CN106153756A - 一种检测依维莫司中雷帕霉素的高效液相色谱法 - Google Patents

Abstract

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种检测依维莫司及其制剂中雷帕霉素的方法，检测方法为高效液相色谱法，色谱条件为：色谱柱为以硅胶为填充剂的色谱柱；流动相为正己烷-乙醇混合液；检测波长为275～280nm；流速为0.5～2.0ml/min；柱温为25～35℃；进样量为5～50μl。采用本发明的高效液相色谱分析法，雷帕霉素与依维莫司的定量限分别为0.1ng和0.15ng；雷帕霉素的检测限是0.05ng，且雷帕霉素在0.01μg/ml～50μg/ml浓度范围内，线性关系良好，可以准确检测样品中雷帕霉素的含量，分析过程中样品分离彻底，分析结果重现性好，为生产过程中质量控制分析提供了简单可靠的方法。

Description

一种检测依维莫司中雷帕霉素的高效液相色谱法

技术领域

本发明属于药物分析领域，涉及一种测定依维莫司及其制剂中雷帕霉素的高效液相色谱方法。

背景技术

依维莫司(Everolimus)是由瑞士Novartis公司研发的一种雷帕霉素衍生物，主要作为一种抗肿瘤药及免疫调节剂、免疫抑制剂。依维莫司的体外免疫抑制活性是雷帕霉素的1/3，但在体内与雷帕霉素相当，其已分别于2008年8月获欧洲EMEA、2009年3月获美国FDA的批准，用于治疗晚期肾细胞癌患者。由于依维莫司的合成基本上是以雷帕霉素为起始物料的，最终产物中或多或少的都有雷帕霉素的残留，而依维莫司和雷帕霉素都属于大环内酯类化合物，且分子量庞大，分子极性相近，在液相色谱中很难对依维莫司中的雷帕霉素进行有效分离，为了监测依维莫司合成过程中的反应进度，检测终产品或制剂中雷帕霉素的含量，保证产品纯度，迫切需要开发一种实用的能同时检测依维莫司和雷帕霉素的分析方法。

GholamAli Khoschsorur等人在2005年第9期《Clinical Chemistry》上发表了《Simulatneous Measurement of Sirolimus and Everolimus in Whole Blood by HPLC with Ultraviolet Detection》，公开了一种测定人血液中雷帕霉素与依维莫司的方法，采用的色谱条件是：Zorbax SB-C18柱，检测波长277nm，柱温55℃，流动相为甲醇-水-乙腈(50:28:22)，流速为0.9ml/min。该方法虽然同时测定了依维莫司和雷帕霉素，但是存在以下问题：1﹚在反相色谱柱中检测分离依维莫司和雷帕霉素时，柱温较高(55℃或更高的温度)，影响色谱柱的使用寿命；2﹚检测分离依维莫司和雷帕霉素时，两者浓度相当，并且只有配制的样品溶液浓度较低时，才能保证依维莫司和雷帕霉素的分离。但当检测依维莫司原料药或其制剂时，依维莫司中雷帕霉素含量很小，此时若样品溶液浓度太低，会使得雷帕霉素的检测响应太小，甚至响应不到，造成误差较大。因此该方法不利用于依维莫司原料或制剂中雷帕霉素的检查。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，该方法简便易行、准确度高、分离度好，可用于控制依维莫司的质量。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，该方法采用紫 外检测器，检测波长为275～285nm，优选为275～280nm，进一步优选为277nm。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，选用的色谱柱为硅胶柱，即以硅胶为填充剂的色谱柱。柱温为25～35℃，优选为30℃。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，该方法采用等度洗脱，选用的流动相为正己烷-乙醇，正己烷-乙醇的体积比为(85～95):(15～5)，优选为90:10。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，选用的流速为0.5～2.0ml/min，优选为0.8～1.2ml/min，进一步优选为1ml/min。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，样品溶解的溶剂为乙醇，稀释溶剂为流动相。样品浓度为(0.1～2.5)mg/ml，优选为(0.25～1.0)mg/ml。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，样品溶液的制备方法为：取依维莫司样品10～750mg，用乙醇1～10ml溶解，用流动相稀释至50～100ml。乙醇用量应该不超过最终定容体积的10％，否则将造成峰形变差、柱效变低。实验表明，直接用流动相溶解样品时，溶解较慢，不能保证样品完全溶解，加热容易造成溶剂挥发，污染环境，超声效果不明显，且费时间，而添加少量乙醇，振摇即可溶解样品，再加流动相稀释，省时方便且不易造成溶剂挥发。

本发明提供一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，可按以下方法实现：取依维莫司样品25mg，用1ml乙醇溶解并用流动相稀释定容，选用硅胶色谱柱，正己烷-乙醇(90:10)为流动相，流速为1.0ml/min，检测波长为277nm，精密量取样品溶液10μl，注入液相色谱仪，完成依维莫司原料及其制剂中雷帕霉素的分离测定。

本发明提供的高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法中按照面积归一化法和外标对照品法计算的结果无明显差异，回收率符合规定。

与传统方法相比，本发明的技术方案具有以下进步性：

1)本发明方法的专属性良好，能使依维莫司中各杂质与主峰以及雷帕霉素与相邻杂质峰间均能获得良好的分离，特别是雷帕霉素与依维莫司能完全分离(分离度大于3.0)，色谱峰峰型尖锐(理论塔板数大于8000)，灵敏度高，重现性好，准确可靠。

2)适用范围广泛。本发明技术方案中雷帕霉素与依维莫司的定量限分别为0.1ng和0.15ng；雷帕霉素的检测限是0.05ng，且雷帕霉素在0.01μg/ml～1000μg/ml浓度范围内，优选雷帕霉素在0.01μg/ml～50μg浓度范围内，线性关系良好。

因此该方法可以广泛应用依维莫司合成过程中的反应进度监测，也可以用于依维莫司原 料和制剂中少量雷帕霉素的检测。

3)柱温较低。可有效保护色谱柱，延长色谱柱适用寿命；同时对液相仪器设备要求较低。

附图说明

图1***适用性试验HPLC图谱

图2原料测定HPLC图谱

图3制剂样品测定HPLC图谱

具体实施方式：

以下内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围，本发明用到、但未进行说明的技术和指标部分，均为现有技术。

实施例中所述的***适用性试验供试品I是指加入0.1％雷帕霉素的依维莫司(雷帕霉素的加入量为供试品总质量的0.1％)样品。

***适用性试验供试品II是指加入2％雷帕霉素的依维莫司(雷帕霉素的加入量为供试品总质量的2％)样品。

***适用性试验供试品III是指加入5％雷帕霉素的依维莫司(雷帕霉素的加入量为供试品总质量的5％)样品。

实施例1

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP Si柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝85:15

检测波长：277nm

柱温：35℃

流速：0.8ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取***适用性试验供试品I约25mg，置50ml量瓶中，加1ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为***适用性溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为5.1，理论塔板数按依维莫司峰计为9568。按照面积归一化法和外标对照品法测定，测定***适用性试验供试品中雷帕霉素含量分别为0.110％和0.105％。回收率分别为110％和105％。结果表明按照面积归一化法和外标对照品法测定结果无明显差异，回收率符合规定。

实施例2

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP SI柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝90:10

检测波长：277nm

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取***适用性试验供试品II约25mg，分别置50ml量瓶中，加1ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为***适用性溶液和供试品溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见附图1。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为4.7，理论塔板数按依维莫司峰计为10655。按照面积归一化法和外标对照品法测定，测定***适用性试验供试品中雷帕霉素含量分别为2.02％和1.99％。回收率分别为101.0％和99.5％。结果表明按照面积归一化法和外标对照品法测定结果无明显差异，回收率高，符合规定。

实施例3

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP SI柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝95:5

检测波长：277nm

柱温：25℃

流速：1.2ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取依维莫司统适用性试验供试品III约25mg，置50ml量瓶中，加1ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为3.8，理论塔板数按依维莫司峰计为8622。按照面积归一化法和外标对照品法测定，测定***适用性试验供试品中雷帕霉素含量分别为5.03％和5.01％。回收率分别为100.6％和100.2％。结果表明按照面积归一化法和外标对照品法测定结果无明显差异，回收率高，符合规定。

实施例4

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP SI柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝90:10

检测波长：277nm

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取依维莫司原料药50mg，置50ml量瓶中，加5ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见附图2。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为4.5，理论塔板数按依维莫司峰计为8628。

利用该方法，测定依维莫司原料药中雷帕霉素含量分别为1.23％。

实施例5

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP SI柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝90:10

检测波长：275nm

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取依维莫司片细粉适量(约相当于依维莫司25mg)，置50ml量瓶中，加5ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析，记录色谱图，见附图3。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为4.8，理论塔板数按依维莫司峰计为9597。

利用该方法，测定依维莫司片中雷帕霉素含量分别为1.19％。

实施例6

1)仪器与条件

高效液相色谱仪：安捷伦1200

色谱柱：Venusil XBP SI柱(4.6×250mm，5μm)

流动相：正己烷-乙醇＝90:10

检测波长：277nm

柱温：30℃

流速：1.0ml/min

进样量：10μl

2)实验步骤

取依维莫司片细粉适量(约相当于依维莫司50mg)，置50ml量瓶中，加5ml乙醇溶解，并用流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液，按上述色谱条件进行高效液相色谱分析。利用该方法，雷帕霉素与依维莫司之间的分离度为4.5，理论塔板数按依维莫司峰计为9435。

利用该方法，测定依维莫司片中雷帕霉素含量分别为0.8％。

Claims (10)

1.一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，选用的色谱柱为硅胶柱，流动相为正己烷-乙醇混合液，柱温为25～35℃，检测波长为275～285nm，流速为0.5～2.0ml/min，以乙醇为样品溶剂，流动相为稀释液制备样品溶液。

2.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，正己烷-乙醇的体积比为(85～95):(15～5)。

3.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，检测波长为275～280nm。

4.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，样品溶液的制备方法为：先将依维莫司用乙醇溶解，再用流动相稀释。

5.如权利要求4所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，乙醇用量应该不超过最终定容体积的10％。

6.如权利要求4所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，样品浓度为(0.1～2.5)mg/ml。

7.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，流速为0.8～1.2ml/min。

8.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，柱温为25～35℃。

9.如权利要求1所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，进样量为5～50μl。

10.如权利要求1-9任一权利要求所述的一种用高效液相色谱法分离测定依维莫司中雷帕霉素的方法，其特征在于，流动相为体积比为90:10的正己烷-乙醇混合液，流速为1.0ml/min，检测波长为277nm，柱温为30℃，进样量10μl，样品浓度为(0.25～1)mg/ml。