttgcat 1080
ccaaaatttg ttgaagattt tgatgatcac caattgattg ctaaaagatt aaagacattc 1140
cacagaaaaa gaaagaattt ggacgctgtt atcaacacat tatctatttc attatattca 1200
ttatttgccg ctgataagaa acctttaaga atattaagaa atggttgttt taaatatttc 1260
caaagaggtg gagaatgtgt taacgggcca attggattat tgagtggcat gttaccattc 1320
ccaatgttgt tattcaacca ttttttcagt gttgccttct attcggtcta tttgaatttt 1380
atagaaagag gacttttggg attcccattg gcattatttg aggcatttga agtgttgttc 1440
actgcaattg taatctttac tccatattta tggaacgaga ttgtaagata g 1491
<210> 3
<211> 1335
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 3
atgggaaagc tattacaatt ggcattgcat ccggtcgaga tgaaggcagc tttgaagctg 60
aagttttgca gaacaccgct attctccatc tatgatcagt ccacgtctcc atatctcttg 120
cactgtttcg aactgttgaa cttgacctcc agatcgtttg ctgctgtgat cagagagctg 180
catccagaat tgagaaactg tgttactctc ttttatttga ttttaagggc tttggatacc 240
atcgaagacg atatgtccat cgaacacgat ttgaaaattg acttgttgcg tcacttccac 300
gagaaattgt tgttaactaa atggagtttc gacggaaatg cccccgatgt gaaggacaga 360
gccgttttga cagatttcga atcgattctt attgaattcc acaaattgaa accagaatat 420
caagaagtca tcaaggagat caccgagaaa atgggtaatg gtatggccga ctacatctta 480
gatgaaaatt acaacttgaa tgggttgcaa accgtccacg actacgacgt gtactgtcac 540
tacgtagctg gtttggtcgg tgatggtttg acccgtttga ttgtcattgc caagtttgcc 600
aacgaatctt tgtattctaa tgagcaattg tatgaaagca tgggtctttt cctacaaaaa 660
accaacatca tcagagatta caatgaagat ttggtcgatg gtagatcctt ctggcccaag 720
gaaatctggt cacaatacgc tcctcagttg aaggacttca tgaaacctga aaacgaacaa 780
ctggggttgg actgtataaa ccacctcgtc ttaaacgcat tgagtcatgt tatcgatgtg 840
ttgacttatt tggccggtat ccacgagcaa tccactttcc aattttgtgc cattccccaa 900
gttatggcca ttgcaacctt ggctttggta ttcaacaacc gtgaagtgct acatggcaat 960
gtaaagattc gtaagggtac tacctgctat ttaattttga aatcaaggac tttgcgtggc 1020
tgtgtcgaga tttttgacta ttacttacgt gatatcaaat ctaaattggc tgtgcaagat 1080
ccaaatttct taaaattgaa cattcaaatc tccaagatcg aacagtttat ggaagaaatg 1140
taccaggata aattacctcc taacgtgaag ccaaatgaaa ctccaatttt cttgaaagtt 1200
aaagaaagat ccagatacga tgatgaattg gttccaaccc aacaagaaga agagtacaag 1260
ttcaatatgg ttttatctat catcttgtcc gttcttcttg ggttttatta tatatacact 1320
ttacacagag cgtga 1335
<210> 4
<211> 1059
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 4
atggcttcag aaaaagaaat taggagagag agattcttga acgttttccc taaattagta 60
gaggaattga acgcatcgct tttggcttac ggtatgccta aggaagcatg tgactggtat 120
gcccactcat tgaactacaa cactccaggc ggtaagctaa atagaggttt gtccgttgtg 180
gacacgtatg ctattctctc caacaagacc gttgaacaat tggggcaaga agaatacgaa 240
aaggttgcca ttctaggttg gtgcattgag ttgttgcagg cttacttctt ggtcgccgat 300
gatatgatgg acaagtccat taccagaaga ggccaaccat gttggtacaa ggttcctgaa 360
gttggggaaa ttgccatcaa tgacgcattc atgttagagg ctgctatcta caagcttttg 420
aaatctcact tcagaaacga aaaatactac atagatatca ccgaattgtt ccatgaggtc 480
accttccaaa ccgaattggg ccaattgatg gacttaatca ctgcacctga agacaaagtc 540
gacttgagta agttctccct aaagaagcac tccttcatag ttactttcaa gactgcttac 600
tattctttct acttgcctgt cgcattggcc atgtacgttg ccggtatcac ggatgaaaag 660
gatttgaaac aagccagaga tgtcttgatt ccattgggtg aatacttcca aattcaagat 720
gactacttag actgcttcgg taccccagaa cagatcggta agatcggtac agatatccaa 780
gataacaaat gttcttgggt aatcaacaag gcattggaac ttgcttccgc agaacaaaga 840
aagactttag acgaaaatta cggtaagaag gactcagtcg cagaagccaa atgcaaaaag 900
attttcaatg acttgaaaat tgaacagcta taccacgaat atgaagagtc tattgccaag 960
gatttgaagg ccaaaatttc tcaggtcgat gagtctcgtg gcttcaaagc tgatgtctta 1020
actgcgttct tgaacaaagt ttacaagaga agcaaatag 1059
<210> 5
<211> 1578
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 5
atggaccaat tggtgaaaac tgaagtcacc aagaagtctt ttactgctcc tgtacaaaag 60
gcttctacac cagttttaac caataaaaca gtcatttctg gatcgaaagt caaaagttta 120
tcatctgcgc aatcgagctc atcaggacct tcatcatcta gtgaggaaga tgattcccgc 180
gatattgaaa gcttggataa gaaaatacgt cctttagaag aattagaagc attattaagt 240
agtggaaata caaaacaatt gaagaacaaa gaggtcgctg ccttggttat tcacggtaag 300
ttacctttgt acgctttgga gaaaaaatta ggtgatacta cgagagcggt tgcggtacgt 360
aggaaggctc tttcaatttt ggcagaagct cctgtattag catctgatcg tttaccatat 420
aaaaattatg actacgaccg cgtatttggc gcttgttgtg aaaatgttat aggttacatg 480
cctttgcccg ttggtgttat aggccccttg gttatcgatg gtacatctta tcatatacca 540
atggcaacta cagagggttg tttggtagct tctgccatgc gtggctgtaa ggcaatcaat 600
gctggcggtg gtgcaacaac tgttttaact aaggatggta tgacaagagg cccagtagtc 660
cgtttcccaa ctttgaaaag atctggtgcc tgtaagatat ggttagactc agaagaggga 720
caaaacgcaa ttaaaaaagc ttttaactct acatcaagat ttgcacgtct gcaacatatt 780
caaacttgtc tagcaggaga tttactcttc atgagattta gaacaactac tggtgacgca 840
atgggtatga atatgatttc taaaggtgtc gaatactcat taaagcaaat ggtagaagag 900
tatggctggg aagatatgga ggttgtctcc gtttctggta actactgtac cgacaaaaaa 960
ccagctgcca tcaactggat cgaaggtcgt ggtaagagtg tcgtcgcaga agctactatt 1020
cctggtgatg ttgtcagaaa agtgttaaaa agtgatgttt ccgcattggt tgagttgaac 1080
attgctaaga atttggttgg atctgcaatg gctgggtctg ttggtggatt taacgcacat 1140
gcagctaatt tagtgacagc tgttttcttg gcattaggac aagatcctgc acaaaatgtt 1200
gaaagttcca actgtataac attgatgaaa gaagtggacg gtgatttgag aatttccgta 1260
tccatgccat ccatcgaagt aggtaccatc ggtggtggta ctgttctaga accacaaggt 1320
gccatgttgg acttattagg tgtaagaggc ccgcatgcta ccgctcctgg taccaacgca 1380
cgtcaattag caagaatagt tgcctgtgcc gtcttggcag gtgaattatc cttatgtgct 1440
gccctagcag ccggccattt ggttcaaagt catatgaccc acaacaggaa acctgctgaa 1500
ccaacaaaac ctaacaattt ggacgccact gatataaatc gtttgaaaga tgggtccgtc 1560
acctgcatta aatcctaa 1578
<210> 6
<211> 1257
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 6
atgtcaggaa cattcaatga tataagaaga aggaagaagg aagaaggaag ccctacagcc 60
ggtattaccg aaaggcatga gaataagtct ttgtcaagca tcgataaaag agaacagact 120
ctcaaaccac aactagagtc atgctgtcca ttggcgaccc cttttgaaag aaggttacaa 180
actctggctg tagcatggca cacttcttca tttgtactct tctccatatt tacgttattt 240
gcaatctcga caccagcact gtgggttctt gctattccat atatgattta tttttttttc 300
gataggtctc ctgcaactgg cgaagtggta aatcgatact ctcttcgatt tcgttcattg 360
cccatttgga agtggtattg tgattatttc cctataagtt tgattaaaac tgtcaattta 420
aaaccaactt ttacgctttc aaaaaataag agagttaacg aaaaaaatta caagattaga 480
ttgtggccaa ctaagtattc cattaatctc aaaagcaact ctactattga ctatcgcaac 540
caggaatgta cagggccaac gtacttattt ggttaccatc cacacggcat aggagcactt 600
ggtgcgtttg gagcgtttgc aacagaaggt tgtaactatt ccaagatttt cccaggtatt 660
cctatttctc tgatgacact ggtcacacaa tttcatatcc cattgtatag agactactta 720
ttggcgttag gtatttcttc agtatctcgg aaaaacgctt taaggactct aagcaaaaat 780
cagtcgatct gcattgttgt tggtggcgct agggaatctt tattaagttc aacaaatggt 840
acacaactga ttttaaacaa aagaaagggt tttattaaac tggccattca aacggggaat 900
attaacctag tgcctgtgtt tgcatttgga gaggtggact gttataatgt tctgagcaca 960
aaaaaagatt cagtcctggg taaaatgcaa ctatggttca aagaaaactt tggttttacc 1020
attcccattt tctacgcaag aggattattc aattacgatt tcggtttgtt gccatttaga 1080
gcgcctatca atgttgttgt tggaaggcct atatacgttg aaaagaaaat aacaaatccg 1140
ccagatgatg ttgttaatca tttccatgat ttgtatattg cggagttgaa aagactatat 1200
tacgaaaata gagaaaaata tggggtaccg gatgcagaat tgaagatagt tgggtaa 1257
<210> 7
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 7
ctttttaagc tggcatccag aaaaaaaaag aatcccagca ccaaaatatt gttttcttca 60
ccaaccatca gttcataggt ccattctctt agcgcaacta cagagaacag gggcacaaac 120
aggcaaaaaa cgggcacaac ctcaatggag tgatgcaacc tgcctggagt aaatgatgac 180
acaaggcaat tgacccacgc atgtatctat ctcattttct tacaccttct attaccttct 240
gctctctctg atttggaaaa agctgaaaaa aaaggttgaa accagttccc tgaaattatt 300
cccctacttg actaataagt atataaagac ggtaggtatt gattgtaatt ctgtaaatct 360
atttcttaaa cttcttaaat tctactttta tagttagtct tttttttagt tttaaaacac 420
caagaactta gtttcgaata aacacacata aacaaacaaa 460
<210> 8
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 8
attcaaattg ttctagtgac ccaccaaagc tgtatcatgc catgttcaga gacgactaca 60
ccaagaagtt aagtctaaaa tcagcaatat accgtcctat gttagcggtt tttagtgccc 120
tgcaaaaaag tcaacgatga cctgaataat ttgcagatta aacctaacaa ttcagaaccc 180
tatattttat ttaatcatga tcaacggatt ggccgtttct tttttctctt ttttttcatc 240
cgctcgatgg atgatgagta aaacaagaaa aacgcagttg gcgactgcta tcagatatga 300
aagcagtttg attgaacaaa gtcggttttt tttaaataga attacaaaaa aggcgtgctt 360
ccaacatctt cttatttaag acaagacgac gtcaactacc ggattaagga acttgactct 420
ttctttcaag aagcaattaa ctacatcaac tagaaccata 460
<210> 9
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 9
agccatagtg atgtctaagt aacctttatg gtatatttct taatgtggaa agatactagc 60
gcgcgcaccc acacacaagc ttcgtctttt cttgaagaaa agaggaagct cgctaaatgg 120
gattccactt tccgttccct gccagctgat ggaaaaaggt tagtggaacg atgaagaata 180
aaaagagaga tccactgagg tgaaatttca gctgacagcg agtttcatga tcgtgatgaa 240
caatggtaac gagttgtggc tgttgccagg gagggtggtt ctcaactttt aatgtatggc 300
caaatcgcta cttgggtttg ttatataaca aagaagaaat aatgaactga ttctcttcct 360
ccttcttgtc ctttcttaat tctgttgtaa ttaccttcct ttgtaatttt ttttgtaatt 420
attcttctta ataatccaaa caaacacaca tattacaata 460
<210> 10
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 10
ctcttcagca tactcaggat catccttttt gacaagagat cccctgctgt tgtctccatt 60
tggtacgcct ggggaactag aattgctgcc gttttgaccc attctcatcc tcaggaaatt 120
tcttctcatt ctgtctcttt taatgaaggg agaggcattc gtcggacctc ccccgtttct 180
actgcctggt ggattgcgtc tggacatcct tgcgcttact cgaataggcc tccctagcta 240
ttcttcaacc tttcgaacca tccatacttc ttactatcat aatttttatt ttatcatgga 300
ggcgagaagg tccttattcg agcatcacta agaacggaac tcgaacattt acaaagtaga 360
aaaattttat gaaaattaat tgttctttct tcagaataca aattagtcat tgtcaaaaag 420
agattagcat ccataaccgc atactctaat tgacgataac 460
<210> 11
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 11
ttcactaccc tttttccatt tgccatctat tgaagtaata ataggcgcat gcaacttctt 60
ttcttttttt ttcttttctc tctcccccgt tgttgtctca ccatatccgc aatgacaaaa 120
aaatgatgga agacactaaa ggaaaaaatt aacgacaaag acagcaccaa cagatgtcgt 180
tgttccagag ctgatgaggg gtatctcgaa gcacacgaaa ctttttcctt ccttcattca 240
cgcacactac tctctaatga gcaacggtat acggccttcc ttccagttac ttgaatttga 300
aataaaaaaa agtttgctgt cttgctatca agtataaata gacctgcaat tattaatctt 360
ttgtttcctc gtcattgttc tcgttccctt tcttccttgt ttctttttct gcacaatatt 420
tcaagctata ccaagcatac aatcaactat ctcatataca 460
<210> 12
<211> 451
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 12
acggattaga agccgccgag cgggtgacag ccctccgaag gaagactctc ctccgtgcgt 60
cctcgtcttc accggtcgcg ttcctgaaac gcagatgtgc ctcgcgccgc actgctccga 120
acaataaaga ttctacaata ctagctttta tggttatgaa gaggaaaaat tggcagtaac 180
ctggccccac aaaccttcaa atgaacgaat caaattaaca accataggat gataatgcga 240
ttagtttttt agccttattt ctggggtaat taatcagcga agcgatgatt tttgatctat 300
taacagatat ataaatgcaa aaactgcata accactttaa ctaatacttt caacattttc 360
ggtttgtatt acttcttatt caaatgtaat aaaagtatca acaaaaaatt gttaatatac 420
ctctatactt taacgtcaag gagaaaaaac c 451
<210> 13
<211> 460
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 13
gaatccttac atcacaccca atcccccaca agtgatcccc cacacaccat agcttcaaaa 60
tgtttctact ccttttttac tcttccagat tttctcggac tccgcgcatc gccgtaccac 120
ttcaaaacac ccaagcacag catactaaat ttcccctctt tcttcctcta gggtgtcgtt 180
aattacccgt actaaaggtt tggaaaagaa aaaagagacc gcctcgtttc tttttcttcg 240
tcgaaaaagg caataaaaat ttttatcacg tttctttttc ttgaaaattt ttttttttga 300
tttttttctc tttcgatgac ctcccattga tatttaagtt aataaacggt cttcaatttc 360
tcaagtttca gtttcatttt tcttgttcta ttacaacttt ttttacttct tgctcattag 420
aaagaaagca tagcaatcta atctaagttt taattacaaa 460
<210> 14
<211> 258
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 14
agtgaattta ctttaaatct tgcatttaaa taaattttct ttttatagct ttatgactta 60
gtttcaattt atatactatt ttaatgacat tttcgattca ttgattgaaa gctttgtgtt 120
ttttcttgat gcgctattgc attgttcttg tctttttcgc cacatgtaat atctgtagta 180
gatacctgat acattgtgga tgctgagtga aattttagtt aataatggag gcgctcttaa 240
taattttggg gatattgg 258
<210> 15
<211> 363
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 15
gaagttaaaa taaaacgaaa aataatgcat aggagttctt tttgtttatt ttgctcttaa 60
taaaaaagtg tcattgtata attagtctta gtttaattat ttatgttttt acaaggacaa 120
aagatttgct gttaaaaaga gttttaaata cccttttttc ttacatatgt atatatacag 180
gtttatgcta ataatattgt atagtttatc atgataatcg cctttcaatt tttcttgtct 240
tctatcaacc atttccaaat catatctctg ttctgcttgt tcttaatatc attctccatg 300
ttaaatttct tcacctttga aaaaccttta ttaatcttat tattcgacag gttagcctta 360
tta 363
<210> 16
<211> 336
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 16
gtctgaagaa tgaatgattt gatgatttct ttttccctcc atttttctta ctgaatatat 60
caatgatata gacttgtata gtttattatt tcaaattaag tagctatata tagtcaagat 120
aacgtttgtt tgacacgatt acattattcg tcgacatctt ttttcagcct gtcgtggtag 180
caatttgagg agtattatta attgaatagg ttcattttgc gctcgcataa acagttttcg 240
tcagggacag tatgttggaa tgagtggtaa ttaatggtga catgacatgt tatagcaata 300
accttgatgt ttacatcgta gtttaatgta cacccc 336
<210> 17
<211> 365
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 17
gcatagctta atccgttttc acgattcata atataataaa taagaaaaga tatatcatat 60
aaacgttata aaattaataa ccgggtaagt gtagaaaagt gatgcgacgg tttattttct 120
cttcctcttg cgattgaatt taacttgcag atagtgacca taaggcaact acccagtggc 180
aaacagtttt gataacgccc agtacatcaa cgagcgagta taaagacttt ggtacatttt 240
aaaaaggaaa catatattgt tttcattgct agaccctttt agtctcacct caataaaact 300
gctttattcc tcattgggct ttttattctt taattttgca tacttatagc gtgaaactgg 360
gcatt 365
<210> 18
<211> 363
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 18
taatgaattc attggaaaac acaaaatatg ttagaataaa taaggatttt ttagtgtttg 60
ggctgtatat cttaagtaag agtattaact tacaggaata ctggagttct cgttgaatat 120
tagtgattgt tttacgtaaa tttcatttat ttaaagcttt tacattagaa gttgtttgaa 180
tgtaagttta ggaaagcact acatagctta ccaggcaaag cgtaactgag aggcagtaaa 240
taccggtggt ttccatatga gtctattagg gtctattgtc cttctctttt tggctttaag 300
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tcg 363
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<211> 190
<212> DNA
<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae S288C)
<400> 19
aagatccgct ctaaccgaaa aggaaggagt tagacaacct gaagtctagg tccctattta 60
tttttttata gttatgttag tattaagaac gttatttata tttcaaattt ttcttttttt 120
tctgtacaga cgcgtgtacg catgtaacat tatactgaaa accttgcttg agaaggtttt 180
gggacgctcg 190

Claims (10)

1.一种高效合成α-香树脂醇的酿酒酵母构建方法。
2.如权利要求1所示，这种方法包括但不仅限于酶的半理性设计、提高α-香树脂醇合酶酶活、强化α-香树脂醇前体代谢途径、提高α-香树脂醇在酿酒酵母中的存贮能力等。
3.如权利要求1-2所示，酶的半理性设计包括借助在线工具Swiss-Model以人源羊毛甾醇合酶(PDB:1W6K)的晶体结构为模板进行同源建模、分子对接等设计突变位点。
4.如权利要求1-3所示，提高α-香树脂醇合酶酶活的方法包括但不仅限于高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建。
5.如权利要求1-4所示，高活性α-香树脂醇合酶突变体的构建方法包括一系列突变体的获得，包括：
所述GenBank号为ACM89977.1所示的底物结合结构域氨基酸序列(353DQIHYEDENSRYITIGCVEKPLMML377)经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸得到的具有高活性的α-香树脂醇合酶MdOSC1衍生的蛋白质；
所述GenBank号为ACM89977.1所示的催化结构域氨基酸序列(249LPFHPSKMFCYCRLTYLPMS268)经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸得到的具有高活性的α-香树脂醇合酶MdOSC1衍生的蛋白质；
所述GenBank号为ACM89977.1所示的N末端部分氨基酸序列(2WKIKFGEGANDPMLFSTNNFHGRQ25)经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸得到的具有高活性的α-香树脂醇合酶MdOSC1衍生的蛋白质。
6.如权利要求1-5所示，通过过表达α-香树脂醇合成途径中的关键酶得到的高拷贝质粒。
7.如权利要求1-6所示，过表达的关键酶包括但不限于权利要求5中所示高活性α-香树脂醇合酶突变体。
8.利用权利要求1-7所示的任意一种方法构建的重组菌株，包括过表达权利要求5中所示高活性α-香树脂醇合酶突变体和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶得到的可生产α-香树脂醇的菌株。
9.利用权利要求1-7所示的任意一种方法构建的重组菌株，包括在基因组高拷贝位点整合酿酒酵母内源性二酰甘油酰转移酶(DGA1)。
10.利用权利要求1-7所示的任意一种方法构建的重组菌株，包括组装在基因组高拷贝位点整合酿酒酵母内源性二酰甘油酰转移酶(DGA1)，和过表达权利要求5中所示高活性α-香树脂醇合酶突变体和3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶，而得到的高效生产α-香树脂醇的酿酒酵母细胞工厂。
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