CN102375033B - 盐酸苯达莫司汀及其有关物质的高效液相色谱分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种用高效液相色谱法对盐酸苯达莫司汀进行有关物质测定的方法，将待测样品用流动相配制成样品溶液，在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上进行反相等度洗脱，流动相为有机溶剂和缓冲溶液。本方法有效地解决了从盐酸苯达莫司汀原料药中分离并检测出有关物质的问题。本方法简便可行，分析时间周期短。
Description
技术领域
本发明涉及抗肿瘤药物盐酸苯达莫司汀及其有关物质的检测方法，特别是用高效液相色谱法进行分析的方法。
背景技术
在药物分析中，有关物质(related substances)检测是控制药品质量的重要指标。
药物分析中所称的“有关物质”是指特定药物中不是主要组成物，但与成份相关的物质。一种药品从合成原料药到制备有关的制剂，再经贮藏、运输、使用，要经历一段较为复杂和漫长的过程。在此期间，每一过程都有可能产生有关的物质，如生产中可能带入起始原料、试剂、中间体、副产物和异构体等；在贮藏和运输过程中，可能产生降解产物、聚合物或晶型转变等特殊杂质。为保证药物的安全有效，同时也要考虑到生产实际情况，因此可允许含有一定限量的无害或低毒性的有关物质，但对毒性较大，能危害人体健康的、无效的或能影响药物稳定性的有关物质则必须严格控制。
盐酸苯达莫司汀(1-甲基-5-双(2-氯乙基)氨基-2-苯并咪唑丁酸盐酸盐)是一种氮芥类抗肿瘤药物。该药物2007年才在欧洲上市，尚未被欧洲药典和美国药典所收载。对于其有关物质和含量的测定方法，不但没有具体的标准，而且国内外文献也未见有详细报道，各国专利数据库中也无相关信息。
盐酸苯达莫司汀原料药物中常见的主要有关物质有八种(见表1)，为保证药品的质量，需要进行分离并测定其含量。
因此，研究并建立盐酸苯达莫司汀有关物质的分析方法，非常必要。
表1盐酸苯达莫司汀及其有关物质的结构式和化学名称
发明内容
本发明的目的是提供一种盐酸苯达莫司汀有关物质高效液相色谱分析方法。通过探索盐酸苯达莫司汀有关物质高效液相色谱分析的各种条件，达到快速、简便、可靠、有效进行分析的目的。
发明人通过对高效液相色谱分析中色谱柱、流动相等条件反复筛选，摸索出了合适的分析条件。为兼顾成品中8种杂质分离的需要，选择了合适的缓冲溶液体系及流动相的比例等关键检测条件，最终确立的方法达到了上述发明目的。
本发明的技术方案如下：
一种盐酸苯达莫司汀中有关物质的高效液相色谱分析方法，将待测样品用流动相配制成0.2mg/ml～1.5mg/ml的样品溶液，在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上进行反相等度洗脱，流动相为有机溶剂和缓冲溶液；所述有机溶剂是甲醇或乙腈，所述缓冲溶液是用酸调节pH至2.0～4.0的盐水溶液；所述盐选自六氟磷酸盐、十二烷基硫酸盐、磷酸盐、醋酸盐或甲酸盐，浓度为0.01～0.05mol/L。
所述酸选自磷酸、醋酸、甲酸或三氟乙酸。所述盐优选六氟磷酸盐钾或十二烷基硫酸钠；
有机溶剂在流动相中的体积比优选为40％～45％。
可采用以下检测条件：
样品检测波长：220～245nm；流动相洗脱速率：0.8～1.2ml/min；色谱柱温度：15～35℃；进样量：20μl。
本方法的效果和优点是：
1、可有效分离出盐酸苯达莫司汀原料药中的杂质，方法有效、可靠；
2、能对盐酸苯达莫司汀原料药中的杂质进行定量，可严格控制盐酸苯达莫司汀质量；
3、分析时间周期短，在40分钟内，能将八个已知杂质与主峰基线分离；
4、操作简单。
附图说明：
图1：本发明方法***专属性实验色谱图(图中各峰均由保留时间标注，主峰为盐酸苯达莫司汀，其中用文字特别标明的是盐酸苯达莫司汀中可能出现的各个已知杂质峰)；
图2～图10、图12是用本发明方法测定盐酸苯达莫司汀有关物质所得到的高效液相色谱图，图中标记为检测得到的杂质E和未知杂质1～4，检测基础条件为：柱温25℃；进样浓度1.0mg/ml；流速：1.0ml/min；检测波长233nm；
图3～图10是在此基础上调整相应参数后测得的图谱，其中：
图3：流动相流速为0.8ml/min；
图4：流动相流速为1.2ml/min；
图5：色谱柱柱温为15℃；
图6：色谱柱柱温为35℃；
图7：流动相比例A∶B(V∶V)＝45∶55；
图8：流动相比例A∶B(V∶V)＝40∶60；图9：缓冲溶液pH值为2.0；
图10：缓冲溶液pH值为4.0；
图11：盐酸苯达莫司汀各杂质紫外光谱图；
图12：不同样品浓度盐酸苯达莫司汀，其中A、B、C图谱的进样浓度分别为0.8、1.0、1.5mg/ml。
具体实施方式：
以下实施例1～9是用本发明的方法进行盐酸苯达莫司汀分析的示例；
实验例1～2是发明人用其他两种方法进行了盐酸苯达莫司汀的分析，作为与本发明方法的对比。
实施例中所使用的色谱分离的流动相、流动相的组成和使用的色谱分离柱及色谱分离柱的填料等，仅作为进一步解释本发明。但是本发明的保护范围，并不限于这些。
主要实验仪器及色谱条件：
以下实施例中使用的实验仪器均为岛津LC2010A型高效液相色谱仪，自动进样器，UV检测器，色谱分离***的控制和记录由岛津LC Solution色谱管理***完成(有关物质波长筛选和浓度筛选试验除外：使用仪器为Agilent 1200型高效液相色谱仪，自动进样器，DAD检测器，色谱分离***的控制和记录由Agilent Chemstation色谱管理***完成)。
除注明外，使用的色谱柱为VP-ODS C18 4.6×250mm 5μm；柱温为25℃；进样量为20μl；流速：1.0ml/min；检测波长233nm。
试剂：乙腈，色谱纯；纯水，分析纯；六氟磷酸钾，阿拉丁试剂
甲醇，色谱纯；三氟乙酸，分析纯
样品见下表：
盐酸苯达莫司汀及其有关物质的情况
实施例1：盐酸苯达莫司汀有关物质测定(一)
1)盐酸苯达莫司汀有关物质测定—***专属性实验
色谱条件：流动相：A：乙腈；B：0.02mol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调pH值到3.0)；A∶B＝425∶575(V∶V)
样品溶液配制：分别称取各杂质标准品(A～H)和成品适量，精密称定，置同一量瓶中，加稀释剂至合适浓度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
实验结果：见附图1，主峰保留时间为12.3min，主峰与各杂质峰分离效果良好，且各杂质峰均能基线分离。
2)原料药盐酸苯达莫司汀中各杂质的定量限和检测限检测：
色谱条件：流动相：A：乙腈 B：0.02mol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调pH值3.0)A∶B＝425∶575(V∶V)
样品溶液配制：分别称取各杂质对照品适量，精密称定，加流动相至合适浓度，摇匀，过滤，即得。进样并记录色谱图。
原料药盐酸苯达莫司汀中各杂质的定量限结果见下表：
原料药盐酸苯达莫司汀中各杂质的检测限结果见下表：
3)盐酸苯达莫司汀有关物质测定—样品检测
流动相：A：乙腈；B：0.02mol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调pH值到3.0)；A∶B＝425∶575(V∶V)
样品溶液配制：称取成品适量，精密称定，置同一量瓶中，加流动相至合适浓度，摇匀，即得(1.0mg/ml)。进样并记录色谱图。
实验结果：见附图2，主峰保留时间为12.3min，各杂质峰与主峰分离效果良好，且各杂质峰(未知杂质1-4)均能基线分离。
实施例2～9：盐酸苯达莫司汀有关物质测定(二～九)
流动相：A：乙腈；B：0.02mol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调pH值)；
样品溶液配制：称取成品适量，精密称定，置同一量瓶中，加流动相至合适浓度，摇匀，即得。进样并记录色谱图。
实验结果：附图3～10，各杂质峰与主峰分离效果良好，且各杂质峰(未知杂质1-4)均能基线分离。
实施例10～13：盐酸苯达莫司汀有关物质测定(十～十三)
仪器：Agilent 1200型高效液相色谱仪(DAD检测器)
流动相：A：乙腈；B：0.02mol/l六氟磷酸钾溶液(磷酸调pH值)；
样品溶液配制：称取成品适量，精密称定，置同一量瓶中，加流动相至合适浓度，摇匀，即得。进样并记录色谱图。
实验结果：
1)由附图11，提取紫外光谱显示各杂质均为成品的同系物，最大紫外吸收波长相同。当检测波长分别为220nm、233nm和245nm时，各杂质存在水平基本一致。
2)由附图12，样品浓度分别为0.8、1.0、1.5mg/ml时；各杂质检测水平基本一致。
| 浓度 | 杂质E | 未知杂质1 | 未知杂质2 |
| 0.8mg/ml | 0.05 | 0.05 | 0.02 |
| 1.0mg/ml | 0.04 | 0.05 | 0.02 |
| 1.5mg/ml | 0.04 | 0.05 | 0.02 |
Claims (5)
1.一种盐酸苯达莫司汀中有关物质的高效液相色谱分析方法，所述有关物质是以下杂质A-H：
检测方法是：将待测样品用流动相配制成0.2mg/ml～1.5mg/ml的样品溶液，在十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱上进行反相等度洗脱，流动相为有机溶剂和缓冲溶液；所述有机溶剂是甲醇或乙腈，所述缓冲溶液是用酸调节pH至2.0～4.0的盐水溶液；所述盐是六氟磷酸盐，浓度为0.01mol/L～0.05mol/L。
2.根据权利要求1所述的分析方法，所述调节pH所用酸选自磷酸、醋酸、甲酸或三氟乙酸。
3.根据权利要求1所述的分析方法，所述盐是六氟磷酸钾。
4.根据权利要求1所述的分析方法，所述有机溶剂在流动相中的体积比为40％～45％。
5.根据权利要求1所述的分析方法，检测条件为：检测波长：220～245nm；流动相洗脱速率：0.8～1.2ml/min；色谱柱温度：15～35℃；进样量：20μl。
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