KR102511209B1 - 벤즈이미다졸 유도체 및 염증 질환의 치료를 위한 그의 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 하기 화학식 I에 따른 화합물을 개시한다:
화학식 I
상기 식에서, Cy, R1, L1, R3, R4, R5, La 및 Ra는 본 발명에 정의된 바와 같다. JAK를 억제할 수 있는, 화학식 I에 따른 신규의 벤즈이미다졸을 개시하며, 상기 화합물을 약학 조성물로서 제조할 수 있고, 인간을 포함한 포유동물에서 다양한 상태, 예를 들어 비제한적인 예로서 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
화학식 I
상기 식에서, Cy, R1, L1, R3, R4, R5, La 및 Ra는 본 발명에 정의된 바와 같다. JAK를 억제할 수 있는, 화학식 I에 따른 신규의 벤즈이미다졸을 개시하며, 상기 화합물을 약학 조성물로서 제조할 수 있고, 인간을 포함한 포유동물에서 다양한 상태, 예를 들어 비제한적인 예로서 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및 치료에 사용할 수 있다.
Description
본 발명은 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병에 관련된 타이로신 키나제과, JAK의 억제제인 화합물에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2를 억제한다. 본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 본 발명의 화합물을 투여함에 의한 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다.
야누스 키나제(JAK)는 사이토킨 신호를 막 수용체로부터 STAT 전사 인자로 전달하는 세포질 타이로신 키나제이다. 4 개의 JAK과 구성원, JAK1, JAK2, JAK3 및 TYK2가 개시되어 있다. 상기 사이토킨이 그의 수용체에 결합시, JAK과 구성원들은 서로 자기인산화 및/또는 트랜스인산화한 다음, STAT를 인산화하고, 이어서 상기는 핵으로 이동하여 전사를 조절한다. JAK-STAT 세포내 신호 전달은 인터페론, 대부분의 인터류킨뿐만 아니라 다양한 사이토킨 및 내분비 인자들, 예를 들어 EPO, TPO, GH, OSM, LIF, CNTF, GM-CSF 및 PRL을 제공한다(Vainchenker W. et al. (2008)).
유전자 모델과 소분자 JAK 억제제의 병용 연구는 다수의 JAK의 치료학적 가능성을 밝혀내었다. JAK3은 면역억제 표적으로서 마우스 및 인간 유전학에 의해 확인된다(O'Shea et al., 2004). JAK3 억제제는 처음에 기관 이식 거부에 대해서, 그러나 나중에는 또한 다른 면역-염증성 적응증들, 예를 들어 류마티스성 관절염(RA), 건선 및 크론병에서 성공적으로 임상적으로 개발되었다(http://clinicaltrials.gov/).
TYK2는 면역-염증 질병에 잠재적인 표적이며, 인간 유전학 및 마우스 녹-아웃 연구에 의해 확인된다(Levy and Loomis, 2007).
JAK1은 면역-염증 질병 분야의 표적이다. JAK1은 다른 JAK들과 이종이량체화하여 사이토킨-구동된 염증전 신호를 전달한다. 따라서, JAK1의 억제는 JAK1 신호를 이용하는 병리학-관련된 사이토킨, 예를 들어 IL-6, IL-4, IL-5, IL-13, 또는 IFN감마를 갖는 면역-염증 질병뿐만 아니라 JAK-매개된 신호 전달에 의해 구동되는 다른 질병들에 중요하다.
연골의 퇴행은 다양한 질병의 특징이며, 상기 질병 중에서 류마티스성 관절염 및 골관절염이 가장 현저하다. 류마티스성 관절염(RA)은 만성적인 관절 퇴행성 질병이며, 관절 구조의 염증 및 파괴를 특징으로 한다. 상기 질병이 관리되지 않으면, 관절 기능의 상실로 인한 실질적인 불구 및 통증 및 심지어 조기 사망에 이르게 된다. 따라서, RA 요법의 목적은 상기 질병을 늦추는 것뿐만 아니라 관절 파괴를 멈추기 위해서 완화를 획득하는 것이다. 상기 질병 결과의 중증도외에, RA의 높은 유병률(세계적으로 성인의 약 0.8%가 병에 걸린다)은 높은 사회-경제적 영향을 의미한다(Choy and Panayi, 2001; Firestein, 2003; Lee and Weinblatt, 2001; O?Dell, 2004; Smolen and Steiner, 2003).
JAK1 및 JAK2는 다수의 사이토킨 및 호르몬에 대한 세포내 신호전달과 관련된다. 이들 사이토킨 및 호르몬 중 어느 하나와 관련된 병리는 JAK1 및 JAK2 억제제에 의해 개선될 수 있다. 따라서, 다수의 알러지 또는 염증 상태 및 자가면역 질환들, 예를 들어 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, 소아 특발성 관절염, 골관절염, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 조직 섬유증, 호산성 염증, 식도염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 이식, 이식편대 숙주병, 건선, 근염, 다발성 경화증은 본 발명에 개시된 화합물에 의한 치료가 이로울 수 있다(Kopf et al., 2010).
골관절염(또한 OA, 또는 마모성 관절염으로 지칭됨)은 가장 통상적인 형태의 관절염이며, 관절 연골의 상실을 특징으로 하고, 종종 뼈의 비대 및 통증과 관련된다(Wieland et al., 2005).
골관절염은 치료하기가 어렵다. 현재, 치유를 획득할 수 없으며 치료는 통증의 완화 및 병든 관절이 변형되는 것을 방지하는데 초점을 두고 있다. 통상적인 치료는 비-스테로이드성 소염 약물(NSAID)의 사용을 포함한다. 식이성 보충제, 예를 들어 콘드로이친 및 글루코스아민 설페이트가 골관절염의 안전하고 유효한 치료 선택권으로서 주장되었지만, 최근의 임상 시험은 상기 두 치료 모두 골관절염과 관련된 통증을 감소시킬 수 없는 것으로 밝혀졌다(Clegg et al., 2006).
동화 과정의 자극, 이화 과정의 차단, 또는 이들 둘의 조합이 연골의 안정화, 및 아마도 심지어 상기 손상의 역전을 생성시킬 수 있으며, 따라서 상기 질병의 추가적인 진행을 방지할 수 있다. 상기 골관절 질환 중에 나타나는 관절 연골 병변의 교정을 위한 치료 방법들이 개발되었으나, 지금까지 이들 중 어느 것도 원위치 및 생체내에서 관절 연골의 재생을 매개할 수 없었다. 종합해 보면, 질병 개질성 골관절염 약물을 입수할 수 없다.
반데힌스트(Vandeghinste) 등(Vandeghinste et al., 2005)은 JAK1을, 그의 억제가 OA를 포함한 다수의 질병에 치료학적 관련성을 가질 수도 있는 표적으로서 발견하였다. 마우스에서 상기 JAK1 유전자의 녹아웃은 JAK1이 발생 중 필수적이고 쓸모없지 않은 역할을 함을 입증하였다: JAK1-/- 마우스는 생후 24시간 이내에 죽었으며 림프구 발생이 심하게 손상되었다. 더욱이, JAK1 -/- 세포는 II 부류 사이토킨 수용체를 사용하는 사이토킨, 신호전달에 감마-c 서브유닛을 사용하는 사이토킨 수용체 및 신호전달에 gp130 서브유닛을 사용하는 사이토킨 수용체과에 반응성이 아니거나 덜 반응성이었다(Rodig et al., 1998).
다양한 그룹들이 연골세포 생물학에서 JAK-STAT 신호전달에 관련되었다. 리(Li) 등(Li et al., 2001)은 온코스타틴 M이 1차 연골세포에서 JAK/STAT 및 MAPK 신호전달 경로의 활성화에 의해 MMP 및 TIMP3 유전자 발현을 유도함을 보였다. 오사키(Osaki) 등(Osaki et al., 2003)은 연골세포에서 콜라겐 II의 인터페론-감마 매개된 억제가 JAK-STAT 신호전달을 수반함을 보였다. IL1-베타는 기질 성분의 발현을 감소시키고 콜라게나제 및 유도성 산화질소 신타제(NOS2)(산화질소의 생성을 매개한다)의 발현을 유도함으로써 연골 이화작용을 유도한다. 오테로(Otero) 등(Otero et al., 2005)은 렙틴 및 IL1-베타가 연골세포에서 NO 생성 또는 NOS2 mRNA의 발현을 상승적으로 유도하며 JAK 억제제에 의해 차단됨을 보였다. 레젠드레(Legendre) 등(Legendre et al., 2003)은 IL6/IL6 수용체가 소 관절 연골세포에서 연골-특이성 기질 유전자 콜라겐 II, 아그레칸 코어 및 링크 단백질의 하향조절을 유도하며, 이는 JAK/STAT 신호전달에 의해 매개됨을 보였다. 따라서, 이러한 관찰은 연골 항상성에서 JAK 키나제 활성에 대한 역할 및 JAK 키나제 억제제에 대한 치료 기회를 암시한다.
JAK과 구성원들은 골수증식성 질환을 포함한 추가적인 상태들에 관련되었다(O’Sullivan et al, 2007)(여기에서 JAK2의 돌연변이가 확인되었다). 이는 JAK, 특히 JAK2의 억제제들이 또한 골수증식성 질환의 치료에 사용될 수 있음을 가리킨다. 또한, 상기 JAK과, 특히 JAK1, JAK2 및 JAK3는 암, 특히 백혈병, 예를 들어 급성 골수성 백혈병(O’Sullivan et al, 2007; Xiang et al., 2008) 및 급성 림프모구성 백혈병(Mullighan et al, 2009), 또는 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종(Constantinescu et al., 2008), 전립선암(Tam et al., 2007)과 관련되었다. 이들 결과는 JAK, 특히 JAK1 및/또는 JAK2의 억제제가 암(백혈병 및 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종, 전립선암)의 치료에도 또한 유용성을 가질 수 있음을 가리킨다.
또한, 캐슬만병, 다발성 골수종, 혈관사이세포 증식성 사구체신염, 건선 및 카포시육종이 상기 사이토킨 IL-6(그의 생물학적 효과는 세포내 JAK-STAT 신호에 의해 매개된다)의 분비과잉에 기인하는 듯하다(Naka et al., 2002). 상기 결과는 JAK의 억제제가 상기 질병의 치료에 또한 유용성을 가질 수도 있음을 보인다.
현행 요법들은 만족스럽지 못하며 따라서 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료에 사용될 수 있는 추가의 화합물들을 확인할 필요가 여전하다. 따라서 본 발명은 화합물들, 그들의 제조 방법 및 본 발명의 화합물을 적합한 약학 담체와 함께 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료를 위한 약제의 제조에서 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 화합물이 JAK의 억제제로서 작용할 수 있고 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료에 유용하다는 발견을 기본으로 한다. 구체적인 태양에서 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2의 억제제이다. 본 발명은 또한 이들 화합물의 제조 방법, 이들 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 본 발명의 화합물의 투여에 의한 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 제공한다:
[화학식 I]
상기 식에서,
R1은 H 또는 Me이고;
L1은 -NR2-; -O- 또는 -CH2-이고;
Cy는 페닐, 또는 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴이고;
R2는 H 또는 C1-4 알킬이고;
R3은 H, 할로, 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알킬, 또는 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알콕시이고;
R4는 H 또는 할로이고;
R5는 -CN, 할로이거나, 또는 -L2-R6이고;
-L2는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7-, 또는 -NR7SO2-이고;
R6은 H, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
R7은 H 또는 C1-4 알킬이고;
R8은 OH, CN, 할로 또는 C1-4 알콕시이고;
La는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)O- 또는 -C(=O)NH-이고;
Ra는
- H,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 임의로 치환된 C1-4 알킬,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc로 임의로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴이고;
Rb는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알콕시,
- C3-7 사이클로알킬,
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬(상기 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, 또는 옥소로 임의로 치환된다),
- -SO2-C1-4 알킬, 또는
- -C(=O)NRb1Rb2이고
Rc는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알킬,
- -C(=O)OH, 또는
- -C(=O)NRc1Rc2이고;
각각의 Rb1, Rb2, Rc1 및 Rc2는 H 및 C1-4 알킬 중에서 독립적으로 선택된다.
특정한 실시태양에서 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2의 억제제이다.
놀랍게도, 본 발명에 이르러 본 발명의 화합물이 밀접하게 관련된 유사체에 비해 개선된 시험관내 활성을 나타낼 수 있음을 발견하였다.
더욱 또한, 특정한 태양에서, 본 발명의 화합물은 밀접하게 관련된 유사체에 비해 시험관내에서 개선된 안정성을 나타낼 수 있다. 상기 개선은 생체내에서 필요한 약물의 투여량을 낮출 수 있으며, 이에 의해 감소된 독성 및/또는 약물-약물 상호작용을 생성시킬 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명의 화합물, 및 약학 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 더욱이, 본 발명에 개시된 약학 조성물 및 치료 방법에 유용한 본 발명의 화합물은 제조 및 사용시 약학적으로 허용 가능하다. 본 발명의 상기 태양에서, 상기 약학 조성물은 본 발명의 화합물과 함께 사용하기에 적합한 추가의 활성 성분들을 추가로 포함할 수 있다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 구체적인 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함한다.
본 발명의 추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 나열된 것들로부터의 상태, 및 특히 이상 JAK 활성, 예를 들어 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병과 관련될 수도 있는 바와 같은 상태에 민감하거나 또는 상기 상태를 앓고 있는 포유동물의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 개시된 바와 같은 약학 조성물 또는 화합물을 투여함을 포함한다. 구체적인 실시태양에서 상기 상태는 이상 JAK1 및/또는 TYK2 활성과 관련된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 본 발명에 나열된 것들 중에서 선택된 상태, 특히 이상 JAK 활성, 예를 들어 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병과 관련될 수도 있는 바와 같은 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.
더욱 또 다른 치료 방법 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 바와 같은 이상 JAK 활성과 인과관계로 관련된 상태에 민감하거나 또는 상기 상태를 앓고 있는 포유동물의 치료 방법을 제공하며, 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 본 발명의 약학 조성물 또는 화합물을 투여함을 포함한다. 구체적인 태양에서 상기 상태는 이상 JAK1 및/또는 TYK2 활성과 인과관계로 관련된다.
추가의 태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 이상 JAK 활성과 인과관계로 관련된 상태의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다.
추가의 태양에서, 본 발명은 이후에 본 발명에 개시되는 전형적인 합성 프로토콜 및 경로에 의해 본 발명의 화합물을 합성하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 주목적은 JAK의 활성을 변형시킬 수 있고 따라서 상기와 인과관계로 관련될 수 있는 임의의 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 신규의 화합물을 제공하는 것이다. 구체적인 태양에서 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2의 활성을 조절한다.
본 발명의 추가의 목적은, JAK, 특히 JAK1 및/또는 TYK2의 활성과 인과관계로 관련될 수 있는 상태 또는 상기 상태의 증상, 예를 들어 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병을 치료하거나 경감시킬 수 있는 화합물을 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 추가의 목적은 JAK 활성과 관련된 질병을 포함한 다양한 상태들, 예를 들어 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용될 수 있는 약학 조성물을 제공하는 것이다. 구체적인 실시태양에서 상기 질병은 JAK1 및/또는 TYK2 활성과 관련된다.
다른 목적 및 이점들은 이어지는 상세한 설명을 고려하여 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
정의
하기의 용어들은 하기에 함께 제공된 의미를 갖고자 하며 본 발명의 개시 및 의도된 범위를 이해하는데 유용하다.
화합물, 상기와 같은 화합물을 함유하는 약학 조성물 및 상기와 같은 화합물 및 조성물의 사용 방법을 포함할 수 있는 본 발명을 개시할 때, 하기의 용어들(존재하는 경우)은 달리 나타내지 않는 한 하기의 의미를 갖는다. 본 발명에 개시될 때 이후 하기에 정의되는 부분들 중 임의의 부분은 다양한 치환체들로 치환될 수 있으며, 각각의 정의가 하기에 설명되는 바와 같은 그의 범위내에 상기와 같은 치환된 부분들을 포함하고자 함은 또한 물론이다. 달리 서술되지 않는 한, "치환된"이란 용어는 하기에 설명되는 바와 같이 정의되어야 한다. "기" 및 "라디칼"이란 용어들은 본 발명에서 사용시 호환 가능한 것으로 간주될 수 있음도 또한 물론이다.
'하나의'란 관사는 본 발명에서 상기 관사의 문법적 대상의 하나 또는 하나보다 많은(즉 적어도 하나)을 지칭하는데 사용될 수 있다. 예로서 '하나의 유사체'는 하나의 유사체 또는 하나보다 많은 유사체를 의미한다.
'알킬'은 명시된 탄소수를 갖는 직쇄 또는 분지된 지방족 탄화수소를 의미한다. 특정한 알킬기는 탄소수 1 내지 8을 갖는다. 보다 특히 저급 알킬은 탄소수 1 내지 6을 갖는다. 추가의 특정기는 탄소수 1 내지 4를 갖는다. 예시적인 직쇄기는 메틸, 에틸, n-프로필 및 n-부틸을 포함한다. 분지된은 하나 이상의 저급 알킬기, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필 또는 부틸이 선형 알킬쇄에 부착됨을 의미하며, 예시적인 분지쇄기는 아이소프로필, 아이소-부틸, t-부틸 및 아이소아밀을 포함한다.
'알콕시'는 -OR26 기를 지칭하며, 이때 R26은 명시된 수의 탄소 원자를 갖는 알킬이다. 특정한 알콕시기는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-부톡시, 3급-부톡시, 2급-부톡시, n-펜톡시, n-헥속시, 및 1,2-다이메틸부톡시이다. 특정한 알콕시기는 저급 알콕시, 즉 탄소수 1 내지 6을 갖는 알콕시다. 추가의 특정한 알콕시기는 탄소수 1 내지 4를 갖는다.
'알케닐'은 명시된 탄소 원자의 수를 갖는 1가 올레핀형 (불포화) 탄화수소기를 지칭한다. 특정한 알케닐은 직쇄 또는 분지될 수 있는 탄소수 2 내지 8, 및 보다 특히 탄소수 2 내지 6을 가지며 하나 이상 및 특히 1 내지 2개의 올레핀 불포화 부위를 갖는다. 특정한 알케닐기는 에테닐(-CH=CH2), n-프로페닐(-CH2CH=CH2), 아이소프로페닐(-C(CH3)=CH2) 등을 포함한다.
'아미노'는 라디칼 -NH2를 지칭한다.
'아릴'은 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자의 제거에 의해 유도된 1가 방향족 탄화수소기를 지칭한다. 특히 아릴은 명시된 고리 원자의 수를 갖는, 모노사이클릭 또는 축합된 폴리사이클릭 방향족 고리 구조를 지칭한다. 구체적으로, 상기 용어는 6 내지 10개의 고리 구성원을 포함하는 기를 포함한다. 상기 아릴기가 모노사이클릭 고리 시스템인 경우 상기는 우선적으로는 탄소수 6을 함유한다. 특히 아릴기는 페닐 및 나프틸을 포함한다.
'사이클로알킬'은 명시된 고리 원자의 수를 갖는, 모노사이클릭, 축합된 폴리사이클릭, 가교된 폴리사이클릭, 또는 스피로사이클릭 비-방향족 하이드로카빌 고리 구조를 지칭한다. 사이클로알킬은 탄소수 3 내지 12, 특히 3 내지 10, 및 보다 특히 탄소수 3 내지 7을 가질 수 있다. 상기와 같은 사이클로알킬기는 예로서 단일 고리 구조, 예를 들어 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실 및 사이클로헵틸을 포함한다.
'시아노'는 라디칼 -CN을 지칭한다.
'할로' 또는 '할로겐'은 플루오로(F), 클로로(Cl), 브로모(Br) 및 요오도(I)를 지칭한다. 특정한 할로기는 플루오로 또는 클로로이다.
'헤테로'는 화합물 또는 화합물상에 존재하는 기를 개시하는데 사용될 때 상기 화합물 또는 기 중의 하나 이상의 탄소 원자가 질소, 산소 또는 황 헤테로원자에 의해 치환되었음을 의미한다. 헤테로를 상술한 하이드로카빌기 중 어느 하나, 예를 들어 1 내지 4, 및 특히 1 내지 3개의 헤테로원자, 보다 전형적으로는 1 또는 2개의 헤테로원자, 예를 들어 단일 헤테로원자를 갖는 알킬, 예를 들어 헤테로알킬, 사이클로알킬, 예를 들어 헤테로사이클로알킬, 아릴, 예를 들어 헤테로아릴 등에 적용할 수 있다.
'헤테로아릴'은 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 명시된 고리 원자의 수를 포함하는, 모노사이클릭 또는 축합된 폴리사이클릭 방향족 고리 구조를 의미한다. 특히, 상기 방향족 고리 구조는 5 내지 9개의 고리원을 가질 수 있다. 상기 헤테로아릴기는 예를 들어 축합된 5원 및 6원 고리 또는 2개의 축합된 6원 고리, 또는 추가의 예로서 2개의 축합된 5원 고리로부터 형성되는 5원 또는 6원 모노사이클릭 고리 또는 축합된 바이사이클릭 구조일 수 있다. 각각의 고리는 전형적으로 질소, 황 및 산소 중에서 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 전형적으로 상기 헤테로아릴 고리는 4개 이하, 보다 전형적으로는 3개 이하, 보다 대개는 2개 이하의 헤테로원자, 예를 들어 단일 헤테로원자를 함유할 것이다. 하나의 실시태양에서, 상기 헤테로아릴 고리는 하나 이상의 고리 질소 원자를 함유한다. 상기 헤테로아릴 고리 중 질소 원자는 이미다졸 또는 피리딘의 경우에서와 같이 염기성이거나, 또는 인돌 또는 피롤 질소의 경우에서와 같이 필수적으로 비-염기성일 수 있다. 일반적으로 상기 헤테로아릴기 중에 존재하는 염기성 질소 원자의 수는 상기 고리의 임의의 아미노기 치환체를 포함하여, 5 미만일 것이다.
5원 모노사이클릭 헤테로아릴기의 예는 비제한적으로 피롤릴, 퓨라닐, 티오페닐, 이미다졸릴, 퓨라자닐, 옥사졸릴, 옥사다이아졸릴, 옥사트라이아졸릴, 아이속사졸릴, 티아졸릴, 아이소티아졸릴, 피라졸릴, 트라이아졸릴 및 테트라졸릴기를 포함한다.
6원 모노사이클릭 헤테로아릴기의 예는 비제한적으로 피리디닐, 피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐 및 트라이아지닐을 포함한다. 또 다른 5원 고리에 축합된 5원 고리를 함유하는 바이사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 이미다조티아졸릴 및 이미다조이미다졸릴을 포함한다. 5원 고리에 축합된 6원 고리를 함유하는 바이사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤즈이미다졸릴, 벤즈옥사졸릴, 아이소벤즈옥사졸릴, 벤즈아이속사졸릴, 벤조티아졸릴, 벤즈아이소티아졸릴, 아이소벤조퓨라닐, 인돌릴, 아이소인돌릴, 인돌리지닐, 퓨리닐(예를 들어 아데닌, 구아닌), 인다졸릴, 피라졸로피리미디닐, 트라이아졸로피리미디닐, 및 피라졸로피리디닐기를 포함한다. 2개의 축합된 6원 고리를 함유하는 바이사이클릭 헤테로아릴기의 특정한 예는 비제한적으로 퀴놀리닐, 아이소퀴놀리닐, 피리도피리디닐, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 신놀리닐, 프탈라지닐, 나프티리디닐 및 프테리디닐기를 포함한다. 특정한 헤테로아릴기는 티오페닐, 피롤릴, 벤조티오페닐, 벤조퓨라닐, 인돌릴, 피리디닐, 퀴놀리닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴 및 피라지닐로부터 유도된 것들이다. 전형적인 헤테로아릴의 예는 하기를 포함한다:
상기에서, 각각의 Y는 >C(=O), NH, O 및 S 중에서 선택된다.
'헤테로사이클로알킬'이란 용어는 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자 및 명시된 고리 원자의 수를 포함하는, 모노사이클릭, 축합된 폴리사이클릭, 스피로사이클릭 또는 가교된 폴리사이클릭의 완전히 포화된 비-방향족 고리 구조를 의미한다. 상기 헤테로사이클로알킬 고리 구조는 4 내지 12개의 고리 구성원, 특히 4 내지 10개의 고리 구성원, 및 보다 특히 4 내지 7개의 고리 구성원을 가질 수 있다. 각각의 고리는 전형적으로 질소, 황 및 산소 중에서 선택된 4개 이하의 헤테로원자를 함유할 수 있다. 전형적으로 헤테로사이클로알킬 고리는 4개 이하의 헤테로원자, 보다 전형적으로는 3개 이하의 헤테로원자, 보다 대개는 2개 이상, 예를 들어 단일의 헤테로원자를 함유할 것이다. 헤테로사이클릭 고리의 예는 비제한적으로 아제티디닐, 옥세타닐, 티에타닐, 피롤리디닐(예를 들어 1-피롤리디닐, 2-피롤리디닐 및 3-피롤리디닐), 모폴리닐, 티오모폴리닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로티오페닐, 이미다졸리닐, 옥사졸리닐, 티아졸리닐, 피페리디닐(예를 들어 1-피페리디닐, 2-피페리디닐, 3-피페리디닐 및 4-피페리디닐), 피라닐, 다이옥사닐, 테트라하이드로피라닐(예를 들어 4-테트라하이드로피라닐), 2-피라졸리닐, 피라졸리디닐 또는 피페라지닐을 포함한다.
모노사이클릭 헤테로사이클로알킬기의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 CH2, NH, O 및 S 중에서 선택된다.
축합된 바이사이클릭 헤테로사이클로알킬기의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 CH2, NH, O 및 S 중에서 선택된다.
가교된 바이사이클릭 헤테로사이클로알킬기의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
상기에서, 각각의 W 및 Y는 독립적으로 CH2, NH, O 및 S 중에서 선택되고, Z는 N 또는 CH이다.
스피로사이클릭 헤테로사이클로알킬기의 특정한 예는 하기의 예시적인 예들로 나타낸다:
상기에서, 각각의 Y는 NH, O 및 S 중에서 선택된다.
'하이드록실'은 라디칼 -OH를 지칭한다.
'옥소'는 라디칼 =O를 지칭한다.
'치환된'은 하나 이상의 수소 원자가 동일하거나 상이한 치환체(들)로 각각 독립적으로 치환된 기를 지칭한다.
'설포' 또는 '설폰산'은 -SO3H와 같은 라디칼을 지칭한다.
'티올'은 -SH 기를 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, '하나 이상으로 치환된'이란 용어는 1 내지 4개의 치환체를 지칭한다. 하나의 실시태양에서 상기는 1 내지 3개의 치환체를 지칭한다. 추가의 실시태양에서 상기는 1 또는 2개의 치환체를 지칭한다. 더욱 추가의 실시태양에서 상기는 하나의 치환체를 지칭한다.
'티오알콕시'는 -SR26 기를 지칭하며, 이때 R26은 명시된 수의 탄소 원자를 갖는 알킬 및 특히 C1-C8 알킬이다. 특정한 티오알콕시기는 티오메톡시, 티오에톡시, n-티오프로폭시, 아이소티오프로폭시, n-티오부톡시, 3급-티오부톡시, 2급-티오부톡시, n-티오펜톡시, n-티오헥속시, 및 1,2-다이메틸티오부톡시이다. 보다 특정한 티오알콕시기는 저급 티오알콕시, 즉 탄소수 1 내지 6을 갖는 티오알콕시다. 추가의 특정한 알콕시기는 탄소수 1 내지 4를 갖는다.
유기 합성 분야의 통상적인 숙련가는 안정한, 화학적으로 가능한 헤테로사이클릭 고리 중의 헤테로원자의 최대수는, 상기가 방향족이든 비방향족이든 간에, 상기 고리의 크기, 불포화도 및 헤테로원자의 원자가에 의해 결정됨을 알 것이다. 일반적으로, 헤테로사이클릭 고리는 상기 헤테로방향족 고리가 화학적으로 가능하고 안정한 한 1 내지 4개의 헤테로원자를 가질 수 있다.
'약학적으로 허용 가능한'은 연방 정부 또는 주 정부의 규제 기관 또는 미국 이외 국가의 해당 당국에 의해 승인되거나 승인 가능함, 또는 동물, 및 보다 특히 인간에의 사용에 대해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 나열됨을 의미한다.
'약학적으로 허용 가능한 염'은 약학적으로 허용 가능하고 모 화합물의 목적하는 약물학적 활성을 갖는 화합물의 염을 지칭한다. 특히, 상기와 같은 염은 무독성이며 무기 또는 유기 산 부가염 및 염기 부가염일 수 있다. 구체적으로, 상기와 같은 염은 (1) 무기산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등과 형성된 산 부가염; 또는 유기산, 예를 들어 아세트산, 프로피온산, 헥산산, 사이클로펜탄프로피온산, 글리콜산, 피루브산, 락트산, 말론산, 숙신산, 말산, 말레산, 퓨마르산, 타타르산, 시트르산, 벤조산, 3-(4-하이드록시벤조일) 벤조산, 신남산, 만델산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 1,2-에탄-다이설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-클로로벤젠설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 4-톨루엔설폰산, 캄포설폰산, 4-메틸바이사이클로[2.2.2]-옥트-2-엔-1-카복실산, 글루코헵톤산, 3-페닐프로피온산, 트라이메틸아세트산, 3급 부틸아세트산, 라우릴 황산, 글루콘산, 글루탐산, 하이드록시나프토산, 살리실산, 스테아르산, 뮤콘산 등과 형성된 산 부가염; 또는 (2) 모 화합물 중에 존재하는 산성 양성자가 금속 이온, 예를 들어 알칼리 금속 이온, 알칼리 토 이온, 또는 알루미늄 이온에 의해 치환되거나; 또는 유기 염기, 예를 들어 에탄올아민, 다이에탄올아민, 트라이에탄올아민, N-메틸글루카민 등과 배위하는 경우 형성된 염을 포함한다. 염은 단지 예로서, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 등; 및 상기 화합물이 염기성 작용기를 함유하는 경우, 무독성 유기 또는 무기산의 염, 예를 들어 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 타르트레이트, 메실레이트, 아세테이트, 말리에이트, 옥살레이트 등을 추가로 포함한다. '약학적으로 허용 가능한 양이온'이란 용어는 산성 작용기의 허용 가능한 양이온성 대이온을 지칭한다. 상기와 같은 양이온은 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄, 테트라알킬암모늄 양이온 등에 의해 예시된다.
'약학적으로 허용 가능한 비히클'은 본 발명의 화합물과 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 담체를 지칭한다.
'전구약물'은, 절단 가능한 기를 가지며 가용매분해에 의해서 또는 생리학적 조건 하에서 생체 내에서 약학적으로 활성인 본 발명의 화합물로 되는, 본 발명 화합물의 유도체를 포함한 화합물을 지칭한다. 상기와 같은 예는 비제한적으로 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬모폴린 에스터 등을 포함한다.
'용매화물'은 용매와, 대개는 가용매분해 반응에 의해 회합되는 화합물의 형태를 지칭한다. 이러한 물리적 회합은 수소 결합을 포함한다. 통상적인 용매는 물, EtOH, 아세트산 등을 포함한다. 본 발명의 화합물을 예를 들어 결정성 형태로 제조할 수 있으며 용매화 또는 수화시킬 수 있다. 적합한 용매화물은 약학적으로 허용 가능한 용매화물, 예를 들어 수화물을 포함하며, 화학량론적 용매화물 및 비-화학량론적 용매화물을 모두 추가로 포함한다. 몇몇 예에서, 상기 용매화물은, 예를 들어 하나 이상의 용매 분자가 상기 결정성 고체의 결정 격자 중에 통합된 경우 단리될 수 있을 것이다. '용매화물'은 용액-상 및 단리 가능한 용매화물 모두를 포함한다. 전형적인 용매화물은 수화물, 에탄올레이트 및 메탄올레이트를 포함한다.
'환자'는 인간을 포함한다. '인간', '환자' 및 '피실험자'란 용어들은 본 발명에서 호환적으로 사용된다.
'유효량'은 질병의 치료를 위해 환자에게 투여 시, 상기 질병에 대해 상기와 같은 치료를 수행하기에 충분한 본 발명 화합물의 양을 의미한다. '유효량'은 상기 화합물, 상기 질병 및 그의 중증도, 및 치료하려는 환자의 연령, 체중 등에 따라 변할 수 있다.
'예방하는' 또는 '예방'은 질병 또는 질환을 얻거나 상기가 발병할 위험을 감소시킴(즉 질병 유발제에 노출되거나 또는 질병 개시에 앞서 상기 질병의 소인이 있을 수 있는 환자에게서 상기 질병의 임상적인 증상들 중 하나 이상이 발생하지 않게 함)을 지칭한다.
'예방학'이란 용어는 '예방'과 관련되며, 질병의 치료 또는 치유보다는 예방을 목적으로 하는 조치 또는 시술을 지칭한다. 예방학적 조치의 비제한적인 예는 백신의 투여; 예를 들어 고정화에 기인하여 혈전증의 위험이 있는 입원 환자에 대한 저 분자량 헤파린의 투여; 및 말라리아가 풍토병이거나 또는 말라리아와 접촉할 위험성이 높은 지리학적 지역의 방문에 앞서 항-말라리아제, 예를 들어 클로로퀸의 투여를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 임의의 질병 또는 질환을 '치료하는' 또는 '치료'는 상기 질병 또는 질환을 개선시킴(즉 상기 질병을 억제하거나 상기 질병의 임상적 증상들 중 하나 이상의 징후, 정도 또는 중증도를 감소시킴)을 지칭한다. 또 다른 실시태양에서 '치료하는' 또는 '치료'는 환자가 알아차릴 수 없는 하나 이상의 물리적 매개변수의 개선을 지칭한다. 더욱 또 다른 실시태양에서, '치료하는' 또는 '치료'는 상기 질병 또는 질환을 물리적으로(예를 들어 알아차릴 수 있는 증상의 안정화), 생리적으로(예를 들어 물리적 매개변수의 안정화), 또는 이들 둘 다에 의해 완화시킴을 지칭한다. 추가의 실시태양에서, "치료하는" 또는 "치료"는 상기 질병의 진행을 늦춤에 관한 것이다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, '알러지성 질병(들)'이란 용어는 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 부비동염, 습진 및 두드러기를 포함한 면역계의 과민성 질환뿐만 아니라 식품 알러지 또는 곤충 독에 대한 알러지를 특징으로 하는 상태의 그룹을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 '천식'이란 용어는 원인이 무엇이든(내인성, 외인성, 또는 둘 다; 알러지성 또는 비-알러지성) 기도 수축과 관련된 폐 기류의 변화를 특징으로 하는 폐의 임의의 질환을 지칭한다. 상기 천식이란 용어는 원인을 가리키는 하나 이상의 형용사와 함께 사용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 '염증성 질병(들)'이란 용어는 류마티스성 관절염, 골관절염, 아동 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식, 비염), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD), 염증성 장 질환(예를 들어 크론병, 궤양성 대장염), 내독소-구동된 질병 상태(예를 들어 우회술 후 합병증 또는 예를 들어 만성 심부전에 기여하는 만성 내독소 상태), 및 연골 관련된 질병, 예를 들어 관절 질병을 포함하는 상태들의 그룹을 지칭한다. 특히 상기 용어는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식), 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD) 및 염증성 장 질병을 지칭한다. 보다 특히 상기 용어는 류마티스성 관절염, 만성 폐쇄성 폐 질병(COPD) 및 염증성 장 질병을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '자가면역 질병(들)'은 COPD와 같은 상태를 포함한 폐쇄성 기도 질병, 천식(예를 들어 내인성 천식, 외인성 천식, 먼지 천식, 소아 천식), 특히 만성 또는 고질성 천식(예를 들어 말기 천식 및 기도 과민반응), 기관지 천식을 포함한 기관지염, 전신 홍반성 루프스(SLE), 피부 홍반 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 다발성 경화증, 건선, 안구건조증, I형 당뇨병 및 이와 관련된 합병증, 아토피성 습진(아토피성 피부염), 갑상선염(하시모토 및 자가면역 갑상선염), 접촉 피부염 및 추가의 습진성 피부염, 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 및 궤양성 대장염), 죽상동맥경화증 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 질병의 그룹을 지칭한다. 특히 상기 용어는 COPD, 천식, 전신 홍반성 루프스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병을 지칭한다. 본 발명에 사용되는 바와 같이, '증식성 질병(들)'이란 용어는 암(예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 골수증식성 질환(예를 들어 진성적혈구증가증, 본태성 혈소판증가증 및 골수섬유증), 백혈병(예를 들어 급성 골수성 백혈병, 급성 및 만성 림프모구성 백혈병), 다발성 골수종, 건선, 재협착증, 피부경화증 또는 섬유증과 같은 상태를 지칭한다. 특히 상기 용어는 암, 백혈병, 다발성 골수종 및 건선을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이, '암'이란 용어는 피부 또는 신체 기관, 예를 들어 비제한적으로 유방, 전립선, 폐, 신장, 췌장, 위 또는 장 중 세포의 악성 또는 양성 증식을 지칭한다. 암은 인접 조직내로 침윤하여 먼 기관, 예를 들어 뼈, 간, 폐 또는 뇌로 확산(전이)하는 경향이 있다. 본 발명에 사용되는 바와 같이 상기 암이란 용어는 전이성 종양 세포 유형(예를 들어 비제한적으로 흑색종, 림프종, 백혈병, 섬유육종, 횡문근육종, 및 비만세포종) 및 조직 암종의 유형(예를 들어 비제한적으로 결장직장암, 전립선암, 소세포 폐암 및 비-소세포 폐암, 유방암, 췌장암, 방광암, 신장암, 위암, 교모세포종, 원발성 간암, 난소암, 전립선암 및 자궁 평활근육종)을 모두 포함한다. 특히, 상기 '암'이란 용어는 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성백혈병, 부신피질 암종, 항문암, 맹장암, 성상세포종, 비정형 유기형/간상 종양, 기저세포 암종, 담즙관암, 방광암, 골암(골육종 및 악성 섬유성 조직구증), 뇌간 신경교종, 뇌 종양, 뇌 및 척수 종양, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결장암, 결장직장암, 두개암종, 피부 T-세포 림프종, 배아성 종양, 자궁내막암, 뇌실막모세포종, 상의세포종, 식도암, 유잉 육종 계열 종양, 눈암, 망막모세포종, 담낭암, 위장(위)암, 위장관 유암종, 위장간질종양(GIST), 위장기질세포 종양, 생식세포 종양, 신경교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 종양(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암, 랑게르한스 세포 조직구증, 후두암, 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수생성 백혈병, 털세포 백혈병, 간암, 비-소세포 폐암, 소세포 폐암, 버킷 림프종, 피부 T-세포림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 림프종, 발덴스트롬 고글로불린혈증, 수모세포종, 수질상피종, 흑색종, 중피종, 구강암, 만성 골수생성 백혈병, 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 인두암, 신경모세포종, 비-소세포 폐암, 구부암, 구강인두암, 골육종, 뼈의 악성 섬유성 조직구증, 난소암, 난소상피암, 난소생식세포 종양, 난소 저 악성 잠재성 종양, 췌장암, 유두종, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 중간 분화의 송과체 실질 종양, 송과체모세포종 및 천막상 원시신경외배엽성 종양, 뇌하수체 종양, 혈장세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐모세포종, 원발성 중추신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포(신장)암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 유잉 육종 계열 종양, 육종, 카포시, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 소장암, 연조직 육종, 편평세포 암종, 위(위장)암, 천막상 원시신경세포외배엽 종양, 고환암, 인후암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 요도암, 자궁암, 자궁육종, 질암, 음문암, 발덴스트롬 고글로불린혈증, 및 빌름 종양을 지칭한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 암이란 용어는 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 유방암 또는 결장암을 지칭한다.
본 발명에 사용되는 바와 같이 '백혈병'이란 용어는 혈액 및 혈액 형성 기관의 신생물 질병을 지칭한다. 상기와 같은 질병은 골수 및 면역계 기능장애를 야기할 수 있으며, 이는 숙주를 감염 및 출혈에 매우 민감하게 한다. 특히 백혈병이란 용어는 급성 골수성 백혈병(AML) 및 급성 림프모구성 백혈병(ALL) 및 만성 림프모구성 백혈병(CLL)을 지칭한다. 또 다른 특정한 실시태양에서, 상기 백혈병이란 용어는 T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 또는 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL)을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '이식 거부'란 용어는 예를 들어 췌장섬의 세포, 조직 또는 고형 기관 동종- 또는 이종이식편, 줄기세포, 골수, 피부, 근육, 각막 조직, 신경 조직, 심장, 폐, 복합 심장-폐, 신장, 간, 장, 췌장, 기관 또는 식도의 급성 또는 만성 거부, 또는 이식편대 숙주병을 지칭한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, '연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병'이란 용어는 골관절염, 건선성 관절염, 소아 류마티스성 관절염, 통풍성 관절염, 패혈성 또는 감염성 관절염, 반응성 관절염, 교감신경성 이영양증, 발육이상, 티체 증후군 또는 늑골 연골염, 섬유근육통, 골연골염, 신경 또는 신경병성 관절염, 관절증, 풍토성 변형 골관절염과 같은 관절염의 풍토성 형태, 므셀레니병 및 한디고두병; 섬유근육통, 전신 홍반성 루푸스, 피부경화증 및 강직성척추염으로부터 발생하는 퇴행과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '선천성 연골 기형(들)'이란 용어는 유전성 연골용해, 연골이형성증 및 의사연골이형성증, 특히 비제한적으로 소이증, 무이증, 골간단 연골이형성증, 및 관련 질환과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이, 'IL6의 분비과잉과 관련된 질병(들)'이란 용어는 캐슬만병, 다발성 골수종, 건선, 카포시 육종 및/또는 혈관사이세포 증식성 사구체신염과 같은 상태를 포함한다.
본 발명에 사용된 바와 같이 '인터페론의 분비과잉과 관련된 질병(들)'이란 용어는 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선, 류마티스성 관절염과 같은 상태를 포함한다.
'본 발명의 화합물(들)' 및 동등한 표현들은 본 발명에 개시된 바와 같은 화학식(들)의 화합물을 포함함을 의미하며, 상기 표현은 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물, 예를 들어 수화물, 및 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물(문맥상 그렇게 허용되는 경우)을 포함한다. 유사하게, 중간체에 대한 언급은, 상기 중간체 자체의 청구 여부에 관계 없이, 상기 중간체의 염, 용매화물(문맥상 그렇게 허용되는 경우)을 포함함을 의미한다.
본 발명에서 범위를 언급하는 경우, 예를 들어 비제한적으로 C1-8 알킬의 경우, 범위의 인용은 상기 범위의 각 구성원들을 나타내는 것으로 간주해야 한다.
본 발명 화합물의 다른 유도체는 그의 산 및 산 유도체 형태 모두의 활성을 갖지만, 산 민감성 형태로 종종, 포유동물 유기체에 대한 용해도, 조직 적합성 또는 지연된 방출의 이점을 제공한다(Bundgard, 1985). 전구약물은 당해 분야의 숙련가에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모 산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스터, 또는 모 산 화합물과 치환되거나 비치환된 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물 상에 매달린 산성 그룹으로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스터, 아미드 및 무수물이 특히 유용한 전구약물이다. 일부의 경우에 이중 에스터 유형의 전구약물, 예를 들어 (아실옥시)알킬 에스터 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스터를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 상기와 같은 전구약물은 본 발명 화합물의 C1 내지 C8 알킬, C2 내지 C8 알케닐, C6-10 임의로 치환된 아릴, 및 (C6-10 아릴)-(C1-4 알킬) 에스터이다.
본 발명에 사용된 바와 같이, '동위원소 변체'란 용어는 화합물을 구성하는 원자들 중 하나 이상에서 비천연 비율의 동위원소를 함유하는 상기와 같은 화합물을 지칭한다. 예를 들어 화합물의 '동위원소 변체'는 하나 이상의 비-방사성 동위원소, 예를 들어 중소수(2H 또는 D), 탄소-13(13C), 나이트로(15N) 등을 함유할 수 있다. 상기와 같은 동위원소 치환이 이루어지는 화합물에서, 하기의 원자들(존재하는 경우)은 다양할 수 있으며, 따라서 예를 들어 임의의 수소는 2H/D일 수 있거나, 임의의 탄소는 13C일 수 있거나, 또는 임의의 질소는 15N일 수 있고, 상기와 같은 원자의 존재 및 위치는 당해 분야의 기술 내에서 측정될 수 있음을 알 것이다. 마찬가지로, 본 발명은, 예를 들어 생성되는 화합물을 약물 및/또는 기질 조직 분포 연구에 사용할 수 있는 경우, 방사성동위원소를 갖는 동위원소 변체의 제조를 포함할 수 있다. 방사성 동위원소인 삼중소수, 즉 3H 및 탄소-14, 즉 14C가 그들의 통합 용이성 및 편리한 검출 수단에 비추어 상기 목적에 특히 유용하다. 더욱이, 양전자 방출 동위원소, 예를 들어 11C, 18F, 15O 및 13N으로 치환된 화합물을 제조할 수 있으며, 이는 기질 수용체 점유를 조사하기 위한 양전자 방출 단층촬영(PET) 연구에 유용할 것이다.
본 발명에 제공된 화합물의 모든 동위원소 변체는, 방사성이든 아니든, 본 발명의 범위 내에 포함된다.
동일한 분자식을 갖지만 원자들의 결합 성질 또는 순서 또는 상기 원자들의 공간 배열이 상이한 화합물을 '이성질체'라 칭함을 또한 알아야 한다. 원자들의 공간 배열이 상이한 이성질체를 '입체이성질체'라 칭한다.
서로 거울상이 아닌 입체이성질체를 '부분입체이성질체'라 칭하며 서로 겹쳐지지 않는 거울상인 이성질체를 '거울상 이성질체'라 칭한다. 화합물이 비대칭 중심을 갖는 경우, 예를 들어 4 개의 상이한 그룹에 결합되는 경우, 한 쌍의 거울상 이성질체가 가능하다. 거울상 이성질체는 그의 비대칭 중심의 절대 배열을 특징으로 할 수 있으며, 이는 칸과 프레로그(Cahn and Prelog)의 R- 및 S-서열화 법칙에 의해서 또는 분자가 편광면을 회전하는 방식에 의해 개시되고 우회전성 또는 좌회전성(즉 각각 (+) 또는 (-)-이성질체)으로 표시된다. 키랄 화합물은 개별적인 거울상 이성질체로서 또는 이들의 혼합물로서 존재할 수 있다. 같은 비율의 거울상 이성질체를 함유하는 혼합물을 '라세미 혼합물'이라 칭한다.
'토오토머'는 특정한 화합물 구조의 상호전환 가능한 형태이고 수소 원자 및 전자의 치환이 다양한 화합물을 지칭한다. 따라서, 2 개의 구조는 π 전자 및 원자(대개는 H)의 이동을 통해 평형으로 존재할 수 있다. 예를 들어, 에놀과 케톤은 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 신속하게 상호전환되기 때문에 토오토머이다. 토오토머화의 또 다른 예는 산 또는 염기에 의한 처리에 의해 마찬가지로 형성되는 페닐나이트로메탄의 산- 및 질소-형태이다.
토오토머 형태는 관심 화합물의 최적의 화학 반응성 및 생물 활성의 획득에 적합할 수 있다.
본 발명의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있으며; 따라서 상기와 같은 화합물은 개별적인 (R)- 또는 (S)-입체이성질체로서 또는 이들의 혼합물로서 생성될 수 있다.
달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구의 범위에서 특정 화합물의 기술 또는 명칭은 개별적인 거울상 이성질체 및 이들의 라세미 또는 다른 혼합물 모두를 포함함을 의미한다. 입체이성질체의 입체화학의 결정 및 분리를 위한 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 화합물이 대사되어 생물학적으로 활성인 대사산물을 제공할 수 있음을 알 것이다.
본 발명
본 발명은 본 발명의 화합물이 JAK의 억제제이고 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료에 유용하다는 확인을 기본으로 한다. 구체적인 실시태양에서 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2의 억제제이다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 제조 방법, 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물, 및 본 발명의 화합물의 투여에 의한 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 방법을 제공한다. 구체적인 실시태양에서 본 발명의 화합물은 JAK1 및/또는 TYK2의 억제제이다.
따라서, 본 발명의 첫 번째 태양에서, 하기 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 제공한다:
화학식 I
상기 식에서,
R1은 H 또는 Me이고;
L1은 -NR2-; -O- 또는 -CH2-이고;
Cy는 페닐, 또는 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴이고;
R2는 H 또는 C1-4 알킬이고;
R3은 H, 할로, 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알킬, 또는 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알콕시이고;
R4는 H 또는 할로이고;
R5는 -CN, 할로이거나, 또는 -L2-R6이고;
-L2는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7-, 또는 -NR7SO2-이고;
R6은 H, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
R7은 H 또는 C1-4 알킬이고;
R8은 OH, CN, 할로 또는 C1-4 알콕시이고;
La는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)O- 또는 -C(=O)NH-이고;
Ra는
- H,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 임의로 치환된 C1-4 알킬,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc로 임의로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴이고;
Rb는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알콕시,
- C3-7 사이클로알킬,
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬(상기 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, 또는 옥소로 임의로 치환된다),
- -SO2-C1-4 알킬, 또는
- -C(=O)NRb1Rb2이고
Rc는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알킬,
- -C(=O)OH, 또는
- -C(=O)NRc1Rc2이고;
각각의 Rb1, Rb2, Rc1 및 Rc2는 H 및 C1-4 알킬 중에서 독립적으로 선택된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R1이 Me인 화학식 I에 따른다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 페닐인 화학식 I에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴인 화학식 I에 따른다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴인 화학식 I에 따른다. 특정한 실시태양에서, Cy는 피라졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 티오페닐, 티아졸릴, 퓨라닐, 피리딜, 피라지닐, 피리미딜, 피리다지닐, 벤조퓨라닐, 벤조티오페닐, 벤조티아졸릴, 벤조티아다이아졸릴, 벤즈옥사졸릴, 인돌릴 또는 인다졸릴이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴인 화학식 I에 따른다. 더욱 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Cy가 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴인 화학식 I에 따른다. 특정한 실시태양에서, Cy는 피라졸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 퓨라닐, 티오페닐, 트라이아졸릴, 테트라졸릴, 티아졸릴, 옥사졸릴, 티아다이아졸릴 또는 옥사다이아졸릴이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, Cy는 피리디닐, 피라지닐, 피리미디닐, 또는 피리다졸릴이다. 보다 특정한 실시태양에서, Cy는 피리딜이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIa, IIb 또는 IIc에 따른다:
[화학식 IIa] [화학식 IIb] [화학식 IIc]
상기 식들에서, L1, R3, R4, La, Ra 및 R5는 상기 실시태양들 중 어느 하나에 개시된 바와 같다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IIIa, IIIb 또는 IIIc에 따른다:
[화학식 IIIa] [화학식 IIIb] [화학식 IIIc] 
상기 식들에서, L1, R3, R4, La, Ra 및 R5는 상기 실시태양들 중 어느 하나에 개시된 바와 같다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L1이 -CH2-인 화학식 I 내지 IIIc 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L1이 -O-인 화학식 I 내지 IIIc 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L1이 -NR2-이고, R2가 상기 실시태양들 중 어느 하나에 개시된 바와 같은 화학식 I 내지 IIIc 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L1이 -NR2-이고, 여기에서 R2가 H인 화학식 I 내지 IIIc 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 L1이 -NR2-이고, 여기에서 R2가 C1-4 알킬인 화학식 I 내지 IIIc 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R2는 Me, Et, 또는 iPr이다. 보다 특정한 실시태양에서, R2는 Me이다. 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, R2는 Et이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, IVe 또는 IVf에 따른다:
[화학식 IVa] [화학식 IVb] [화학식 IVc]
[화학식 IVd] [화학식 IVe] [화학식 IVf]
상기 식들에서, R3, R4, R5, La 및 Ra는 상기 실시태양들 중 어느 하나에 개시된 바와 같다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 La가 존재하지 않는 화학식 I 내지 IVf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 La가 -C(=O)-, -C(=O)O- 또는 -C(=O)NH-인 화학식 I 내지 IVf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 Va, Vb, Vc, Vd, Ve 또는 Vf에 따른다:
[화학식 Va] [화학식 Vb] [화학식 Vc]
[화학식 Vd] [화학식 Ve] [화학식 Vf]
상기 식들에서, R3, R4, R5 및 Ra는 상기 실시태양들 중 어느 하나에 개시된 바와 같다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R4가 H 또는 할로인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R4는 F 또는 Cl이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, R4는 H이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 H인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 할로인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R3은 F 또는 Cl이다. 보다 특정한 실시태양에서, R3은 Cl이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 C1- 4알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R3은 Me, Et 또는 n-Pr이다. 보다 특정한 실시태양에서, R3은 Me 또는 Et이다. 가장 특정한 실시태양에서, R3은 Et이다. 또 다른 가장 특정한 실시태양에서 R3은 Me이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된 C1- 4알킬인 인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R3은 -CHF2, -CF3, -CH2-CHF2 또는 -CH2-CF3이다. 보다 특정한 실시태양에서, R3은 -CF3 또는 -CH2-CF3이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 C1- 4알콕시인 인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R3은 -OMe, -OEt 또는 -On-Pr이다. 보다 특정한 실시태양에서, R3은 -OMe 또는 -OEt이다.
또 다른 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R3가 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로로 치환된 C1- 4알콕시인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R3은 -OCHF2, -OCF3, 또는 -OCH2-CHF2이다. 보다 특정한 실시태양에서, R3은 -OCHF2이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 CN인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 할로인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R5는 F 또는 Cl이다. 보다 특정한 실시태양에서, R5는 F이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 -L2-R6이고, R6이 상술한 바와 같고, L2가 -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7- 또는 -NR7SO2-이고, R7이 선행 실시태양들 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R7은 H이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, R7은 C1- 4알킬이다. 보다 특정한 실시태양에서, R7은 Me 또는 Et이다. 가장 특정한 실시태양에서 R7은 Me이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 -L2-R6이고, L2가 상술한 바와 같고, R6이 H인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 -L2-R6이고, L2가 상술한 바와 같고, R6이 C1- 6알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이다. 보다 특정한 실시태양에서, R6은 Me 또는 Et이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 -L2-R6이고, L2가 상술한 바와 같고, R6이 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8기로 치환된 C1- 6알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 또 다른 실시태양에서, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 치환된다. 특정한 실시태양에서, R6은 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 R8 기로 치환된 C1- 6알킬이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 R8 기로 치환된다. 보다 특정한 실시태양에서, R6은 하나의 R8 기로 치환된 C1- 6알킬이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나의 R8 기로 치환된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R8이 OH, CN, 할로 또는 C1- 4알콕시인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R8은 OH, CN, F, Cl, -OMe 또는 -OEt이다.
특정한 실시태양에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 -C(=O)- 또는 -SO2-이고, R6은 C1-6알킬이다. 보다 특정한 실시태양에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 -C(=O)- 또는 -SO2이고, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이다. 가장 특정한 실시태양에서, R5는 -C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me 또는 -SO2Et이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 R5가 -L2-R6이고, L2가 -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7- 또는 -NR7SO2-이고, R6 및 R7이 선행 실시태양 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, R7은 H, Me 또는 Et이고, R6은 선행 실시태양 중 어느 하나에 정의된 바와 같다. 또 다른 특정한 실시태양에서, R7은 선행 실시태양 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, R6은 H이다. 더욱 또 다른 특정한 실시태양에서, R7은 선행 실시태양 중 어느 하나에 정의된 바와 같고, R6은 하나 이상의 독립적으로 선택된 OH, CN, 할로 또는 C1- 4알콕시로 임의로 치환된 C1- 6알킬이다. 보다 특정한 실시태양에서, R7은 H, Me 또는 Et이고, R6은 H이다. 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, R7은 H, Me 또는 Et이고, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 OH, CN, 할로 또는 C1-4알콕시로 임의로 치환된다. 더욱 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, R7은 H, Me 또는 Et이고, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 OH, CN, F, Cl, OMe 또는 OEt로 임의로 치환된다. 가장 특정한 실시태양에서, R5는 -C(=O)NH2 또는 -SO2NH2이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 H인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 C1- 4알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Ra는 Me, Et, iPr 또는 tBu이다. 보다 특정한 실시태양에서, Ra는 Me 또는 Et이다. 가장 특정한 실시태양에서, Ra는 Me이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 치환된 C1- 4알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 또 다른 실시태양에서, Ra는 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 치환된다. 특정한 실시태양에서, Ra는 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 Rb로 치환된 C1- 4알킬이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, Ra는 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 Rb로 치환된다. 보다 특정한 실시태양에서, Ra는 하나의 Rb로 치환된 C1- 4알킬이다. 또 다른 보다 특정한 실시태양에서, Ra는 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나의 Rb로 치환된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 할로, CN 또는 OH인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 F, Cl, CN 또는 OH이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 C1- 4알콕시인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 OMe, OEt 또는 OiPr이다. 보다 특정한 실시태양에서, Rb는 OMe이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 C3- 7사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다. 보다 특정한 실시태양에서, Rb는 사이클로프로필이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 적어도 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, 또는 옥소로 치환된, O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 적어도 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 옥소로 치환된다. 또 다른 특정한 실시태양에서, Rb는 하나 이상의 독립적으로 선택된 F, Cl 또는 옥소로 치환된, O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬이다. 보다 특정한 실시태양에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 F, Cl 또는 옥소로 치환된다. 가장 특정한 실시태양에서, Rb는 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 F, Cl 또는 옥소로 치환된, O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬이다. 또 다른 가장 특정한 실시태양에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 F, Cl 또는 옥소로 치환된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 -SO2-C1- 4알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rb는 -SO2CH3, 또는 -SO2CH2CH3이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rb가 -C(=O)NRb1Rb2이고, 여기에서 각각의 Rb1 또는 Rb2가 H 및 C1- 4알킬 중에서 독립적으로 선택되는 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, 각각의 Rb1 또는 Rb2는 H, -CH3 및 -CH2CH3 중에서 독립적으로 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, Rb는 -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, 또는 -C(=O)NMe2이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Ra는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이다. 보다 특정한 실시태양에서, Ra는 사이클로프로필이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc 기로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 또 다른 실시태양에서, Ra는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc 기로 치환된다. 특정한 실시태양에서, Ra는 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 Rc 기로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, Ra는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 1, 2 또는 3개의 독립적으로 선택된 Rc 기로 치환된다. 보다 특정한 실시태양에서, Ra는 하나의 Rc 기로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬이다. 또 다른 특정한 실시태양에서, Ra는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이고, 이들은 각각 하나의 Rc 기로 치환된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rc가 할로, CN 또는 OH인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rc는 F, Cl, CN 또는 OH이다. 보다 특정한 실시태양에서, Rc는 F이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rc가 C1- 4알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Rc는 -Me, -Et 또는 -iPr이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rc가 -C(=O)OH인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Rc가 -C(=O)NRc1Rc2이고, 여기에서 각각의 Rc1 또는 Rc2가 H 및 C1- 4알킬 중에서 독립적으로 선택되는 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, 각각의 Rc1 또는 Rc2는 H, -CH3 및 -CH2CH3 중에서 독립적으로 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, Rc는 -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, 또는 -C(=O)NMe2이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가
인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가
인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Ra는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 Ra가 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴인 화학식 I 내지 Vf 중 어느 하나에 따른다. 특정한 실시태양에서, Ra는 퓨라닐, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 옥사다이아졸릴, 테트라졸, 피리디닐, 피라지닐 또는 피리미디닐이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 하기 중에서 선택된다:
N-(6-((6-시아노-4-에틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)사이클로프로판카복스아미드,
N-(6-(4-시아노-2-에틸-6-플루오로페닐아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)사이클로프로판카복스아미드,
N-(6-((4-시아노-2-에틸-6-플루오로페닐)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)사이클로프로판카복스아미드,
메틸 6-((6-시아노-4-에틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일카바메이트,
메틸 6-((4-시아노-2-에틸-6-플루오로페닐)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일카바메이트,
(1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-에틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
N-(6-((4-시아노-2-에틸-6-플루오로페닐)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드 (1S,2S)/(1R,2R) 라세미 혼합물,
(1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-에틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-(4-시아노-2-에틸-페녹시)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-(2-chloro-4-시아노-6-플루오로-N-메틸-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-2-플루오로-N-[6-[(6-플루오로-4-메틸-3-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-[(2,6-다이플루오로-3-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-2-플루오로-3-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-(4-시아노-2-플루오로-N-메틸-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-2-플루오로-N-[6-(2-플루오로-N,6-다이메틸-4-메틸설포닐-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-2-플루오로-N-[6-(2-플루오로-N-메틸-4-메틸설포닐-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
N-[6-[(4-에틸-6-메틸설포닐-3-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
N-[6-(2-플루오로-N,6-다이메틸-4-메틸설포닐-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-2-플루오로-4-메틸-3-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-[(2-시아노-3-플루오로-5-메틸-4-피리딜)-메틸-아미노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
5-((4-(사이클로프로판카복스아미도)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)(메틸)아미노)-4-에틸피콜린아미드,
4-에틸-5-((4-((1R,2R)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미도)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)(메틸)아미노)피콜린아미드,
(1R,2R)-N-[6-(N,2-다이메틸-4-메틸설포닐-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
(1R,2R)-N-[6-(4-에틸설포닐-N,2-다이메틸-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드,
5-(7-아미노-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일)옥시-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴,
N-[6-[(4-에틸-6-메틸설포닐-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
N-[6-[4-(시아노메틸)아닐리노]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드,
N-[6-(2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신-6-일아미노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]사이클로프로판카복스아미드, 및
5-[7-[[(1R,2R)-2-플루오로사이클로프로판카보닐]아미노]-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일]옥시-4-메틸-피리딘-2-카복스아미드.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 하기 중에서 선택된다:
1-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-3-아이소프로필-우레아,
4-메틸-5-[3-메틸-7-(메틸아미노)벤즈이미다졸-5-일]옥시-피리딘-2-카보나이트릴,
5-[7-(다이메틸아미노)-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일]옥시-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴,
N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-3-하이드록시-아제티딘-1-카복스아미드,
N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]모폴린-4-카복스아미드, 및
1-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-3-아이소프로필-우레아.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드이다. 보다 특정한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드가 아니다. 보다 특정한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드가 아니다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드이다. 보다 특정한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 (1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드가 아니다. 보다 특정한 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 화학식 I에 따르며, 여기에서 상기 화합물은 (1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드가 아니다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물은 동위원소 변체가 아니다.
하나의 태양에서 본 발명에 개시된 실시태양들 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 유리 염기로서 존재한다.
하나의 태양에서 본 발명에 개시된 실시태양들 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용 가능한 염이다.
하나의 태양에서 본 발명에 개시된 실시태양들 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 상기 화합물의 용매화물이다.
하나의 태양에서 본 발명에 개시된 실시태양들 중 어느 하나에 따른 본 발명의 화합물은 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물이다.
각 실시태양의 명시된 그룹들을 별도로 상기에 일반적으로 나열하였지만, 본 발명의 화합물은 상기 화학식뿐만 아니라 본 발명에 제공된 다른 화학식들의 다수의 또는 각각의 실시태양이 각각의 변수에 대해서 각각 나타낸 특정한 구성원 또는 그룹들 중 하나 이상으로부터 선택된 것이다. 따라서, 본 발명은 그의 범위내에 상기와 같은 실시태양들의 모든 조합을 포함하고자 한다.
각 실시태양에 대해 명시된 그룹들을 상기에 별도로 일반적으로 나열하였지만, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 변수(예를 들어 R 기)가 상기 나열된 화학식(들) 중 어느 하나에 따른 하나 이상의 실시태양들 중에서 선택된 것일 수 있다. 따라서, 본 발명은 그의 범위내에 개시된 실시태양들 중 어느 하나로부터의 변수들의 모든 조합을 포함하고자 한다.
한편으로, 그룹 또는 실시태양으로부터의 명시된 변수들 중 하나 이상, 또는 이들의 조합의 제외도 또한 본 발명에 의해 고려된다.
몇몇 태양에서, 본 발명은 상기 화학식들에 따른 화합물들의 전구약물 및 유도체를 제공한다. 전구약물은 대사적으로 절단가능한 그룹을 가지며 용매분해에 의해서 또는 생리학적 조건하에서 본 발명의 화합물로 되는, 생체내에서 약학적으로 활성인 본 발명 화합물의 유도체이다. 상기와 같은 예는 비제한적으로 콜린 에스터 유도체 등, N-알킬모폴린 에스터 등을 포함한다.
본 발명 화합물의 다른 유도체는 상기 화합물의 산 및 산 유도체 형태 모두에서 활성을 갖지만, 종종 산 민감성 형태가 용해도, 조직 적합성, 또는 포유동물 유기체에서 지연된 방출의 이점을 제공한다(Bundgard H, 1985). 전구약물은 당해 분야의 전문가들에게 널리 공지된 산 유도체, 예를 들어 모산과 적합한 알콜과의 반응에 의해 제조된 에스터, 또는 모산 화합물과 치환되거나 비치환된 아민과의 반응에 의해 제조된 아미드, 또는 산 무수물, 또는 혼합된 무수물을 포함한다. 본 발명의 화합물에 대해 펜던트인 산성 기로부터 유도된 간단한 지방족 또는 방향족 에스터, 아미드 및 무수물이 바람직한 전구약물이다. 일부의 경우에 이중 에스터 유형의 전구약물, 예를 들어 (아실옥시)알킬 에스터 또는 ((알콕시카보닐)옥시)알킬에스터를 제조하는 것이 바람직하다. 본 발명의 화합물의 C1 내지 C8 알킬, C2-C8 알케닐, 아릴, C7-C12 치환된 아릴, 및 C7-C12 아릴알킬 에스터가 특히 유용하다.
조항
1) 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물, 또는 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물:
화학식 I
상기 식에서,
R1은 H 또는 Me이고;
L1은 -NR2-; -O- 또는 -CH2-이고;
Cy는 페닐, 또는 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴이고;
R2는 H 또는 C1-4 알킬이고;
R3은 H, 할로, 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알킬, 또는 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알콕시이고;
R4는 H 또는 할로이고;
R5는 -CN, 할로이거나, 또는 -L2-R6이고;
-L2는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7-, 또는 -NR7SO2-이고;
R6은 H, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
R7은 H 또는 C1-4 알킬이고;
R8은 OH, CN, 할로 또는 C1-4 알콕시이고;
La는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)O- 또는 -C(=O)NH-이고;
Ra는
- H,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 임의로 치환된 C1-4 알킬,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc로 임의로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴이고;
Rb는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알콕시,
- C3-7 사이클로알킬,
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬(상기 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, 또는 옥소로 임의로 치환된다),
- -SO2-C1-4 알킬, 또는
- -C(=O)NRb1Rb2이고
Rc는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알킬,
- -C(=O)OH, 또는
- -C(=O)NRc1Rc2이고;
각각의 Rb1, Rb2, Rc1 및 Rc2는 H 및 C1-4 알킬 중에서 독립적으로 선택된다.
2) 1항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R1은 Me이다.
3) 1항 또는 2항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Cy는 페닐이다.
4) 1항 또는 2항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, Cy는 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 9원 모노사이클릭 또는 축합된 바이사이클릭 헤테로아릴이다.
5) 1항 또는 2항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴은 N, O 및 S 중에서 독립적으로 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 포함한다.
6) 1항 또는 2항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Cy는 피리딜이다.
7) 1항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 하기 화학식 IIa, IIb 또는 IIc에 따른다:
[화학식 IIa] [화학식 IIb] [화학식 IIc]
상기 식들에서, L1, R3, R4, La, Ra 및 R5는 1항에 개시된 바와 같다.
8) 1항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 하기 화학식 IIIa, IIIb 또는 IIIc에 따른다:
[화학식 IIIa] [화학식 IIIb] [화학식 IIIc]
상기 식들에서, L1, R3, R4, La, Ra 및 R5는 1항에 개시된 바와 같다.
9) 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, L1은 -CH2-이다.
10) 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, L1은 O이다.
11) 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, L1은 -NR2-이다.
12) 11항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R2는 H이다.
13) 11항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R2는 C1-4 알킬이다.
14) 11항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R2는 Me이다.
15) 1항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 하기 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, IVe 또는 IVf에 따른다:
[화학식 IVa] [화학식 IVb] [화학식 IVc]
[화학식 IVd] [화학식 IVe] [화학식 IVf]
상기 식들에서, R3, R4, R5, La 및 Ra는 1항에 개시된 바와 같다.
16) 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, La는 존재하지 않는다.
17) 1항 내지 15항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, La는 -C(=O)-이다.
18) 1항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 하기 화학식 Va, Vb, Vc, Vd, Ve 또는 Vf에 따른다:
[화학식 Va] [화학식 Vb] [화학식 Vc]
[화학식 Vd] [화학식 Ve] [화학식 Vf]
상기 식들에서, R3, R4, R5, La 및 Ra는 1항에 개시된 바와 같다.
19) 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R4는 H이다.
20) 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R4는 F 또는 Cl이다.
21) 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R3은 H이다.
22) 1항 내지 18항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R3은 C1- 4알킬이다.
23) 22항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R3은 Me 또는 Et이다.
24) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 CN이다.
25) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 할로이다.
26) 25항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 F 또는 Cl이다.
27) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, R6은 1항에 개시된 바와 같고, L2는 -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7- 또는 -NR7SO2-이다.
28) 27항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R7은 H이다.
29) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 1항에 개시된 바와 같고, R6은 H이다.
30) 1항 내지 26항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 1항에 개시된 바와 같고, R6은 C1- 6알킬이다.
31) 30항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6은 Me이다.
32) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 1항에 개시된 바와 같고, R6은 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8기로 치환된 C1- 6알킬이다.
33) 32항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 치환된다.
34) 33항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R8은 OH, CN, F, Cl, -OMe 또는 -OEt이다.
35) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 -C(=O)- 또는 -SO2-이고, R6은 C1- 6알킬이다.
36) 35항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -C(=O)Me, -C(=O)Et, -SO2Me 또는 -SO2Et이다.
37) 1항 내지 23항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -L2-R6이고, L2는 -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2NR7- 또는 -NR7SO2-이고, R7은 H, Me 또는 Et이고, R6은 Me, Et, iPr 또는 tBu이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 OH, CN, 할로 또는 C1- 4알콕시로 임의로 치환된다.
38) 37항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, R5는 -C(=O)NH2 또는 -SO2NH2이다.
39) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 C1- 4알킬이다.
40) 39항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 Me 또는 Et이다.
41) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 치환된 C1- 4알킬이다.
42) 41항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 Me, Et, iPr 또는 tBu이다.
43) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 F, Cl, CN 또는 OH이다.
44) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 OMe, OEt 또는 OiPr이다.
45) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실이다.
46) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이다.
47) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이고, 이들은 각각 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로 또는 옥소로 치환된다.
48) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 -SO2CH3, 또는 -SO2CH2CH3이다.
49) 41항 또는 42항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rb는 -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, 또는 -C(=O)NMe2이다.
50) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬이다.
51) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc 기로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬이다.
52) 50항 또는 51항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 사이클로프로필, 사이클로부틸, 또는 사이클로펜틸이다.
53) 51항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rc는 F, Cl, CN 또는 OH이다.
54) 51항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rc는 -Me, -Et 또는 -iPr이다.
55) 51항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rc는 -C(=O)OH이다.
56) 51항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Rc는 -C(=O)NH2, -C(=O)NMeH, 또는 -C(=O)NMe2이다.
57) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는
이다.
58) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는
이다.
59) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬이다.
60) 59항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 옥세타닐, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, 아제티디닐, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모폴리닐 또는 티오모폴리닐이다.
61) 1항 내지 38항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴이다.
62) 61항에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염에서, Ra는 퓨라닐, 티에닐, 피롤릴, 옥사졸릴, 티아졸릴, 이미다졸릴, 트라이아졸릴, 옥사다이아졸릴, 테트라졸, 피리디닐, 피라지닐 또는 피리미디닐이다.
63) 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 표 I 중에서 선택된다.
64) 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드이다.
65) 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드가 아니다.
66) 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서,
상기 화합물은 (1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드이다.
67) 1항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염에서, 상기 화합물은 (1R,2R)-N-(6-((6-시아노-4-메틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)-2-플루오로사이클로프로판카복스아미드가 아니다.
68) 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물.
69) 추가의 치료제를 포함하는 68항에 따른 약학 조성물.
70) 약제에 사용하기 위한, 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물.
71) 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물.
72) 증식성 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물.
73) 72항에 따른 화합물에서, 증식성 질병은 골수섬유증, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암 중에서 선택된다.
74) 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 수행하기에 충분한 양의 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병의 치료 또는 예방 방법.
75) 증식성 질병의 치료 또는 예방을 수행하기에 충분한 양의 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 상기 질병의 치료 또는 예방 방법.
76) 76항에 따른 치료 방법에서, 증식성 질병은 골수섬유증, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암 중에서 선택된다.
77) 75항 내지 77항 중 어느 한 항에 따른 방법에서, 1항 내지 67항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 또는 68항 또는 69항에 따른 약학 조성물을 추가의 치료제와 함께 투여한다.
78) 69항에 따른 약학 조성물, 또는 78항에 따른 방법에서, 추가의 치료제는 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 또는 예방을 위한 작용제이다.
79) 69항에 따른 약학 조성물, 또는 78항에 따른 방법에서, 추가의 치료제는 골수섬유증, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프모구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암의 치료 또는 예방을 위한 작용제이다.
약학 조성물
본 발명의 화합물은 약제로서 사용될 때, 전형적으로는 약학 조성물의 형태로 투여된다. 상기와 같은 조성물은 제약 분야에 널리 공지된 방식으로 제조될 수 있으며 하나 이상의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 화합물을 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 실제 투여되는 화합물의 양은 전형적으로는 의사에 의해, 관련된 상황, 예를 들어 치료하려는 질환, 선택된 투여 경로, 실제 투여되는 화합물, 개인 환자의 연령, 체중 및 반응, 환자의 증상의 중증도 등에 비추어 결정될 것이다.
본 발명의 약학 조성물을 경구, 직장, 경피, 피하, 관절-내, 정맥 내, 근육 내 및 비 내를 포함한 다양한 경로에 의해 투여할 수 있다. 의도하는 전달 경로에 따라, 본 발명의 화합물을 바람직하게는 주사성 또는 경구 조성물로서 또는 연고로서, 로션으로서 또는 모든 경피 투여의 경우 패치로서 제형화한다.
경구 투여용 조성물은 벌크 액체 용액 또는 현탁액, 또는 벌크 분말의 형태를 취할 수 있다. 그러나, 보다 통상적으로, 상기 조성물을 단위 투여형으로 제공하여 정확한 투여를 용이하게 한다. "단위 투여형"이란 용어는 인간 환자 및 다른 포유동물에 대해 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 분리된 단위를 지칭하며, 각각의 단위는 목적하는 치료 효과를 생성시키도록 계산된 소정량의 활성 물질을, 적합한 약학 부형제, 비히클 또는 담체와 함께 함유한다. 전형적인 단위 투여형은 액체 조성물의 미리 충전되거나, 미리 측정된 앰풀 또는 주사기 또는 고체 조성물의 경우에 환제, 정제, 캡슐 등을 포함한다. 상기와 같은 조성물에서, 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물은 대개 소량 성분(약 0.1 내지 약 50 중량% 또는 바람직하게는 약 1 내지 약 40 중량%)이며, 나머지는 다양한 비히클 또는 담체 및 목적하는 투여형의 형성에 도움이 되는 가공 보조제이다.
경구 투여용으로 적합한 액체 형태는 완충제, 현탁 및 분배제, 착색제, 풍미제 등과 함께 적합한 수성 또는 비수성 비히클을 포함할 수 있다. 고체 형태는 예를 들어 하기의 성분들 중 임의의 것 또는 유사한 성질의 화합물을 포함할 수 있다: 결합제, 예를 들어 미정질 셀룰로스, 검 트라가칸트 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들어 전분 또는 락토오스, 붕해제, 예를 들어 알긴산, 프리모젤, 또는 옥수수 전분; 윤활제, 예를 들어 마그네슘 스테아레이트; 활주제, 예를 들어 콜로이드성 이산화 규소; 감미제, 예를 들어 슈크로스 또는 사카린; 또는 풍미제, 예를 들어 페퍼민트, 메틸 살리실레이트, 또는 오렌지향.
주사성 조성물은 전형적으로는 주사성 멸균 염수 또는 포스페이트-완충된 염수 또는 당해 분야에 공지된 다른 주사성 담체를 기본으로 한다. 이전과 같이, 상기와 같은 조성물 중의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물은 전형적으로는 소량 성분(종종 약 0.05 내지 10 중량%)이며, 나머지는 주사성 담체 등이다.
경피 조성물을 전형적으로는 상기 활성 성분(들)을 일반적으로 약 0.01 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 20 중량%, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 10 중량%, 및 보다 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 중량% 범위의 양으로 함유하는 국소 연고 또는 크림으로서 제형화한다. 연고로서 제형화 시, 상기 활성 성분을 전형적으로는 파라핀성 또는 수-혼화성 연고 베이스와 배합할 것이다. 한편으로, 상기 활성 성분을 예를 들어 수중 유적형 크림 베이스와 함께 크림으로 제형화할 수도 있다. 상기와 같은 경피 제형은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며 일반적으로는 상기 활성 성분 또는 상기 제형의 피부 침투 안정성을 증대시키기 위해서 추가적인 성분들을 포함한다. 모든 상기와 같은 공지된 경피 제형 및 성분들은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명의 화합물을 또한 경피 장치에 의해 투여할 수 있다. 따라서, 경피 투여를 수용조 또는 다공성 막 유형, 또는 고체 기질 잡동사니의 패치를 사용하여 수행할 수 있다.
경구 투여성, 주사성 또는 국소 투여성 조성물에 대한 상술한 성분들은 단지 예시적인 것이다. 다른 물질들뿐만 아니라 가공 기법 등이 본 발명에 참고로 인용된 문헌[Part 8 of Remington’s Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 나열되어 있다.
본 발명의 화합물을 또한 서방성 형태로 또는 서방성 약물 전달 시스템으로부터 투여할 수 있다. 전형적인 서방성 물질에 대한 명세를 문헌[Remington’s Pharmaceutical Sciences]에서 찾을 수 있다.
하기의 제형예들은 본 발명에 따라 제조될 수 있는 전형적인 약학 조성물들을 예시한다. 그러나, 본 발명을 하기의 약학 조성물들로 제한하지 않는다.
제형 1 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수도 있다. 상기 혼합물을 정제 프레스에서 240 내지 270 ㎎ 정제(정제당 80 내지 90 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킬 수 있다.
제형 2 - 캡슐
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:1 중량비로 전분 희석제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 상기 혼합물을 250 ㎎ 캡슐에 충전할 수 있다(캡슐당 125 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물).
제형 3 - 액체
본 발명의 화합물(125 ㎎)을 슈크로스(1.75 g) 및 잔탄 검(4 ㎎)과 혼합하고, 생성된 혼합물을 블렌딩하고, 10번 메쉬 U.S. 체에 통과시키고, 이어서 앞서 제조된 미정질 셀룰로스와 나트륨 카복시메틸 셀룰로스(11:89, 50 ㎎)의 수중 용액과 혼합할 수 있다. 나트륨 벤조에이트(10 ㎎), 풍미제 및 착색제를 물로 희석하고, 교반하면서 첨가할 수도 있다. 이어서 충분한 물을 교반하면서 가할 수 있다. 이어서 충분한 물을 가하여 총 5 ㎖의 부피를 생성시킬 수 있다.
제형 4 - 정제
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 1:2 중량비로 건조 젤라틴 결합제와 함께 건조 분말로서 혼합할 수 있다. 소량의 마그네슘 스테아레이트를 윤활제로서 첨가할 수 있다. 상기 혼합물을 정제 프레스에서 450 내지 900 ㎎ 정제(150 내지 300 ㎎의 화학식 I에 따른 본 발명의 활성 화합물)로 형성시킨다.
제형 5 - 주사액
화학식 I에 따른 본 발명의 화합물을 대략 5 ㎎/㎖의 농도로 완충된 멸균 염수 주사성 수성 매질에 용해시키거나 현탁시킬 수 있다.
제형 6 - 국소용
스테아릴 알콜(250 g) 및 백색 바셀린(250 g)을 약 75 ℃에서 용융시키고 이어서 수(약 370 g) 중에 용해된 화학식 I에 따른 본 발명의 화합물(50 g), 메틸파라벤(0.25 g), 프로필파라벤(0.15 g), 나트륨 라우릴 설페이트(10 g), 및 프로필렌 글리콜(120 g)의 혼합물을 가하고, 생성되는 혼합물을 응결시까지 교반할 수 있다.
치료 방법
본 발명의 화합물은 포유동물에서 JAK의 이상 활성과 인과관계로 관련되거나 또는 상기에 기인할 수 있는 상태의 치료를 위한 치료제로서 사용될 수 있다. 특히 상태는 JAK1 및/또는 TYK2의 이상 활성과 관련된다. 따라서, 본 발명의 화합물 및 약학 조성물은 인간을 포함한 포유동물에서 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 위한 치료제로서 용도가 발견된다.
하나의 태양에서, 본 발명은 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 태양에서, 본 발명은 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 본 발명에 개시된 질병이 있거나 또는 있을 위험이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 태양에서, 본 발명은 알러지성 질병, 염증 질병, 자가면역 질병, 증식성 질병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병, 선천성 연골 기형, 및/또는 IL6의 분비과잉 또는 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병이 있거나 또는 상기 질병이 있을 위험이 있는 포유동물의 치료 방법을 제공한다.
치료 방법의 태양에서, 본 발명은 알러지성 반응에 민감하거나 또는 상기 반응이 침범한 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 알러지성 반응은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및 두드러기, 식품 알러지 또는 곤충독에 대한 알러지 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 알러지성 반응의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 알러지성 반응은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및 두드러기, 식품 알러지 및 곤충독에 대한 알러지 중에서 선택된다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 알러지성 반응의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 알러지성 반응은 알러지성 기도 질병, 부비강염, 습진 및 두드러기, 식품 알러지 및 곤충독에 대한 알러지 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 염증 상태에 민감하거나 또는 상기 반응이 침범한 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 염증 상태의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.
더욱 또 다른 태양에서, 본 발명은 염증 상태의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 염증 상태는 류마티스성 관절염, 골관절염, 알러지성 기도 질병(예를 들어 천식) 및 염증성 장 질병(예를 들어 크론병 또는 궤양성 대장염) 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 자가면역 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 전신 홍반성 루프스이다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 자가면역 질병은 COPD, 천식, 전신 홍반성 루푸스, I형 당뇨병 및 염증성 장 질병 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 증식성 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및 건선 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 골수섬유종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 증식성 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및 건선 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 골수섬유종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암 중에서 선택된다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 증식성 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 암(예를 들어 고형 종양, 예를 들어 자궁 평활근육종 또는 전립선암), 백혈병(예를 들어 AML, ALL 또는 CLL), 다발성 골수종 및 건선 중에서 선택된다. 보다 특정한 실시태양에서, 상기 증식성 질병은 골수섬유종, T-세포 급성 림프모구성 백혈병(T-ALL), 다발성 골수종, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 확산성 큰 B-세포 림프종(DLBCL), 췌장암, 간암, 간세포 암종(HCC), 폐암, 유방암 및 결장암 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 이식 거부에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 이식 거부는 기관 이식 거부이다.
또 다른 태양에서 본 발명은 이식 거부의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 이식 거부는 기관 이식 거부이다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 이식 거부는 기관 이식 거부이다.
치료 방법의 태양에서, 본 발명은 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 치료 유효량의 본 발명의 화합물, 또는 본 발명에 개시된 약학 조성물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 선천성 연골 기형의 치료 및/또는 예방 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효량의 본 발명에 개시된 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다.
또 다른 태양에서 본 발명은 선천성 연골 기형의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 선천성 연골 기형의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 IL6의 분비과잉과 관련된 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IL6의 분비과잉과 관련된 질병은 캐슬만병 및 혈관사이세포 증식성 사구체신염 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 IL6의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IL6의 분비과잉과 관련된 질병은 캐슬만병 및 혈관사이세포 증식성 사구체신염 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 IL6의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 IL6의 분비과잉과 관련된 질병은 캐슬만병 및 혈관사이세포 증식성 사구체신염 중에서 선택된다.
추가의 치료 방법의 태양에서, 본 발명은 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병에 민감하거나 또는 상기 질병에 걸린 포유동물의 예방 및/또는 치료 방법을 제공하며, 상기 방법은 유효한 상태-치료 또는 상태-예방량의 본 발명에 개시된 바와 같은 본 발명의 약학 조성물 및 화합물 중 하나 이상을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병은 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 및 류마티스성 관절염 중에서 선택된다.
또 다른 태양에서 본 발명은 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방에 사용하기 위해 본 발명의 화합물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병은 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 및 류마티스성 관절염 중에서 선택된다.
더욱 또 다른 태양에서 본 발명은 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용하기 위해 본 발명의 화합물, 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 특정한 실시태양에서, 상기 인터페론의 분비과잉과 관련된 질병은 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 및 류마티스성 관절염 중에서 선택된다.
본 발명의 추가의 태양으로서 특히 상기 언급한 상태 및 질병의 치료 및/또는 예방에 약제로서 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 제공한다. 또한 본 발명에서 상기 언급한 상태 및 질병들 중 하나의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 본 발명 화합물의 용도를 제공한다.
본 발명의 방법의 특정한 섭생은 염증을 수반하는 질병을 앓고 있는 피실험자에게, 상기 피실험자에서 상기 염증의 수준을 감소시키고, 바람직하게는 상기 염증의 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시태양은 류마티스성 관절염을 앓고 있거나 상기 관절염의 발병에 민감한 피실험 환자에게, 상기 환자의 관절에서 염증을 각각 감소시키거나 예방하고, 바람직하게는 상기 염증의 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다.
본 발명의 방법의 추가의 특정한 섭생은 연골 또는 관절 변성을 특징으로 하는 질병 상태(예를 들어 류마티스성 관절염 및/또는 골관절염)를 앓고 있는 피실험자에게, 상기 변성을 감소시키고, 바람직하게는 상기 변성의 저절로 계속되는 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 상기 방법의 특정한 실시태양은 골관절염을 앓고 있거나 상기 관절염의 발병에 민감한 피실험 환자에게, 상기 환자의 관절에서 연골 변성을 각각 감소시키거나 예방하고, 바람직하게는 상기 변성의 저절로 계속되는 원인 과정을 종결시키기에 충분한 기간 동안 유효량의 본 발명의 화합물을 투여함을 포함한다. 특정한 실시태양에서, 상기 화합물은 연골 동화 및/또는 이화-억제 성질을 나타낼 수 있다.
주사 용량 수준은 모두 약 1 내지 약 120 시간 및 특히 24 내지 96 시간 동안 약 0.1 ㎎/㎏/h 내지 적어도 10 ㎎/㎏/h의 범위이다. 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏ 이상의 프리로딩 일시주사를 또한 투여하여 적합한 정상 상태 수준을 성취할 수 있다. 최대 총 용량은 40 내지 80 ㎏ 인간 환자의 경우 약 2 g/일을 초과하지 않을 것으로 예상된다.
장기적인 상태, 예를 들어 퇴행 상태의 예방 및/또는 치료를 위해서, 상기 치료 섭생을 대개는 수개월 또는 수년에 걸쳐 늘릴 수 있으며 따라서 경구 투여가 환자의 편의성 및 허용성을 위해 바람직하다. 경구 투여의 경우, 매일 1 내지 5 회 및 특히 매일 2 내지 4 회 및 전형적으로 매일 3 회의 경구 용량이 전형적인 섭생이다. 이러한 투여 패턴을 사용하는 경우, 각각의 용량은 약 0.01 내지 약 20 ㎎/㎏의 본 발명의 화합물을 제공하며, 특히 각각의 용량은 약 0.1 내지 약 10 ㎎/㎏ 및 특히 약 1 내지 약 5 ㎎/㎏을 제공한다.
경피 용량은 일반적으로 주사 용량을 사용하여 성취되는 것과 유사하거나 더 낮은 혈중 수준을 제공하도록 선택된다.
질환의 발병을 예방하기 위해 사용될 때, 본 발명의 화합물을 상기 질환이 발병할 위험이 있는 환자에게, 전형적으로는 의사의 충고 및 감독 하에서, 상술한 투여량 수준으로 투여할 것이다. 특정 질환이 발병할 위험이 있는 환자는 일반적으로 상기 질환의 가족력이 있는 환자 또는 상기 질환의 발병에 특히 민감한 것으로 유전자 시험 또는 선별에 의해 확인된 환자를 포함한다.
본 발명의 화합물을 단독 활성제로서 투여하거나 또는 다른 치료제, 예를 들어 동일하거나 유사한 치료 활성을 나타내고 병행 투여에 대해 안전하고 효능 있는 것으로 결정된 다른 화합물과 함께 투여할 수 있다. 특정한 실시태양에서, 2 개(이상)의 작용제의 동시 투여는 각각 현저하게 더 낮은 용량의 사용을 허용하며, 이에 의해 나타나는 부작용이 감소된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물 또는 본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물을 약제로서 투여한다. 특정 실시태양에서, 상기 약학 조성물은 추가의 활성 성분을 추가로 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 염증을 동반하는 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 면역조절제, 예를 들어 아자티오프린, 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론 또는 덱사메타손), 사이클로포스파미드, 사이클로스포린 A, 타크로리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 뮤로모냅-CD3(OKT3, 예를 들어 오르쏘콜론(Orthocolone)(등록상표)), ATG, 아스피린, 아세트아미노펜, 이부프로펜, 나프록센 및 피록시캄을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 관절염(예를 들어 류마티스성 관절염)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 진통제, 비-스테로이드성 소염 약물(NSAIDS), 스테로이드, 합성 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 아우라노핀, 나트륨 아우로티오말레이트, 페니실라민, 클로로퀸, 하이드록시클로로퀸, 아자티오프린, 및 시클로스포린), 및 생물학적 DMARDS(예를 들어 비제한적으로 인플릭시맵, 에타너셉트, 아달리뮤맵, 리툭시맵, 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 증식성 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 메토트렉세이트, 류코보린, 아드리아마이신, 프레니손, 블레오마이신, 사이클로포스파미드, 5-플루오로유라실, 패클리탁셀, 도세탁셀, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 비노렐빈, 독소루비신, 타목시펜, 토레미펜, 메제스트롤 아세테이트, 아나스트로졸, 고세렐린, 항-HER2 단클론 항체(예를 들어 허셉틴(Herceptin)(상표)), 카페시타빈, 랄록시펜 하이드로클로라이드, EGFR 억제제(예를 들어 이레사(Iressa)(등록상표), 타세바(Tarceva)(상표), 에르비툭스(Erbitux)(상표)), VEGF 억제제(예를 들어 아바스틴(Avastin)(상표)), 프로테오솜 억제제(예를 들어 벨케이드(Velcade)(상표)), 글리벡(Glivec)(등록상표) 및 hsp90 억제제(예를 들어 17-AAG)를 포함한다. 추가로, 본 발명의 화합물을 다른 요법, 예를 들어 비제한적으로 방사선요법 또는 수술과 함께 투여할 수 있다. 특정 실시태양에서 상기 증식성 질환은 암, 골수증식성 질병 및 백혈병 중에서 선택된다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드, 세포성장 억제제(예를 들어 퓨린 유사체), 알킬화제(예를 들어 질소 머스터드(사이클로포스파미드), 니트로소유레아, 백금 화합물 등), 대사길항물질(예를 들어 메토트렉세이트, 아자티오프린 및 머캅토퓨린), 세포독성 항생제(예를 들어 닥티노마이신 안트라사이클린, 미토마이신 C, 블레오마이신, 및 미트라마이신), 항체(예를 들어 항-CD20, 항-CD25, 또는 항-CD3(OTK3) 단클론 항체, 아트감(Atgam)(등록상표) 및 티모글로불린(Thymoglobuline)(등록상표)), 사이클로스포린, 타크로리무스, 라파마이신(시로리무스), 인터페론(예를 들어 INF-β), TNF 결합 단백질(예를 들어 인플릭시맵(레미케이드(Remicade)(상표), 에타너셉트(엔브렐(Enbrel)(상표) 또는 아달리뮤맵(휴미라(Humira)(상표)), 마이코페놀레이트, 핑고리모드 및 미리오신을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 이식 거부의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 칼시뉴린 억제제(예를 들어 사이클로스포린 또는 타크로리무스(FK506)), mTOR 억제제(예를 들어 시로리무스, 에베로리무스), 증식-방지제(예를 들어 아자티오프린, 마이코페놀산), 코르티코스테로이드(예를 들어 프레드니솔론, 하이드로코르티손), 항체(예를 들어 단클론 항-IL-2Rα 수용체 항체, 바실릭시맵, 다클리주맵), 다클론성 항-T-세포 항체(예를 들어 항-흉선세포 글로불린(ATG), 항-림프구 글로불린(ALG))를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 비염 및/또는 COPD의 치료 및/또는 예방을 위한 작용제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 베타2-아드레날린 수용체 작용물질(예를 들어 살부타몰, 레발부테롤, 터뷰탈린 및 비톨테롤), 에피네프린(흡입형 또는 정제), 항콜린제(예를 들어 이프라트로피움 브로마이드), 글루코코르티코이드(경구 또는 흡입형), 오래 작용하는 β2-작용물질(예를 들어 살메테롤, 포모테롤, 밤부테롤, 및 서방성 경구 알부테롤), 흡입형 스테로이드와 오래 작용하는 기관지 확장제의 조합(예를 들어 플루티카손/살메테롤, 부데소니드/포모테롤), 류코트리엔 길항물질 및 합성 억제제(예를 들어 몬테류카스트, 자피르류카스트 및 질류톤), 매개체 방출 억제제(예를 들어 크로모글리케이트 및 케토티펜), IgE 반응의 생물학적 조절제(예를 들어 오말리주맵), 항히스타민제(예를 들어 세테리진, 신나리진, 펙소페나딘), 및 혈관수축제(예를 들어 옥시메타졸린, 자일로메타졸린, 나파졸린 및 트라마졸린)를 포함한다.
추가로, 본 발명의 화합물을 천식 및/또는 COPD에 대한 응급 요법과 함께 투여할 수도 있으며, 상기와 같은 요법은 산소 또는 헬리옥스 투여, 분무된 살부타몰 또는 터부탈린(항콜린제(예를 들어 이프라트로피움)와 임의로 병용됨), 전신 스테로이드(경구 또는 정맥 내, 예를 들어 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 덱사메타손 또는 하이드로코르티손), 정맥 내 살부타몰, 비-특이적 베타-작용물질, 주사제 또는 흡입제(예를 들어 에피네프린, 아이소에타린, 아이소프로테레놀, 메타프로테레놀), 항콜린제(IV 또는 분무형, 예를 들어 글리코피롤레이트, 아트로핀, 이프라트로피움), 메틸잔틴(테오필린, 아미노필린, 바미필린), 기관지확장 효과를 갖는 흡입 마취제(예를 들어 아이소플루란, 할로탄, 엔플루란), 케타민, 및 정맥 내 황산 마그네슘을 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 염증성 장 질병(IBD)의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 부데소니드) 합성 질병 변형, 면역조절제(예를 들어 메토트렉세이트, 레플루노미드, 설파살라진, 메살라진, 아자티오프린, 6-머캅토퓨린 및 시클로스포린) 및 생물학적 질병 변형, 면역조절제(인플릭시맵, 아다리뮤맵, 리툭시맵 및 아바타셉트)를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 SLE의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 질병-변형 항류마티스 약물(DMARD), 예를 들어 항말라리아약(예를 들어 플라퀘닐, 하이드록시클로로퀸), 면역억제제(예를 들어 메토트렉세이트 및 아자티오프린), 사이클로포스파미드 및 마이코페놀산, 면역억제성 약물 및 진통제, 예를 들어 비스테로이드성 소염 약물, 오피에이트(예를 들어 덱스트로프로폭시펜 및 코-코다몰), 오피오이드(예를 들어 하이드로코돈, 옥시코돈, MS 콘틴, 또는 메타돈), 및 펜타닐 듀라제식 경피 패치를 포함한다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 건선의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 국소 치료제, 예를 들어 입욕액, 보습제, 콜 타르를 함유하는 약물첨가된 크림 및 연고, 다이트라놀(안트랄린), 코르티코스테로이드 유사 데속시메타손(토피코트(Topicort)(상표)), 플루오시노니드, 비타민 D3 유사체(예를 들어 칼시포트리올), 아르간 오일 및 레티노이드(에트레티네이트, 아시트레틴, 타자로텐), 전신 치료제, 예를 들어 메토트렉세이트, 사이클로스포린, 레티노이드, 티오구아닌, 하이드록시유레아, 설파살라진, 마이코페놀레이트 모페틸, 아자티오프린, 타크로리무스, 퓨마르산 에스터 또는 생물제, 예를 들어 아메비브(Amevive)(상표), 엔브렐(Enbrel)(상표), 휴미라(Humira)(상표), 레미케이드(Remicade)(상표), 라프티바(Raptiva)(상표) 및 유스테키누맵(IL-12 및 IL-23 차단제)을 포함한다. 추가로, 본 발명의 화합물을 다른 요법들, 예를 들어 비제한적으로 광선요법, 또는 광화학요법(예를 들어 프소랄렌 및 자외선 A 광선요법(PUVA))과 함께 투여할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 화합물을 알러지 반응의 치료 및/또는 예방을 위한 또 다른 치료제와 함께 투여하며, 특정한 작용제는 비제한적으로 항히스타민제(예를 들어 세티리진, 다이펜하이드라민, 펙소페나딘, 레보세티리진), 글루코코르티코이드(예를 들어 프레드니손, 베타메타손, 베클로메타손, 덱사메타손), 에피네프린, 테오필린 또는 항-류코트리엔(예를 들어 몬테류카스트 또는 자피르류카스트), 항-콜린제 및 울혈완화제를 포함한다.
동시 투여는 숙련가에게 자명한 바와 같이 2개 이상의 치료제를 동일한 치료 섭생의 부분으로서 환자에게 전달하는 임의의 수단을 포함한다. 2개 이상의 작용제를 단일 제형으로 동시에 투여할 수도 있지만, 이는 필수적인 것은 아니다. 상기 작용제들을 상이한 제형으로 상이한 시점에서 투여할 수도 있다.
화학 합성 과정
일반적인 내용
본 발명의 화합물을 하기의 일반적인 방법 및 과정을 사용하여 쉽게 입수할 수 있는 출발 물질로부터 제조할 수 있다. 전형적이거나 바람직한 공정 조건(즉 반응 온도, 시간, 반응물들의 몰비, 용매, 압력 등)이 주어지는 경우, 달리 나타내지 않는 한 다른 공정 조건들을 또한 사용할 수 있음을 알 것이다. 최적의 반응 조건은 사용되는 특정 반응물 또는 용매에 따라 변할 수 있지만, 상기와 같은 조건들은 통상적인 최적화 과정에 의해 당해 분야의 숙련가에 의해 결정될 수 있다.
추가로, 당해 분야의 숙련가들에게 자명한 바와 같이, 몇몇 작용기들이 바람직하지 못한 반응을 겪지 않도록 하기 위해서 통상적인 보호 그룹이 필요할 수 있다. 특정 작용기에 적합한 보호 그룹뿐만 아니라 보호 및 탈보호에 적합한 조건의 선택은 당해 분야에 널리 공지되어 있다(Greene, T W; Wuts, P G M;, 1991).
하기의 방법들을 본 발명에서 상기에 나열한 본 발명의 화합물의 제조에 관한 상세한 내용과 함께 제공한다. 본 발명의 화합물을 유기 합성 분야의 숙련가에 의해 공지되거나 상업적으로 입수할 수 있는 출발 물질 및 시약으로부터 제조할 수 있다.
모든 시약들은 상업적인 등급의 것들이었으며 달리 나타내지 않는 한 추가의 정제 없이 제공받은 대로 사용되었다. 상업적으로 입수할 수 있는 무수 용매를 불활성 분위기 하에서 수행된 반응들에 사용하였다. 달리 나타내지 않는 한 다른 모든 경우는 시약 등급 용매가 사용되었다. 컬럼 크로마토그래피를 실리카젤 60(35 내지 70 ㎛) 상에서 수행하였다. 박층 크로마토그래피를 사전-코팅된 실리카젤 F-254 플레이트(두께 0.25 ㎜)를 사용하여 수행하였다. 1H NMR 스펙트럼은 브룩커 DPX 400 NMR 분광계(400 MHz) 또는 브룩커 어드밴스 300 NMR 분광계(300 MHz) 상에 기록되었다. 1H NMR 스펙트럼에 대한 화학 이동(δ)은 내부 기준으로서 테트라메틸실란(δ 0.00) 또는 적합한 잔류 용매 피크, 즉 CHCl3(δ 7.27)에 대한 백만당 부(ppm)로 보고된다. 다중도는 단일선(s), 이중선(d), 삼중선(t), 사중선(q), 오중선(quin), 다중선(m) 및 브로드(br)로서 제공된다. 전기분무 MS 스펙트럼을 워터스 플랫폼(Waters platform) LC/MS 분광계 상에서 또는 워터스 매스(Waters Mass) 검출기 3100 분광계에 커플링된 워터스 액퀴티(Waters Acquity) H-클래스 UPLC로 획득하였다. 사용된 컬럼: 워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ ID x 50 ㎜ L, 워터스 액퀴티 UPLC BEH C18 1.7 ㎛, 2.1 ㎜ ID x 30 ㎜ L, 또는 워터스 엑스테라(Xterra) MS 5 ㎛ C18, 100 x 4.6 ㎜. 상기 방법들은 MeCN/H2O 구배(H2O는 0.1% TFA 또는 0.1% NH3을 함유한다) 또는 MeOH/H2O 구배(H2O는 0.05% TFA를 함유한다)를 사용한다. 극초단파 가열을 바이오테이지 이니시에이터(Biotage Initiator)로 수행하였다.
예비 HPLC 정제를 ZQ 단일 사중극 질량 분광계와 커플링된 질량-지시된 자동-정제 시스템으로 수행하였다. 모든 HPLC 정제를 H2O(상이한 pH)/MeCN의 구배로 수행하였다. 염기성 조건하에서의 예비 HPLC 분리는 대개 BEH 엑스브리지 C18(5 ㎛, 19 x 5 ㎜) 예비컬럼 및 BEH 엑스브리지 C18(5 ㎛, 19 x 100 ㎜)을 사용하여 수행되었다. 산성 조건하에서의 분리는 대개 CSH 셀렉트(Select) C18(5 ㎛, 19 x 5 ㎜) 예비컬럼 및 CSH 셀렉트 C18(5 ㎛, 19 x 100 ㎜)을 사용하여 수행되었다. 초점 구배는 10분의 주기 시간으로 5분간 수중 x%에서부터 x+25% 아세토나이트릴까지였다. 상기 컬럼 유량은 20 ㎖/분이었다. 주입 부피는 200 내지 750 ㎕의 범위였다. 모세관 분할기를 사용하여 컬럼 분리 후의 흐름을 상기 질량 분광계로 전환시켰으며 상기는 1 ㎖/분의 메이크-업 흐름에 의해 희석되었다. 상기 메이크-업 흐름은 메탄올 중의 0.1% 포름산이다. 모든 샘플을 워터스 질량 지시된 분획 콜렉션에 의해 정제하였다.
[표 I]
실험 부분에 사용된 약어들의 목록
본 발명 화합물의 합성적 제조
실시예 1. 본 발명의 중간체 화합물들의 합성
1.1. 비스-(4-메톡시-벤질)-아민(Int.1)의 합성
p-아니스알데하이드(411 mmol), 4-메톡시벤질아민(411 mmol) 및 톨루엔(500 ㎖)을 응축기 및 딘-스타크 트랩이 장착된 환저 플라스크에서 합하였다. 반응물을 1시간 동안 환류시켰으며 이러는 동안 물을 상기 반응 혼합물로부터 제거하였다. 상기 반응물을 냉각시키고 농축시켰다. 잔사를 MeOH(120 ㎖)에 용해시켰다. 상기 혼합물을 5 ℃로 냉각시키고 NaBH4(205 mmol)를 45분에 걸쳐 나누어 가하였다. 상기 반응물을 서서히 가열 환류시켰다. 환류하에서 2시간 후에, 상기 반응물을 실온으로 냉각시키고 농축시켰다. 상기 잔사를 EtOAc에 용해시켰다. 유기층을 세척하고(3 x H2O 및 염수), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2. (6-브로모-1-메틸-1H-벤조이미다졸-4-일)-비스-(4-메톡시-벤질)-아민(Int.2)의 합성
1.2.1. 단계 i: 5-브로모-1,3-다이플루오로-2-나이트로-벤젠
AcOH(150 ㎖) 중의 4-브로모-2,6-다이플루오로아닐린(240 mmol)의 용액을 70 ℃에서 30분 동안 AcOH(450 ㎖) 중의 NaBO3·4H2O(325 mmol)의 현탁액에 적가하였다. 또 다른 2080 mmol의 NaBO3·4H2O를 5시간에 걸쳐 상기 혼합물에 가하였다. 이 기간 동안 상기 혼합물을 70 ℃에서 교반하였다. 상기 혼합물을 물에 붓고 Et2O로 추출하였다. 유기층을 상술한 동일 조건을 사용하여 또 다른 반응물로부터 수득한 또 다른 Et2O 용액과 합하였다. 상기 혼합물을 농축시켰다. 침전물이 형성되었으며 이를 여과에 의해 분리시켰다. 상기 여액을 농축시켜 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 석유 에테르) 후에 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2.2. 단계 ii: (5-브로모-3-플루오로-2-나이트로-페닐)-메틸-아민
THF(82 ㎖) 중의 2M MeNH2를 THF(1 L) 중의 5-브로모-1,3-다이플루오로-2-나이트로벤젠(164 mmol) 및 Cs2CO3(197 mmol)의 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반하고 이어서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에서 제거하였다. 잔사를 EtOAc와 H2O 사이에 분배시켰다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2.3. 단계 iii: 5-브로모-N,N-비스-(4-메톡시-벤질)-N'-메틸-2-나이트로-벤젠-1,3-다이아민
비스-(4-메톡시-벤질)-아민(346 mmol), 5-브로모-3-플루오로-N-메틸-2-나이트로아닐린(297 mmol) 및 Et3N(891 mmol)의 혼합물을 120 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서 상기 혼합물을 냉각시켰다. 조 물질을 상술한 동일한 과정에 따라 수득된 또 다른 물질과 합하였다. 생성 혼합물을 EtOAc에서 희석하고 세척하였다(2 x 0.2M HCl, H2O 및 포화된 NaHCO3). 유기상을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2.4. 단계 iv: 5-브로모-N,N-비스-(4-메톡시-벤질)-N"-메틸-벤젠-1,2,3-트라이아민
1:1 MeOH/THF(1 L) 중의 5-브로모-N,N-비스-(4-메톡시-벤질)-N'-메틸-2-나이트로-벤젠-1,3-다이아민(170 mmol), NH4Cl(2038 mmol) 및 Zn(2034 mmol)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고 HCOOH(20 ㎖)를 서서히 가하였다. 상기 혼합물을 실온에 도달되게 하고 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 상술한 과정에 따라 수득한 또 다른 혼합물과 합하였다. 생성 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 DCM에 용해시켰다. 유기 혼합물을 세척하고(포화된 NH4Cl), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.2.5. 단계 v: (6-브로모-1-메틸-1H-벤조이미다졸-4-일)-비스-(4-메톡시-벤질)-아민
5-브로모-N,N-비스-(4-메톡시-벤질)-N"-메틸-벤젠-1,2,3-트라이아민(170 mmol)을 HC(OEt)3(100 mol) 및 MeCN(500 ㎖)의 혼합물에 용해시켰다. 상기 혼합물을 85 ℃에서 5시간 동안 교반하고 실온에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 상술한 과정에 따라 수득한 또 다른 혼합물과 합하였다. 생성 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 15:85에서 60:40 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 생성물을 수득하였다.
1.3. 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int. 3)의 합성.
1.3.1. 단계 i: 비스-(4-메톡시-벤질)-[1-메틸-6-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]다이옥사보로란-2-일)-1H-벤조이미다졸-4-일]-아민
DMF(150 ㎖) 중의 (6-브로모-1-메틸-1H-벤조이미다졸-4-일)-비스-(4-메톡시-벤질)-아민(54 mmol), 비스(피나콜레이토)다이보론(81 mmol), PdCl2(dppf).DCM(2.71 mmol) 및 KOAc(162.5 mmol)의 혼합물을 질소 스트림하에서 5분 동안 초음파처리하였다. 이어서 상기 혼합물을 응축기가 구비된 환저 플라스크에서 1시간 동안 110 ℃에서 교반하였다. 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 여액을 농축시켰다. 잔사를 EtOAc에 용해시키고 유기층을 세척하고(H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.3.2. 단계 ii: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴
H2O(20 ㎖) 중의 30 중량% H2O2를 DMF(600 ㎖) 중의 N,N-비스(4-메톡시벤질)-1-메틸-6-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-다이옥사보로란-2-일)-1H-벤조[d]이미다졸-4-아민(58.5 mmol)의 용액에 가하고 혼합물을 실온에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 5% 수성 Na2SO3로 급냉시켰다. 상기 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 세척하고(H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.4. 일반적인 방법: 오쏘-방향 요오드화
여기에서 W는 -N=, -CH=, -C(Cl)=일 수 있고; Y는 -N=, -C(CN)=일 수 있다.
1.4.1. 방법 A1
EtOH 중의 아미노 방향족 또는 헤테로방향족 출발 물질(1 당량), Ag2SO4(1 당량) 및 I2(1 당량)의 혼합물을 실온 내지 50 ℃ 범위의 온도에서 1시간 내지 대략 16시간까지 변할 수 있는 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 여과하고, 농축시키고 유기 용매 중에서 희석한다. 상기 유기 혼합물은 수성 후처리를 겪는다. 용매를 감압하에서 제거하고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
1.4.2. 방법 A1의 예시적인 실시예: 4-아미노-3-플루오로-5-요오도-벤조나이트릴(Int.4)의 합성.
EtOH(700 ㎖) 중의 4-아미노-3-플루오로벤조나이트릴(147 mmol), I2(147 mmol) 및 Ag2SO4(147 mmol)의 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 농축시켰다. 잔사를 EtOAc에 용해시키고 세척하였다(포화된 Na2S2O3 x 3). 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 95:5에서 70:30 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.4.3. 방법 A2
EtOH 중의 아미노 방향족 또는 헤테로방향족 출발 물질(1 당량), Ag2SO4(3 내지 4 당량) 및 I2(3 내지 4 당량)의 혼합물을 70 ℃에서 16시간 동안 교반한다. 추가 당량의 I2 및 Ag2SO4를 가하여 상기 전환을 증가시킬 수 있다. 상기 혼합물을 여과하고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
1.5. 방법 A2의 예시적인 실시예: 5-아미노-6-플루오로-4-요오도-피리딘-2-카보나이트릴(Int.5)의 합성.
EtOH(200 ㎖) 중의 Int.11(3.62 mmol), I2(14.5 mmol) 및 Ag2SO4(14.5 mmol)의 혼합물을 70 ℃에서 16시간 동안 교반하였다. 5 당량의 I2 및 Ag2SO4를 더 가하고 반응물을 70 ℃에서 추가로 72시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고, 농축시키고 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80에서 40:60 EtOAc/사이클로헥산)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.6. 일반적인 방법: 네기시 반응에 의한 나이트릴기의 도입
여기에서 RA는 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있고; X는 Cl, Br 또는 I일 수 있다.
1.6.1. 방법 B
DMF 중의 아릴/헤테로아릴 할라이드(1 당량), 아연 시아나이드(1 내지 3 당량), Pd(PPh3)4(0.1 내지 0.2 당량)의 혼합물을 5분 내지 0.5시간 범위의 기간 동안 극초단파 장치에서 150 ℃에서 가열한다. 상기 혼합물을 여과하고 농축시킨다. 잔사를 유기 용매로 희석한다. 상기 유기 혼합물을 후처리하고 용매를 감압하에서 제거한다. 잔사를 연마하거나 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
1.6.2. 방법 B의 예시적인 실시예: 5-플루오로-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.7)의 합성
극초단파 튜브를 DMF(20 ㎖) 중의 2-클로로-5-플루오로-4-메틸피리딘(5.5 mmol), Zn(CN)2(16.6 mmol), Pd(PPh3)4(1.1 mmol)로 충전하였다. 혼합물을 극초단파 반응기에서 150 ℃에서 5분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 상술한 과정에 따라 수득한 다른 조물질과 합하였다. 생성 혼합물을 여과하였다. 여액을 감압하에서 농축시켰다. 잔사를 EtOAc로 희석하고, 세척하고(포화된 NH4Cl), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 5:95에서 15:85 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.7. 일반적인 방법: 메틸 보론산에 의한 스즈키
여기에서 W는 -N=, -CH=, -C(Cl)=일 수 있고; Y는 -N=, -C(CN)=일 수 있고; X는 -I 또는 -Br일 수 있다.
1.7.1. 방법 C
1,4-다이옥산 중의 방향족/헤테로방향족 할라이드(1 당량), 메틸 보론산(1.3 내지 3 당량), Pd(dppf)Cl2.DCM(0.11 내지 0.2 당량) 및 Cs2CO3(3 내지 5 당량)의 혼합물을 100 ℃에서 교반한다. 혼합물을 유기 용매로 희석한다. 상기 유기 혼합물을 후처리하고 용매를 감압하에서 제거한다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공한다.
1.7.2. 방법 C의 예시적인 실시예: 5-아미노-6-플루오로-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.12)의 합성
1,4-다이옥산(8 ㎖) 중의 Int.5(3 mmol), 메틸 보론산(9.1 mmol), Pd(dppf)Cl2.DCM(0.32 mmol) 및 Cs2CO3(15.2 mmol)의 혼합물을 105 ℃에서 5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(EtOAc), 세척하고(포화된 NaHCO3), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 10:90에서 50:50 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.8. 6-브로모-2-플루오로-피리딘-3-일아민(Int.15)의 합성
AcOH 중의 2-플루오로피리딘-3-아민(44.6 mmol) 및 KOAc(44.6 mmol)의 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고 Br2(44.6 mmol)을 적가하였다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 15분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시키고 잔사를 EtOAc/MeOH에 용해시켰다. 유기 용액을 세척하고(포화된 NaHCO3, 포화된 Na2S2O3), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 80:20 석유 에테르/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.9. 2-브로모-6-플루오로-4-메탄설포닐-페닐아민(Int.16)의 합성
AcOH 중의 2-플루오로-4-메틸설포닐-아닐린(22.76 mmol) 및 KOAc(22.7 mmol)의 혼합물을 실온에서 교반하였다. 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고 Br2(22.7 mmol)를 적가하였다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시키고 잔사를 EtOAc에 용해시켰다. 유기 혼합물을 세척하고(포화된 NaHCO3, 포화된 Na2S2O3), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.10. 4-아미노-3-에틸-5-플루오로-벤조나이트릴(Int.17)의 합성
Cs2CO3(46 mmol) 및 Pd(dppf)Cl2.DCM(0.76 mmol)의 혼합물을 DMF(35 ㎖) 중에 현탁시키고 질소로 탈기시켰다. H2O(400 ㎕), THF(11.5 ㎖) 중의 1M Et3B 및 DMF(5 ㎖) 중의 Int.4(7.63 mmol)의 용액을 상기 혼합물에 가하고 반응물을 60 ℃에서 30분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시키고 잔사를 EtOAc에 용해시키고 세척하고(포화된 NaHCO3, H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 95:5 석유 에테르/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.11. 일반적인 방법: NH2의 요오다이드로의 전환
여기에서 R10은 Me 또는 Et일 수 있다.
1.11.1. 방법 D
농축된 HCl(6 당량)을 0 ℃에서 H2O 중의 아미노 방향족/헤테로방향족 화합물(1 당량)의 혼합물에 적가한다. H2O 중의 NaNO2(1.05 당량)의 용액을 적가한다. 생성 혼합물을 0 ℃에서 15분 동안 교반한다. H2O 중의 KI(1.05 당량)의 용액을 적가한다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 15분 및 실온에서 1시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매로 추출한다. 수성 후처리 및 감압하에서 용매의 제거 후에, 잔사를 연마 또는 크로마토그래피시켜 목적하는 생성물을 제공할 수 있다.
1.11.2. 방법 D의 예시적인 실시예: 5-요오도-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.18)의 합성
농축된 HCl(0.9 ㎖)을 0 ℃에서 H2O(10 ㎖) 중의 Int.8(1.88 mmol)의 혼합물에 적가한 다음 H2O(0.5 ㎖) 중의 NaNO2(1.97 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성 혼합물을 0 ℃에서 15분 동안 교반하였다. H2O(1 ㎖) 중의 KI(1.97 mmol)의 용액을 적가하였다. 생성 혼합물을 0 ℃에서 15분 및 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 세척하고(H2O) 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 75:25 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.12. 6-브로모-4-메틸-피리딘-3-일아민(Int.20)의 합성
H2O(5 ㎖) 중의 NH4Cl(14.9 mmol) 및 철 분말(18.4 mmol)의 혼합물을 90 ℃에서 교반하였다. 2-브로모-4-메틸-5-나이트로피리딘(2.3 mmol)을 나누어 가하였다. 상기 혼합물을 90 ℃에서 1시간 15분 동안 교반하였다. 반응을 정지시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.13. 4-아미노-3-클로로-5-플루오로-벤조나이트릴(Int.21)의 합성
AcOH(300 ㎖) 중의 4-아미노-3-플루오로벤조나이트릴(184 mmol) 및 NCS(276 mmol)의 혼합물을 70 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시켰다. H2O를 잔사에 가하고 고체 생성물을 여과하고 세척하였다(포화된 NaHCO3 및 H2O). H2O를 제거하기 위해서, THF를 가하고 감압하에서 제거하여 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.14. 3-에틸-4-하이드록시-벤조나이트릴(Int.22)의 합성
농축된 H2SO4(3.4 ㎖)를 0 ℃에서 H2O(12 ㎖) 중의 4-아미노-3-에틸벤조나이트릴(6.84 mmol)의 용액에 적가하였다. H2O(5 ㎖) 중의 NaNO2(7.52 mmol)의 용액을 0 ℃에서 상기 생성 혼합물에 적가하였다. 반응물을 0 ℃에서 30분 및 100 ℃에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 세척하고(H2O), 건조시키고 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.15. 2-클로로-3-플루오로-피리딘-4-일아민(Int.23)의 합성
1.15.1. 단계 i: 3급-부틸 N-(2-클로로-3-플루오로-4-피리딜)카바메이트
다이페닐포스포릴 아지드(DPPA)(129 mmol)를 1:1 3급-BuOH/톨루엔(200 ㎖) 중의 2-클로로-3-플루오로-피리딘-4-카복실산(85.7 mmol), Et3N(257 mmol)의 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 4시간 동안 가열하였다. 혼합물을 H2O로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 80:20 DCM/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물 3급-부틸 N-(2-클로로-3-플루오로-4-피리딜)카바메이트를 제공하였다.
1.15.2. 단계 ii: 2-클로로-3-플루오로-피리딘-4-일아민
1:2 TFA/DCM(45 ㎖) 중의 3급-부틸 N-(2-클로로-3-플루오로-4-피리딜)카바메이트(20.2 mmol)의 용액을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, MeOH 중의 100:0에서 90:10 DCM/7N NH3)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.16. 일반적인 방법: (6-브로모-1-메틸-1H-벤조이미다졸-4-일)-비스-(4-메톡시-벤질)-아민(Int.2)과의 부흐발트 커플링.
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다.
1.16.1. 방법 E1
무수 톨루엔 중의 Int.2(1 당량), 상응하는 아닐린(1.1 당량), Cs2CO3(2 당량) 및 XPhos(0.3 당량)의 혼합물을 Pd(OAc)2(0.1 내지 0.15 당량)의 첨가 전에 불활성 기체로 퍼징한다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 대략 16시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수성상 사이에 분배시킬 수 있다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로 상기 반응 혼합물을 여과하고 농축시킬 수 있다. 잔사를 그대로 보관하거나 또는 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공할 수도 있다.
1.16.2. 방법 E1의 예시적인 실시예: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일아미노}-4-에틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.24)의 합성.
무수 톨루엔(6.3 ㎖) 중의 Int.2(0.75 mmol), Int.10(0.79 mmol), Cs2CO3(1.5 mmol) 및 XPhos(0.225 mmol)의 혼합물을 Pd(OAc)2(0.075 mmol)의 첨가 전에 불활성 기체로 퍼징하였다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 H2O로 희석하고 DCM으로 추출하였다. 유기층을 세척하고(염수), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 50:50 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.16.3. 방법 E2
무수 톨루엔 중의 Int.2(1 당량), 상응하는 아닐린(1.1 당량), Cs2CO3(4 내지 5 당량) 및 XPhos(0.4 당량)의 혼합물을 Pd(OAc)2(0.2 내지 0.3 당량)의 첨가 전에 불활성 기체로 퍼징한다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 1 내지 24시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수성상 사이에 분배시킬 수 있다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로 상기 반응 혼합물을 여과하고 농축시킬 수 있다. 잔사를 그대로 보관하거나 또는 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공할 수도 있다.
1.16.4. 방법 E2의 예시적인 실시예: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일아미노}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.27)의 합성.
무수 톨루엔(35 ㎖) 중의 Int.2(4 mmol), Int.8(4.3 mmol), Cs2CO3(20 mmol) 및 XPhos(1.6 mmol)의 혼합물을 Pd(OAc)2(1.2 mmol)의 첨가 전에 아르곤으로 퍼징하였다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 98:2에서 25:75 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.16.5. 방법 E3
무수 1,4-다이옥산 중의 Int.2(1 당량), 아닐린(1.1 당량), BINAP(0.3 당량), Cs2CO3(4 당량) 및 Pd(OAc)2(0.2 당량)의 혼합물을 불활성 기체로 탈기시킨다. 상기 반응물을 100 내지 110 ℃에서 4시간 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수성상 사이에 분배시킬 수 있다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로 상기 반응 혼합물을 여과하고 농축시킬 수 있다. 잔사를 그대로 보관하거나 또는 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공할 수도 있다.
1.16.6. 방법 E3의 예시적인 실시예: N6-(2-플루오로-4-메탄설포닐-페닐)-N4,N4-비스-(4-메톡시-벤질)-1-메틸-1H-벤조이미다졸-4,6-다이아민(Int.34)의 합성
무수 1,4-다이옥산(15 ㎖) 중의 Int.2(1.48 mmol), 2-플루오로-4-메틸설포닐-아닐린(1.58 mmol), BINAP(0.47 mmol), Cs2CO3(6.32 mmol) 및 Pd(OAc)2(0.32 mmol)의 혼합물을 질소로 탈기시켰다. 상기 반응물을 100 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc로 희석하고 유기층을 세척하고(H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.16.7. 방법 E4
무수 1,4-다이옥산 중의 Int.2(1 당량), 아닐린(1.1 당량), Brettphos(0.1 당량), Cs2CO3(5 당량) 및 Pd(OAc)2(0.05 당량)의 혼합물을 불활성 기체로 탈기시킨다. 상기 반응물을 85 내지 95 ℃에서 2시간 내지 대략 8시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 유기상 사이에 분배시킬 수 있다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로 상기 반응 혼합물을 여과하고 농축시킬 수 있다. 잔사를 그대로 보관하거나 또는 크로마토그래피에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공할 수도 있다.
1.16.8. 방법 E4의 예시적인 실시예: N6-(2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신-6-일)-N4,N4-비스[(4-메톡시페닐)메틸]-1-메틸-벤즈이미다졸-4,6-다이아민(Int.78)의 합성.
무수 1,4-다이옥산(15 ㎖) 중의 Int.2(1.17 mmol), 2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신-6-아민(1.29 mmol), Brettphos(0.117 mmol), Cs2CO3(6.32 mmol) 및 Pd(OAc)2(0.058 mmol)의 혼합물을 질소로 탈기시켰다. 상기 반응물을 90 ℃에서 대략 5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc로 희석하고 유기층을 세척하고(H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.17. 일반적인 방법: 부흐발트 생성물의 메틸화
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다.
1.17.1. 방법 F
NaH(무기 오일 중의 60%, 1.1 내지 3 당량)를 0 ℃에서 THF 또는 DMF 중의 부흐발트 커플링(1 당량)으로부터 수득된 중간체의 용액에 가한다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반한다. MeI(1.1 내지 3 당량)를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 1시간 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수성상 사이에 분배시킨다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하거나 추가의 정제 없이 그대로 사용한다.
1.17.2. 방법 F의 예시적인 실시예: N6-(2-플루오로-4-메탄설포닐-6-메틸-페닐)-N4,N4-비스-(4-메톡시-벤질)-1,N6-다이메틸-1H-벤조이미다졸-4,6-다이아민(Int.37)의 합성
NaH(무기 오일 중의 60%, 6.76 mmol)를 0 ℃에서 THF(10 ㎖) 중의 Int.35(2.25 mmol)의 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. MeI(6.76 mmol)를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc로 희석하고 H2O로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80에서 80:20 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.17.3. 방법 F의 예시적인 실시예: N4,N4-비스[(4-메톡시페닐)메틸]-N6,1-다이메틸-N6-(2-메틸-4-메틸설포닐-페닐)벤즈이미다졸-4,6-다이아민(Int.49A) 및 N6-(4-에틸설포닐-2-메틸-페닐)-N4,N4-비스[(4-메톡시페닐)메틸]-N6,1-다이메틸-벤즈이미다졸-4,6-다이아민(Int.49B)의 합성.
NaH(무기 오일 중의 60%, 4.86 mmol)를 0 ℃에서 THF(10 ㎖) 중의 Int.36(1.62 mmol)의 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 30분 동안 교반하였다. MeI(4.86 mmol)를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc로 희석하고 H2O로 세척하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80에서 80:20 EtOAc/석유 에테르)에 의해, 부 생성물(Int.49B, 부 생성물)과 함께 목적하는 생성물(Int.49A, 주 생성물)의 혼합물을 제공하였다.
1.18. 4-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-3-에틸-벤조나이트릴(Int.50)의 합성
피리딘(2 ㎖) 중의 Int.2(0.4 mmol), Int.22(0.4 mmol), CuI(0.06 mmol) 및 Cs2CO3(1 mmol)의 혼합물을 아르곤으로 플러싱시키고, 밀봉하고, 200 ℃에서 3시간 동안 극초단파 반응기에서 가열하였다. 상기 혼합물을 H2O로 희석하고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 건조시키고 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.19. 일반적인 방법: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.3)과 방향족 또는 헤테로방향족 할라이드간의 울만 커플링
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다.
1.19.1. 방법 G
1:1 DMF/1,4-다이옥산 중의 Int.3(1 당량), 아릴 할라이드(1.2 내지 1.3 당량), CuI(0.1 내지 0.2 당량), N,N-다이메틸 글리신(0.3 내지 0.5 당량) 및 Cs2CO3(3 당량)의 혼합물을 불활성 기체로 플러싱시키고 110 ℃에서 4.5시간 내지 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 여과하고, 유기 용매와 수성상 사이에 분배시킨다. 상기 두 층을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
1.19.2. 합성 G의 예시적인 실시예: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.51)의 합성.
1:1 DMF/1,4-다이옥산(4 ㎖) 중의 Int.3(0.39 mmol), Int.18(0.47 mmol), CuI(0.08 mmol), N,N-다이메틸 글리신(0.2 mmol) 및 Cs2CO3(1.17 mmol)의 혼합물을 아르곤으로 플러싱시키고 밀봉된 튜브에서 110 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. 상기 여액을 농축시켰다. 물을 가하고 상기 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 물로 세척하고, 건조시키고 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 40:60 사이클로헥산/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.20. 일반적인 방법: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸}-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.3) 및 방향족 또는 헤테로방향족 할라이드간의 SNAr 커플링
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있다.
1.20.1. 방법 H
DMF 중의 Int.3(1 당량), 아릴/헤테로아릴 할라이드(1.2 내지 1.5 당량) 및 K2CO3(2 당량)의 혼합물을 100 ℃에서 3시간 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 EtOAc로 희석하고, H2O로 수회 세척하고, 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시킨다.
1.20.2. 방법 H의 예시적인 실시예: 5-{7-[비스-(4-메톡시-벤질)-아미노]-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일옥시}-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(Int.51)의 합성.
DMF(160 ㎖) 중의 Int.3(58 mmol), Int.7(70 mmol) 및 K2CO3(116 mmol)의 혼합물을 100 ℃에서 교반하였다. 3시간 후에 추가의 7.35 mmol의 Int.7을 상기 반응물에 가하고 상기 혼합물을 100 ℃에서 추가로 1시간 동안 교반하였다. 생성 혼합물을 EtOAc로 희석하고, H2O로 수회 세척하고, 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 15:85에서 35:75 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.21. 일반적인 방법: 비스-PMB 탈보호
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있으며; -L-은 -NH-, -NMe- 또는 -O-일 수 있다.
1.21.1. 방법 I1
TFA 중의 보호된 비스-PMB 아민(1 당량)의 혼합물을 실온에서 30분 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 온도를 50 또는 60 ℃로 증가시키고 상기 혼합물을 0.5 내지 3시간 범위의 기간 동안 추가로 교반한다. 상기 혼합물을 염기성 수성 용액 및 유기 용매를 사용하여 후처리한다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로, 반응 혼합물을 먼저 농축시키고 이어서 잔사에 상술한 후처리를 가한다. 상기 후처리로부터 수득한 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 또는 아이소루트(ISOLUTE)(등록상표) SCX-3(바이오테이지(Biotage)) 이온 교환 수지에 의해 정제시키거나 그대로 보관할 수 있다.
1.21.2. 방법 I1의 예시적인 실시예: N6-(2-플루오로-4-메탄설포닐-6-메틸-페닐)-1,N6-다이메틸-1H-벤조이미다졸-4,6-다이아민(Int.53)의 합성.
TFA(5 ㎖) 중의 Int.37(0.33 mmol)의 혼합물을 실온에서 1시간 및 50 ℃에서 0.5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 포화된 NaHCO3와 DCM 사이에 분배시켰다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80에서 100:0 EtOAc/석유 에테르)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.21.3. 방법 I1의 예시적인 실시예: N6,1-다이메틸-N6-(2-메틸-4-메틸설포닐-페닐)벤즈이미다졸-4,6-다이아민(Int.56A) 및 N6-(4-에틸설포닐-2-메틸-페닐)-N6,1-다이메틸-벤즈이미다졸-4,6-다이아민(Int.56B)의 합성
TFA(5 ㎖) 중의 Int.49A 및 49B(전체 약 0.61 mmol)의 혼합물을 실온에서 대략 16시간 및 50 ℃에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 포화된 NaHCO3와 DCM 사이에 분배하였다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80에서 100:0 EtOAc/석유 에테르)로 Int.49B의 탈보호로부터 유래하는 부 생성물(Int.56B, 부 생성물)과 함께 목적하는 생성물(Int.56A, 주 생성물)의 혼합물을 제공하였다.
1.21.4. 방법 I2
DCM/TFA(3:1 내지 1:1 비) 중의 보호된 비스-PMB 아민(1 당량)의 혼합물을 실온에서 20분 내지 3시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 염기성 수용액 및 유기 용매를 사용하여 후처리한다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로, 반응 혼합물을 먼저 농축시키고 이어서 잔사에 상술한 후처리를 가한다. 상기 후처리로부터 수득한 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 또는 아이소루트(등록상표) SCX-3(바이오테이지) 이온 교환 수지에 의해 정제시키거나 그대로 보관할 수 있다.
1.21.5. 방법 I2의 예시적인 실시예: 5-(7-아미노-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일)옥시-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(화합물 28)의 합성
TFA(5 ㎖)를 0 ℃에서 DCM(55 ㎖) 중의 Int.51(23.1 mmol)의 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 20분 동안 교반하였다. 톨루엔을 가하고 상기 혼합물을 농축시켰다. 잔사를 포화된 NaHCO3와 DCM 사이에 분배시켰다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 95:5 EtOAc/MeOH)에 의해 정제시켰다. 상기 컬럼으로부터 수득된 생성물을 THF로 세척하여 목적하는 생성물(Int 79)을 제공하였다.
1.21.6. 방법 I3
TFA 중의 보호된 비스-PMB 아민(1 당량)의 혼합물을 실온에서 30분 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매 중에서 희석하고 염기성 수용액을 사용하여 세척한다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로, 세척 전에, 상기 반응 혼합물을 먼저 농축시킬 수 있다. 이어서 상기 유기층을 농축시키고, 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 또는 아이소루트(등록상표) SCX-3(바이오테이지) 이온 교환 수지에 의해 정제시키거나 또는 어떠한 추가의 정제 없이 그대로 사용할 수 있다.
1.21.7. 방법 I3의 예시적인 실시예: 5-[(7-아미노-3-메틸-3H-벤조이미다졸-5-일)메틸-아미노]-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(화합물 62)의 합성
TFA(10 ㎖) 중의 Int.41(2.4 mmol)의 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(DCM), 포화된 NaHCO3로 세척하고, 이어서 5N NaOH로 세척하였다. 상기 두 층을 분리시키고 수성층을 DCM으로 추가로 추출하였다. 유기층들을 합하고, 건조시키고(상 분리기를 통한 여과), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 90:10 EtOAc/MeOH)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.22. 4-에틸-6-메탄설포닐-피리딘-3-일아민(Int.70)의 합성.
1.22.1. 단계 i: 4-에틸-2-메틸설포닐-5-나이트로-피리딘
DMSO(10 ㎖) 중의 2-브로모-4-에틸-5-나이트로-피리딘(4.35 mmol) 및 나트륨 메탄설포네이트(4.35 mmol)의 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 빙수에 붓고 얼음이 녹을 때까지 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하고 고체(목적하는 생성물)를 수집하였다.
1.22.2. 단계 ii: 4-에틸-6-메틸설포닐-피리딘-3-아민
H2O(10 ㎖) 중의 4-에틸-2-메틸설포닐-5-나이트로-피리딘(4.1 mmol), NH4Cl(26.65 mmol) 및 철 분말(33 mmol)의 혼합물을 90 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 반응을 정지시키고, 여과하고 EtOAc로 추출하였다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
1.23. 4-에틸-5-요오도-2-메틸설포닐-피리딘(Int.74)의 합성
H2O(1.8 ㎖) 중의 KI(15 mmol) 및 NaNO2(12 mmol)의 용액을, 온도를 10 내지 15 ℃에서 유지시키면서 MeCN(12 ㎖) 중의 Int.70(6 mmol) 및 p-TsOH·H2O(18 mmol)의 혼합물에 적가하였다. 상기 혼합물을 10 내지 15 ℃에서 10분 동안 및 이어서 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0 ℃로 냉각시키고, 중화시키고(포화된 NaHCO3) 추출하였다(DCM). 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 70:30 석유 에테르/EtOAc)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
실시예 2. 본 발명 화합물의 합성
2.1. 일반적인 방법: 최종 화합물을 수득하기 위한 아민 중간체의 염화 카보닐 유도체에 의한 아실화
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있으며; L은 NH, NMe 또는 O일 수 있고; RB는 사이클로알킬, OMe일 수 있다.
2.1.1. 방법 J1
RBCOCl(1 당량)을 0 ℃에서 DCM/피리딘(2:1에서 5:1 비) 중의 중간체 아민(1 당량)의 용액에 가한다. 상기 혼합물을 40분 내지 2시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수용액 사이에 분배시킨다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 한편으로, 상기 반응 혼합물을 후처리 없이 농축시킬 수 있다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해 또는 예비 HPLC에 의해 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하여 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.1.2. 방법 J1의 예시적인 실시예: N-(6-((6-시아노-4-에틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일)사이클로프로판카복스아미드(화합물 1)의 합성
사이클로프로판카보닐 클로라이드(0.39 mmol)를 0 ℃에서 1:2 피리딘/DCM(2.55 ㎖) 중의 Int.63(0.39 mmol)의 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 97:3 DCM/MeOH)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.1.3. 방법 J2
RBC(=O)Cl(1.5 내지 3 당량)을 DCM 중의 중간체 아민(1 당량) 용액에 이어서 피리딘(1.5 내지 3 당량)에 가한다. 상기 혼합물을 2시간 내지 대략 16시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수용액 사이에 분배시킨다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피, 예비 HPLC, 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하여 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.1.4. 방법 J2의 예시적인 실시예: 메틸 6-((6-시아노-4-에틸피리딘-3-일)(메틸)아미노)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-4-일카바메이트(화합물 4)의 합성
메틸 클로로포메이트(0.33 mmol)를 무수 DCM(2.2 ㎖) 중의 Int.63(0.22 mmol)의 용액에 이어서 피리딘(0.33 mmol)에 가하였다. 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 H2O와 DCM 사이에 분배시켰다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 세척하고(포화된 NaHCO3), 건조시키고(Na2SO4), 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 95:5 DCM/MeOH)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.2. 일반적인 방법: 최종 화합물을 수득하기 위한 아민 중간체의 카복실산 유도체에 의한 아실화
여기에서 RA는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴일 수 있으며; L은 NH, NMe 또는 O일 수 있고; RC는 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬일 수 있다.
2.1.1. 방법 K1
(COCl)2(1.4 내지 2 당량)을 0 ℃에서 DCM 중의 카복실산(1.5 내지 2 당량)의 용액에 가한다. 촉매량의 DMF를 가하고 상기 반응물을 30분 내지 1시간 범위의 기간 동안 0 ℃에서 교반한다. DCM 중의 중간체 아민(1 당량) 및 피리딘(2 내지 4 당량)의 용액을 상기 혼합물에 가한다. 생성 혼합물을 실온에서 30분 내지 2시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수용액 사이에 분배시킨다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해, 예비 HPLC에 의해 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하여 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.2.2. 방법 K1의 예시적인 실시예: (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-에틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드(화합물 6)의 합성.
(COCl)2(0.186 mmol)를 DCM(1 ㎖) 중의 ((1R,2R)-(-)-2-시스-플루오로-사이클로프로판카복실산(켐콜렉트(ChemCollect), 로트 n. 1241399, 0.186 mmol)의 용액에 이어서 DMF(2 방울)에 가하였다. 상기 반응 혼합물을 0 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. DCM(1 ㎖) 중의 Int.65(0.093 mmol) 및 피리딘(0.186 mmol)의 용액을 상기 혼합물에 가하고 상기 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 포화된 NaHCO3를 가하고 상기 두 상을 분리시켰다. 유기층을 농축시켰다. 잔사를 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 100:0에서 95:5 DCM/MeOH)에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.2.3. 방법 K1의 예시적인 실시예: (1R,2R)-N-[6-(N,2-다이메틸-4-메틸설포닐-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드(화합물 26) 및 (1R,2R)-N-[6-(4-에틸설포닐-N,2-다이메틸-아닐리노)-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드(화합물 27)
(COCl)2(0.82 mmol)를 DCM(1 ㎖) 중의 ((1R,2R)-(-)-시스-2-플루오로-사이클로프로판카복실산(ABCR, 로트 n. 1242863, 0.92 mmol)의 용액에 이어서 DMF(1 방울)에 가하였다. 상기 반응 혼합물을 0 ℃에서 45분 동안 교반하였다. DCM(1 ㎖) 중의 Int.56A 및 Int56B(전체 대략 0.46 mmol) 및 피리딘(1.85 mmol)의 혼합물의 용액을 상기 혼합물에 가하고 상기 반응물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 DCM으로 희석하고, 세척하고(H2O), 상기 두 상을 분리시켰다. 유기층을 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 플래시 컬럼 크로마토그래피(SiO2, 20:80 EtOAc/석유 에테르에서 90:10 EtOAc/MeOH)에 의해 화합물 26 및 화합물 27의 혼합물을 제공하였다. 상기 두 성분을 예비 HPLC에 의해 분리시켰다.
2.2.4. 방법 K2
(COCl)2(1.35 내지 2.5 당량)를 0 ℃에서 DCM 중의 카복실산(1.4 내지 3 당량)의 용액에 가한다. 촉매량의 DMF를 가하고 반응물을 0 ℃에서 30분 내지 1시간 범위의 기간 동안 교반한다. NMP 또는 NMP/DCM 중의 중간체 아민(1 당량) 및 피리딘(1.7 내지 4 당량)의 용액을 별도로 제조하여, 상기 중간체 아민이 완전히 용해되도록 한다. 용해를 돕기 위해서, 가열을 적용할 수 있다(70 ℃까지의 온도). 후자 용액을 0 ℃에서 새로 형성된 염화 아실을 함유하는 용액에 적가한다. 생성 혼합물을 실온에서 1 내지 2시간 범위의 기간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수용액 사이에 분배시킨다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해, 예비 HPLC에 의해, 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하는 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.2.5. 방법 K2의 예시적인 실시예: (1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드(화합물 20)의 합성
(COCl)2(16.6 mmol)를 DCM(70 ㎖) 중의 ((1R,2R)-(-)-시스-2-플루오로-사이클로프로판카복실산(ABCR, 로트 n. 1242863, 17.5 mmol)의 용액에 이어서 DMF(200 ㎕)에 가하였다. 상기 반응 혼합물을 0 ℃에서 45분 동안 교반하였다. NMP(15 ㎖) 중의 화합물 28(12.5 mmol) 및 피리딘(21.3 mmol)의 용액을 65 ℃에서 가열하여 용해를 돕고, 실온으로 냉각되게 둔다. 화합물 28 및 피리딘을 함유하는 용액을 0 ℃에서 활성화된 카복실 유도체를 함유하는 혼합물에 가하고 상기 반응물을 실온에서 45분 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 EtOAc와 포화된 NaHCO3 사이에 분배시켰다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 추가로 세척하고(포화된 NaHCO3, NH4Cl, H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켰다. 조 물질을 DCM/iPrOH로부터 침전에 의해 정제하고 생성 고체를 Et2O로 세척하고 진공하에서 건조시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.3. 일반적인 방법: 최종 화합물을 수득하기 위한 나이트릴기의 가수분해
여기에서 L은 NH, NMe 또는 O이고; RC는 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬이고; Z는 N 또는 CH이고; R10은 Me 또는 Et이다.
2.3.1. 방법 L
나이트릴 출발 물질(1 당량)의 용액을 4:1 EtOH/DMSO 혼합물 중에 용해시킨다. 생성 유기 용액을 하기의 비율 10:2:1 유기 용액/H2O2/1N NaOH로 30% H2O2/H2O 및 1N NaOH와 혼합한다. 상기 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 유기 용매와 수용액 사이에 분배시킨다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 건조시키고 농축시킨다. 상기 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해, 예비 HPLC에 의해, 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하는 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.3.2. 방법 L의 예시적인 실시예: 5-((4-(사이클로프로판카복스아미도)-1-메틸-1H-벤조[d]이미다졸-6-일)(메틸)아미노)-4-에틸피콜린아미드(화합물 24)의 합성.
화합물 1(0.19 mmol)의 용액을 4:1 EtOH/DMSO 혼합물(2.3 ㎖)에 용해시켰다. 생겅되는 유기 용액을 30% H2O2/H2O(0.4 ㎖) 및 1N NaOH(0.23 ㎖)와 혼합하였다. 상기 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 다이클로로메탄과 물 사이에 분배시켰다. 층들을 분리시키고 유기층을 상 분리기를 통해 여과하고 농축시켰다. 잔사를 예비 HPLC에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.3.3. 방법 M: 우레아의 일반적인 합성 방법
카보닐다이트라이아졸(1.5 당량)을 DCM 중의 화합물 28(1.0 당량) 및 피리딘(5 당량)의 혼합물에 가한다. 이어서 상기 혼합물을 50 ℃에서 1시간 동안 교반한다. 임의의 추가의 처리 없이, 필요한 아민 RaNH2를 50 ℃에서 상기 용액에 가하고 추가로 1시간 동안 교반한다. UPLC에 의한 상기 반응의 완료 후에, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 DCM으로 희석하고, 이어서 상기 혼합물을 물에 분배한다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 0.25M HCl 용액, 나트륨 바이카보네이트 용액으로 세척하고, 건조시키고 농축시킨다. 잔사를 실리카 크로마토그래피에 의해, 예비 HPLC에 의해, 또는 적합한 용매 혼합물을 사용하는 침전에 의해 정제시킬 수 있다.
2.3.4. 방법 M의 예시적인 실시예: 1-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-3-아이소프로필-우레아(화합물 33)의 합성
카보닐다이트라이아졸(1.07 mmol)을 DCM(3 ㎖) 중의 화합물 28(0.71 mmol) 및 피리딘(3.55 mmol)의 혼합물에 가하고 생성 혼합물을 50 ℃에서 교반하였다. 2시간 후에 침전물이 형성되었으며 상기 혼합물을 1시간 동안 추가로 교반하였다. 이어서 메틸 아민(THF 중의 2M 용액)(2.84 mmol)을 50 ℃에서 상기 용액에 가하고 추가로 1시간 동안 교반하였다. UPLC에 의한 상기 반응의 완료 후에, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 DCM으로 희석하고, 이어서 상기 혼합물을 물에 분배하였다. 상기 두 상을 분리시키고 유기층을 0.25M HCl 용액, 나트륨 바이카보네이트 용액으로 세척하고, 건조시키고 농축시켰다. 상기 잔사를 임의의 추가의 정제 없이 사용하였다.
2.4. 5-[7-[[(1R,2R)-2-플루오로사이클로프로판카보닐]아미노]-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일]옥시-4-메틸-피리딘-2-카복스아미드(화합물 32)의 합성
H2O(pH 13, 10 ㎖) 중의 화합물 20(0.27 mmol) 및 DMSO(0.5 ㎖)의 혼합물을 50 ℃에서 72시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 여과하였다. 고체를 수집하고 예비 HPLC에 의해 정제시켜 목적하는 생성물을 제공하였다.
2.5. 4-메틸-5-[3-메틸-7-(메틸아미노)벤즈이미다졸-5-일]옥시-피리딘-2-카보나이트릴(화합물 34) 및 5-[7-(다이메틸아미노)-3-메틸-벤즈이미다졸-5-일]-옥시-4-메틸-피리딘-2-카보나이트릴(화합물 35)의 합성
NaH를 0 ℃에서 THF(10 ㎖) 중의 화합물 28(0.36 mmol)의 혼합물에 가하였다. 30분 후에, MeI(0.36 mmol)를 가하고 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고 완료시까지 교반하였다. UPLC에 의해 완료를 모니터한 후에, 반응물을 에틸 아세테이트 중에서 희석하고 물로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 화합물 34 및 화합물 35를 예비 HPLC에 의해 단리시켰다.
하기 표 III 및 비교 실시예들에 나열된 본 발명의 예시적인 화합물들을 표 II에 나열된 중간체들을 사용하여 본 발명에 개시된 합성 방법에 따라 제조하였다. 본 발명 화합물 및 비교 실시예의 일부 화합물의 NMR 스펙트럼 데이터를 표 IV에 제공한다.
[표 II]
본 발명의 화합물들에 대한 예시적인 중간체들
[표 III]
본 발명의 예시적인 화합물들
[표 IV]
본 발명의 예시적인 화합물들의 NMR 데이터
실시예 3. 비교 화합물
3.1. 화합물 A 2-[4-[(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]페닐]아세토나이트릴
1,4-다이옥산(1 ㎖) 중의 Pd2(dba)3(0.01 mmol) 및 Xantphos(0.01 mmol)의 혼합물을 초음파처리하고 질소하에서 1,4-다이옥산(2 ㎖) 중의 6-브로모-1-메틸-벤즈이미다졸(0.45 mmol), 2-(4-아미노페닐)아세토나이트릴(0.58 mmol) 및 Cs2CO3(0.62 mmol)의 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(H2O), 건조시키고(상 분리기) 농축시켰다. 잔사를 예비 HPLC에 의해 정제시켜 목적하는 생성물(화합물 A)을 제공하였다.
MW: 262.3. MS Ms'd: 263.2.
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.13 (1 H, s), 7.68 (1 H, dd), 7.60 (1 H, dd), 7.54 (1 H, d), 7.32 (1 H, d), 7.24 (1 H, t), 6.91 (1 H, dd), 3.77 (3 H, s), 3.39 (3 H, s).
3.2. 화합물 B
1,4-다이옥산(1 ㎖) 중의 Pd2(dba)3(0.01 mmol) 및 Xantphos(0.01 mmol)의 혼합물을 초음파처리하고 질소하에서 1,4-다이옥산(2 ㎖) 중의 6-브로모-1-메틸-벤즈이미다졸(0.45 mmol), 2,3-다이하이드로-1,4-벤조다이옥신-6-아민(0.58 mmol) 및 Cs2CO3(0.62 mmol)의 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 110 ℃에서 12시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(H2O), 건조시키고(상 분리기) 농축시켰다. 잔사를 예비 HPLC에 의해 정제시켜 목적하는 생성물(화합물 B)을 제공하였다.
MW: 281.3. MS Ms'd: 282.1.
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 7.94 (1 H, s), 7.80 (1 H, br s), 7.45 (1 H, d), 7.05 (1 H, d), 6.86 (1 H, dd), 6.73 (1 H, dd), 6.61-6.57 (2 H, m), 4.22-4.16 (4 H, m), 3.71 (3 H, s).
3.3. 화합물 C 3-플루오로-4-[메틸-(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]벤조나이트릴
3.3.1. 단계 i: 3-플루오로-4-[(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]벤조나이트릴
무수 톨루엔(8 ㎖) 중의 6-브로모-1-메틸-벤즈이미다졸(2.38 mmol), 4-아미노-3-플루오로-벤조나이트릴(3.57 mmol), XPhos(0.95 mmol), Cs2CO3(7.14 mmol) 및 Pd(OAc)2(0.71 mmol)의 혼합물을 110 ℃에서 대략 16시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(EtOAc), 세척하고(H2O), 건조시키고(Na2SO4) 농축시켜 목적하는 생성물 3-플루오로-4-[(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]벤조나이트릴을 제공하였다.
3.3.2. 단계 ii: 3-플루오로-4-[메틸-(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]벤조나이트릴(화합물 C)
NaH(7.14 mmol)를 0 ℃에서 THF(10 ㎖) 중의 3-플루오로-4-[(3-메틸벤즈이미다졸-5-일)아미노]벤조나이트릴(2.38 mmol)의 용액에 가하였다. 상기 혼합물을 30분 동안 교반하였다. MeI(4.76 mmol)를 가하고 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 희석하고(DCM), 세척하고(H2O) 농축시켰다. 잔사를 예비 HPLC에 의해 정제시켜 목적하는 생성물(화합물 C)을 제공하였다.
MW: 280.1. MS Ms'd: 281.0.
NMR: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 8.13 (1 H, s), 7.68 (1 H, dd), 7.60 (1 H, dd), 7.54 (1 H, d), 7.32 (1 H, d), 7.24 (1 H, t), 6.91 (1 H, dd), 3.77 (3 H, s), 3.39 (3 H, s).
3.4. 화합물 D
상기 화합물의 합성은 PCT 국제 출원(2013) WO 2013117645(Menet et al, 2013)에 개시되었다.
생물학적
실시예
실시예 4. 시험관내 분석
4.1. JAK1 억제 분석
4.1.1. JAK1 분석 폴리GT 기질
재조합 인간 JAK1 촉매 도메인(아미노산 850-1154; 카탈로그 번호 08-144)을 카르나 바이오사이언시즈(Carna Biosciences)로부터 구입하였다. 10 ng의 JAK1을 키나제 반응 완충제(15 mM 트리스-HCl pH 7.5, 1 mM DTT, 0.01% 트윈-20, 10 mM MgCl2, 2 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 12.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너(Greiner), V-바닥)에서 배양한다. 30 ℃에서 45 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정지시킨다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮긴다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉한다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트(Microscint)-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(Topcount)(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행한다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산한다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정한다:
억제 백분율 = ((RFU 시험 화합물 - RFU 대조용)/(RFU 비히클 - RFU 대조용)) x 100
RFU 시험 화합물 = 존재하는 시험 화합물을 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 대조용 = 양성 대조용 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 비히클 = 비히클의 존재하에서 측정된 RFU
일련의 용량 희석물을, JAK1 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 각각의 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조한다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8 개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험한다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮추었다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
4.1.2. JAK1 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 JAK1(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4774)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 1 ng의 JAK1을 키나제 반응 완충제(25 mM MOPS pH 6.8, 0.01% 브리즈(Brij)-35, 5 mM MgCl2, 2 mM DTT, 7 μM ATP) 중의 20 nM Ulight-JAK1(tyr1023) 펩타이드와 4 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 20 ㎕의 부피로, 백색 384 Opti 플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6007290)에서 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1 x 검출 완충제(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움-항-포스포타이로신(PT66)(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가함으로써 반응을 정시켰다. 320 ㎚에서의 여기를 갖는 엔비젼(Envision)을 사용하고 615 ㎚에서 방출을 측정하여 판독을 수행한다(퍼킨 엘머). 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 상대 형광 단위(RFU)를 비히클의 존재 하에서 획득된 RFU로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)/(비히클의 존재 하에서 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK1 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험한다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC50 ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.
[표 V]
본 발명의 예시적인 화합물들의 JAK1 IC50 값
* > 500 nM
** > 100-500 nM
*** > 50-100 nM
**** 0.1-50 nM
[표 VI]
비교 화합물들의 JAK1 IC50 값
4.1.3. JAK1 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. 1 ng의 JAK1(인비트로젠, PV4774)을 상기 분석에 사용한다. 기질은 50 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023) 펩타이드(퍼킨 엘머, TRF0121)이었다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25 mM MOPS pH 6.8, 0.01%, 2 mM DTT, 5 mM MgCl2 브리즈(Brij)-35에서 수행한다. 인산화된 기질을 1.1.2에 개시된 바와 같이 Eu-표지된 항-포스포타이로신 항체 PT66(퍼킨 엘머, AD0068)를 사용하여 측정한다. 320 ㎚에서의 여기 및 615 ㎚ 및 665 ㎚에서의 방출을 갖는 엔비젼(퍼킨 엘머)상에서 판독을 수행한다.
4.2. JAK2 억제 분석
4.2.1. JAK2 분석 폴리GT 기질
재조합 인간 JAK2 촉매 도메인(아미노산 808-1132; 카탈로그 번호 PV4210)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.025 mU의 JAK2를 키나제 반응 완충제(5 mM MOPS pH 7.5, 9 mM MgAc, 0.3 mM EDTA, 0.06% 브리즈, 및 0.6 mM DTT, 1 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 2.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양한다. 30 ℃에서 90 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정지시킨다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮긴다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉한다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행한다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산한다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정한다:
억제 백분율 = ((RFU 시험 화합물 - RFU 대조용)/(RFU 비히클 - RFU 대조용)) x 100
RFU 시험 화합물 = 존재하는 시험 화합물을 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 대조용 = 양성 대조용 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 비히클 = 비히클의 존재하에서 측정된 RFU
일련의 용량 희석물을 JAK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조한다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험한다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
4.2.2. JAK2 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 JAK2(촉매 도메인, 아미노산 866-1154; 카탈로그 번호 PV4210)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.0125 mU의 JAK2를 키나제 반응 완충제(25mM HEPES pH7.0, 0.01% 트리톤 X-100, 7.5mM MgCl2 , 2mM DTT, 7.5μM ATP) 중의 25 nM Ulight-JAK1(tyr1023) 펩타이드(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 TRF0121))와 4 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 20 ㎕의 부피로, 백색 384 Opti 플레이트(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 6007290)에서 배양하였다. 실온에서 60 분 후에, 20 ㎕/웰의 검출 혼합물(1 x 검출 완충제(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 CR97-100C), 0.5 nM 유로피움-항-포스포타이로신(PT66)(퍼킨 엘머, 카탈로그 번호 AD0068), 10 mM EDTA)을 가함으로써 반응을 정지시켰다. 320 ㎚에서의 여기를 갖는 엔비젼을 사용하고 615 ㎚에서 방출을 측정하여 판독을 수행한다(퍼킨 엘머). 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 상대 형광 단위(RFU)를 비히클의 존재 하에서 획득된 RFU로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)/(비히클의 존재 하에서 측정된 RFU - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 RFU)) x 100.
일련의 용량 희석물을 JAK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조한다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험한다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM). 데이터를 상기 분석으로부터의 평균 IC50 ± 상기 평균의 표준 오차로서 나타낸다.
하기의 화합물들을 본 발명에 개시된 분석을 사용하여 측정된 바와 같은 JAK2에 대한 그들의 활성 및 IC50 값들에 대해 시험하였으며, 하기 표 VII에 제공한다.
[표 VII]
본 발명의 예시적인 화합물들의 JAK2 IC50 값
* > 500 nM
** > 100-500 nM
*** > 50-100 nM
**** 0.1-50 nM
[표 VIII]
비교 화합물들의 JAK2 IC50 값
4.2.3. JAK2 Kd 측정 분석
JAK2(인비트로젠, PV4210)를 2.5 nM의 최종 농도로 사용한다. 결합 실험을 다양한 화합물 농도로, 25 nM 키나제 추적자 236(인비트로젠, PV5592) 및 2 nM Eu-항-GST(인비트로젠, PV5594)를 사용하여 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% 브리즈-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA에서 수행한다. 추적자의 검출은 제조사의 절차에 따라 수행한다.
4.3. JAK3 억제 분석
4.3.1. JAK3 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 JAK3 촉매 도메인(아미노산 781-1124; 카탈로그 번호 PV3855)을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 0.5 ng JAK3 단백질을 키나제 반응 완충제(25 mM 트리스 pH 7.5, 0.5 mM EGTA, 10mM MgCl2, 2.5mM DTT, 0.5 mM Na3VO4, 5 mM b-글리세로포스페이트, 0.01% 트리톤 X-100, 1 μM 비-방사성 ATP, 0.25 μCi 33P-감마-ATP(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 2.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 45 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((RFU 시험 화합물 - RFU 대조용)/(RFU 비히클 - RFU 대조용)) x 100
RFU 시험 화합물 = 존재하는 시험 화합물을 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 대조용 = 양성 대조용 억제제를 갖는 샘플에 대해 측정된 RFU
RFU 비히클 = 비히클의 존재하에서 측정된 RFU
일련의 용량 희석물을 JAK3 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 각각의 화합물들에 대해 제조하였다. 각각의 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/5 희석, 10 개 점에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
하기의 화합물들을 본 발명에 개시된 분석을 사용하여 측정된 바와 같은 JAK3에 대한 그들의 활성 및 IC50 값들에 대해 시험하였으며, 하기 표 IX에 제공한다.
[표 IX]
본 발명의 예시적인 화합물들의 JAK3 IC50 값
* > 500 nM
** > 100-500 nM
*** > 50-100 nM
**** 0.1-50 nM
[표 X]
비교 화합물들의 JAK3 IC50 값
4.3.2. JAK3 Ki 측정 분석
Ki의 측정을 위해서, 상이한 양의 화합물을 효소와 혼합하며, 상기 효소 반응은 ATP 농도의 함수로서 추적된다. 상기 Ki를, Km 대 화합물 농도의 이중 역비례 플롯팅(라인웨버-버크 플롯)에 의해 측정한다. JAK3(카르나 바이오사이언시즈, 09CBS-0625B)을 10 ng/㎖의 최종 농도로 사용한다. 기질은 폴리(Glu,Tyr)나트륨 염(4:1) , MW 20 000 - 50 000(시그마, P0275)이다. 상기 반응을 다양한 농도의 ATP 및 화합물과 함께 25mM 트리스 pH 7.5, 0.01% 트리톤 X-100, 0.5mM EGTA, 2.5mM DTT, 0.5mM Na3VO4, 5mM b-글리세로포스페이트, 10mM MgCl2에서 수행하고 150 mM 인산의 첨가에 의해 정지시킨다. 상기 기질 폴리GT에 결합된 포스페이트의 측정을, 필터 플레이트(수확기 사용, 퍼킨 엘머) 상에 상기 샘플들을 로딩하고 후속으로 세척하여 수행한다. 폴리GT 중의 결합된 33P를 상기 필터 플레이트(퍼킨 엘머)에 섬광 액체의 첨가후 탑카운트 섬광 계수기에서 측정한다.
4.4. TYK2 억제 분석
4.4.1. TYK2 Ulight-JAK1 펩타이드 분석
재조합 인간 TYK2 촉매 도메인(아미노산 871-1187; 카탈로그 번호 08-147)을 카르나 바이오사이언시즈로부터 구입하였다. 5 ng의 TYK2를 키나제 반응 완충제(25 mM Hepes pH 7.2, 50 mM NaCl, 0.5mM EDTA, 1mM DTT, 5mM MnCl2, 10mM MgCl2, 0.1% 브리즈-35, 0.1 μM 비-방사성 ATP, 0.125 μCi 33P-감마-ATP(GE 헬쓰케어, 카탈로그 번호 AH9968) 최종 농도) 중의 12.5 ㎍ 폴리GT 기질(시그마 카탈로그 번호 P0275)과 5 ㎕의 시험 화합물 또는 비히클(DMSO, 1% 최종 농도)의 존재 또는 부재 하에서 총 25 ㎕의 부피로, 폴리프로필렌 96-웰 플레이트(그레이너, V-바닥)에서 배양하였다. 30 ℃에서 90 분 후에, 25 ㎕/웰의 150 mM 인산을 가함으로써 반응을 정시켰다. 종결된 키나제 반응을 모두 세포 수확기(퍼킨 엘머)를 사용하여 예비세척된(75 mM 인산) 96 웰 필터 플레이트(퍼킨 엘머 카탈로그 번호 6005177)로 옮겼다. 플레이트를 300 ㎕/웰의 75 mM 인산 용액으로 6 회 세척하고 상기 플레이트의 바닥을 밀봉하였다. 40 ㎕/웰의 마이크로신트-20을 가하고, 상기 플레이트의 상부를 밀봉하고 탑카운트(퍼킨 엘머)를 사용하여 판독을 수행하였다. 키나제 활성을, 양성 대조용 억제제(10 μM 스타우로스포린)의 존재 하에서 획득된 분당카운트(cpm)를 비히클의 존재 하에서 획득된 cpm으로부터 감하여 계산하였다. 상기 활성을 억제하는 시험 화합물의 능력을 하기와 같이 측정하였다:
억제 백분율 = ((시험 화합물이 존재하는 샘플에 대해 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)/(비히클의 존재 하에서 측정된 cpm - 양성 대조용 억제제가 있는 샘플에 대해 측정된 cpm)) x 100.
일련의 용량 희석물을 TYK2 분석에서 용량-반응 효과의 시험 및 상기 화합물에 대한 IC50의 계산이 가능하도록 상기 화합물들에 대해 제조하였다. 상기 화합물을 20 μM의 농도에 이어서 일련의 1/3 희석, 8 개 점(20μM - 6.67μM - 2.22μM - 740nM - 247nM - 82nM - 27nM - 9nM)에서 1% DMSO의 최종 농도로 통상적으로 시험하였다. 일련의 화합물 효능이 증가하면, 보다 많은 희석물을 제조하고/하거나 최고 농도를 낮춘다(예를 들어 5 μM, 1 μM).
하기의 화합물들을 본 발명에 개시된 분석을 사용하여 측정된 바와 같은 TYK2에 대한 그들의 활성 및 IC50 값들에 대해 시험하였으며, 하기 표 XI에 제공한다.
[표 XI]
본 발명의 예시적인 화합물들의 TYK2 IC50 값
* > 500 nM
** > 100-500 nM
*** > 50-100 nM
**** 0.1-50 nM
[표 XII]
비교 화합물들의 TYK2 IC50 값
4.4.2. TYK2 Kd 측정 분석
TYK2(카르나 바이오사이언시즈, 09CBS-0983D)를 5 nM의 최종 농도로 사용한다. 결합 실험을 다양한 화합물 농도로, 50 nM 키나제 추적자 236(인비트로젠, PV5592) 및 2 nM Eu-항-GST(인비트로젠, PV5594)를 사용하여 50mM Hepes pH 7.5, 0.01% 브리즈-35, 10mM MgCl2, 1mM EGTA에서 수행한다. 추적자의 검출은 제조사의 절차에 따라 수행한다.
실시예 5. 세포 분석:
5.1. JAK1, JAK2 및 TYK2 선택성 세포 분석
5.1.1. 선택성 JAK1 세포 분석, PBMC 중 IFNα에 의한 STAT1의 활성화
말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 멸균 조건하에서 림포프렙(LymphoPrep)(상표) 배지(액시스 쉴드(Axis-Shield))를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 버피 코트로부터 단리한 다음 Ca++Mg++이 없는 PBS 중에서 3회 연속 세척 단계를 수행한다. PBMC를 10%(v/v) 열 불활성화된 FBS, 1% Pen-Strep(100 U/㎖ 페니실리움 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 함유하는 평지 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고 37 ℃ 5% CO2에서 가습 배양기에서 추가로 배양한다.
PBMC를 24 웰 플레이트에서 10%(v/v) FBS 및 1% Pen-Strep(인비트로젠)을 함유하는 200 ㎕ 부피의 RPMI 1640(인비트로젠) 중에 5.0 1006 세포/웰로 시딩한다.
PBMC를 37 ℃ 5% CO2에서 30분 동안 시험 화합물로 처리한다. 25 ㎕의 10x 농축된 화합물 희석액을 상기 배지에 가한다. 30분의 시험 화합물/비히클 전-처리 후에, PBMC를 37 ℃ 5% CO2에서 25 ㎕(10x 농축된)의 사이토킨 촉발제의 첨가에 의해 100 ng/㎖의 최종 농도로 재조합 인간 IFNα(펩프로테크(PeproTech))로 30분 동안 자극하여 250 ㎕/웰의 최종 부피를 획득한다.
모든 화합물을 20 μM로 출발한 다음 일련의 1/3 희석, 총 8개 점(20 μM, 6.6 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 0.082 μM, 0.027 μM 및 0.009 μM)에서 0.2% DMSO의 최종 농도로 1회 시험한다.
30분의 사이토킨 자극 후에, 250 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮기고, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿화한 다음, 상등액을 제거한다. 상기 세포 펠릿을 EDTA-무 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈 어플라이드 사이언시즈(Roche Applied Sciences), 제품 번호 11836170001)이 보충된 1x 용해 완충제 100 ㎕ 중에서 재조성한 다음 샘플을 동결시키고 -80 ℃에서 보관한다. 1x 용해 완충제를 포스포-STAT1 엘리사 키트에 제공하며 상기 완충제는 포스파타제 억제제를 함유한다. 인산화된 STAT1의 내인성 수준을 제조사의 설명에 따라 96-웰 패쓰스캔(PathScan)(등록상표) 포스포-STAT1(Tyr701) 샌드위치 ELISA 키트(셀 시그널링(Cell Signaling), 제품 번호 #7234)를 사용하여 정량분석한다.
HRP 활성(HRP는 2차 항체에 접합된다)을 100 ㎕의 새로 제조된 루미놀 기질(BM 케미루미네슨스(Chemiluminescence) ELISA 기질(POD), 롯슈, 제품 번호 11582950001)의 첨가, 암실에서 실온에서 5분간 배양에 의해 측정하고 써모 사이언티픽 루미노스캔(Thermo Scientific Luminoskan) 상행 미세플레이트 광도계(200 msec의 적분시)에서 측정한다.
5.1.2. 선택성 JAK2 세포 분석, PBMC 중 GM-CSF에 의한 STAT5의 활성화
말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 멸균 조건하에서 림포프렙(상표) 배지(액시스 쉴드)를 사용하여 밀도 구배 원심분리에 의해 버피 코트로부터 단리한 다음 Ca++Mg++이 없는 PBS 중에서 3회 연속 세척 단계를 수행한다. PBMC를 10%(v/v) 열 불활성화된 FBS, 1% Pen-Strep(100 U/㎖ 페니실리움 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신)을 함유하는 평지 RPMI 1640 배지에 재현탁시키고 37 ℃ 5% CO2에서 가습 배양기에서 추가로 배양한다.
PBMC를 24 웰 플레이트에서 10%(v/v) FBS 및 1% Pen-Strep(인비트로젠)을 함유하는 200 ㎕ 부피의 RPMI 1640(인비트로젠) 중에 5.0E06 세포/웰로 시딩한다.
PBMC를, 25 ㎕의 10x 농축된 화합물 희석액을 상기 배지에 가함으로써 시험 화합물로 처리하고 37 ℃ 5% CO2에서 30분 동안 배양한다. 후속으로, PBMC를 웰당 25 ㎕(10x 농축된)의 사이토킨 촉발제의 첨가에 의해 0.5 ng/㎖의 최종 농도로 재조합 인간 GM-CSF(펩프로테크)로 자극하여 250 ㎕의 최종 부피를 획득한다. 세포를 37 ℃ 5% CO2에서 30분 동안 촉발시킨다.
모든 화합물을 20 μM로 출발한 다음 일련의 1/3 희석, 총 8개 용량(20 μM, 6.6 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 0.082 μM, 0.027 μM 및 0.009 μM)에서 0.2% DMSO의 최종 농도로 1회 시험한다.
30분의 사이토킨 자극 후에, 250 ㎕의 세포 현탁액을 96-웰 V-바닥 플레이트로 옮긴 다음 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리시켜 세포를 펠릿화한다. 세포 상등액을 제거하고 펠릿을 EDTA-무 프로테아제 억제제 칵테일(롯슈 어플라이드 사이언시즈, 제품 번호 11836170001)이 보충된 1x 용해 완충제 100 ㎕ 중에서 재조성한 다음 샘플을 동결시키고 -80 ℃에서 보관한다. 1x 용해 완충제를 포스포-STAT5 엘리사 키트에 제공하며 상기 완충제는 포스파타제 억제제를 함유한다. 인산화된 STAT5의 내인성 수준을 제조사의 설명에 따라 96-웰 패쓰스캔(등록상표) 포스포-STAT5(Tyr694) 샌드위치 ELISA 키트(셀 시그널링, 제품 번호 #7113)를 사용하여 정량분석한다.
HRP 활성(HRP는 2차 항체에 접합된다)을 100 ㎕의 새로 제조된 루미놀 기질(BM 케미루미네슨스 ELISA 기질(POD), 롯슈, 제품 번호 11582950001)의 첨가, 암실에서 실온에서 5분간 배양에 의해 측정하고 써모 사이언티픽 루미노스캔 상행 미세플레이트 광도계(200 msec의 적분시)에서 측정한다.
5.1.3. 선택성 TYK2 세포 분석, NK-92 세포에서 IL-12에 의한 STAT4의 활성화
NK-92 세포(인간 악성 비-호지킨 림프종, 인터류킨-2(IL-2) 의존성 천연 살해 세포주, ATCC #CRL-2407).
NK-92 세포를, 0.2 mM 미오-이노시톨, 0.1 mM 2-머캅토-EtOH, 0.1 mM 폴산, 12.5% 열 불활성화된 말 혈청(인비트로젠, 제품 번호 26050-088), 12.5% 열 불활성화된 FBS, 1% Pen-Strep(100 U/㎖ 페니실리움 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신) 및 10 ng/㎖ 재조합 인간 IL-2(R&D 시스템스)를 함유하는 최소 필수 배지(MEM) 알파 배지 w/o 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보뉴클레오사이드, 2 mM L-글루타민, 2.2 g/L 나트륨 바이카보네이트(인비트로젠, 제품 번호 22561-021)에서 유지시킨다. IL-2를, 각각의 배지를 새로 보충하면서 상기 배지에 가한다. 세포를 37 ℃ 5% CO2에서 가습 배양기에서 배양한다.
NK-92 세포의 계대배양 분획을 rhIL-2 없이 평지 배지에서 1차 세척하고, 24-웰 플레이트에서 0.2 mM 미오-이노시톨, 0.1 mM 2-머캅토에탄올, 0.1 mM 폴산, 12.5% 열 불활성화된 말 혈청(인비트로젠, 제품 번호 26050-088), 12.5% 열 불활성화된 FBS, 1% Pen-Strep(인비트로젠)을 함유하는 400 ㎕ 부피의 평지 알파 MEM 배지 w/o rhIL-2 중에서 0.5E06 세포/웰로 시딩한다.
NK-92 세포를, rhIL-12 자극 전에 30분 동안 50 ㎕의 10x 농축된 화합물 희석액을 가함으로써 시험 화합물로 처리하고 37 ℃ 5% CO2에서 배양한다. 30분의 화합물/비히클 전-처리 후에, 세포를 50 ㎕(10x 농축된)의 사이토킨 촉발제의 첨가에 의해 25 ng/㎖의 최종 농도로 재조합 인간 IL-12(R&D 시스템스, 제품 번호 219-IL)로 자극하여 500 ㎕/웰의 최종 부피를 획득한다. NK-92 세포를 37 ℃ 5% CO2에서 30분 동안 rhIL-12로 촉발시킨다.
모든 화합물을 20 μM로 출발한 다음 일련의 1/3 희석, 총 8개 용량(20 μM, 6.6 μM, 2.2 μM, 0.74 μM, 0.25 μM, 0.082 μM, 0.027 μM 및 0.009 μM)에서 0.2% DMSO의 최종 농도로 1회 시험한다.
rhIL-12 자극된 NK-92 세포에서 포스포-STAT4의 수준을 갈리오스(Gallios)(상표) 유식 세포계(벡크만 쿨터(Beckman Coulter))상에서 유식세포측정 분석을 사용하여 정량분석한다. 30분의 사이토킨 자극 후에 상기 세포를, 상기 웰에 즉시 500 ㎕의 예온된 BD 사이토픽스(Cytofix) 고정 완충제(BD 포스플로우(Phosflow)(상표), 제품 번호 554655)를 가함으로써 고정시킨다(상기 세포를 스핀 다운시키기 보다는 인산화 상태를 유지시키기 위해서 즉시 고정시킨다, 같은 부피의 예온된 BD 사이노픽스 완충제를 세포 현탁액에 가하여 상기 세포를 고정시키는 것이 권장된다). 세포를 37 ℃에서 10분 동안 배양한다. 상기 고정된 세포 분획을 재현탁시키고(1 ㎖) FACS 튜브로 옮긴 다음 원심분리 단계(300x g, 10 분) 및 상등액 제거를 수행한다. 상기 세포 펠릿을 혼합하고(와동시키고) 상기 세포를, 1 ㎖의 BD 포스플로우 펌(Perm) 완충제 III(BD 포스플로우(상표), 제품 번호 558050)를 첨가한 다음 얼음상에서 30분 동안 배양시켜 침투성으로 만든다. 상기 침투화 단계 후에, 상기 세포를, 10분 동안 300x g에서 중간 원심분리 및 상등액의 제거와 함께 BD 파밍겐(Pharmingen)(상표) 염색 완충제(BD 파밍겐, 제품 번호 554656)로 2회 세척한다. 상기 펠릿(0.5E06 세포)을 100 ㎕의 BD 파밍겐(상표) 염색 완충제 중에 재현탁시키고, 20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT4(pY693)를 상기 세포에 혼합함으로써 염색하고(BD 포스플로우(상표), PE 마우스 항-STAT4(pY693), 제품 번호 558249), 이어서 암실에서 실온에서 30분 동안 배양한다. 상기 염색된 세포를 2 ㎖의 BD 파밍겐(상표) 염색 완충제로 1회 세척하고 500 ㎕의 BD 파밍겐(상표) 염색 완충제 중에 재현탁시키고 갈리오스(상표) 유식 세포계(벡크만 쿨터)상에서 분석하였다.
모든 분석에 대해서, 죽은 세포 및 세포 찌꺼기를 전방 산란(FSC) 및 측면 산란(SSC)에 의해 제외시킨다. 사이토킨 자극에 따른 STAT4 단백질의 인산화의 변화를, 모든 사이토킨 자극된 시험 화합물 및 자극되지 않은 샘플들에 대해 게이트 통제된 분획 100%를 기준으로 세포당 X-중간 또는 X-평균 형광 강도(MFI)를 계산하여 근사값을 구한다.
5.1.4. JAK1, JAK2 및 TYK2 분석 결과:
자극되지 않은 샘플(촉발제 없음/비히클(0.2% DMSO))을 양성 대조용(100% 억제)으로서 사용한다. 음성 대조용(0% 억제)으로서, 자극된 샘플(촉발제/비히클(0.2% DMSO))을 사용한다. 상기 양성 및 음성 대조용을 사용하여 'Z' 및 '억제 퍼센트(PIN)' 값을 계산한다.
억제 백분율을 하기로부터 계산한다:
억제 백분율 = ((RCLU(촉발제/비히클) - RCLU(시험 화합물))/((RCLU(촉발제/비히클) - RCLU(촉발제 없음/비히클)) x 100
여기에서
RCLU(촉발제/비히클): 비히클 및 촉발제의 존재하에서 측정된 상대적인 화학발광 신호
RCLU(시험 화합물): 시험 화합물의 존재하에서 측정된 상대적인 화학발광 신호
RCLU(촉발제 없음/비히클): 촉발제 없이 비히클의 존재하에서 측정된 상대적인 화학발광 신호
판독 신호를 X-평균값(사이토킨 자극된 NK-92 세포에서 pSTAT4 수준의 유식 세포측정 분석)으로서 나타내는 경우에, 상기 RCLU는 X-평균값으로 대체된다.
PIN 값을 용량-반응으로 시험된 화합물에 대해 플롯팅하며 EC50 값을 비-선형 회귀(s자) 곡선 정합을 적용하는 그래프패드 프리즘 소프트웨어를 사용하여 유도한다.
5.2. 폐암 및 간세포 암종 세포주 분석에서 JAK1 돌연변이
5.2.1. JAK1 돌연변이는 구성적 신호전달을 유도하였다.
JAK1 돌연변이가 있고 없는 암 세포주들(표 I - 폐암 세포주들)을 4 내지 6시간 동안 혈청 없이 또는 혈청과 함께 배양하고, 5, 10, 30 및 45분 동안 사이토킨 칵테일(IFNγ, IL2, IL4 및 IL6)로 자극하거나 자극하지 않는다. JAK1, STAT1, STAT3 및 STAT5의 인산화를 면역블럿(셀 시그널링 항체)에 의해 평가한다.
5.2.2. JAK 억제제를 사용하는 JAK1 돌연변이체의 표적화
5.2.2.1. JAK-STAT 경로 인산화:
JAK1 돌연변이가 있고 없는 암 세포주들을 상이한 농도의 JAK 억제제의 존재 또는 부재하에서 배양한다. 세포를 면역블럿에 의해 유효한 JAK-STAT 경로 억제에 대해 24 및 48시간째에 분석한다.
[표 XIII]
표 I: 예시적인 폐암 세포주들
5.2.2.2. 세포 생육력
2D-분석:
JAK1 돌연변이가 있고 없는 암 세포주들을 증가하는 농도의 JAK 억제제의 존재 또는 부재하에서 배양한다. 48 내지 72시간 후에, 세포 생육력을 셀 티터-글로(Cell Titer-Glo) 발광 세포 생육력 분석(프로메가(Promega)) 또는 MTT 분석을 사용하여 측정한다. 한편으로, 암 세포주들을 상이한 배양 시점들에서 고정 농도의 JAK 억제제와 함께 셀 티터-글로 발광 세포 생육력 분석(프로메가) 또는 MTT 분석을 사용하여 세포 생육력에 대해 분석한다.
3D-분석:
JAK1 돌연변이가 있고 없는 암 세포주들을 반-고형 아가 배지에 시딩한다. 다-세포 콜로니의 형성을, 상이한 배양 시점들에서 형광 염료를 사용하여 세포 생육력을 측정함으로써 측정한다. 세포 시딩 후 잠재적인 억제제의 첨가는 종양형성 억제 효과의 분석을 허용한다.
5.2.3. 쥐 Ba/F3 세포에서 인간 JAK1 돌연변이의 조사
(Kan et al., 2013; Staerk et al., 2005; Zenatti et al., 2011에 예시된 바와 같다)
JAK1 발현 벡터의 제작: 야생형 및 돌연변이 인간 JAK1 서열을 레트로바이러스 벡터내로 클로닝하고 클론들을 서열분석에 의해 확인한다.
Ba/F3 세포의 레트로바이러스 감염: Ba/F3 세포를 293T 세포에서 생성된 레트로바이러스 상등액으로 감염시킨다.
인간 WT 또는 돌연변이된 JAK1을 발현하는 Ba/F3 세포를 4시간 동안 IL-3과 함께 또는 상기 없이 배양하고 JAK-STAT 경로의 인산화를 면역블럿에 의해 평가한다.
JAK1 돌연변이의 형질전환 가능성을, 사이토킨-의존성 Ba/F3 세포에서 발현시 자율적인 생육을 유도하는 각 돌연변이의 능력을 측정함으로써 평가한다. 세포 생육을 사이토킨 IL-3의 부재하에서 평가한다.
돌연변이 JAK1 형질도입된 Ba/F3 세포주를 증가하는 농도의 JAK 억제제의 존재 또는 부재하에서 배양함으로써 JAK 억제제에 대한 상기 세포주의 감도를 평가한다. 48 내지 72시간 후에, 세포 생육력을 셀 티터-글로 발광 세포 생육력 분석(프로메가) 또는 MTT 분석을 사용하여 측정한다. 한편으로, 암 세포주들을 상이한 배양 시점들에서 고정 농도의 JAK 억제제와 함께 셀 티터-글로 발광 세포 생육력 분석(프로메가) 또는 MTT 분석을 사용하여 세포 생육력에 대해 분석한다.
5.2.4. JAK1 돌연변이의 생체내 종양형성 가능성
5.2.4.1. 이종이식편 모델:
돌연변이 JAK1 발현 세포를 CD1 nu/nu 마우스 또는 Rag1-/- 마우스에서 피하 주사하고 종양 진행에 대해 평가한다. 피하 종양 부피 성장 곡선을 확립시킨다. 2차 수령 동물내로의 1차 종양의 이식성을 측정한다.
5.2.4.2. PDX 모델
환자-유래된 이종이식(PDX)은 직접 상기 환자에서 면역결핍 마우스내로의 1차 종양(JAK1 돌연변이를 함유하는)의 전달을 기본으로 한다. 이를 수행하기 위해서, 환자 종양을 수술로부터 새롭게 수득해야 하며, 이 시점에서 상기 종양을 기계적으로 또는 화학적으로 절단하고, 이때 작은 부분을 1차 스톡으로서 떼어놓고 NOD-SCID 마우스에 확립시킨다. PDX 모델을, 일단 종양 크기가 너무 커지면 세포를 직접 마우스에서 마우스로 계대배양함으로써 유지시킨다. 종양을 이소성으로(종양을 마우스의 피하 옆구리에 이식함) 또는 동소성으로(마우스의 선택 기관에 직접 이식함) 이식할 수 있다.
1차 및 2차 종양에서 JAK1, STAT1, STAT3 및 STAT5의 인산화를 면역블럿에 의해 평가한다.
5.3. PBL 증식 분석
인간 말초 혈액 림프구(PBL)를 IL-2로 자극하고 증식을 BrdU 결합 분석을 사용하여 측정한다. 상기 PBL을 먼저 72 시간 동안 PHA로 자극하여 IL-2 수용체를 유도하고, 이어서 24 시간 동안 절식시켜 세포 증식을 정지시킨 다음 추가로 72 시간 동안 IL-2 자극한다(24 시간 BrdU 표지화 포함). 세포를 IL-2 첨가 1 시간 전에 시험 화합물과 예비배양시킨다. 세포를 10%(v/v) FBS를 함유하는 RPMI 1640에서 배양한다.
5.4. 인간 전혈 분석(hWBA)
5.4.1. 프로토콜 1
5.4.1.1. IL-6 자극 프로토콜
유식 세포측정 분석을 수행하여 인간 전혈로 생체외 JAK2 화합물 선택성에 대해 JAK1을 확립시킨다. 따라서, 사전 동의를 받은 인간 지원자로부터 혈액을 채취한다. 이어서 혈액을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 평형화하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 분액한다. 화합물을 상이한 농도로 가하고 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하고 후속으로 JAK1-의존성 경로 자극에 대해서는 인터류킨 6(IL-6)으로, 또는 JAK2-의존성 경로 자극에 대해서는 GM-CSF로, 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 자극한다. 이어서 포스포-STAT1 및 포스포-STAT5를 FACS 분석을 사용하여 평가한다.
5.4.1.2. 포스포-STAT1 분석
5.4.1.2.1. 시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우(PhosFlow), 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온한다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버린다.
10 ㎍ rhIL-6(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 206-IL)을 1㎖의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득한다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관한다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조한다. 대조용-처리된 샘플은 화합물 대신에 DMSO를 수용한다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양한다.
5.4.1.2.2. 혈액과 화합물과의 배양 및 IL-6에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거한다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나눈다. 이어서, 1.5 ㎕의 시험 화합물 희석액을 각 혈액 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 1과 1/2 마이크로리터의 10배 희석된 IL-6 모액을 상기 혈액 샘플(최종 농도 10 ng/㎖)에 가하고 상기 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
5.4.1.2.3. 백혈구 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양한다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시킨다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% MeOH를 가한다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양한다.
이어서 침투된 세포를 3% BSA를 함유하는 1x PBS로 세척하고 최종적으로 3% BSA를 함유하는 1X PBX 80 ㎕에 재현탁한다.
5.4.1.2.4. 항 포스포-STAT1 및 항-CD4 항체에 의한 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT1(pY701) 또는 PE 마우스 IgG2aκ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612564 및 559319) 및 FITC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 FITC-접합된 아이소타입 항체를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석한다.
5.4.1.2.5. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT1 양성 세포를 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트화후 측정한다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-6 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다.
5.4.1.3. 포스포-STAT5 분석
시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우, 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온한다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버린다.
10 ㎍ rhGM-CSF(AbCys S.A., 카탈로그 번호 P300-03)을 100 ㎕의 PBS 0.1% BSA에 용해시켜 100 ㎍/㎖ 모액을 수득한다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관한다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조한다. 대조용-처리된 샘플은 시험 화합물없이 DMSO를 수용한다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양한다.
5.4.1.3.1. 혈액과 화합물과의 배양 및 GM-CSF에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거한다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나눈다. 이어서, 1.5 ㎕의 화합물 희석액을 각 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 5,000 배 희석된 GM-CSF 모액(1.5 ㎕)을 상기 혈액 샘플(최종 농도 20 ng/㎖)에 가하고 상기 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
5.4.1.3.2. 백혈구 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양한다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시킨다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% MeOH를 가한다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양한다.
5.4.1.3.3. 항 포스포-STAT5 및 항-CD33 항체에 의한 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC 마우스 항 CD33 항체(BD 바이오사이언시즈 #345800) 또는 대조용 APC 마우스 IgG1 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈 #345818)를 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석한다.
5.4.1.3.4. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT5 양성 세포를 림프구 CD33+ 세포상에서 게이트 통제 후 측정한다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하며 이는 CD33+ 세포상의 포스포-STAT5에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산된 GM-CSF 자극의 억제의 백분율에 상응한다.
5.5. 프로토콜 2
5.5.1. 자극 프로토콜
유식 세포측정 분석을 수행하여 인간 전혈로 생체외 JAK2 화합물 선택성에 대해 JAK1을 확립시킨다. 따라서, 사전동의를 받은 인간 지원자로부터 혈액을 채취한다. 이어서 혈액을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 평형화하고, 이어서 에펜도르프 튜브에 분액한다. 화합물을 상이한 농도로 가하고 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분간 배양하고 후속으로 JAK1-의존성 경로 자극에 대해서는 인터류킨 6(IL-6)으로, JAK1/TYK2 경로 자극에 대해서는 인터페론 알파(IFNα)로, JAK1/JAK3 경로 자극에 대해서는 인터류킨 2(IL-2)로, 또는 JAK2-의존성 경로 자극에 대해서는 GM-CSF로, 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분간 자극한다. 이어서 포스포-STAT1(IL-6- 및 IFNα-자극된 세포의 경우) 및 포스포-STAT5(IL-2- 및 GM-CSF-자극된 세포의 경우)를 FACS 분석을 사용하여 평가한다.
5.5.2. 포스포-STAT 분석
5.5.2.1. 시약의 제조
5X 용해/고정 완충제(BD 포스플로우, 카탈로그 번호 558049)를 증류수로 5 배 희석하고 37 ℃에서 예온한다. 남은 희석된 용해/고정 완충제는 버린다.
10 ㎍ rhIL-6(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 206-IL)을 1㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득한다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관한다.
10 ㎍ rhIL-2(R&D 시스템스, 카탈로그 번호 202-IL)을 1㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 10 ㎍/㎖ 모액을 수득한다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관한다.
5 ㎍ rhGM-CSF(AbCys S.A., 카탈로그 번호 P300-03)를 12.5㎖의 PBS + 0.1% BSA에 용해시켜 400 ng/㎖ 모액을 수득한다. 상기 모액을 분액하고 -80 ℃에서 보관한다.
상기 화합물의 3배 연속 희석물을 DMSO(10 mM 모액) 중에서 제조한다. 대조용-처리된 샘플은 화합물 대신에 DMSO를 수용한다. 모든 샘플을 1% 최종 DMSO 농도로 배양한다.
5.5.2.2. 혈액과 화합물과의 배양 및 촉발제에 의한 자극
인간 혈액을 헤파린처리된 튜브에 수거한다. 상기 혈액을 148.5 ㎕의 분액들로 나눈다. 이어서, 1.5 ㎕의 시험 화합물 희석액을 각 혈액 분액에 가하고 상기 혈액 샘플을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 30 분 동안 배양한다. 1과 1/2 마이크로리터의 10배 희석된 IL-6 모액, 1.5 ㎕의 uIFNα(PBL 바이오메디컬(Biomedical), 카탈로그 번호 11200-1) 모액, 1.5 ㎕의 25배 희석된 IL-2 모액 또는 1.5 ㎕의 200배 희석된 GM-CSF 모액을 상기 혈액 샘플에 가하고 상기 샘플들을 부드럽게 흔들면서 37 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
5.5.2.3. 백혈구 제제
상기 자극 기간의 끝에서, 적혈구를 용해시키고 백혈구를 고정시키기 위해서 3 ㎖의 1X 예온된 용해/고정 완충제를 상기 혈액 샘플에 바로 가하고, 간단히 와동시키고 수욕에서 37 ℃에서 15 분간 배양한다.
튜브를 400xg에서 4 ℃에서 5 분간 원심분리시킨다. 세포 펠릿을 3 ㎖의 저온 1X PBS로 세척하고, 원심분리후 상기 세포 펠릿을 100 ㎕의 빙냉 1X PBS에 재현탁하고 900 ㎕ 빙냉 100% MeOH를 가한다. 이어서 세포를 침투를 위해 30 분간 4 ℃에서 배양한다.
이어서 침투된 세포를 3% BSA를 함유하는 1x PBS로 세척하고 최종적으로 3% BSA를 함유하는 1X PBX 80 ㎕에 재현탁한다.
5.5.2.4. 세포 표지
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT1(pY701) 또는 PE 마우스 IgG2aκ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612564 및 559319) 및 APC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 APC-접합된 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 555349 및 555751)를 IL-6 및 IFNα-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC-접합된 항-CD4 항체 또는 대조용 APC-접합된 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 555349 및 555751)를 IL-2-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
20 ㎕의 PE 마우스 항-STAT5(pY694) 또는 PE 마우스 IgG1κ 아이소타입 대조용 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 각각 612567 및 554680) 및 APC 마우스 항 CD33 항체(BD 바이오사이언시즈 #345800) 또는 대조용 APC 마우스 IgG1 아이소타입 항체(BD 바이오사이언시즈, 카탈로그 번호 345818)를 GM-CSF-자극된 튜브에 가하고 혼합하고, 이어서 암실에서 4 ℃에서 20 분 동안 배양한다.
이어서 세포를 1X PBS로 1 회 세척하고 FACSCanto II 유식 세포계(BD 바이오사이언시즈) 상에서 분석한다.
5.5.2.5. FACSCanto II상에서 형광 분석
총 50,000 개의 사건을 카운트하고 포스포-STAT1 양성 세포를 IL-6- 및 IFNα-자극된 세포에 대해서 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트화후 측정한다. 포스포-STAT5 양성 세포를 IL-2-자극된 세포에 대해서 림프구 게이트에서 CD4+ 세포에 게이트 통제 후 측정한다. 포스포-STAT5 양성 세포를 CD33+ 세포에 게이트 통제 후 측정한다. 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-6 또는 IFNα 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다. IL-2 자극된 세포의 경우, 데이터를 FACSDiva 소프트웨어를 사용하여 분석하고 IL-2 자극의 억제 백분율을 CD4+ 세포상의 포스포-STAT1에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다. GM-CSF 자극된 세포의 경우, GM-CSF 자극의 억제 백분율을 CD33+ 세포상의 포스포-STAT5에 대한 양성 세포의 백분율로부터 계산한다.
실시예 6. 생체내 모델
6.1. CIA 모델
6.1.1. 물질
완전 프로인트 항원보강제(CFA) 및 불완전 프로인트 항원보강제(IFA)를 디프코(Difco)로부터 구입하였다. 소 콜라겐 유형 II(CII), 리포폴리사카라이드(LPS), 및 엔브렐(Enbrel)을 각각 콘드렉스(Chondrex)(Isle d’Abeau, 프랑스 소재); 시그마(P4252, 프랑스(L’Isle d’Abeau) 소재), 와이예트(Whyett)(25mg 주사성 주사기, 프랑스 소재) 아크로스 오가닉스(Acros Organics)(미국 캘리포니아주 팔로알토 소재)로부터 수득하였다. 사용된 다른 모든 시약들은 시약 등급의 것이었으며 모든 용매는 분석 등급의 것이었다.
6.1.2. 동물
검은 아구티 래트(수컷, 7-8 주된 것)를 할란 레보라토리즈(Harlan Laboratories)(프랑스 메종 알포르 소재)로부터 수득하였다. 래트를 12 시간 명/암 주기(0700-1900)로 유지시켰다. 온도를 22 ℃에서 유지시키고, 사료와 물을 자유롭게 제공하였다.
6.1.3. 콜라겐 유발된 관절염(CIA)
실험 하루전에, CII 용액(2 ㎎/㎖)을 0.05 M 아세트산으로 제조하고 4 ℃에서 보관하였다. 면역화 직전에, 동부피의 항원보강제(IFA) 및 CII를 빙수욕에서 미리 냉각시킨 유리병에서 균질화기에 의해 혼합하였다. 유화액이 형성되지 않는 경우 잉여의 항원보강제 및 연장된 균질화가 필요할 수도 있다. 0.2 ㎖의 상기 유화액을 제1일에 각 래트의 꼬리 기부에 피내 주사하고, 두 번째 추가 피내 주사(CFA 0.1 ㎖ 염수 중 2 ㎎/㎖의 CII 용액)를 제9일에 수행하였다. 상기 면역화 방법은 공개된 방법(Jou et al., 2005; Sims et al, 2004)으로부터 변형되었다.
6.1.4. 연구 설계
상기 화합물들의 치료 효과를 상기 래트 CIA 모델에서 시험하였다. 래트를 동등한 그룹으로 무작위로 나누었으며 각각의 그룹은 10 마리의 래트를 함유하였다. 모든 래트를 제1일에 면역시키고 제9일에 추가 면역시켰다. 치료 투약을 제16일에서부터 제30일까지 지속하였다. 음성 대조군은 비히클(MC 0.5%)로 처리하고 양성 대조군은 엔브렐(10 ㎎/㎏, 3x 주, s.c.)로 처리하였다. 관심 화합물을 전형적으로는 3 회 용량, 예를 들어 3, 10, 30 ㎎/㎏, p.o.로 시험하였다.
6.1.5. 관절염의 임상 평가
관절염을 문헌[Khachigian 2006], [Lin et al 2007] 및 [Nishida et al. 2004)]의 방법에 따라 채점한다. 4 개의 발 각각의 팽창을 하기와 같이 관절염 점수로 순위를 매긴다: 0 - 증상 없음; 1 - 발목 또는 손목과 같은 한 가지 유형의 관절의 순하지만 명확한 발적 및 팽창, 또는 병든 손발가락 수와 관계없이, 개별 손발가락으로 한정된 겉보기 발적 및 팽창; 2 - 2 가지 이상의 유형의 관절의 보통의 발적 및 팽창; 3 - 손발가락을 포함한 전체 발의 심한 발적 및 팽창; 4 - 다수의 관절을 포함하여 최대로 염증을 일으킨 사지(최대 누적 임상 관절 점수는 동물당 16점이다)(Nishida et al., 2004).
수회 연구의 메타분석을 허용하기 위해서, 상기 임상 점수값들을 하기와 같이 표준화하였다:
임상 점수의 AUC(AUC 점수): 제1일부터 제14일까지의 곡선 아래 면적(AUC)을 각각의 개별 래트에 대해서 계산하였다. 각 동물의 AUC를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 AUC로 나누고 100을 곱하였다(즉 AUC는 연구당 평균 비히클 AUC의 백분율로서 표현되었다).
임상 점수는 제1일에서부터 제14일(종점 점수)까지 증가한다: 각 동물에 대한 임상 점수 차이를, 상기 동물에 대한 데이터가 획득된 연구에서 비히클에 대해 획득된 평균 임상 점수 차이로 나누고 100을 곱하였다(즉 상기 차이는 연구당 상기 비히클에 대한 평균 임상 점수 차이의 백분율로서 표현되었다).
6.1.6. 관절염의 발병후 체중 변화(%)
임상적으로, 체중 손실은 관절염과 관련된다(Rall and Roubenoff, 2004; Shelton et al., 2005; Walsmith et al., 2004). 따라서, 관절염 발병후 체중 변화를 상기 래트 모델에서 치료 효과의 평가를 위한 비-특이적 종점으로서 사용할 수 있다. 상기 관절염 발병후 체중 변화(%)를 하기와 같이 계산하였다:
마우스: (체중(주 6) - 체중(주 5))/체중(주 5) x 100%
래트: (체중(주 4) - 체중(주 3))/체중(주 3) x 100%
6.1.7. 방사선학
X-선 사진을 각각의 개별적인 동물의 뒷발에서 촬영하였다. 무작위한 맹검 식별 번호를 각각의 사진에 부여하고, 골 미란의 중증도를 하기와 같은 방사선학적 라르센(Larsen) 점수 시스템으로 2 개의 독립적인 점수에 의해 순위를 매겼다: 0-완전한 골 윤곽 및 정상적인 관절 공간을 갖는 정상; 1-외부 중족골 중 임의의 하나 또는 2개가 가벼운 골 미란을 보이는 약간의 이상; 2-외부 중족골 중 3 내지 5 개가 골 미란을 보이는 명확한 조기 이상; 3-상기 외부 중족골 모두뿐만 아니라 내부 중족골 중 임의의 하나 또는 2개가 명확한 골 미란을 보이는 중간의 파괴성 이상; 4-모든 중족골이 명확한 골 미란을 보이고 내부 중족골 중 하나 이상이 완전히 미란되어 일부 골 관절 윤곽이 부분적으로 보존되는 중증의 파괴성 이상; 5-골 윤곽이 없는 절단 이상. 이러한 득점 시스템은 하기 문헌들의 변형이다: Bush et al., 2002; Jou et al., 2005; Salvemini et al., 2001; Sims et al., 2004.
6.1.8. 조직학
방사선학 분석후에, 마우스의 뒷발을 10% 포스페이트-완충된 포르말린(pH 7.4) 중에 고정시키고, 정밀한 조직학을 위해 빠른 골 탈회제(레보라토리즈 유로바이오(Laboratories Eurobio))로 탈회시키고 파라핀에 묻었다. 관절염에 걸린 관절의 확실한 광범위한 평가를 위해서, 4 개 이상의 일련의 단편(5 ㎛ 두께)을 절단하였으며 각각의 일련의 단편의 사이는 100 ㎛이었다. 상기 단편들을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 활액막 염증 및 골 및 연골 손상에 대한 조직 검사를 이중 맹검 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 각각의 발에서, 4 개의 매개변수를 4-점 규모로 평가하였다. 상기 매개변수는 세포 침윤, 판누스 중증도, 연골 미란 및 골 미란이었다. 하기와 같이 상응하게 점수를 매겼다: 1-정상, 2-순한, 3-보통, 4-심한. 상기 4 개의 점수를 함께 합하고 추가적인 점수, 즉 'RA 총점'으로서 나타낸다.
6.1.9. 종골(뒤꿈치 뼈)의 미세전산화 단층촬영(μCT) 분석
RA에서 관찰된 골 손상은 특히 골피질에서 발생하며 μCT 분석에 의해 밝혀질 수 있다(Oste et al., 2007; Sims et al., 2004). 상기 종골의 스캐닝 및 3D 용적 재건후에, 골 손상을 상기 뼈의 종방향 축에 수직인 인실리코 단리된, 슬라이드당 존재하는 식별 대상의 수로서 측정한다. 상기 골이 많이 손상될수록 보다 많은 식별 대상이 측정된다. 종골을 따라 균일하게 분배된(약 10.8 ㎛로 이격됨) 1000 개의 슬라이드를 분석한다.
6.1.10. 정상상태 PK
제7일 또는 제11일째에, 혈액 샘플을 하기의 시점들에서, 응고 방지제로서 리튬 헤파린을 사용하여 후-안와 공동에서 채취하였다: 투여전, 1, 3 및 6 시간. 전혈 샘플을 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관하였다. 각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하였으며, 여기에서 질량 분광계는 양의 전기분무 방식으로 작동되었다. 약동학적 매개변수들을 윈놀린(Winnonlin)(등록상표)(파사이트(Pharsight)(등록상표), 미국 소재)을 사용하여 계산하였으며 상기 투여전 혈장 수준은 24 시간 혈장 수준과 같은 것으로 가정되었다.
6.2. 종양학 모델
JAK2-구동된 골수증식성 질병에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 생체내 모델이 문헌[Geron et al., 2008]; 문헌[Wernig et al. 2008]에 개시되어 있다.
6.3. 마우스 IBD 모델
IBD에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 시험관내 및 생체내 모델이 문헌[Wirtz and Neurath, 2007]에 개시되어 있다.
6.4. 마우스 천식 모델
천식에 대한 소분자의 효능을 확인하기 위한 시험관내 및 생체내 모델이 문헌[Ip et al. 2006]; [Kudlacz et al., 2008]; [Nials and Uddin, 2008]; [Pernis and Rothman, 2002]에 개시되어 있다.
6.5. IL22 또는 IL23의 피내 주사에 의해 유도된 건선-형 상피 과형성의 쥐 모델
6.5.1. 물질
무 담체, 마우스 재조합 IL22(582-ML-CF)가 R&D 시스템스에 의해 제공된다. 무-담체, 마우스 재조합 IL23(14-8231, CF)이 e-바이오사이언스에 의해 제공된다.
6.5.2. 동물
Balb/c 마우스(암컷, 18 내지 20 g 체중)를 CERJ(프랑스 소재)로부터 수득한다. 마우스를 12시간 명/암 주기(07:00 - 19:00)로 유지시킨다. 온도를 22 ℃에서 유지시키고, 먹이와 물을 무제한으로 제공한다.
6.5.3. 연구 설계
상기 연구의 설계를 문헌[Rizzo et al, 2011]으로부터 적응 개조한다.
제1일(D1)에, 상기 마우스의 양쪽 귀 둘레를 면도한다.
연속해서 4일 동안(D1 내지 D4), 상기 마우스에게 아이소플루란의 흡입에 의해 유도된 마취하에서 우측 귓바퀴에 마우스 재조합 IL22 또는 IL23(PBS/0.1% BSA 중의 1 ㎍/20 ㎕) 및 좌측 귓바퀴에 20 ㎕의 PBS/0.1% BSA의 1일 피내 용량을 제공하였다.
D1 내지 D5 동안, 마우스에게 IL23/IL22 주사 또는 비히클 1시간 전에 시험-화합물(MC 0.5% 중 10, 30 또는 100 ㎎/㎏, po, qd)을 투여한다.
6.5.4. 질병의 평가
상기 양쪽 귀의 두께를 자동 캘리퍼스로 매일 측정한다. 체중을 초기 및 사망시 평가한다. 제5일째, 최종 투여 후 2시간째에 상기 마우스를 죽인다. 상기 귀의 귓바퀴를 연골을 제외하고 절제한다. 상기 귓바퀴를 칭량하고 이어서 1 ㎖의 RNAlater 용액을 함유하는 바이알 또는 포름알데하이드 중에 넣는다.
D4에서, 혈액 샘플을 또한 투여 직전(T0) 및 투여 후 1시간, 3시간, 6시간째에 PK 프로파일을 위해서 후-안와 공동으로부터 수집한다.
그룹당 8마리의 마우스가 존재한다. 결과를 평균±sem으로서 나타내며 통계학적 분석을 IL22 또는 IL23 비히클 그룹에 대해서 일원 Anova에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
6.5.5. 조직학
죽인 후에, 귀를 수집하고 3.7% 파라포름알데하이드 중에 고정시킨 후에 파라핀에 묻는다. 2 ㎛ 두께로 절단하고 헤마톡실린 및 에오신으로 염색한다. 귀의 표피 두께를 x20 배율로 귀당 6개의 상을 포착하여 상 분석(Sis'Ncom 소프트웨어)에 의해 측정한다. 데이터를 평균±sem으로서 나타내며 통계학적 분석을 IL22 또는 IL23 비히클 그룹에 대해서 일원 Anova에 이어서 듄네트의 사후 검정을 사용하여 수행한다.
6.5.6. RNA 추출, RT-PCR 및 실시간 PCR
귀 조직 중의 IL-17a, IL-22, IL-1β, LCN2 및 S100A9 전사물 수준을 실시간 정량 PCR을 사용하여 측정한다.
실시예 7. 약동학, ADME 및 독성 분석
7.1. 열역학적 용해도
상기 시험 화합물을 유리 바이알 중에서 1 ㎎/㎖의 농도로 0.2 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 또는 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.0에 가한다.
샘플들을 로테이터 드라이브(Rotator drive) STR 4(스튜어트 사이언티픽(Stuart Scientific), Bibby)에서 3.0의 속도로 실온에서 24 시간 동안 회전시킨다.
24시간 후에, 800 ㎕의 상기 샘플을 에펜도르프 튜브로 옮기고 14000 rpm에서 5분 원심분리시킨다. 이어서 상기 샘플의 상등액 200 ㎕를 멀티스크린R(MultiscreenR) 용해도 플레이트(밀리포어(Millipore), MSSLBPC50)로 옮기고, 상기 상등액을 진공 다기관의 도움으로 깨끗한 그레이너 폴리프로필렌 V-바닥 96 웰 플레이트(카탈로그 번호 651201)로 여과한다(10-12" Hg). 5 ㎕의 상기 여액을, 표준 곡선을 함유하는 플레이트에서의 배양에 사용된 동일한 완충제 95 ㎕(F20)에 희석한다(그레이너, 카탈로그 번호 651201).
상기 화합물에 대한 표준 곡선을 DMSO(5000 μM) 중에서 인자 2 희석된 10 mM DMSO 모액으로부터 출발하여 DMSO 중에서 새로 제조하고 이어서 DMSO 중에서 19.5 μM까지 추가로 희석한다. 이어서 5000 μM로부터의 일련의 희석액 3 ㎕를 97 ㎕ 아세토나이트릴-완충제 혼합물(50/50)로 옮겼다. 최종 농도 범위는 2.5 내지 150 μM이다.
상기 플레이트를 밀봉 매트(MA96RD-04S, www.kinesis.co.uk)로 밀봉하고 샘플을 실온에서 콴옵티파이즈(Quanoptimize)를 사용하여 최적화된 조건하에서 LC-MS(ZQ 1525, 워터스)상에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.
상기 샘플을 1 ㎖/분의 유량으로 LC-MS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 엑스브리지 C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(워터스) 상에서 양이온 분무 하에 실행시킨다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B까지의 범위이다.
피크 면적을 매시링크스(Masslynx) 소프트웨어의 도움으로 분석하고 샘플의 피크 면적을 표준 곡선에 대해 플롯팅하여 화합물의 용해도를 획득한다.
용해도 값을 μM 또는 ㎍/㎖로 보고한다.
7.2. 수성 용해도
DMSO 중 10 mM 모액으로부터 출발하여, 일련의 상기 화합물의 희석물을 DMSO 중에서 제조한다. 상기 연속 희석물을 96 NUNC 맥시솔브 플레이트 F-바닥(카탈로그 번호 442404)으로 옮기고 실온에서 0.2 M 포스페이트 완충제 pH 7.4 또는 0.1 M 시트레이트 완충제 pH 3.0을 가한다.
최종 농도 범위는 5 회의 동등한 희석 단계에서 200 μM에서부터 2.5 μM이다. 최종 DMSO 농도는 2%를 초과하지 않는다. 200 μM 파이렌을 각각의 96 웰 플레이트의 구석 지점에 가하며 이를 현미경상의 Z-축 눈금화를 위한 기준 점으로서 제공한다.
상기 분석 플레이트를 밀봉하고 230 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 동안 배양한다. 이어서 상기 플레이트를 백색광 현미경 하에서 스캐닝하여, 농도당 침전물의 개별적인 그림을 제공한다. 상기 침전물을 분석하고 숫자로 전환시켜 그래프상에 플롯팅한다. 상기 화합물이 완전히 용해된 것으로 보이는 첫 번째 농도는 하기에 보고된 농도이나, 진정한 농도는 상기 농도와 보다 높은 하나의 희석 단계 사이의 어딘가에 놓일 것이다.
상기 프로토콜에 따라 측정된 용해도값을 ㎍/㎖로 보고한다.
7.3. 혈장 단백질 결합(평형 투석)
DMSO 중의 상기 화합물의 10 mM 모액을 DMSO에서 인자 5로 희석한다. 상기 용액을 새로 해동시킨 인간, 래트, 마우스 또는 개 혈장(바이오리클레메이션(BioReclamation) INC) 중에서 5 μM의 최종 농도 및 0.5%의 최종 DMSO 농도로 추가로 희석한다(PP-마스터블록 96 웰(그레이너, 카탈로그 번호 780285)에서 1094.5 ㎕ 혈장 중 5.5 ㎕).
삽입물이 있는 피어스 레드 디바이스(Pierce Red Device)(써모 사이언티픽, 카탈로그 번호 89809)를 준비하고 완충제 챔버에 750 ㎕ PBS 및 혈장 챔버에 500 ㎕의 스파이크 혈장을 충전시킨다. 상기 플레이트를 230 rpm에서 진탕시키면서 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한다. 배양후, 상기 두 챔버 모두의 120 ㎕를 96-웰 환저, PP 깊은 웰 플레이트(Nunc, 카탈로그 번호 278743) 중의 360 ㎕ 아세토나이트릴로 옮기고 알루미늄 호일 뚜껑으로 밀봉한다. 상기 샘플을 혼합하고 얼음상에 30 분간 둔다. 이어서 상기 플레이트를 1200 rcf에서 4 ℃에서 30 분 원심분리하고 상등액을 LC-MS상에서의 분석을 위해 96 v-바닥 PP 플레이트(그레이너, 651201)로 옮긴다.
상기 플레이트를 www.kinesis.co.kr의 밀봉 매트(MA96RD-04S)로 밀봉하고 샘플을 실온에서 콴옵티파이즈를 사용하여 최적화된 조건하에서 LC-MS(ZQ 1525, 워터스)상에서 측정하여 상기 분자의 적합한 질량을 측정한다.
상기 샘플을 1 ㎖/분의 유량으로 LC-MS 상에서 분석한다. 용매 A는 15 mM 암모니아이고 용매 B는 아세토나이트릴이다. 상기 샘플을 엑스브리지 C18 3.5 μM(2.1 x 30 ㎜) 컬럼(워터스) 상에서 양이온 분무 하에 실행시킨다. 용매 구배는 2 분의 총 실행 시간을 가지며 5% B에서부터 95% B까지의 범위이다.
상기 완충제 챔버 및 혈장 챔버 중의 화합물로부터의 피크 면적은 100% 화합물인 것으로 간주된다. 혈장에 결합된 백분율이 상기 결과로부터 유도되며 이를 혈장에 결합된 백분율로서 보고한다.
PBS 중 최종 시험 농도의 화합물의 용해도를 현미경에 의해 검사하여 침전의 관찰 여부를 나타낸다.
7.4. 알데하이드 옥시다제 안정성
DMSO 중의 시험 화합물의 10 mM 모액을 먼저 물(5배)로 희석하여 50 μM 작용 용액을 수득한다. 알데하이드 옥시다제(하이드라라진)의 선택성 억제제를 5 mM 용액으로서 수중에서 제조한다.
10 ㎕의 간 S9 현탁액(인간 및 래트, BD 바이오사이언스 젠테스트(Gentest), 20 ㎎/㎖)을 86 ㎕의 50 mM 칼륨 포스페이트 완충제, pH 7.4에 37 ℃에서 가하여 배양 혼합물을 제조한다. 2 ㎕의 5 mM 하이드라라진을 가하거나(선택성 억제제의 첨가와 함께 배양하는 경우) 또는 2 ㎕의 물(상기 억제제의 첨가 없이 배양하는 경우)을 가한다.
5분의 예온 후에, 2 ㎕의 50 μM 시험 화합물을 상기 배양 혼합물에 가하여 상기 반응을 개시시킨다. 0, 3, 6, 12, 18 및 30분의 배양 후에, 상기 반응(100 ㎕)을 분석 내부 표준으로서 10 ng/㎖의 와파린을 함유하는 1% 아세트산 혼합물과 함께, 300 ㎕의 MeCN:MeOH(2:1)로 종료시킨다.
샘플들을 혼합하고, 원심분리시키고, 상등액을 LC-MS에 의해 분석한다.
시험 화합물은, S9에 의한 제거가 하이드라라진에 의해 억제되는 경우 알데하이드 옥시다제의 기질로서 간주된다. 시험 화합물의 종 특이성 제거는 또한 알데하이드 옥시다제에 의한 대사를 암시할 수 있다.
프탈라진을 양성 대조용으로서 포함시킨다.
장비 응답(시험 화합물과 내부 표준의 피크 면적비)을, 남아있는 화합물의 비율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서 간주됨)에 기준한다. 상기 남아있는 시험 화합물의 비율의 플롯을 사용하여, 그래프패드 프리즘 소프트웨어로 상기 S9 배양에서의 반감기(T½) 및 고유 제거율을 측정한다.
시험관내 고유 제거율(CLint(㎕/분/㎎))을 계산하기 위해서, 하기의 식을 사용한다:
CLint = (0.693/T½) x (배양 부피/단백질량) x 1000
7.5. 간 마이크로솜 안정성
DMSO 중의 화합물의 10 mM 모액을 96 깊은 웰 플레이트(그레이너, 카탈로그 번호 780285)에서 105 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4에서 6 μM로 희석하고 37 ℃에서 예온한다.
700 U/㎖의 글루코스-6-포스페이트-데하이드로게나제(G6PDH, 롯슈, 10127671001) 작용 모액을 105 mM 포스페이트 완충제 pH 7.4 중에서 인자 1:700으로 희석한다. 0.528 M MgCl2.6H2O(시그마, M2670), 0.528 M 글루코스-6-포스페이트(시그마, G-7879) 및 0.208 M NADP+(시그마, N-0505)를 함유하는 보조인자 혼합물을 105 mM 포스페이트 완충제, pH 7.4 중에서 인자 1:8로 희석한다.
1 ㎎/㎖의 관심 종(인간, 마우스, 래트, 개...)의 간 마이크로솜(제노테크), 0.8 U/㎖ G6PDH 및 보조인자 혼합물(6.6 mM MgCl2, 6.6 mM 글루코스-6-포스페이트, 2.6 mM NADP+)를 함유하는 작용 용액을 제조한다. 상기 혼합물을 실온에서 15 분간 예비배양하나, 결코 20 분을 넘어서는 안 된다.
예비 배양후, 화합물 희석물 및 상기 마이크로솜을 함유하는 혼합물을 함께 동량으로 가하고 300 rpm에서 30 분간 배양한다. 0 분의 시점에 대해서 2 부피의 MeOH를 상기 화합물 희석물에 가한 후 상기 마이크로솜 혼합물을 가한다. 배양 중 최종 농도는 3 μM 화합물 또는 대조용 화합물, 0.5 ㎎/㎖ 마이크로솜, 0.4 U/㎖ G6PDH, 3.3 mM MgCl2, 3.3 mM 글루코스-6-포스페이트 및 1.3 mM NADP+이다.
배양 30 분 후에, 상기 반응을 2 부피의 MeOH로 정지시킨다.
상기 두 시점 모두에서, 샘플들을 혼합하고, 원심분리하고, 상등액을 LC-MS/MS상에서의 분석을 위해 수확한다. 장비 반응(즉 피크 높이)을, 남은 화합물의 백분율을 측정하기 위해서 0 시점 샘플(100%로서)에 대해 참조한다. 표준 화합물 프로판올올 및 베라파밀을 상기 분석 설계에 포함시킨다.
마이크로솜 안정성에 대한 데이터를 30 분 후에 남은 화합물의 총량의 백분율로서 나타낸다.
7.6. 간세포 안정성
간세포에서의 대사 제거율을 평가하기 위한 모델이 문헌[McGinnity et al., Drug Metabolism and Disposition 2008, 32, 11, 1247]에 개시되어 있다.
7.7. Caco2 침투성
양방향 Caco-2 분석을 하기에 개시하는 바와 같이 수행한다. Caco-2 세포를 유러피언 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC, cat 86010202)로부터 수득하고 이를 24-웰 트랜스웰 플레이트(피셔 TKT-545-020B)에서 21 일 세포 배양 후에 사용한다.
2 x 105 세포/웰을 DMEM + GlutaMAXI + 1% NEAA + 10% FBS(페이탈클론(FetalClone) II) + 1% Pen/Strep으로 이루어진 도말 배지에 시딩한다. 상기 배지를 매 2 내지 3일마다 교환한다.
시험 및 비교 화합물(프로프라놀올 및 로다민 123 또는 빈블라스틴, 모두 시그마로부터 구입하였다)을 25 mM HEPES(pH 7.4)를 함유하는 행크의 균형 염 용액 중에서 제조하고 이를 0.25%의 최종 DMSO 농도로, 10 μM의 농도에서 상기 트랜스웰 플레이트 조립체의 정상(125 ㎕) 또는 측저(600 ㎕) 챔버에 가한다.
50 μM 루시퍼 옐로우(시그마)를 모든 웰 중의 공여 완충제에 가하여 루시퍼 옐로우 침투를 모니터함으로써 세포층의 통합성을 평가한다. 루시퍼 옐로우(LY)는 친지성 장벽을 자유롭게 침투할 수 없으므로, 높은 정도의 LY 운반은 상기 세포층의 불량한 통합성을 가리킨다.
150 rpm에서 궤도 진탕기에서 진탕시키면서 37 ℃에서 1 시간 배양 후에, 70 ㎕의 분액을 상기 정상(A) 및 기부(B) 챔버로부터 취하여 96 웰 플레이트 중에 분석 내부 표준(0.5 μM 카바마제핀)을 함유하는 100 ㎕의 50:50 아세토나이트릴:수 용액에 가한다.
루시퍼 옐로우를 측저 및 정상쪽으로부터의 액체 150 ㎕를 함유하는 깨끗한 96 웰 플레이트 중의 스펙트라맥스 제미니(Spectramax Gemini) XS(Ex 426 nm 및 Em 538 nm)로 측정한다.
상기 샘플들 중의 화합물의 농도를 고성능 액체-크로마토그래피/질량 분광학(LC-MS/MS)에 의해 측정한다.
겉보기 침투성(Papp) 값을 하기의 관계식으로부터 계산한다:
Papp = [화합물]수용체 최종 x V수용체/([화합물]공여체 초기 x V공여체)/Tinc x V공여체/표면적 x 60 x 10-6 ㎝/s
V = 챔버 부피
Tinc = 배양 시간.
표면적 = 0.33 ㎤
상기 정상 세포 표면으로부터 활성 유출의 지표로서 유출비를 PappB>A/Papp A>B의 비를 사용하여 계산한다.
하기의 분석 허용 기준을 사용한다:
프로프라놀올: Papp(A>B) 값 ≥ 20(x10-6 ㎝/s)
로다민 123 또는 빈블라스틴: Papp(A>B) 값 < 5(x10-6 ㎝/s), 유출비 ≥ 5.
루시퍼 옐로우 침투성: ≤ 100 ㎚/s
7.8. MDCKII-MDR1 침투성
MDCKII-MDR1 세포는 P-당단백질(P-gp)을 암호화하는, 인간 다중약물 내성(MDR1) 유전자를 과발현하는 마딘-달비 개 신장 상피세포이다. 세포를 네덜란드 암 연구소로부터 수득하며 24-웰 밀리셀(Millicell) 세포 배양 삽입물 플레이트(밀리포어, PSRP010R5)에서 3 내지 4일 세포 배양 후에 사용한다. 양방향 MDCKII-MDR1 침투성 분석을 하기에 개시하는 바와 같이 수행한다.
3 x 105 세포/㎖(1.2 x 105 세포/웰)을 DMEM + 1% 글루타맥스(Glutamax)-100 + 1% 항생제/항진균제 + 10% FBS(바이오웨스트(Biowest), S1810)로 이루어지는 도말 배지에 시딩한다. 세포를 CO2 배양기에 3 내지 4일간 둔다. 상기 배지를 시딩 후 24시간째 및 실험 당일에 교환한다.
시험 및 기준 화합물(암프레나비어 및 프로프라놀올)을 둘베코의 포스페이트 완충 염수(D-PBS, pH 7.4)에서 제조하고 상기 미니셀 세포 배양 삽입물 플레이트 조립체의 정상(400 ㎕) 또는 측저(800 ㎕) 챔버에 1%의 최종 DMSO 농도와 함께 10 μM(암프레나비어의 경우 0.5 μM)의 최종 농도로 가한다.
100 μM 루시퍼 옐로우(시그마)를, 루시퍼 옐로우 침투를 모니터함으로써 상기 세포 단층의 통합성을 평가하기 위해 모든 공여 완충제 용액에 가한다. 루시퍼 옐로우는 세포사이 경로에 대한 형광 마커이며 상기 분석 동안 밀착연접 통합성을 확인하기 위해서 모든 단층에 내부 대조용으로서 사용된다.
궤도 진탕기에서 150 rpm으로 진탕시키면서 37 ℃에서 1시간 배양 후에, 75 ㎕의 분액을 상기 정상(A) 및 기저(B) 챔버 모두로부터 취하고 96 웰 플레이트 중에 분석학적 내부 표준(10 ng/㎖ 와파린)을 함유하는 225 ㎕ 아세토나이트릴:수 용액(2:1)에 가한다. 분액을 공여 용액으로부터 상기 실험의 초기에 또한 수행하여 초기(Co) 농도를 획득한다.
상기 샘플 중 화합물의 농도를 고성능 액체-크로마토그래피/질량 분광학(LC-MS/MS)에 의해 측정한다.
루시퍼 옐로우를 모든 수령 웰들(측저 또는 정상부)로부터의 액체 150 ㎕를 함유하는 96 웰 플레이트에서 플루오로스캔 어센트 FL 써모 사이언티픽(Fluoroscan Ascent FL Thermo Scientific)(Ex 485 ㎚ 및 Em 530 ㎚)으로 측정한다.
7.9. 설치류에서 약동학 연구
7.9.1. 동물
스프래그-다우리 래트(수컷, 5 내지 6주된 것)를 장비에(Janvier)(프랑스소재)로부터 수득한다. 래트를 처리 전 적어도 7일 동안 환경에 순응시키고 12시간 명/암 주기(0700 - 1900)로 유지시킨다. 온도는 대략 22 ℃에서 유지시키고, 물과 먹이는 자유롭게 제공한다. 시험 화합물의 투여 2일 전에, 래트를 아이소플루란 마취하에서 경정맥 중에 카테터를 심는 수술을 수행하였다. 상기 수술 후에, 래트를 개별적으로 수용한다. 경구 투여 적어도 16시간 전 및 6시간 후에, 동물로부터 먹이를 빼앗는다. 물은 자유롭게 제공한다.
7.9.2. 약동학 연구
화합물을 정맥내 경로의 경우 PEG200/생리식염수(60/40) 및 경구 경로의 경우 0.5% 메틸셀룰로스 및 10% 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린 pH 3 중에서 제형화한다. 시험 화합물을 단일 식도 영양으로서 5 ㎎/㎏(5 ㎖/㎏의 투여 부피)으로 경구 투여하고 미정맥을 통한 일시주사로서 1 ㎎/㎏(5 ㎖/㎏의 투여 부피)으로 정맥내 투여한다. 각 그룹은 3마리 래트로 이루어졌다. 혈액 샘플을 경정맥을 통해, 리튬-헤파린을 응고방지제로서 사용하여 하기의 시점에서 채혈한다: 0.05, 0.25, 0.5, 1, 3, 5 및 8시간(정맥내 경로) 및 0.25, 0.5, 1, 3, 5, 8 및 24시간(경구 경로). 한편으로, 혈액 샘플을 후-안와 공동에서 리튬-헤파린을 응고방지제로서 사용하여 하기의 시점에서 채혈한다: 0.25, 1, 3 및 6시간(경구 경로). 전혈 샘플을 5000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고 생성되는 혈장 샘플을 분석시까지 -20 ℃에서 보관한다.
7.9.3. 혈장 중 화합물 수준의 정량분석
각 시험 화합물의 혈장 농도를 LC-MS/MS 방법에 의해 측정하며, 여기에서 질량 분광계는 양의 전기분무 방식으로 작동한다.
7.9.4. 약동학적 매개변수의 측정
약동학적 매개변수를 윈놀린(등록상표)(파사이트(등록상표), 미국 소재)을 사용하여 계산한다.
7.10. 7-일 래트 독성 연구
시험 화합물에 대한 7-일 경구 독성 연구를 스프래그-다우리 수컷 래트에서 5 ㎖/㎏/일의 일정한 투여량-부피로 위관영양에 의해, 100, 300 및 500 ㎎/㎏/일의 1일 용량으로 수행하여 그의 독성 가능성 및 독성약동학을 평가한다.
시험 화합물들을 정제수 중의 30%(v/v) HPβCD에서 제형화한다. 각 그룹은 독성약동학을 위해 5마리의 주 수컷 래트뿐만 아니라 3마리의 위성 동물을 포함하였다. 네 번째 그룹에게 동일한 빈도, 투여량 부피로, 단지 수중의 30%(v/v) HPβCD만을, 동일한 투여 경로에 의해 제공하며, 상기 그룹은 비히클 대조군으로서 작용한다.
상기 연구의 목적은 부작용을 생성시키지 않는 최저 용량(관찰 가능한 부작용 수준이 없다 - NOAEL)을 측정하기 위한 것이다.
7.11. QT 연장을 위한 책임
QT 연장의 가능성을 hERG 패치 클램프 분석에서 평가한다.
전-세포 패치-클램프 기록을 펄스 v8.77 소프트웨어(HEKA)에 의해 조절되는 EPC10 증폭기를 사용하여 수행한다. 일련의 저항은 전형적으로 10 MΩ 미만이며 60% 초과까지 보상되고, 기록은 누락 공제되지 않는다. 전극을 GC150TF 피펫 유리(하바드(Harvard))로부터 제조한다.
외부욕 용액은 135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 5 mM 글루코스, 10 mM HEPES, pH 7.4를 함유한다.
내부 패치 피펫 용액은 100 mM K-글루코네이트, 20 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM Na2ATP, 2 mM 글루타치온, 11 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7.2를 함유한다.
약물을 바이올로직(Biologic) MEV-9/EVH-9 고속 관류 시스템을 사용하여 관류시킨다.
모든 기록을 hERG 채널을 안정하게 발현하는 HEK293 세포상에서 수행한다. 세포를 2개의 백금 막대(굿펠로우(Goodfellow))를 사용하는 기록 챔버에 고정된 12 ㎜ 둥근 커버슬립(저먼 글래스(German glass), 벨코(Bellco))상에서 배양한다. hERG 전류를 활성화 펄스를 사용하여 1000 m 동안 +40 mV로 발생시킨 다음 꼬리 전류 펄스로 2000 m 동안 -50 mV로 발생시키며, 유지 전위는 -80 mV이다. 펄스를 20초마다 적용하며 모든 실험을 실온에서 수행한다.
최종 소견
당해 분야의 숙련가들은 상기 설명이 사실상 예시적이고 설명적이며, 본 발명과 그의 바람직한 실시태양들을 예시하고자 함을 알 것이다. 통상적인 실험을 통해서, 숙련가는 본 발명의 진의로부터 이탈됨 없이 수행될 수 있는 명백한 변형 및 변화들을 인식할 것이다. 첨부된 청구의 범위 내에 있는 모든 상기와 같은 변형들을 포함시키고자 한다. 따라서, 본 발명을 상기 설명에 의해서가 아닌, 하기의 청구의 범위 및 그의 등가물들에 의해서 한정하고자 한다.
본 명세서에 인용된, 비제한적으로 특허 및 특허 출원을 포함한 모든 공보들은, 각각의 개별적인 공보가 마치 완전히 개시된 것처럼 본 발명에 참고로 인용됨을 구체적이고 개별적으로 가리키는 바와 같이 본 발명에 참고로 인용된다.
다양한 화합물들의 차별적인 세포 침투 능력과 같은 인자들이 시험관 내 생화학에서 화합물의 활성과 세포 분석 간의 불일치에 기여할 수도 있음은 물론이다.
본 출원에 제공되고 나타낸 바와 같은 본 발명 화합물들의 화학 명칭들 중 적어도 일부는 상업적으로 입수할 수 있는 화학물질 명명 소프트웨어 프로그램의 사용에 의해 자동화된 토대로 발생될 수 있으며 독립적으로 입증되지는 않았다. 이러한 기능을 수행하는 전형적인 프로그램은 오픈 아이 소프트웨어 인코포레이티드(Open Eye Software, Inc.)에 의해 판매되는 렉시켐(Lexichem) 명명 도구 및 MDL, Inc.에 의해 판매되는 오토놈(Autonom) 소프트웨어 도구를 포함한다. 상기 나타낸 화학물질 명칭 및 도시된 구조가 상이한 경우에, 상기 도시된 구조는 억제될 것이다.
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Claims (16)
- 하기 화학식 I에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염, 또는 용매화물, 또는 상기 약학적으로 허용 가능한 염의 용매화물:
화학식 I
상기 식에서,
R1은 H 또는 Me이고;
L1은 -NR2-; -O- 또는 -CH2-이고;
Cy는 페닐, 피리딘 또는 다이하이드로벤조다이옥신이고;
R2는 H 또는 C1-4 알킬이고;
R3은 H, 할로, 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알킬, 또는 하나 이상의 할로로 임의로 치환된 C1-4 알콕시이고;
R4는 H 또는 할로이고;
R5는 -CN, 할로이거나, 또는 -L2-R6이고;
-L2는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)NR7-, -NR7C(=O)-, -SO2-, -SO2NR7-, 또는 -NR7SO2-이고;
R6은 H, 또는 하나 이상의 독립적으로 선택된 R8 기로 임의로 치환된 C1-6 알킬이고;
R7은 H 또는 C1-4 알킬이고;
R8은 OH, CN, 할로 또는 C1-4 알콕시이고;
La는 존재하지 않거나, 또는 -C(=O)-, -C(=O)O- 또는 -C(=O)NH-이고;
Ra는
- H,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rb로 임의로 치환된 C1-4 알킬,
- 하나 이상의 독립적으로 선택된 Rc로 임의로 치환된 C3-7 모노사이클릭 사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬, 또는
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 5 내지 6원 모노사이클릭 헤테로아릴이고;
Rb는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알콕시,
- C3-7 사이클로알킬,
- O, N 및 S 중에서 독립적으로 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하는 4 내지 7원 모노사이클릭 헤테로사이클로알킬(상기 헤테로사이클로알킬은 하나 이상의 독립적으로 선택된 할로, 또는 옥소로 임의로 치환된다),
- -SO2-C1-4 알킬, 또는
- -C(=O)NRb1Rb2이고
Rc는
- 할로,
- CN,
- OH,
- C1-4 알킬,
- -C(=O)OH, 또는
- -C(=O)NRc1Rc2이고;
각각의 Rb1, Rb2, Rc1 및 Rc2는 H 및 C1-4 알킬 중에서 독립적으로 선택된다. - 제 1 항에 있어서,
R1이 Me인 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염. - 제 1 항에 있어서,
하기 화학식 IIa, IIb 또는 IIc에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
상기 식들에서, L1, R3, R4, La, Ra 및 R5는 제 1 항에 개시된 바와 같다. - 제 1 항에 있어서,
하기 화학식 IVa, IVb, IVc, IVd, IVe 또는 IVf에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
상기 식들에서, R3, R4, R5, La 및 Ra는 제 1 항에 개시된 바와 같다. - 제 1 항에 있어서,
하기 화학식 Va, Vb, Vc, Vd, Ve 또는 Vf에 따른 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염:
상기 식들에서, R3, R4, R5 및 Ra는 제 1 항에 개시된 바와 같다. - 제 1 항에 있어서,
R4가 H, F 또는 Cl인 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염. - 제 1 항에 있어서,
R3가 H, Me 또는 Et인 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염. - 제 1 항에 있어서,
R5가 CN, F, Cl, -SO2Me 또는 -SO2Et인 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염. - 제 1 항에 있어서,
Ra가
인 화합물 또는 약학적으로 허용 가능한 염. - 제 1 항에 있어서,
(1R,2R)-N-[6-[(6-시아노-4-메틸-3-피리딜)옥시]-1-메틸-벤즈이미다졸-4-일]-2-플루오로-사이클로프로판카복스아미드인 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염. - 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 알러지성 질병, 류마티스성 관절염, 골관절염, 아동 특발성 관절염, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 알러지성 기도 질병, 만성 폐쇄성 폐질환, 궤양성 대장염, 크론병, 천식, 전신 홍반성 루프스, Ⅰ형 당뇨병, 이식 거부, 연골 턴오버의 장애를 수반하는 질병 또는 선천성 연골 기형의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
- 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 캐슬만병, 다발성 골수종, 건선, 카포시 육종 또는 혈관사이세포 증식성 사구체신염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
- 약학적으로 허용 가능한 담체 및 약학적으로 유효한 양의, 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는, 전신 및 피부 홍반성 루푸스, 루푸스 신염, 피부근염, 쇼그렌 증후군, 건선 또는 류마티스성 관절염의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 약학 조성물.
- 삭제
- 삭제
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