TW201336844A - 可用於治療退化及發炎疾病之新穎化合物 - Google Patents

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Abstract

□本發明揭示能夠抑制JAK之根據式I之新穎咪唑并吡啶，該化合物可製備成醫藥組合物形式，且可用於預防及治療包括人類在內之哺乳動物的多種病況，該等病況之非限制性實例包括過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關的疾病。

Description

可用於治療退化及發炎疾病之新穎化合物
本發明係關於作為JAK抑制劑之化合物，JAK為酪胺酸激酶家族，涉及於過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病中。具體而言，本發明化合物抑制JAK1及/或JAK2。本發明亦提供用於製備本發明化合物之方法、包含本發明化合物之醫藥組合物，藉由投與本發明化合物來預防及/或治療疾病之方法，該等疾病涉及過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
傑納斯激酶(Janus kinase，JAK)為細胞質酪胺酸激酶，其將細胞因子信號自膜受體轉導至STAT轉錄因子。已描述四個JAK家族成員，即JAK1、JAK2、JAK3及TYK2。在細胞因子結合至其受體後，JAK家族成員發生自體磷酸化及/或相互轉磷酸化，隨後STAT磷酸化，接著遷移至核以調節轉錄。JAK-STAT細胞內信號轉導服務於干擾素、大部分介白素以及多種細胞因子及內分泌因子，諸如EPO、TPO、GH、OSM、LIF、CNTF、GM-CSF及PRL(Vainchenker W.等人(2008))。
遺傳模型與小分子JAK抑制劑研究之組合揭露了若干JAK之治療 潛力。JAK3係以小鼠及人類遺傳學作為免疫抑制目標來驗證(O'Shea J.等人(2004))。JAK3抑制劑成功地進入臨床開發中，最初用於器官移植物排斥反應，而稍後亦用於其他免疫發炎適應症，諸如類風濕性關節炎(RA)、牛皮癬及克隆氏病(Crohn's disease)(http：//clinicaltrials.gov/)。
TYK2為免疫發炎疾病之潛在目標，此藉由人類遺傳學及小鼠基因剔除研究得到驗證(Levy D.及Loomis C.(2007))。
JAK1為免疫發炎疾病領域中的一個目標。JAK1與其他JAK形成異二聚體，以轉導由細胞因子驅動之促發炎信號傳導。因此，對於因使用JAK1信號傳導之病理相關性細胞因子(諸如IL-6、IL-4、IL-5、IL-12、IL-13、IL-23或IFNγ)引起之免疫發炎疾病以及對於由JAK介導之信號轉導所驅動之其他疾病而言，抑制JAK1係值得關注的。
軟骨退化係多種疾病之標誌，在該等疾病中，類風濕性關節炎及骨關節炎係最突出的。類風濕性關節炎(RA)為一種慢性關節退化疾病，以關節結構之炎症及破壞為特徵。若該疾病不作檢查，則其會因關節功能喪失而導致實質性失能及疼痛，甚至是過早死亡。因此，RA療法之目標不僅為減慢該疾病，而且亦實現症狀緩解，以便停止關節破壞。除疾病後果之嚴重性外，RA之高流行率(全世界約0.8%之成人受到影響)亦意味著高社會經濟學影響。(有關RA之評述，參考Smolen及Steiner(2003)；Lee及Weinblatt(2001)；Choy及Panayi(2001)；O'Dell(2004)及Firestein(2003))。
JAK1及JAK2牽涉於許多細胞因子及激素之細胞內信號轉導。與該等細胞因子及激素中任一者相關之病理學可藉由JAK1及JAK2抑制劑改善。因此，若干過敏症、炎症及自體免疫病症可能得益於用本發明中所述之化合物進行的治療，包括類風濕性關節炎、全身性紅斑狼 瘡、青少年特發性關節炎、骨關節炎、哮喘、慢性阻塞性肺病COPD、組織纖維化、嗜伊紅血球炎症、食道炎、發炎性腸病(例如克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、移植、移植物抗宿主疾病、牛皮癬、肌炎、多發性硬化(Kopf等人，2010)。
骨關節炎(又稱為OA，或磨損又撕裂之關節炎)係最常見之關節炎形式，且以關節炎軟骨喪失，通常伴隨骨肥大及疼痛為特徵。有關骨關節炎之詳盡評述，參考Wieland等人(2005)。
骨關節炎很難治療。目前，沒有可用之治癒方法，且治療集中在減輕疼痛及防止受影響之關節變形。常見的治療包括使用非類固醇消炎藥(NSAID)。儘管已經提出諸如軟骨素及硫酸葡糖胺之膳食增補劑作為治療骨關節炎之安全且有效的選擇，但近期的臨床試驗揭露，兩種治療均無法減輕與骨關節炎相關之疼痛。(Clegg等人，2006)。
刺激合成代謝過程、阻斷分解代謝過程或該兩者之組合可使軟骨穩定，且甚至可能逆轉損害，並因此防止該疾病之進一步進展。已經開發用於補救在骨關節炎疾病期間出現之關節軟骨病變的治療方法，但截至目前，尚無方法能夠在原位及在活體內介導關節軟骨之再生。總體而言，沒有可用的緩和疾病之骨關節炎藥物。
Vandeghinste等人(WO 2005/124342)發現了作為目標之JAK1，其抑制可能適於治療包括OA在內之若干疾病。小鼠體內JAK1基因之基因剔除證實，JAK1在發育期間起到至關重要且必不可少的作用：JAK1-/-小鼠在出生後24小時內死亡且淋巴細胞發育嚴重受損。此外，JAK1 -/-細胞對利用II型細胞因子受體、利用γ-c次單元進行信號傳導之細胞因子受體及利用gp130次單元進行信號傳導之細胞因子受體家族的細胞因子無反應性或反應性較低(Rodig等人，1998)。
各種團體已牽涉軟骨細胞生物學中之JAK-STAT信號傳導。Li等人(2001)顯示，制瘤素M(Oncostatin M)藉由活化JAK/STAT及MAPK 信號傳導路徑來誘導原代軟骨細胞中之MMP及TIMP3基因表現。Osaki等人(2003)顯示，軟骨細胞中干擾素-γ介導之膠原蛋白II抑制涉及JAK-STAT信號傳導。IL1-β藉由減少基質組分之表現，並且藉由誘導膠原蛋白酶及介導一氧化氮(NO)產生之誘導型一氧化氮合成酶(NOS2)的表現來誘導軟骨分解代謝。Otero等人(2005)顯示，瘦素與IL1-β協同性地誘導軟骨細胞中NO之產生或NOS2 mRNA之表現，且該作用被JAK抑制劑阻斷。Legendre等人(2003)顯示，IL6/IL6受體誘導牛關節軟骨細胞中軟骨特異性基質基因膠原蛋白II、聚集蛋白聚糖核心及連接蛋白之下調，且此係由JAK/STAT信號傳導所介導。因此，該等觀察結果表明了JAK激酶活性在軟骨動態平衡中之作用及JAK激酶抑制劑之治療可能。
JAK家族成員已牽涉於已鑑別出JAK2之突變的其他病況中，包括脊髓增生性病症(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol.44(10)：2497-506)。此指明，JAK，特別是JAK2之抑制劑亦可用於治療脊髓增生性病症。此外，JAK家族，特別是JAK1、JAK2及JAK3已關聯到癌症，特別是白血病，例如急性骨髓白血病(O'Sullivan等人，2007,Mol Immunol.44(10)：2497-506；Xiang等人，2008,「Identification of somatic JAK1 mutations in patients with acute myeloid leukemia」Blood First Edition Paper，線上預先出版，2007年12月26日；DOI 10.1182/blood-2007-05-090308)及急性淋巴母細胞白血病(Mullighan等人，2009)；或實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤(Constantinescu等人，2007,Trends in Biochemical Sciences 33(3)：122-131)、***癌(Tam等人，2007,British Journal of Cancer,97,378-383)。該等結果指出，JAK，特別是JAK1及/或JAK2之抑制劑亦可用於治療癌症(白血病，及實體腫瘤，例如子宮平滑肌肉瘤、***癌)。
此外，卡斯爾曼氏病(Castleman's disease)、多發性骨髓瘤、系膜 增生性腎小球腎炎、牛皮癬及卡堡氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)可能歸因於細胞因子IL-6之分泌過多，該細胞因子IL-6之生物作用係由細胞內JAK-STAT信號傳導所介導(Tetsuji Naka,Norihiro Nishimoto及Tadamitsu Kishimoto,Arthritis Res 2002,4(增刊3)：S233-S242)。此結果顯示，JAK之抑制劑亦可用於治療該等疾病。
當前之療法不能令人滿意且因此，仍然需要鑑別出可用於治療過敏症、發炎及自體免疫病症、增生性病症及退化性關節疾病，例如骨關節炎、類風濕性關節炎及骨質疏鬆症，特別是骨關節炎及類風濕性關節炎之其他化合物。因此，本發明提供化合物、其製造方法以及包含本發明化合物及適合醫藥載劑之醫藥組合物。本發明亦提供本發明化合物之用途，其用於製備供治療過敏症、發炎及自體免疫病症、增生性病症及退化性關節疾病，例如骨關節炎、類風濕性關節炎及骨質疏鬆症，特別是骨關節炎及類風濕性關節炎之藥劑。
本發明係基於發現本發明化合物能夠充當JAK之抑制劑，且其可用於治療過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。在一個特定態樣中，本發明化合物為JAK1及/或JAK2之抑制劑。本發明亦提供用於製備該化合物之方法、包含該化合物之醫藥組合物，及藉由投與本發明化合物來治療以下疾病之方法：過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
因此，在本發明之第一態樣中，提供具有式(I)之本發明化合物：
在一個特定實施例中，本發明化合物為JAK1及/或JAK2之抑制劑。
在一個更特定的實施例中，具有該抑制作用之化合物以至少9倍於其他JAK家族成員之選擇性抑制JAK1。
在另一態樣中，本發明提供醫藥組合物，其包含本發明化合物及醫藥載劑、賦形劑或稀釋劑。此外，可用於本文所揭示之醫藥組合物及治療方法中的本發明化合物之製備及使用形式為醫藥學上可接受的。在本發明之該態樣中，醫藥組合物可另外包含適於與本發明化合物組合使用之其他活性成分。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用作藥劑。在一個特定實施例中，該醫藥組合物另外包含另一活性成分。
在本發明之另一態樣中，本發明提供一種治療易患或罹患本文所列該等病況中之病況，且特別是可能與異常JAK活性相關之該等病況之哺乳動物的方法，該等病況例如為過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病，其中該方法包括投與有效量之如本文所述的醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該病況與異常JAK1及/或JAK2活性相關。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療或預防選自本文中所列之病況的病況，特別是可能與異常JAK活性有關之該 等病況，例如過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關的疾病。
在治療態樣之另一方法中，本發明提供一種用於治療易患或罹患如本文中所述的病因與異常JAK活性有關之病況之哺乳動物的方法，並且包括投與有效治療病況或預防病況之量的本文中所述的醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定態樣中，該病況之病因與異常JAK1及/或JAK2活性相關。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用作藥劑。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療或預防病因與異常JAK活性有關之病況。
在其他態樣中，本發明提供用於合成本發明化合物之方法，其中代表性合成方案及路徑將稍後於本文中揭示。
因此，本發明的一個主要目的係提供一種新穎化合物，其可改變JAK活性並由此預防或治療病因可能與之有關的任何病況。在一個特定態樣中，本發明化合物調節JAK1及/或JAK2之活性。
本發明另一目的係提供可治療或減輕病因可能與JAK、特別是JAK1及/或JAK2之活性有關之病況或其症狀的化合物，該等病況諸如為過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關的疾病。
本發明又一目的係提供一種醫藥組合物，其可用於治療或預防多種病況，包括與JAK活性有關之疾病，諸如過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關的疾病。在一 個特定實施例中，該疾病與JAK1及/或JAK2活性相關。
熟習此項技術者自考慮以下詳細說明之描述將對其他目的及益處顯而易知。
定義
以下術語意欲具有下文隨之所提供之含義並且可用於瞭解本發明之描述及預定範疇。
當對可包括化合物、含有該等化合物之醫藥組合物及使用該等化合物及組合物之方法的本發明進行描述時，除非另作指示，否則以下術語(若存在)具有以下含義。亦應瞭解，當本文中描述時，以下所定義之任何部分可經多種取代基取代，且各別定義意欲包括在如下文陳述之範疇內的該等經取代部分。除非另作規定，否則術語「經取代」將如下文陳述進行定義。還應瞭解，術語「基團(groups)」與「基團(radicals)」當在本文中使用時可視為可互換的。
冠詞「一個(種)(a)」及「一個(種)(an)」在本文中可用於指一個或一個以上(亦即，至少一個)該冠詞之語法賓語。舉例而言，「一種類似物」意謂一種類似物或一種以上類似物。
如本文中所用，術語「JAK」係關於傑納斯激酶(JAK)之家族，其為細胞質酪胺酸激酶，用以將細胞因子信號自膜受體轉導至STAT轉錄因子。描述了四個JAK家族成員：JAK1、JAK2、JAK3及TYK2，且術語JAK可統指所有JAK家族成員，或指一或多個JAK家族成員，如上下文所指示。
「醫藥學上可接受」意謂聯邦或州政府之管理機構或除美國以外之國家中之相應機構所批准或可批准的，或被列於美國藥典或其他 一般認可之藥典中適用於動物且更特定地用於人類的。
「醫藥學上可接受之鹽」係指醫藥學上可接受的且具有母體化合物之所需藥理學活性的本發明化合物之鹽。特定言之，該等鹽為無毒的，可為無機或有機酸加成鹽及鹼加成鹽。具體言之，該等鹽包括：(1)與無機酸形成之酸加成鹽，該等無機酸諸如為鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸及其類似酸；或與有機酸形成之酸加成鹽，該等有機酸諸如為乙酸、丙酸、己酸、環戊烷丙酸、乙醇酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、蘋果酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、酒石酸、檸檬酸、苯甲酸、3-(4-羥基苯甲醯基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲烷磺酸、乙烷磺酸、1,2-乙烷-二磺酸、2-羥基乙烷磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟腦磺酸、4-甲基雙環[2.2.2]-辛-2-烯-1-甲酸、葡糖庚酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、第三丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、麩胺酸、羥基萘酸、水楊酸、硬脂酸、黏康酸及其類似酸；或(2)當母體化合物中存在之酸性質子經金屬離子(例如鹼金屬離子、鹼土金屬離子或鋁離子)置換或與有機鹼(諸如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺及其類似鹼)配位時所形成的鹽。僅舉例而言，鹽進一步包括鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨及其類似物；且當該化合物含有鹼性官能基時，無毒有機或無機酸之鹽，諸如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、乙酸鹽、順丁烯二酸鹽、草酸鹽及其類似鹽。術語「醫藥學上可接受之陽離子」係指酸性官能基之可接受之陽離子型抗衡離子。該等陽離子之實例為鈉、鉀、鈣、鎂、銨、四烷基銨陽離子及其類似陽離子。
「醫藥學上可接受之媒劑」係指與本發明化合物一起投與之稀釋劑、佐劑、賦形劑或載劑。
「前藥」係指具有可裂解基團且藉由溶劑分解作用或在活體內在生理條件下變為具有醫藥活性之本發明化合物的化合物，包括本發 明化合物之衍生物。該等實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物、N-烷基嗎啉酯及其類似物。
「溶劑合物」係指通常藉由溶劑分解反應而與溶劑締合之化合物形式。此物理締合包括氫鍵接。習知之溶劑包括水、乙醇、乙酸及其類似溶劑。本發明化合物可製備成(例如)結晶形式且可經溶劑化或水化。適合的溶劑合物包括醫藥學上可接受之溶劑合物，諸如水合物，且進一步包括化學計量之溶劑合物與非化學計量之溶劑合物兩者。在某些情況下，溶劑合物將能夠分離，例如當一或多個溶劑分子併入結晶固體之晶格中時。「溶劑合物」涵蓋溶液相與可分離溶劑合物兩者。代表性溶劑合物包括水合物、乙醇合物及甲醇合物。
「個體」包括人類。術語「人類」、「患者」與「個體」在本文中可互換使用。
「治療有效量」意謂當投與個體以治療疾病時足以實現該針對疾病之治療的化合物量。「治療有效量」可取決於化合物、疾病及其嚴重程度，以及欲治療個體之年齡、體重等而變化。
「預防(Preventing)」或「預防(Prevention)」係指降低患上或發生一種疾病或病症之風險(亦即，在疾病發作前，使可能暴露於致病因素或易患該疾病之個體不發生該疾病之至少一種臨床症狀)。
術語「預防」與「預防」相關，且指達到預防而非治療或治癒疾病之目的的措施或程序。預防措施之非限制性實例可包括投與疫苗；對例如因不動而有患血栓症風險之住院患者投與低分子量肝素；以及在訪問瘧疾盛行或感染瘧疾之風險較高的地理區域前，投與抗瘧疾藥，諸如氯喹。
在一個實施例中，任何疾病或病症之「治療(Treating)」或「治療(Treatment)」係指改善該疾病或病症(亦即，停滯該疾病或減少其至少一種臨床症狀之表現、程度或嚴重性)。在另一實施例中，「治療 (Treating)」或「治療(Treatment)」係指改善至少一項個體可能無法辨別之身體參數。在又一實施例中，「治療(Treating)」或「治療(Treatment)」係指在身體上(例如使可辨別之症狀穩定)、生理上(例如使身體參數穩定)或兩方面調節疾病或病症。在另一實施例中，「治療(Treating)」或「治療(Treatment)」係關於減慢疾病之進展。
如本文中所用，術語「過敏症」係指一組以免疫系統之過敏性病症為特徵的病況，包括過敏性呼吸道疾病(例如哮喘、鼻炎)、竇炎、濕疹及蕁麻疹，以及食物過敏症或對昆蟲毒素過敏。
如本文中所用，術語「發炎病況」係指這樣一組病況，其包括類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年特發性關節炎、牛皮癬、牛皮癬性關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘、鼻炎)、發炎性腸病(例如克隆氏病、潰瘍性結腸炎)、內毒素引發之疾病狀態(例如繞通手術後之併發症或例如引起慢性心臟衰竭之長期內毒素狀態)，及涉及軟骨(諸如關節軟骨)之相關疾病。特定言之，該術語係指類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘)及發炎性腸病。
如本文中所用，術語「自體免疫疾病」係指這樣一組疾病，其包括阻塞性呼吸道疾病(包括諸如COPD之病況)、哮喘(例如內源性哮喘、外因性哮喘、粉塵性哮喘、幼兒哮喘)，特別是慢性或頑固性哮喘(例如老年哮喘及呼吸道高反應性)、支氣管炎(包括支氣管哮喘)、全身性紅斑狼瘡(SLE)、皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、休格連氏症候群(Sjogren's syndrome)、多發性硬化、牛皮癬、乾眼病、I型糖尿病及與之相關之併發症、異位性濕疹(異位性皮膚炎)、接觸性皮膚炎及其他濕疹性皮膚炎、發炎性腸病(例如，克隆氏病及潰瘍性結腸炎)、動脈粥樣硬化及肌萎縮性側索硬化。特定言之，該術語係指COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病及發炎性腸病。
如本文中所用，術語「增生性疾病」係指以下病況：諸如癌症 (例如子宮平滑肌肉瘤或***癌)、脊髓增生性病症(例如真性紅血球增多症、原發性血小板增多症及脊髓纖維化)、白血病(例如急性骨髓白血病、急性及慢性淋巴母細胞白血病)、多發性骨髓瘤、牛皮癬、再狹窄、硬皮病或纖維化。特定言之，該術語係指癌症、白血病、多發性骨髓瘤及牛皮癬。
如本文中所用，術語「癌症」係指皮膚中或身體器官(例如(但不限於)***、***、肺、腎、胰腺、胃或腸)中細胞之惡性或良性生長。癌症傾向於浸潤至相鄰組織中且擴散(轉移)至遠端器官，例如骨骼、肝、肺或腦。如本文中所用，術語癌症包括轉移性腫瘤細胞類型，諸如(但不限於)黑素瘤、淋巴瘤、白血病、纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤及肥大細胞瘤；及組織癌症類型，諸如(但不限於)結腸直腸癌、***癌、小細胞肺癌及非小細胞肺癌、乳癌、胰腺癌、膀胱癌、腎癌、胃癌、神經膠母細胞瘤、原發性肝癌、卵巢癌、***癌及子宮平滑肌肉瘤。
如本文中所用，術語「白血病」係指血液及生血器官之贅生性疾病。該等疾病可引起骨髓及免疫系統功能失常，從而使得宿主特別易於感染及出血。特定言之，術語白血病係指急性骨髓白血病(AML)，以及急性淋巴母細胞白血病(ALL)及慢性淋巴母細胞白血病(CLL)。
如本文中所用，術語「移植排斥反應」係指例如胰島、幹細胞、骨髓、皮膚、肌肉、角膜組織、神經元組織、心臟、肺、聯合心肺、腎、肝、腸、胰腺、氣管或食管之細胞、組織或實體器官同種異體移植物或異種移植物的急性或慢性排斥反應，或者移植物抗宿主疾病。
如本文中所用，術語「涉及軟骨代謝減弱之疾病」包括諸如以下病況：骨關節炎、牛皮癬性關節炎、青少年類風濕性關節炎、痛風 性關節炎、敗血性或感染性關節炎、反應性關節炎、反射***感神經萎縮症、反射***感神經營養不良症、蒂策氏症候群(Tietze syndrome)或肋軟骨炎、肌肉纖維疼痛、骨軟骨炎、神經性或神經病性關節炎、關節病、關節炎之變形性形式如地方性變形性骨關節炎、姆塞萊尼氏病(Mseleni disease)及杭迪度氏病(Handigodu disease)；由肌肉纖維疼痛引起的退化、全身性紅斑狼瘡、硬皮病及僵直性脊椎炎。
如本文中所用，術語「先天性軟骨畸形」包括諸如以下病況：遺傳性軟骨溶解、軟骨營養不良及假性軟骨營養不良，特別是(但不限於)小耳症、無耳、幹骺端軟骨營養不良及相關病症。
如本文中所用，術語「與IL6分泌過多有關之疾病」包括諸如以下病況：卡斯爾曼氏病、多發性骨髓瘤、牛皮癬、卡堡氏肉瘤及/或系膜增生性腎小球腎炎。
如本文中所用，術語「與干擾素分泌過多有關之疾病」包括諸如以下病況：全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、休格連氏症候群、牛皮癬、類風濕性關節炎。
「本發明化合物」及等效之表述意欲包含如本文所述之式之化合物，該表述包括醫藥學上可接受之鹽，及溶劑合物(例如水合物)及醫藥學上可接受之鹽之溶劑合物(在上下文容許之情況下)。類似地，提及中間物(不管是否主張其本身)在上下文容許之情況下意欲包含其鹽及溶劑合物。
當本文中提及範圍(例如(但不限於)C1-8烷基)時，對於一個範圍之引述應視為對該範圍中每一成員之陳述。
本發明化合物之其他衍生物中的酸及酸衍生物形式均具有活性，但酸敏感性形式常常提供在哺乳動物生物體中之溶解性、組織相容性或延遲釋放之優勢(參看，Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7- 9頁，第21-24頁，Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包括習此相關技藝之人士熟知之酸衍生物，諸如由母體酸與適合的醇反應所製備的酯，或由母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應所製備的醯胺，或酸酐，或混合酸酐。衍生自側接於本發明化合物上之酸性基團的簡單脂族或芳族酯、醯胺及酸酐為特別有用之前藥。在一些情況下，合意地製備雙酯型前藥，諸如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特定言之，該等前藥為本發明化合物之C1-8烷基酯、C2-8烯基酯、C6-10視情況取代之芳基酯，及(C6-10芳基)-(C1-4烷基)酯。
如本文中所用，術語「同位素變體」係指在構成化合物之一或多個原子處含有非天然比例之同位素的該化合物。舉例而言，化合物之「同位素變體」可含有一或多個非放射性同位素，諸如氘(2H或D)、碳-13(13C)、氮-15(15N)或其類似物。應瞭解，在進行此類同位素取代之化合物中，以下原子(若存在的話)可變化，由此例如任何氫可為2H/D，任何碳可為13C，或任何氮可為15N，且該等原子之存在及位置可在此項技術之技能範圍內確定。同樣，在例如所得到的化合物可用於藥物及/或基質組織分佈研究之情形中，本發明可包括用放射性同位素製備同位素變體。放射性同位素氚(亦即3H)及碳-14(亦即14C)由於易於併入性及現成偵測手段而特別適用於此目的。另外，可製備經正電子發射同位素(諸如11C、18F、15O及13N)取代之化合物，且其將適用於正電子發射斷層成像(PET)研究中，用於檢查受質受體佔有率。
本文提供之化合物之所有同位素變體無論為放射性抑或非放射性的，均意欲涵蓋在本發明之範疇內。
亦應瞭解，具有相同分子式但原子鍵接之性質或順序或者原子空間排列不同的化合物稱為「異構體」。原子空間排列不同之異構體稱為「立體異構體」。
不互為鏡像之立體異構體稱為「非對映異構體」，且彼此為不重疊鏡像之立體異構體稱為「對映異構體」。當一種化合物具有一個不對稱中心，例如其鍵接至四個不同基團時，可能為一對對映異構體。對映異構體可以其不對稱中心之絕對組態為特徵，且藉由Cahn及Prelog之R-及S-定序規則描述，或藉由分子旋轉偏光平面之方式描述且指定為右旋性或左旋性的(亦即，分別為(+)或(-)-異構體)。對掌性化合物可以個別對映異構體或以其混合物形式存在。含有相等比例之對映異構體的混合物稱為「外消旋混合物」。
「互變異構體」係指呈可互換形式之特定化合物結構且氫原子及電子之位移變化的化合物。因此，兩種結構可經由π電子及原子(通常為H)之移動而平衡。舉例而言，烯醇與酮為互變異構體，因為其藉由用酸或鹼處理而迅速相互轉變。互變異構現象之另一實例為苯基硝基甲烷之酸-及硝基-形式，同樣為藉由用酸或鹼處理而形成。
互變異構形式可與所關注化合物之最佳化學反應性及生物活性之獲得相關。
本發明化合物可具有一或多個不對稱中心；因此，該等化合物可製備為個別(R)-或(S)-立體異構體或其混合物形式。
除非另作指示，否則說明書及申請專利範圍中特定化合物之描述或命名意欲包括個別對映異構體及其外消旋或其他混合物。此項技術中熟知用於測定立體化學性及分離立體異構體之方法。
化合物
本發明係基於鑑別出本發明化合物為JAK之抑制劑，且其可用於治療過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。本發明亦提供用於製備本發明化合物之方法、包含本發明化合物之醫藥組合物，及藉由投與本發明化合物來治 療以下疾病之方法：過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形，及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。在一個特定實施例中，本發明化合物為JAK1及JAK2之抑制劑。
因此，在本發明之第一態樣中，揭示具有式(I)之本發明化合物：
在一個實施例中，本發明化合物不為同位素變體。
在一個態樣中，本發明化合物係以游離鹼形式存在。
在一個態樣中，本發明化合物為醫藥學上可接受之鹽。
在一個態樣中，本發明化合物為該化合物之溶劑合物。
在一個態樣中，本發明化合物為化合物之醫藥學上可接受之鹽的溶劑合物。
在某些態樣中，本發明提供根據上式之化合物之前藥及衍生物。前藥為本發明化合物之衍生物，其具有代謝可裂解之基團且藉由溶劑分解作用或在活體內在生理條件下變為具有醫藥活性之本發明化合物。該等實例包括(但不限於)膽鹼酯衍生物及其類似物、N-烷基嗎啉酯及其類似物。
本發明化合物之其他衍生物中的酸及酸衍生物形式均具有活性，但酸敏感性形式常常提供在哺乳動物生物體中之溶解性、組織相容性或延遲釋放之優勢(參看，Bundgard,H.,Design of Prodrugs，第7- 9頁，第21-24頁，Elsevier,Amsterdam 1985)。前藥包括習此相關技藝之人士熟知之酸衍生物，諸如由母體酸與適合的醇反應所製備的酯，或由母體酸化合物與經取代或未經取代之胺反應所製備的醯胺，或酸酐，或混合酸酐。衍生自側接於本發明化合物上之酸性基團的簡單脂族或芳族酯、醯胺及酸酐為較佳之前藥。在一些情況下，合意地製備雙酯型前藥，諸如(醯氧基)烷基酯或((烷氧基羰基)氧基)烷基酯。特別有用的為本發明化合物之C1至C8烷基酯、C2-C8烯基酯、芳基酯、C7-C12經取代芳基酯及C7-C12芳烷基酯。
本發明化合物為新穎JAK抑制劑。特定言之，該化合物為JAK1及/或JAK2之有效抑制劑；然而，其可以較低效力抑制TYK2及JAK3。
醫藥組合物
當用作醫藥時，本發明化合物通常係以醫藥組合物之形式投與。該等組合物可按醫藥領域中熟知之方式製備且包含至少一種活性化合物。一般而言，本發明化合物係以醫藥有效量投與。實際投與之化合物之量通常將由醫師根據相關情形確定，該等情形包括欲治療之病況；所選投藥途徑；所投與之實際化合物；個別患者之年齡、體重及反應；患者症狀之嚴重性，及其類似情形。
本發明之醫藥組合物可藉由多種途徑投與，包括口服、直腸、經皮、皮下、關節內、靜脈內、肌肉內及鼻內。取決於預定遞送途徑，本發明化合物較佳經調配為可注射或口服組合物形式，或調配為供經皮投與之油膏、洗液或貼片形式。
經口投與之組合物可呈散裝液體溶液或懸浮液或者散裝粉末之形式。然而，更常見的是，該等組合物係以單位劑型提供以有助於精確給藥。術語「單位劑型」係指適於以單一劑量用於人類個體及其他哺乳動物之物理離散單元，各單元含有經計算以產生所需治療效果之 預定量的活性物質，以及適合的醫藥賦形劑、媒劑或載劑。典型單位劑型包括具有液體組合物之預填充、預量測之安瓿或注射器，或者在固體組合物情況下為丸劑、錠劑、膠囊或其類似劑型。在該等組合物中，本發明化合物通常為微量組分(約0.1重量%至約50重量%或較佳為約1重量%至約40重量%)，且其餘部分為有助於形成所需給藥形式之各種媒劑或載劑及加工助劑。
適於經口投與的液體形式可包括適合的水性或非水性媒劑及緩衝劑、懸浮劑及分散劑、著色劑、調味劑及其類似物。固體形式可包括例如以下成分或具有類似性質之化合物中之任一者：黏合劑，諸如微晶纖維素、黃芪膠或明膠；賦形劑，諸如澱粉或乳糖；崩解劑，諸如褐藻酸、普雷莫膠(Primogel)或玉米澱粉；潤滑劑，諸如硬脂酸鎂；助流劑，諸如膠狀二氧化矽；甜味劑，諸如蔗糖或糖精；或調味劑，諸如薄荷、水楊酸甲酯或橙類香精。
可注射組合物通常基於可注射無菌生理食鹽水或磷酸鹽緩衝之生理食鹽水，或此項技術中已知之其他可注射載劑。如前所述，該等組合物中之活性化合物通常為微量組分，常常為約0.05重量%至10重量%，且其餘部分為可注射載劑及其類似物。
經皮組合物通常經調配為含有活性成分之局部用軟膏或乳膏，該(該等)活性成分之量一般在約0.01重量%至約20重量%，較佳在約0.1重量%至約20重量%，較佳在約0.1重量%至約10重量%，且更佳在約0.5重量%至約15重量%之範圍內。當調配為軟膏時，活性成分通常將與石蠟基質或可與水混合之軟膏基質組合。或者，活性成分可與例如水包油乳膏基質一起調配成乳膏。該等經皮調配物為此項技術中熟知的且一般包括用以增進活性成分或調配物之穩定皮膚滲透之額外成分。所有該等已知之經皮調配物及成分均包括在本發明之範疇內。
本發明化合物亦可藉由經皮裝置投與。因此，經皮投藥可使用 儲集囊或多孔膜型或者固體基質類貼片實現。
用於可經口投與、可注射或可局部投與組合物之上述組分僅為代表性的。其他材料以及加工技術及其類似內容陳述於Remington's Pharmaceutical Sciences之第8部分，第17版，1985,Mack Publishing Company,Easton,Pennsylvania中，其以引用之方式併入本文中。
本發明化合物亦可按持續釋放形式或由持續釋放藥物遞送系統投與。有關代表性持續釋放材料的描述可見於Remington's Pharmaceutical Sciences中。
以下調配物實例說明可根據本發明製備之代表性醫藥組合物。然而，本發明不限於以下醫藥組合物。
調配物1-錠劑
本發明化合物可以乾粉形式與乾燥的明膠黏合劑以約1：2重量比混合。可添加微量硬脂酸鎂作為潤滑劑。該混合物可在製錠機中成形為240-270 mg錠劑(每片錠劑80-90 mg活性醯胺化合物)。
調配物2-膠囊
本發明化合物可以乾粉形式與澱粉稀釋劑以約1：1重量比混合。可將該混合物填入250 mg膠囊中(每粒膠囊125 mg活性醯胺化合物)。
調配物3-液體
本發明化合物(125 mg)可與蔗糖(1.75 g)及三仙膠(4 mg)混合，且可摻合所得混合物，使其通過10號美國篩網，且隨後與先前製備的微晶纖維素及羧甲基纖維素鈉(11：89，50 mg)之水溶液混合。苯甲酸鈉(10 mg)、調味劑及著色劑可用水稀釋且在攪拌下添加。隨後可在攪拌下，添加足量水。隨後，可再添加足量水以得到5 mL總體積。
調配物4-錠劑
本發明化合物可以乾粉形式與乾燥的明膠黏合劑以約1：2重量比混合。可添加微量硬脂酸鎂作為潤滑劑。該混合物可在製錠機中成形 為450-900 mg錠劑(150-300 mg活性醯胺化合物)。
調配物5-注射液
可將本發明化合物溶解或懸浮於經緩衝無菌生理食鹽水可注射水性介質中，達到約5 mg/mL濃度。
調配物6-局部用
可將硬脂醇(250 g)及白石蠟脂(250 g)在約75℃下熔融，且隨後可添加本發明化合物(50 g)對羥基苯甲酸甲酯(0.25 g)、對羥基苯甲酸丙酯(0.15 g)、月桂基硫酸鈉(10 g)及丙二醇(120 g)溶解於水(約370 g)中之混合物，且可攪拌所得混合物直至其凝結。
治療方法
本發明化合物可用作治療劑以治療哺乳動物之病因與異常JAK活性有關或歸因於異常JAK活性之病況。特定言之，病況與JAK1及/或JAK2之異常活性有關。因此，本發明之化合物及醫藥組合物可用作預防及/或治療哺乳動物(包括人類)之過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病的治療劑。
在一個態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用作藥劑。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造藥劑。
在又一態樣中，本發明提供一種治療患有本文所揭示之疾病或有患該疾病之風險之哺乳動物的方法，該方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定態樣中，本發明提供一種治療患有以下疾病或有患該等疾病之風險之哺乳動物的方法：過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸 形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關的疾病。
在一個治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患過敏性反應之哺乳動物的方法，該方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該過敏性反應係選自過敏性呼吸道疾病、竇炎、濕疹及蕁麻疹、食物過敏症及對昆蟲毒素過敏。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防過敏性反應。在一個特定實施例中，該過敏性反應係選自過敏性呼吸道疾病、竇炎、濕疹及蕁麻疹、食物過敏症及對昆蟲毒素過敏。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療或預防過敏性反應之藥劑。在一個特定實施例中，該過敏性反應係選自過敏性呼吸道疾病、竇炎、濕疹及蕁麻疹、食物過敏症及對昆蟲毒素過敏。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患發炎病況之哺乳動物的方法。該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該發炎病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘)及發炎性腸病。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防發炎病況。在一個特定實施例中，該發炎病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘)及發炎性腸病。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防發炎病況之藥劑。在一個特定實施例中，該發炎病況係選自類風濕性關節炎、骨關節炎、過敏性呼吸道疾病(例如哮喘)及發炎性腸病。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患 自體免疫疾病之哺乳動物的方法。該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病及發炎性腸病。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防自體免疫疾病。在一個特定實施例中，該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病及發炎性腸病。在一個更特定之實施例中，該自體免疫疾病為全身性紅斑狼瘡。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防自體免疫疾病之藥劑。在一個特定實施例中，該自體免疫疾病係選自COPD、哮喘、全身性紅斑狼瘡、I型糖尿病及發炎性腸病。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患增生性疾病之哺乳動物的方法，該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該增生性疾病係選自癌症(例如實體腫瘤，諸如子宮平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多發性骨髓瘤及牛皮癬。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防增生性疾病。在一個特定實施例中，該增生性疾病係選自癌症(例如實體腫瘤，諸如子宮平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多發性骨髓瘤及牛皮癬。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防增生性疾病之藥劑。在一個特定實施例中，該增生性疾病係選自癌症(例如實體腫瘤，諸如子宮平滑肌肉瘤或***癌)、白血病(例如AML、ALL或CLL)、多發 性骨髓瘤及牛皮癬。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患移植排斥反應之哺乳動物的方法，該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，該移植排斥反應為器官移植物排斥反應。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防移植排斥反應。在一個特定實施例中，該移植排斥反應為器官移植物排斥反應。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防移植排斥反應之藥劑。在一個特定實施例中，該移植排斥反應為器官移植物排斥反應。
在一個治療方法態樣中，本發明提供一種治療及/或預防易患或罹患涉及軟骨代謝減弱之疾病之哺乳動物的方法，該方法包括投與治療有效量之本發明化合物，或一或多種本文所述之醫藥組合物。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防涉及軟骨代謝減弱之疾病。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防涉及軟骨代謝減弱之疾病之藥劑。
本發明亦提供一種治療及/或預防先天性軟骨畸形之方法，該方法包括投與有效量之一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防先天性軟骨畸形。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防先天性軟骨畸形之藥 劑。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患與IL6分泌過多有關之疾病之哺乳動物的方法，該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，與IL6分泌過多有關之疾病係選自卡斯爾曼氏病及系膜增生性腎小球腎炎。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防與IL6分泌過多有關之疾病。在一個特定實施例中，與IL6分泌過多有關之疾病係選自卡斯爾曼氏病及系膜增生性腎小球腎炎。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防與IL6分泌過多有關之疾病之藥劑。在一個特定實施例中，與IL6分泌過多有關之疾病係選自卡斯爾曼氏病及系膜增生性腎小球腎炎。
在其他治療方法態樣中，本發明提供治療及/或預防易患或罹患與干擾素分泌過多有關之疾病之哺乳動物的方法，該等方法包括投與有效治療病況或預防病況之量的一或多種本文所述之醫藥組合物或本發明化合物。在一個特定實施例中，與干擾素分泌過多有關之疾病係選自全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、休格連氏症候群、牛皮癬及類風濕性關節炎。
在另一態樣中，本發明提供本發明化合物，其用於治療及/或預防與干擾素分泌過多有關之疾病。在一個特定實施例中，與干擾素分泌過多有關之疾病係選自全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、休格連氏症候群、牛皮癬及類風濕性關節炎。
在又一態樣中，本發明提供本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物，其用於製造供治療及/或預防與干擾素分泌過多有關之疾病之藥劑。在一個特定實施例中，與干擾素分泌過多有關之疾病 係選自全身性及皮膚紅斑狼瘡、狼瘡腎炎、皮肌炎、休格連氏症候群、牛皮癬及類風濕性關節炎。
作為本發明另一態樣，提供本發明化合物，其用作醫藥，尤其用於治療及/或預防先前提及之病況及疾病。本文中亦提供本發明化合物之用途，其用於製造供治療及/或預防一種上文提及之病況及疾病的藥劑。
本發明方法之特定方案包括對患有涉及炎症之疾病之個體投與有效量之本發明化合物，持續一段足以降低個體之炎症程度且較佳終止引起該炎症之過程的時間。該方法之特定實施例包括對患有或易於發生類風濕性關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物，分別持續一段足以減輕或預防該患者之關節炎症且較佳終止引起該炎症之過程的時間。
本發明方法之另一特定方案包括對患有以軟骨或關節退化為特徵之疾病病況(例如類風濕性關節炎及/或骨關節炎)的個體投與有效量之本發明化合物，持續一段足以減少且較佳終止引起該退化之自我持續過程的時間。該方法之特定實施例包括對患有或易於發生骨關節炎之個體患者投與有效量之本發明化合物，分別持續一段足以減少或預防該患者之關節軟骨退化且較佳終止引起該退化之自我持續過程的時間。在一個特定實施例中，該化合物可展現軟骨合成代謝及/或抗分解代謝特性。
注射液劑量在約0.1 mg/kg/h到至少10 mg/kg/h之範圍內，均持續約1至約120小時且尤其24至96小時。亦可投與約0.1 mg/kg至約10 mg/kg或10 mg/kg以上之預裝載單次劑量(bolus)以達到適宜的穩態水準。預期對於40至80 kg之人類患者，最大總劑量不超過每天約2 g。
對於長期病況(諸如退化性病況)之預防及/或治療，治療方案通常持續多月或多年，因此對於患者之便利性及耐受性而言，以口服給 藥較佳。在口服給藥之情況下，代表性方案為每天1至5個且尤其2至4個且通常3個口服劑量。使用該等給藥模式，每一劑量提供約0.01至約20 mg/kg本發明化合物，且特定劑量各自提供約0.1至約10 mg/kg且尤其約1至約5 mg/kg。
經皮劑量一般經選擇以提供類似於或低於使用注射劑量所達到之血液含量。
當用於防止病況發作時，通常根據醫師之建議且在醫師之監督下，將上述劑量含量之本發明化合物投與有發生該病況之風險的患者。有發生特定病況之風險的患者一般包括具有該病況之家族史之患者，或已藉由遺傳測試或篩選而鑑別為特別易發生該病況之患者。
本發明化合物可作為唯一活性劑投與，或其可與其他治療劑組合投與，包括呈現相同或相似治療活性且經確定該組合投藥為安全且有效之其他化合物。在一個特定實施例中，共投與兩種(或兩種以上)藥劑允許顯著降低每一藥劑之使用劑量，由此降低所見到之副作用。
在一個實施例中，將本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物作為藥劑投與。在一個特定實施例中，該醫藥組合物另外包含另一活性成分。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防涉及炎症之疾病之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)免疫調節劑，例如硫唑嘌呤(azathioprine)、皮質類固醇(例如潑尼松龍(prednisolone)或***(dexamethasone))、環磷醯胺(cyclophosphamide)、環孢素A(cyclosporin A)、他克莫司(tacrolimus)、黴酚酸嗎啉乙酯(Mycophenolate Mofetil)、莫羅莫那-CD3(muromonab-CD3)(OKT3，例如Orthocolone®)、ATG、阿司匹林(aspirin)、對乙醯胺基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)及吡羅昔康(piroxicam)。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防關節炎(例如類風濕性關節炎)之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)鎮痛劑、非類固醇消炎藥(NSAIDS)、類固醇類、合成DMARDS(例如(但不限於)甲胺喋呤(methotrexate)、來氟米特(leflunomide)、柳氮磺吡啶(sulfasalazine)、金諾芬(auranofin)、金硫丁二鈉(sodium aurothiomalate)、青黴胺(penicillamine)、氯喹(chloroquine)、羥氯喹(hydroxychloroquine)、硫唑嘌呤及環孢素(ciclosporin))及生物DMARDS(例如(但不限於)英利昔單抗(Infliximab)、依那西普(Etanercept)、阿達木單抗(Adalimumab)、利妥昔單抗(Rituximab)及阿巴西普(Abatacept))。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防增生性病症之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：甲胺喋呤、亞葉酸(leukovorin)、阿德力黴素(adriamycin)、潑尼松(prenisone)、博來黴素(bleomycin)、環磷醯胺、5-氟尿嘧啶、紫杉醇(paclitaxel)、多烯紫杉醇(docetaxel)、長春新鹼(vincristine)、長春花鹼(vinblastine)、長春瑞賓(vinorelbine)、多柔比星(doxorubicin)、他莫昔芬(tamoxifen)、托瑞米芬(toremifene)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)、阿那曲唑(anastrozole)、戈舍瑞林(goserelin)、抗HER2單株抗體(例如HerceptinTM)、卡培他濱(capecitabine)、鹽酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride)、EGFR抑制劑(例如lressa®、TarcevaTM、ErbituxTM)、VEGF抑制劑(例如AvastinTM)、蛋白酶體抑制劑(例如VelcadeTM)、Glivec®及hsp90抑制劑(例如17-AAG)。此外，本發明化合物可與其他療法組合投與，該等療法包括(但不限於)放射療法或手術。在一個特定實施例中，增生性病症係選自癌症、脊髓增生性疾病或白血病。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防自體免疫疾病之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：糖皮質激素、細胞 生長抑制劑(例如嘌呤類似物)、烷基化劑(例如氮芥(nitrogen mustards)(環磷醯胺)、亞硝基脲、鉑化合物及其他)、抗代謝物(例如甲胺喋呤、硫唑嘌呤及巰基嘌呤)、細胞毒性抗生素(例如更生黴素(dactinomycin)、蒽環黴素(anthracycline)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素及米拉黴素(mithramycin))、抗體(例如抗CD20、抗CD25或抗CD3(OTK3)單株抗體，Atgam®及Thymoglobuline®)、環孢素、他克莫司、雷帕黴素(西羅莫司(sirolimus))、干擾素(例如IFN-β)、TNF結合蛋白(例如英利昔單抗(RemicadeTM)、依那西普(EnbrelTM)或阿達木單抗(HumiraTM))、黴酚酸酯(mycophenolate)、芬戈莫德(Fingolimod)及多球殼菌素(Myriocin)。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防移植排斥反應之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：鈣調素抑制劑(例如環孢素或他克莫司(FK506))、mTOR抑制劑(例如西羅莫司、依維莫司(everolimus))、抗增生劑(例如硫唑嘌呤、黴酚酸)、皮質類固醇(例如潑尼松龍、氫化可的松(hydrocortisone))、抗體(例如單株抗IL-2Rα受體抗體，巴利昔單抗(basiliximab)、達克珠單抗(daclizumab))、多株抗T細胞抗體(例如抗胸腺細胞球蛋白(ATG)、抗淋巴細胞球蛋白(ALG))。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防哮喘及/或鼻炎及/或COPD之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：β2-腎上腺素受體促效劑(例如沙丁胺醇(salbutamol)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、特布他林(terbutaline)及比托特羅(bitolterol))、腎上腺素(吸入劑或錠劑)、抗膽鹼激導性劑(例如異丙托溴銨(ipratropium bromide))、糖皮質激素(口服或吸入)長效β2-促效劑(例如沙丁胺醇、福莫特羅(formoterol)、班布特羅(bambuterol)及持續釋放之口服沙丁胺醇)、吸入性類固醇與長效支氣管擴張藥之組合(例如氟替卡松 (fluticasone)/沙丁胺醇、布***(budesonide)/福莫特羅)、白三烯拮抗劑及合成抑制劑(例如孟魯司特(montelukast)、紮魯司特(zafirlukast)及齊留通(zileuton))、介體釋放抑制劑(例如色甘酸鹽(cromoglycate)及酮替芬(ketotifen))、IgE反應之生物調節劑(例如奧馬珠單抗(omalizumab))、抗組織胺(例如西替利(ceterizine)、桂利嗪(cinnarizine)、非索非那定(fexofenadine))及血管收縮劑(例如羥甲唑啉(oxymethazoline)、賽洛唑啉(xylomethazoline)、萘唑啉(nafazoline)及曲馬唑啉(tramazoline))。
此外，本發明化合物可與哮喘及/或COPD之急救療法組合投與，該等療法包括投與氧氣或氦氧混合劑、霧化沙丁胺醇或特布他林(視情況與抗膽鹼激導性劑(例如異丙托銨)組合)、全身性類固醇(口服或靜脈內，例如潑尼松、潑尼松龍、甲潑尼龍、***或氫化可的松)、靜脈內沙丁胺醇、注射或吸入性非特異性β-促效劑(例如腎上腺素、異他林(isoetharine)、異丙腎上腺素(isoproterenol)、異丙喘寧(metaproterenol)、抗膽鹼激導性劑(IV或霧化的，例如格隆溴銨(glycopyrrolate)、阿托品(atropine)、異丙托銨)、甲基黃嘌呤(茶鹼(theophylline)、胺茶鹼(aminophylline)、巴米茶鹼(bamiphylline))、具有支氣管擴張作用之吸入式麻醉劑(例如異氟烷(isoflurane)、氟烷(halothane)、***(enflurane))、克他命(ketamine)及靜脈內硫酸鎂。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防發炎性腸病(IBD)之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：糖皮質激素(例如潑尼松、布***)、合成性改善疾病之免疫調節劑(例如甲胺喋呤、來氟米特、柳氮磺吡啶、美沙拉秦(mesalazine)、硫唑嘌呤、6-巰基嘌呤及環孢素)及生物性改善疾病之免疫調節劑(英利昔單抗、阿達木單抗、利妥昔單抗及阿巴西普)。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防SLE之另一 治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：改善疾病之抗風濕藥(DMARD)，諸如抗瘧疾藥(例如普喹尼爾(plaquenil)、羥氯喹)、免疫抑制劑(例如甲胺喋呤及硫唑嘌呤)、環磷醯胺及黴酚酸；免疫抑制藥及鎮痛劑，諸如非類固醇消炎藥、鴉片劑(例如右丙氧芬(dextropropoxyphene)及複方可待因撲熱息痛(co-codamol))、類鴉片劑(例如氫可酮(hydrocodone)、羥考酮(oxycodone)、美施康定(MS Contin)或***(methadone))及芬太尼多瑞吉經皮貼片(fentanyl duragesic transdermal patch)。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防牛皮癬之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：局部治療，諸如浴液、補濕劑、藥膏及軟膏，其含有煤焦油、地蒽酚(dithranol)(蒽三酚(anthralin))、皮質類固醇如去羥米松(desoximetasone)(TopicortTM)、醋酸氟輕鬆(fluocinonide)、維生素D3類似物(例如卡泊三醇(calcipotriol))、摩洛哥堅果油(Argan oil)及類視黃素(依曲替酯(etretinate)、阿曲汀(acitretin)、他紮羅汀(tazarotene))；全身治療，諸如甲胺喋呤、環孢素、類視黃素、硫鳥嘌呤(tioguanine)、羥基脲、柳氮磺吡啶、黴酚酸嗎啉乙酯、硫唑嘌呤、他克莫司、反丁烯二酸酯，或生物藥劑，諸如AmeviveTM、EnbrelTM、HumiraTM、RemicadeTM、RaptivaTM及優特克單抗(ustekinumab)(IL-12及IL-23阻斷劑)。另外，本發明化合物可與包括(但不限於)光照療法或光化學療法(例如補骨脂素(psoralen)及紫外線A光照療法(PUVA))之其他療法組合投與。
在一個實施例中，本發明化合物係與治療及/或預防過敏性反應之另一治療劑共投與；特定藥劑包括(但不限於)：抗組織胺(例如西替利嗪(cetirizine)、苯海拉明(diphenhydramine)、非索非那定、左旋西替利嗪(levocetirizine))、糖皮質激素(例如潑尼松、倍他米松(betamethasone)、倍氯米松(beclomethasone)、***)、腎上腺 素、茶鹼或抗白三烯藥(例如孟魯司特或紮魯司特)、抗膽鹼激導性劑及解充血劑。
如熟習此項技術者將顯而易知，共投藥包括作為同一治療方案之一部分將兩種或兩種以上治療劑遞送至患者的任何方式。可以單一調配物同時投與兩種或兩種以上藥劑，不過此並非必需的。該等藥劑可以不同調配物且在不同時間投與。
通用合成程序 總則
可使用以下通用方法及程序，由易於獲得的起始物質製備本發明化合物。應瞭解，當給定典型或較佳處理條件(亦即，反應溫度、時間、反應物之莫耳比、溶劑、壓力等)時，除非另作規定，否則亦可使用其他處理條件。最佳反應條件可隨所使用之特定反應物或溶劑變化，但該等條件可由熟習此項技術者根據常規優化程序確定。
另外，如熟習此項技術者將顯而易知，習知保護基可為防止某些官能基經歷不合需要之反應所必需的。此項技術中熟知適用於特定官能基之保護基以及適於保護及脫保護之條件的選擇。舉例而言，多種保護基及其引入與移除已描述於T.W.Greene及P.G.M.Wuts,Protecting Groups in Organic Synthesis，第2版，Wiley,New York,1991，及其中所引用之參考文獻中。
以下詳細提供了有關製備如上文所定義之本發明化合物以及比較實例之方法。本發明化合物可由熟習有機合成技術者自已知或市售起始物質及試劑製備。
除非另作規定，否則所有試劑均為商品級且以原樣使用，未經進一步純化。市售無水溶劑係用於在惰性氛圍下進行之反應。試劑級溶劑係用於所有其他情形，除非另作說明。管柱層析法係在矽膠60(35-70 μm)上執行。薄層層析法係使用預塗覆之矽膠F-254板(厚度 0.25 mm)進行。1H NMR譜圖係記錄在Bruker DPX 400 NMR光譜儀(400 MHz)上。1H NMR譜圖之化學位移(δ)係相對於作為內部參考之四甲基矽烷(δ 0.00)或適當殘留溶劑峰(亦即，CHCl3(δ 7.27))以百萬分率(ppm)報導。多重性係以單峰(s)、雙峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、多重峰(m)及寬峰(br)提供。偶合常數(J)係以Hz為單位提供。電噴霧MS譜圖係在Micromass platform LC/MS光譜儀上獲得。用於LCMS分析之管柱：Hichrom,Kromasil Eternity,2.5 μm C18,150×4.6mm；Waters Xbridge 5μm C18(2),250×4.6mm(參看86003117)；Waters Xterra MS 5μm C18,100×4.6mm(Plus guard濾筒)(參看186000486)；Gemini-NX 3 μm C18 100×3.0 mm(參看00D-4453-Y0)；Phenomenex Luna 5μm C18(2),100×4.6mm(Plus guard濾筒)(參看00D-4252-E0)；Kinetix fused core 2.7μm C18 100×4.6 mm(參看00D-4462-E0)；Supelco,Ascentis® Express C18(參看53829-U)，或Hichrom Halo C18,2.7μm C18,150×4.6mm(參看92814-702)。LC-MS係在耦接至裝備有UV偵測器Waters 2996之HPLC Waters 2795之Waters Micromass ZQ上記錄。LC亦係在耦接至UV偵測器Agilent G1315A之HPLC Agilent 1100上執行。製備型HPLC：Waters XBridge Prep C18 5μm ODB 19mm ID×100mm L(部件編號186002978)。所有方法均使用MeCN/H2O梯度。H2O含有0.1% TFA或0.1% NH3。
實驗部分中所用縮寫之清單：
本發明化合物之合成製備 通用合成方法 中間物之合成 中間物1/中間物2
步驟(i)：(2-氯-5-硝基-吡啶-4-基)-甲基-胺(中間物1)
室溫下，向2-氯-4-甲氧基-5-硝基-吡啶(0.026 mol)於無水THF(50 mL)中之溶液中添加甲胺(25 mL)(2M之THF溶液)。在室溫下使混合物再攪拌2小時。藉由TLC及LCMS觀察到反應完成後，減壓蒸發溶劑，得到5 g所需中間物1。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)：δ 2.95(d,3H),7.01(s,1H),8.57(bs,1H),8.86,1H)。
質量(M+1)：m/z 188。
步驟(ii)：6-氯-N-甲基-吡啶-3,4-二胺
在50℃下，向中間物1(0.026 mol)於乙酸(100 mL)中之經攪拌溶液中添加鐵粉(9 g，0.16 mL)。隨後，在80℃下加熱反應混合物約1小時，此時TLC顯示反應完成；將其冷卻，過濾且用乙酸乙酯(3×100 mL)洗滌。蒸發有機層得到殘留塊狀物，隨後用NaHCO3水溶液中和且用乙酸乙酯(3×100 mL)萃取。用水(2×100 mL)洗滌合併之有機層，經無水硫酸鈉乾燥且減壓濃縮，得到所需化合物。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d6)：δ 2.74(d,3H),4.66(s,2H),6.25(s,1H),7.36(s,1H)。
質量(M+1)：m/z 158。
步驟(iii)6-氯-1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶：(中間物2)
向6-氯-N-甲基-吡啶-3,4-二胺(22 mmol)於原甲酸三甲酯(25 mL)中之經攪拌溶液中添加甲酸(1 mL)且在100℃下加熱約4小時，此時TLC顯示反應完成。使反應物冷卻至室溫且添加水(50 mL)，且用乙酸乙酯(4×50 mL)萃取混合物，用NaHCO3水溶液洗滌合併之有機層，經無水硫酸鈉乾燥且減壓濃縮，得到所需產物中間物2。
1H-NMR(400 MHz,DMSO-d 6 )：δ 3.84(s,3H),7.83(s,1H),8.39(s,1H),8.74(s,1H)。
質量(M+1)：m/z 168。
化合物1：3-(4-(3-乙基-4-(甲基(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-基)-3-側氧基丙腈 途徑1：
步驟i)：4-(4-胺基-3-乙基苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
在回流下，在1,4-二噁烷(180 mL)及水(20 mL)中將4-溴-2-乙基苯胺(4.96 mL，35.0 mmol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(13 g，42.0 mmol)、[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(1.43 g，1.75 mmol)及碳酸銫(34.2 g，105 mmol)加熱18小時。將反應混合物冷卻至室溫且經由Celite過濾，用DCM洗滌且用水洗滌有機物，乾燥(MgSO4)，過濾且真空濃縮。使用矽膠管柱層析法且用含10%至20% EtOAc之異己烷溶離來純化所得殘餘物，得到所需化合物。
1H NMR δ(ppm)(DMSO-d6)：7.02-6.96(2 H,m,ArH),6.56(1 H,d,ArH),5.88(1 H,s,CH),4.89(2 H,s,NH2),3.94(2 H,s,CH),3.53-3.47(2 H,m,CH),2.44(2 H,q,CH2),2.38(2 H,s,CH),1.67-1.18(9 H,m,CH3),1.13(3 H,t,CH3)。
步驟ii)：4-(3-乙基-4-((1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
向經攪拌之脫氣(N2)1,4-二噁烷(230 mL)中添加4-(4-胺基-3-乙基苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(8.25 g，27.3 mmol)、6-氯-1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(4.15 g，24.8 mmol)、參(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(1.25 g，1.37 mmol)、2-環己基膦基-2',4',6'-三異丙基聯苯(1.30 g，2.73 mmol)及第三丁醇鈉(3.94 g，30 mmol)。將反應混合物加熱至100℃，保持1.5小時，冷卻至室溫，經由Celite過濾且用DCM洗滌。濾液用水洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空濃縮，並藉由管柱層析法，使用矽膠且用含0%至3% MeOH之DCM溶離來純化所得殘餘物。合併含產物之溶離份且真空濃縮，得到所需化合物。
1H NMR δ(ppm)(DMSO-d6)：8.48(1 H,d,NH),8.04(1 H,s,ArH),7.89(1 H,s,ArH),7.56-7.49(1 H,m,ArH),7.30(1 H,d,ArH),7.23(1 H,dd,ArH),6.74-6.71(1 H,m,ArH),6.10(1 H,s,CH),4.00(2 H,s,CH),3.73-3.63(3 H,m,CH3),3.58-3.52(2 H,m,CH),2.70-2.59(2 H,m,CH),2.53-2.46(2 H,s,CH),1.55-1.35(9 H,m,CH3),1.18-1.09(3 H,m,CH3)。
步驟iii)：4-(3-乙基-4-(甲基-(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
在0℃下，將六甲基二矽烷胺基鈉(1M之THF溶液，13.5 mL，13.5 mmol)逐滴添加至4-(3-乙基-4-((1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(5.32 g，12.3 mmol)於DMF(55 mL)中之溶液中。在0℃下，攪拌所得深褐色溶液20分鐘，其中逐滴添加碘甲烷(0.84 mL，13.5 mmol)，且使反應混合物經30分鐘升溫至室溫。真空濃縮反應混合物，溶解於DCM中，用水洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空濃縮，得到所需化合物，其不經進一步純化即用於下一步驟中。
1H NMR δ(ppm)(CHCl3-d)：8.72(1 H,s,ArH),7.61(1 H,s,ArH), 7.43-7.38(1 H,m,ArH),7.35-7.30(1 H,m,ArH),7.19-7.15(1 H,m,ArH),6.13(1 H,s,CH),5.90(1 H,d,ArH),4.11(2 H,s,CH),3.70-3.64(2 H,m,CH),3.56(3 H,s,CH3),3.45(3 H,s,CH3),2.62-2.47(4 H,m,CH),1.54-1.50(9 H,m,CH3),1.29-1.11(3 H,m,CH3)。
LCMS(10cm_Formic_ACE 3 C18 AR_HPLC_MeCN)Rt 8.23(min)m/z 448(MH+)。
步驟iv)：N-(2-乙基-4-(1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)苯基)-N,1-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-胺
室溫下，在DCM(25 mL)及三氟乙酸(5 mL)中將4-(3-乙基-4-(甲基(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(2.5 g，5.59 mmol)攪拌1天。真空濃縮反應混合物且將其溶解於DCM中，並裝載至10 g SCX管柱上，用MeOH洗滌且用7N NH3之MeOH溶液：MeOH(1：5)溶離。真空濃縮溶離液，得到所需化合物。
1H NMR δ(ppm)(DMSO-d6)：8.52-8.45(1 H,m,ArH),7.98(1 H,s,ArH),7.42(1 H,d,ArH),7.34(1 H,dd,ArH),7.13(1 H,d,ArH),6.25(1 H,s,ArH),6.13(1 H,s,CH),4.12(1 H,s,NH),3.59(3 H,s,CH3),3.41-3.38(2 H,m,CH),3.17(3 H,s,CH3),2.97-2.88(2 H,m,CH),2.45(2 H,q,CH2),2.39(2 H,s,CH),1.17-1.04(3 H,m,CH3)。
步驟v)：化合物1
室溫下，在DMF(3 mL)中將N-(2-乙基-4-(1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)苯基)-N,1-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-胺(110 mg，0.32 mmol)、2-氰基乙酸(30 mg，0.35 mmol)、(六氟磷酸2-(7-氮雜-1H-苯并***-1-基)-1,1,3,3-四甲基)(146 mg，0.38 mmol)及二異丙基乙胺(0.22 mL，1.28 mmol)攪拌1小時。藉由製備型HPLC純化粗反應混合物，得到所需化合物。
途徑2：
步驟1：4-(4-胺基-3-乙基苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
向4-溴-2-乙基苯胺(13.5 g，0.0675 mol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼-2-基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(25 g，0.081 mmol)、碳酸銫(65 g，0.2 mmol)於二噁烷(350 mL)及水(60 mL)中之經攪拌混合物中添加[1,1'-雙(二苯基膦基)二茂鐵]二氯鈀(II)(2.5 g，0.003 mol)。所得混合物用N2(g)沖洗且隨後加熱至100℃，保持18小時。此後，反應混合物冷卻至室溫且經由Hydroflo Super Cel®過濾且隨後真空濃縮。殘餘物用DCM(100 mL)稀釋，經由Celite且隨後疏水性玻璃料過濾。真空濃縮後，藉由層析法(溶離劑：含5%至25% EtOAc之異己烷)純化，得到所需化合物。
1H NMR δ(ppm)(DMSO-d6)：7.05-6.99(2 H,m),6.59(1 H,d),5.91(1 H,s),4.92(2 H,s),3.98(2 H,s),3.53(3 H,s),2.03(1 H,s),1.46(9 H,t),1.26-1.09(5 H,m)。
步驟2：4-(3-乙基-4-((1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)- 5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
將6-氯-1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶(6.7 g，0.04 mol)、4-(4-胺基-3-乙基苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(13.2 g，0.044 mol)、2-二環己基膦基-2',4',6'-三異丙基聯苯(2.08 g，0.004 mol)、參(二亞苄基丙酮)二鈀(0)(2.0 g，0.002 mol)及第三丁醇鈉(6.4 g，0.067 mol)組合於脫氣(N2)之二噁烷(370 mL)中，並加熱至100℃，保持1.5小時。此後，反應混合物冷卻至室溫且經由Hydroflo Super Cel®過濾並真空濃縮。所得殘餘物藉由層析法(溶離劑：含0至10% MeOH之DCM)純化，得到所需化合物。
1H NMRδ(ppm)(CHCl3-d)：8.70(1 H,d),7.70(1 H,s),7.44(1 H,d),7.33(1 H,d),6.58(1 H,d),6.31(1 H,s),4.10(2 H,s),2.73-2.61(2 H,m),2.57(2 H,s),1.67(3 H,s),1.51(9 H,s),1.29-1.21(5 H,m)。2H在溶劑峰下。
步驟3：4-(3-乙基-4-(甲基-(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯
0℃下，在氮氣氛圍下，向4-(3-乙基-4-((1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(8.02 g，18.50 mmol)於DMF(80 mL)中之經攪拌溶液中逐滴添加雙(三甲基矽烷基)胺基鈉(1.0M之THF溶液，20.3 mL，20.35 mmol)。攪拌20分鐘後，逐滴添加碘甲烷(1.27 mL，20.35 mmol)於DMF(5 mL)中之溶液。室溫下攪拌1.5小時後，反應混合物用水稀釋且隨後真空濃縮。殘餘物用水及DCM稀釋，且使用疏水性玻璃料分離，且隨後真空濃縮有機物，得到所需化合物，其不經進一步純化即使用。
1H NMR δ(ppm)(CHCl3-d)：8.73-8.68(1 H,m),7.60(1 H,s),7.40(1 H,d),7.32(1 H,dd),7.19-7.08(1 H,m),5.91-5.87(1 H,m),4.11(2 H,s),3.67(2 H,t),3.73-3.34(3 H,m),3.44(3 H,s),2.57-2.48(2 H, m),1.67(2 H,s),1.50(9 H,s),1.15(3 H,q)。1H在溶劑峰下。
步驟4：N-(2-乙基-4-(1,2,3,6-四氫吡啶-4-基)苯基)-N,1-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-胺
向4-(3-乙基-4-(甲基(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-甲酸第三丁酯(7.51 g，16.78 mmol)於DCM(75 mL)中之經攪拌溶液中添加三氟乙酸(15 mL)且所得混合物攪拌8小時。此後，真空濃縮反應混合物。所得殘餘物經由SCX管柱過濾，用NH3(7M之MeOH溶液)：MeOH溶離。真空濃縮，得到所需化合物，其不經進一步純化即使用。
1H NMR δ(ppm)(CHCl3-d)：8.72(1 H,d),7.60(1 H,s),7.44-7.37(1 H,m),7.33(1 H,dd),7.16(1 H,d),6.23-6.20(1 H,m),5.90(1 H,d),3.58(2 H,q),3.58-3.50(3 H,m),3.49(1 H,s),3.51-3.36(3H,m),3.18-3.08(2 H,m),2.58-2.48(5 H,m),1.20-1.11(3 H,m)。未觀測到NH。
步驟5：3-(4-(3-乙基-4-(甲基(1-甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基)胺基)苯基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-基)-3-側氧基丙腈
向2-氰基乙酸(1.45 g，17.03 mmol)於DCM(110 mL)中之經攪拌溶液中添加六氟磷酸O-(7-氮雜苯并***-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(7.06 g，18.58 mmol)且混合物攪拌20分鐘。此後，依序添加N,N-二異丙基乙胺(10.8 mL，61.92 mmol)及N-(2-乙基-4-(1,2,3,6四氫吡啶-4-基)苯基)-N,1-二甲基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-胺(5.38 g，15.48 mmol)且所得混合物攪拌8小時。此後，反應混合物用水稀釋且分離各層。有機物用水、飽和碳酸氫鈉洗滌，乾燥(MgSO4)且真空濃縮。所得殘餘物藉由層析法(溶離劑：含2至10% MeOH之EtOAc)純化，得到粗產物。將其溶解於DCM中且用水(×9)洗滌，乾燥(MgSO4)且真空濃縮，得到所需化合物。
1H NMR δ(ppm)(DMSO-d6)：8.51(1 H,s,ArH),8.14(1 H,s,ArH),7.48(1 H,dd,ArH),7.43-7.37(1 H,m,ArH),7.20(1 H,d,ArH),6.36(1 H,s,CH),6.23(1 H,d,ArH),4.16(2 H,s,CH),4.10(2 H,s,CH),3.74-3.51(5 H,m,CH,CH3),3.36(3 H,s,CH3),2.66-2.42(4 H,m,CH,CH2),1.11(3 H,t,CH3)。
LCMS(15cm_Bicarb_GeminiNX_HPLC_CH3CN)tR 8.89(min)m/z 415(MH+)。
生物實例 實例1：活體外分析 1.1 JAK1抑制分析 1.1.1 JAK1分析多聚GT受質
重組人JAK1催化結構域(胺基酸850-1154；目錄號08-144)係購自Carna Biosciences。在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中，將10 ng JAK1與12.5 μg多聚GT受質(Sigma目錄號P0275)一起在激酶反應緩衝液(15 mM Tris-HCl pH 7.5、1 mM DTT、0.01% Tween-20、10 mM MgCl2、2 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)最終濃度)中在存在或不存在5 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為25 μL。在30℃下45分鐘後，藉由添加25微升/孔之150 mM磷酸來停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預先洗滌(75 mM磷酸)之96孔濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL之75 mM磷酸溶液洗滌板6次，並密封板底部。添加40微升/孔Microscint-20，密封板頂部且使用Topcount(Perkin Elmer)執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的cpm來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下： 抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)除以(在媒劑存在下測定之cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在JAK1分析中測試劑量反應效應及計算每一化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO之最終濃度中8點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)1/3連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。
1.1.2 JAK1 Ulight-JAK1肽分析
重組人JAK1(催化結構域，胺基酸866-1154；目錄號PV4774)係購自Invitrogen。在白色384 Opti板(Perkin Elmer，目錄號6007290)中，將1 ng JAK1與20 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer目錄號TRF0121)一起在激酶反應緩衝液(25 mM MOPS pH 6.8、0.01% Brij-35、5 mM MgCl2、2 mM DTT、7 μM ATP)中在存在或不存在4 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為20 μL。在室溫下60分鐘後，藉由添加20微升/孔之偵測混合物(1×偵測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mM EDTA)來停止反應。使用Envision(Perkin Elmer)，藉由在320 nm下激發且在615 nm下量測發射來執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的相對螢光單位(RFU)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的RFU來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下：抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的RFU-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的RFU)除以(在媒劑存在下測定之RFU-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的RFU)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在JAK1分析中測試劑量反應效應及計算化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO最終濃度中10點1/5連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。資料表示為由分析得到之平均IC50±平均值之標準誤差。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK1之活性且報告以下IC50值：1.368、4.086、3.633、3.455、2.311、0.8151、6.841、6.138、0.7565、1.467、1.602、3.081、1.127、1.447、1.922、2.340、1.446、2.422、1.424及4.143 nM。
1.1.3 JAK1 Ki測定分析
為測定Ki，將不同量之化合物與酶混合且酶促反應隨ATP濃度而變化。藉助於Km相對於化合物濃度之雙倒數作圖(萊思威佛-伯克曲線(Lineweaver-Burk plot))來測定Ki。在分析中使用1 ng JAK1(Invitrogen,PV4774)。受質為50 nM Ulight-JAK-1(Tyr1023)肽(Perkin Elmer,TRF0121)。該反應係在25 mM MOPS pH 6.8，0.01% Brij-35，2 mM DTT、5 mM MgCl2中在不同濃度之ATP及化合物下執行。如1.1.2中所述，使用Eu標記之抗磷酸酪胺酸抗體PT66(Perkin Elmer,AD0068)量測磷酸化受質。在envision(Perkin Elmer)上，藉由在320 nm下激發且隨後在615 nm及665 nm下發射來執行讀出。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK1之活性且報告以下Ki值：3.688 nM。
1.2 JAK2抑制分析 1.2.1 JAK2分析多聚GT受質
重組人JAK2催化結構域(胺基酸808-1132；目錄號PV4210)係購自Invitrogen。在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中，將0.025mU JAK2與2.5 μg多聚GT受質(Sigma目錄號P0275)一起在激酶反應緩衝液(5 mM MOPS pH 7.5、9 mM MgAc、0.3 mM EDTA、0.06% Brij及0.6 mM DTT、1 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)最終濃度)中在存在或不存在5 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為25 μL。在30℃下90分鐘後，藉由添加25微升/孔之150 mM磷酸來停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預先洗滌(75 mM磷酸)之96孔濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL之75 mM磷酸溶液洗滌板6次，並密封板底部。添加40微升/孔Microscint-20，密封板頂部且使用Topcount(Perkin Elmer)執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的cpm來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下：抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)除以(在媒劑存在下測定之cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在JAK2分析中測試劑量反應效應及計算每一化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO之最終濃度中8點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)1/3連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。
1.2.2 JAK2 Ulight-JAK1肽分析
重組人JAK2(催化結構域，胺基酸866-1154；目錄號PV4210)係購自Invitrogen。在白色384 Opti板(Perkin Elmer，目錄號6007290)中，將0.0125 mU JAK2與25 nM Ulight-JAK1(tyr1023)肽(Perkin Elmer目錄號TRF0121)一起在激酶反應緩衝液(25 mM HEPES pH7.0、0.01% Triton X-100、7.5 mM MgCl2、2 mM DTT、7.5 μM ATP)中在存在或不存在4 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為20 μL。在室溫下60分鐘後，藉由添加20微升/孔之偵測混合物(1×偵測緩衝液(Perkin Elmer，目錄號CR97-100C)、0.5 nM銪-抗磷酸酪胺酸(PT66)(Perkin Elmer，目錄號AD0068)、10 mMEDTA)來停止反應。使用Envision(Perkin Elmer)，藉由在320 nm下激發且在615 nm下量測發射來執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的相對螢光單位(RFU)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的RFU來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下：抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的RFU-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的RFU)除以(在媒劑存在下測定之RFU-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的RFU)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在JAK2分析中測試劑量反應效應及計算化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO最終濃度中10點1/5連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。資料表示為由分析得到之平均IC50±平均值之標準誤差。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK2之活性且報告以下IC50值：61.46、108.1、100.8、42.93、26.35、155.3、35.71及30.50 nM。
1.2.3 JAK2 Ki測定分析
使用最終濃度為5 nM之JAK2(Invitrogen,PV4210)。在50 mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10 mM MgCl2、1 mM EGTA中，使用25 nM激酶示蹤劑236(Invitrogen,PV5592)及2 nM Eu-抗GST(Invitrogen,PV5594)在不同化合物濃度下執行結合實驗。根據製造商之程序執行示蹤劑之偵測。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK2之活性且報告以下Ki值：25.1 nM。
1.3 JAK3抑制分析
重組人JAK3催化結構域(胺基酸781-1124；目錄號PV3855)係購自Invitrogen。在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中，將0.5 ng JAK3蛋白與2.5 μg多聚GT受質(Sigma目錄號P0275)一起在激酶反應緩衝液(25 mM Tris pH 7.5、0.5 mM EGTA、10 mM MgCl2、2.5 mM DTT、0.5 mM Na3VO4、5 mM b-甘油磷酸、0.01% Triton X-100、1 μM非放射性ATP、0.25 μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)最終濃度)中在存在或不存在5 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為25 μL。在30℃下45分鐘後，藉由添加25微升/孔之150 mM磷酸來停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預先洗滌(75 mM磷酸)之96孔濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL之75 mM磷酸溶液洗滌板6次，並密封板底部。添加40微升/孔Microscint-20，密封板頂部且使用Topcount(Perkin Elmer)執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的cpm來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下：抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)除以(在媒劑存在下測定之cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在JAK3分析中測試劑量反應效應及計算每一化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO最終濃度中10點1/5連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK3之活性且報告以下IC50值：160.3、65.17、142.0、66.89、30.91、32.81、38.01及66.63 nM。
1.3.1 JAK3 Ki測定分析
為測定Ki，將不同量之化合物與酶混合且酶促反應隨ATP濃度而變化。藉助於Km相對於化合物濃度之雙倒數作圖(萊思威佛-伯克曲線)來測定Ki。所用JAK3(Carna Biosciences,09CBS-0625B)之最終濃度為10 ng/mL。受質為多聚(Glu,Tyr)鈉鹽(4：1)，MW 20000-50000(Sigma,P0275)。該反應係在25 mM Tris pH 7.5、0.01% Triton X-100、0.5 mM EGTA、2.5 mM DTT、0.5 mM Na3VO4、5 mM b-甘油磷酸、10 mM MgCl2中在不同濃度ATP及化合物下執行，且藉由添加150 mM磷酸停止。藉由將樣品裝載至濾板(使用收集器，Perkin Elmer)上，且隨後進行洗滌，來量測受質多聚GT中磷酸酯之併入。在將閃爍液添加至濾板(Perkin Elmer)後，在Topcount閃爍計數器中量測多聚GT中併入之33P。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK2之活性且報告以下Ki值：234及218.2 nM。
1.4 TYK2抑制分析
重組人TYK2催化結構域(胺基酸871-1187；目錄號08-147)係購自Carna Biosciences。在聚丙烯96孔板(Greiner，V型底)中，將5 ng TYK2與12.5 μg多聚GT受質(Sigma目錄號P0275)一起在激酶反應緩衝液(25 mM Hepes pH 7.2、50 mM NaCl、0.5 mM EDTA、1 mM DTT、5 mM MnCl2、10 mM MgCl2、0.1% Brij-35、0.1 μM非放射性ATP、0.125 μCi 33P-γ-ATP(GE Healthcare，目錄號AH9968)最終濃度)中在存在或不存在5 μL含測試化合物或媒劑(DMSO，1%最終濃度)之情況下培育，總體積為25 μL。在30℃下90分鐘後，藉由添加25微升/孔之 150 mM磷酸來停止反應。使用細胞收集器(Perkin Elmer)將所有終止之激酶反應物轉移至預先洗滌(75 mM磷酸)之96孔濾板(Perkin Elmer目錄號6005177)中。用每孔300 μL之75 mM磷酸溶液洗滌板6次，並密封板底部。添加40微升/孔Microscint-20，密封板頂部且使用Topcount(Perkin Elmer)執行讀出。藉由用在媒劑存在下獲得的每分鐘計數(cpm)減去在陽性對照抑制劑(10 μM星形孢菌素)存在下獲得的cpm來計算激酶活性。測試化合物抑制此活性之能力測定如下：抑制百分比=((針對存在測試化合物之樣品所測定的cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)除以(在媒劑存在下測定之cpm-針對含陽性對照抑制劑之樣品所測定的cpm)) * 100。
製備化合物之劑量稀釋液系列，從而能夠在TYK2分析中測試劑量反應效應及計算每一化合物之IC50。常規地測試20 μM濃度，隨後在1% DMSO之最終濃度中8點(20 μM-6.67 μM-2.22 μM-740 nM-247 nM-82 nM-27 nM-9 nM)1/3連續稀釋之每一化合物。當化合物系列之效力增加時，製備更多稀釋液及/或降低最高濃度(例如5 μM、1 μM)。
已使用上述分析測試本發明化合物針對JAK3之活性且報告以下IC50值：25.58、42.81、15.03、24.81、13.43、12.25、17.26及35.37 nM。
1.4.1 TYK2 Ki測定分析
所用TYK2(Carna Biosciences,09CBS-0983B)之最終濃度為5 nM。在50 mM Hepes pH 7.5、0.01% Brij-35、10 mM MgCl2、1 mM EGTA中，使用50 nM激酶示蹤劑236(Invitrogen,PV5592)及2 nM Eu-抗GST(Invitrogen,PV5594)在不同化合物濃度下執行結合實驗。根據製造商之程序執行示蹤劑之偵測。
已使用上述分析測試本發明化合物針對TYK2之活性且報告以下 Ki值：70.7及108 nM。
實例2.細胞分析：
2.1 JAK-STAT信號傳導分析
將HeLa細胞維持於含有10%熱滅活胎牛血清、100 U/mL青黴素(penicillin)及100 μg/mL鏈黴素(streptomycin)之杜貝卡氏改良型伊格氏培養基(DMEM)中。使用70%匯合之HeLa細胞進行轉染。在96孔板格式中，每孔用40 ng pSTAT1(2)-螢光素酶報導子(Panomics)、作為內對照報導子之8 ng LacZ報導子及52 ng pBSK，使用0.32 μL Jet-PEI(Polyplus)作為轉染試劑，短暫性轉染含20,000個細胞之87 μL細胞培養基。在37℃、5% CO2下培育隔夜後，移除轉染培養基。添加81 μL DMEM+1.5%熱滅活胎牛血清。添加9 μL 10×濃度之化合物，保持60分鐘，隨後添加10 μL 33 ng/mL最終濃度之人OSM(Peprotech)。
一式兩份測試所有化合物，以20 μM起始，隨後在0.2% DMSO之最終濃度中1/3連續稀釋，總計8個劑量(20 μM-6.6 μM-2.2 μM-740 nM-250 nM-82 nM-27 nM-9 nM)。
在37℃、5% CO2下培育隔夜後，藉由添加100 μL溶解緩衝液/孔(PBS、0.9 mM CaCl2、0.5 mM MgCl2、10%海藻糖、0.05% Tergitol NP9、0.3% BSA)來溶解細胞。
使用40 μL細胞溶解產物，藉由添加180 μL β-Gal溶液(30 μL ONPG 4mg/mL+150 μL β-半乳糖苷酶緩衝液(0.06 M Na2HPO4、0.04 M NaH2PO4、1 mM MgCl2))，保持20分鐘，來讀取β-半乳糖苷酶活性。藉由添加50 μL Na2CO3 1 M來停止反應。在405 nm下讀取吸光度。
如製造商(Perkin Elmer)所述，在Envision(Perkin Elmer)上使用40 μL細胞溶解產物加40 μL Steadylite®來量測螢光素酶活性。
省略OSM用作陽性對照物(100%抑制)。使用0.5% DMSO(0%抑 制)作為陰性對照物。使用陽性及陰性對照物來計算z'及「抑制百分比」(PIN)值。
抑制百分比=((在媒劑存在下測定之螢光度-針對存在測試化合物之樣品所測定之螢光度)除以(在媒劑存在下測定之螢光度-針對不含引發劑之樣品所測定之螢光度)) * 100。
標繪在劑量反應中所測試之化合物的PIN值且得出EC50值。
已使用上述分析測試本發明化合物之活性且報告以下IC50值：251.9、233.3、100.9、82.35、1212、385.7、305.0及1027.0 nM。
2.2 OSM/IL-1β信號傳導分析
經顯示，OSM及IL-1β在人軟骨肉瘤細胞株SW1353中協同性上調MMP13含量。在96孔板中，將細胞以15,000個細胞/孔接種於120 μL體積含10%(v/v)FBS及1%青黴素/鏈黴素(InVitrogen)之DMEM(Invitrogen)中，在37℃、5% CO2下培育。將細胞與15 μL化合物一起在含2% DMSO之M199培養基中預培育1小時，之後用15 μL OSM及IL-1β引發，以達到25 ng/mL OSM及1 ng/mL IL-1β，且在引發後48小時，量測條件培養基中之MMP13含量。使用抗體捕獲活性分析法量測MMP13活性。為此，在4℃下用35 μL 1.5 μg/mL之抗人MMP13抗體(R&D Systems,MAB511)溶液塗覆384孔板(NUNC,460518,MaxiSorb black)，保持24小時。用PBS+0.05% Tween洗滌孔2次後，在4℃下用100 μL含5%脫脂奶粉(Santa Cruz,sc-2325,Blotto)之PBS阻斷其餘結合位點，保持24小時。接下來，用PBS+0.05% Tween洗滌孔2次，且添加35 μL含MMP13之培養物上清液於稀釋100倍之阻斷緩衝液中之1/10稀釋液，並在室溫下培育4小時。接下來，用PBS+0.05% Tween洗滌孔2次，隨後藉由添加35 μL 1.5 mM之4-胺基苯乙酸汞(APMA)(Sigma,A9563)溶液且在37℃下培育1小時來活化MMP13。再用PBS+0.05% Tween洗滌孔且添加35 μL MMP13受質(Biomol,P-126, OmniMMP螢光受質)。在37℃下培育24小時後，在Perkin Elmer Wallac EnVision 2102多標記讀取器(Multilabel Reader)(激發波長：320 nm，發射波長：405 nm)中量測經轉化受質之螢光度。
抑制百分比=((在媒劑存在下測定之螢光度-針對存在測試化合物之樣品所測定之螢光度)除以(在媒劑存在下測定之螢光度-針對不含引發劑之樣品所測定之螢光度)) * 100。
2.3 PBL增殖分析
用IL-2刺激人周圍血淋巴細胞(PBL)且使用BrdU併入分析來量測增殖。首先用PHA刺激PBL達72小時以誘導IL-2受體，隨後使其禁食24小時以停止細胞增殖，隨後再用IL-2刺激72小時(包括24小時之BrdU標記期)。將細胞與測試化合物一起預培育1小時，隨後添加IL-2。在含有10%(v/v)FBS之RPMI 1640中培養細胞。
2.4全血分析(WBA) 2.4.1 IFNα刺激方案
為預測測試化合物在活體內抑制JAK1或JAK2依賴性信號傳導路徑之效力，使用人全血來開發生理學相關之活體外模型。在WBA分析中，用化合物離體處理自提交知情同意書之人類志願者抽取的血液(1小時)，且隨後用干擾素α(IFNα，JAK1依賴性路徑)(30分鐘)或用顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF，JAK2依賴性路徑)(2小時)刺激。
2.4.1.1磷酸化STAT1分析
對於IFNα刺激，使用pSTAT1 ELISA分析量測白血球提取物中由IFNα引起之信號轉導及轉錄活化子1磷酸化(pSTAT1)之增加。在干擾素α(IFNα)引發後信號轉導及轉錄活化子1(STAT1)之磷酸化係JAK1介導之事件。開發磷酸化STAT1分析來評估化合物抑制JAK1依賴性信號傳導路徑之能力，該分析用於量測細胞提取物中之磷酸化STAT1含 量。
用化合物離體處理自提交知情同意書之人類志願者抽取之人全血(1小時)且隨後用IFNα刺激30分鐘。使用磷酸化STAT1 ELISA來量測白血球提取物中由INFα引起之STAT1磷酸化增加。
ACK溶解緩衝液由0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTA組成。該緩衝液之pH為7.3。
在H2O中將10×細胞溶解緩衝液濃縮物(來自Cell Signaling之PathScan磷酸化STAT1(Tyr701)夾層ELISA套組之一部分)稀釋10倍。使用前，將蛋白酶抑制劑添加到緩衝液中。
將20 μg IFNα溶解於40 μL H2O中以獲得500 μg/mL之儲備液。該儲備液在-20℃下儲存。
在DMSO中製備該化合物之3倍稀釋液系列(最高濃度：10 mM)。隨後，在培養基中進一步稀釋該化合物(稀釋率取決於所需最終化合物濃度)。
2.4.1.1.1血液與化合物一起培育且用IFNα刺激
將人血液收集於經肝素處理之管中。將血液分成392 μL之等分試樣。之後，將4 μL化合物稀釋液添加至每一等分試樣中且在37℃下培育血液樣品1小時。在RPMI培養基中將IFNα儲備液稀釋1000倍，以獲得500 ng/mL工作溶液。將4 μL 500 ng/mL之工作溶液添加至血液樣品中(最終濃度IFNα：5 ng/mL)。樣品在37℃下培育30分鐘。
2.4.1.1.2細胞提取物之製備
在刺激期結束時，將7.6 mL ACK緩衝液添加至血液樣品中以溶解紅血球。藉由倒轉管5次來混合樣品且在冰上培育反應物5分鐘。在此培育期間，RBC之溶解應顯而易見。藉由在4℃下以300 g離心7分鐘來使細胞集結，且移除上清液。將10 mL 1×PBS添加至每一管中且使細胞集結粒再懸浮。樣品再在4℃下以300 g離心7分鐘。移除上清 液且將集結粒再懸浮於500 μL 1×PBS中。隨後，將細胞懸浮液轉移至一個潔淨的1.5 mL微量離心管中。藉由在4℃下以700 g離心5分鐘來使細胞集結。移除上清液且將集結粒溶解於150 μL細胞溶解緩衝液中。樣品在冰上培育15分鐘。之後，樣品在-80℃下儲存，直至進一步加工。
2.4.1.1.3藉由ELISA量測STAT1磷酸化
使用來自Cell Signaling之Pathscan磷酸化STAT1(Tyr701)夾層ELISA套組(目錄號：#7234)來測定磷酸化STATI含量。
使細胞提取物在冰上解凍。將管在4℃下以16,000 g離心5分鐘且收集澄清的溶解產物。同時，將該套組中之微孔板條平衡至室溫，且藉由在H2O中將洗滌緩衝液稀釋20倍來製備洗滌緩衝液。樣品在樣品稀釋劑中稀釋2倍，且將100 μL添加至微孔板條中。該等板條在4℃下培育隔夜。
次日，用洗滌緩衝液洗滌孔3次。將100 μL偵測抗體添加至孔中。該等板條在37℃下培育1小時。隨後，再用洗滌緩衝液洗滌孔3次。將100 μL連接HRP之二次抗體添加至每一孔中且樣品在37℃下培育。30分鐘後，再洗滌孔3次且將100 μL TMB受質添加至所有孔中。當樣品變藍時，添加100 μL STOP溶液以停止反應。在450 nm下量測吸光度。
2.4.1.2資料分析
將對細胞提取物中由IFNα引起之磷酸化STAT1誘導的抑制對化合物濃度作圖且使用Graphpad軟體導出IC50值。若R2(統計模型中用於量測模型之可變性比例及其預測能力之決定係數。R2範圍為0(資料無相關性：無預測價值)至1(全相關：較大預測價值))大於0.8且希爾斜率(hill slope)小於3，則資料保留。
2.4.1.3 IL-8 ELISA
對於GM-CSF刺激，使用IL-8 ELISA分析來量測血漿中介白素-8(IL-8)含量之增加。顆粒球巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)誘導之介白素8(IL-8)表現係JAK2介導之事件。已開發IL-8 ELISA來評估化合物抑制JAK2依賴性信號傳導路徑之能力，該分析可用於量測血漿樣品中之IL-8含量。
用化合物離體處理自提交知情同意書之人類志願者抽取之人全血(1小時)且隨後用GM-CSF刺激2小時。使用IL-8 ELISA分析來量測血漿中IL-8含量之增加。
將10 μg GM-CSF溶解於100 μL H2O中以獲得100 μg/mL之儲備液。該儲備液在-20℃下儲存。
在DMSO中製備測試化合物之3倍稀釋液系列(最高濃度：10 mM)。隨後，在培養基中進一步稀釋該化合物(稀釋率取決於所需最終化合物濃度)。
2.4.1.3.1血液與化合物一起培育且用GM-CSF刺激
將人血液收集於經肝素處理之管中。將血液分成245 μL之等分試樣。之後，將2.5 μL測試化合物稀釋液添加至每一等分試樣中且在37℃下培育血液樣品1小時。在RPMI培養基中將GM-CSF儲備液稀釋100倍，以獲得1 μg/mL工作溶液。將2.5 μL 1 μg/mL之工作溶液添加至血液樣品中(最終濃度GM-CSF：10 ng/mL)。樣品在37℃下培育2小時。
2.4.1.3.2血漿樣品之製備
樣品在4℃下以1,000 g離心15分鐘。收集100 μL血漿且在-80℃儲存待用。
2.4.1.3.3藉由ELISA量測IL-8含量
使用來自R&D Systems之人IL-8化學發光免疫分析套組(目錄號：Q8000B)測定IL-8含量。
藉由在H2O中將洗滌緩衝液稀釋10倍來製備洗滌緩衝液。藉由將1份Glo試劑1添加至2份Glo試劑B中，保持15分鐘至4小時，來製備工作glo試劑待用。將100 μL分析稀釋劑RD1-86添加至每一孔中。之後，添加50 μL樣品(血漿)。ELISA板在室溫下以500 rpm培育2小時。所有孔用洗滌緩衝液洗滌4次且將200 μL IL-8結合物添加至每一孔中。在室溫下培育3小時後，用洗滌緩衝液洗滌孔4次，且將100 μL工作glo試劑添加至每一孔中。ELISA板在室溫下培育5分鐘(避光)。量測發光(0.5秒/孔讀取時間)。
2.4.2 IL-6刺激方案
此外，使用人全血執行流動式細胞測量術分析以離體確定JAK1較JAK2之化合物選擇性。因此，自提交知情同意書之人類志願者獲取血液。隨後，在輕柔搖動下，將血液在37℃下平衡30分鐘，隨後等分至艾本德管(Eppendorf tube)中。添加不同濃度之化合物且在輕柔搖動下在37℃下培育30分鐘，且隨後在輕柔搖動下，在37℃下對於JAK1依賴性路徑刺激用介白素6(IL-6)或對於JAK2依賴性路徑刺激用GM-CSF刺激20分鐘。隨後使用FACS分析評價磷酸化STAT1及磷酸化STAT5。
2.4.2.1磷酸化STAT1分析
對於白血球中IL-6刺激之信號轉導及轉錄活化子1(pSTAT1)磷酸化增加，用化合物離體處理自提交知情同意書之人類志願者抽取的人全血30分鐘且隨後用IL-6刺激20分鐘。使用抗磷酸化STAT1抗體，藉由FACS量測淋巴細胞中由IL-6引起之STAT1磷酸化增加。
用蒸餾水將5×溶解/固定緩衝液(Lyse/Fix buffer；BD PhosFlow，目錄號558049)稀釋5倍，並在37℃下預加溫。丟棄殘留的經稀釋溶解/固定緩衝液。
將10 μg rhIL-6(R&D Systems，目錄號206-IL)溶解於含0.1% BSA之1 mL PBS中，以獲得10 μg/mL儲備液。將該儲備液等分且在-80℃下儲存。
在DMSO中製備該化合物之3倍稀釋液系列(10 mM儲備液)。對照處理之樣品接受DMSO而非化合物。所有樣品在1%最終DMSO濃度下培育。
2.4.2.1.1血液與化合物一起培育且用IL-6刺激
將人血液收集於經肝素處理之管中。將血液分成148.5 μL之等分試樣。隨後，將1.5 μL測試化合物稀釋液添加至每一血液等分試樣中且在輕柔搖動下，在37℃下培育血液樣品30分鐘。將IL-6儲備液(1.5 μL)添加至血液樣品中(最終濃度10 ng/mL)且在輕柔搖動下，在37℃下培育樣品20分鐘。
2.4.2.1.2白血球製備及CD4標記
在刺激期結束時，立即將3 mL 1X預加溫之溶解/固定緩衝液添加至血液樣品中，短暫渦旋且在水浴中於37℃下培育15分鐘，以便溶解紅血球且固定白細胞，隨後在-80℃下冷凍待用。
對於後續步驟，將管在37℃下解凍，保持約20分鐘，且在4℃下以400×g離心5分鐘。用3 mL冷1×PBS洗滌細胞集結粒，並在離心後，將細胞集結粒再懸浮於100 μL含3% BSA之PBS中。添加結合FITC之抗CD4抗體或結合FITC之同型對照抗體且在室溫下於暗處培育20分鐘。
2.4.2.1.3細胞滲透及用抗磷酸化STAT1抗體標記
在用1×PBS洗滌細胞後，將細胞集結粒再懸浮於100 μL冰冷的1×PBS中且添加900 μL冰冷的100% MeOH。隨後在4℃下培育細胞30分鐘以供滲透。
隨後用含3% BSA之1×PBS洗滌經滲透之細胞，且最後將其再懸浮於80 μL含3% BSA之1×PBX中。
添加20 μL PE小鼠抗STAT1(pY701)或PE小鼠IgG2aκ同型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612564及559319)且混合，隨後在4℃下於暗處培育30分鐘。
隨後用1×PBS洗滌細胞1次，並在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。
2.4.2.1.4在FACSCanto II進行螢光分析
計出50,000個總事件且在淋巴細胞閘中，在對CD4+細胞進行閘控後，量測磷酸化STAT1陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析資料且基於CD4+細胞上磷酸化STAT1陽性細胞之百分比來計算IL-6刺激之抑制百分比。
2.4.2.2磷酸化STAT5分析
對於白血球中GM-CSF刺激之信號轉導及轉錄活化子5(pSTAT5)磷酸化增加，用化合物離體處理自提交知情同意書之人類志願者抽取的人全血30分鐘且隨後用GM-CSF刺激20分鐘。使用抗磷酸化STAT5抗體，藉由FACS量測單核細胞中由GM-CSF引起之STAT5磷酸化增加。
用蒸餾水將5×溶解/固定緩衝液(BD PhosFlow，目錄號558049)稀釋5倍，並在37℃下預加溫。丟棄殘留的經稀釋溶解/固定緩衝液。
將10 μg rhGM-CSF(AbCys S.A.目錄號P300-03)溶解於100 μL含0.1% BSA之PBS中以獲得100 μg/mL儲備液。該儲備液在-80℃下等分儲存。
在DMSO中製備該化合物之3倍稀釋液系列(10 mM儲備液)。對照處理之樣品接受DMSO而非測試化合物。所有樣品在1%最終DMSO濃度下培育。
2.4.2.2.1血液與化合物一起培育且用GM-CSF刺激
將人血液收集於經肝素處理之管中。將血液分成148.5 μL之等分 試樣。隨後，將1.5 μL化合物稀釋液添加至每一等分試樣中且在輕柔搖動下，在37℃下培育血液樣品30分鐘。將GM-CSF儲備液(1.5 μL)添加至血液樣品中(最終濃度20 pg/mL)且在輕柔搖動下，在37℃下培育樣品20分鐘。
2.4.2.2.2白血球製備及CD14標記
在刺激期結束時，立即將3 mL 1X預加溫之溶解/固定緩衝液添加至血液樣品中，短暫渦旋且在水浴中於37℃下培育15分鐘，以便溶解紅血球且固定白細胞，隨後在-80℃下冷凍待用。
對於後續步驟，將管在37℃下解凍，保持約20分鐘，且在4℃下以400×g離心5分鐘。用3 mL冷1×PBS洗滌細胞集結粒，並在離心後，將細胞集結粒再懸浮於100 μL含3% BSA之PBS中。添加FITC小鼠抗CD14抗體(BD Biosciences，目錄號345784)或FITC小鼠IgG2bκ同型對照抗體(BD Biosciences，目錄號555057)且在室溫下於暗處培育20分鐘。
2.4.2.2.3細胞滲透及用抗磷酸化STAT5抗體標記
在用1×PBS洗滌細胞後，將細胞集結粒再懸浮於100 μL冰冷的1×PBS中且添加900 μL冰冷的100% MeOH。隨後在4℃下培育細胞30分鐘以供滲透。
隨後用含3% BSA之1×PBS洗滌經滲透之細胞，且最後將其再懸浮於80 μL含3% BSA之1×PBX中。
添加20 μL PE小鼠抗STAT5(pY694)或PE小鼠IgG1κ同型對照抗體(BD Biosciences，目錄號分別為612567及554680)，混合，隨後在4℃下於暗處培育30分鐘。
隨後用1×PBS洗滌細胞1次，並在FACSCanto II流式細胞儀(BD Biosciences)上分析。
2.4.2.2.4在FACSCanto II進行螢光分析
計出50,000個總事件且在對CD14+細胞進行閘控後，量測磷酸化STAT5陽性細胞。使用FACSDiva軟體分析資料且基於CD14+細胞上磷酸化STAT5陽性細胞之百分比來計算GM-CSF刺激之抑制百分比。
2.5 CTLL2活力分析
該方案描述了針對維持CTLL2之IL2依賴性活力之能力來分析化合物活性的方法。
CTLL2細胞在含10%胎牛血清(FBS，HiClone SV30160.03；1%青黴素/鏈黴素及含ConA之10% T_STIM(BD Biosciences目錄號354115)之RPMI1640培養基(Life Technologies目錄號21875-034)中培養。
在白色384孔板(Greiner,781080)中，將CTLL細胞以每孔1000個細胞接種於20 μL培養基中。
向該等孔中添加10 μL經稀釋化合物(或對照物)。陰性對照物為DMSO稀釋液。最終DMSO濃度為0.1%。
將板在37℃下培育24小時，且隨後使用ATP-lite(Perkin Elmer，目錄號6016739)量測ATP含量。為此，將30 μL ATPlite溶液添加至每一孔中，且在振盪2分鐘且在室溫下於暗處再培育8分鐘後，在針對發光所裝備之PerkinElmer Envision多重讀取器中量測生物發光。
已使用上述分析測試本發明化合物之活性且報告以下IC50值：1806及2442 nM。
2.6 BA/F3活力分析
該方案描述了針對維持BA/F3之IL3依賴性活力之能力來分析化合物活性的方法。
BA/F3細胞在含10%胎牛血清(FBS，HiClone SV30160.03；1%青黴素/鏈黴素及10 ng/mL IL-3(peprotech，目錄號213-13)之RPMI1640培養基(Life Technologies目錄號21875-034)中培養。在白色384孔板(Greiner,781080)中，將BA/F3細胞以每孔1500個細胞接種於20 μL培 養基中。向該等孔中添加10 μL經稀釋化合物(或對照物)。陰性對照物為DMSO稀釋液。最終DMSO濃度為0.1%。
將板在37℃下培育48小時，且隨後使用ATP-lite(Perkin Elmer，目錄號6016739)量測ATP含量。為此，將30 μL ATPlite溶液添加至每一孔中，且在振盪2分鐘且在室溫下於暗處再培育8分鐘後，在針對發光所裝備之PerkinElmer Envision多重讀取器中量測生物發光。
已使用上述分析測試本發明化合物之活性且報告以下IC50值：6903、3678及2670 nM。
實例3. 活體內模型 3.1 CIA模型 3.1.1材料
完全弗氏佐劑(Completed Freund's adjuvant，CFA)及不完全弗氏佐劑(IFA)係購自Difco。牛膠原蛋白II型(CII)、脂多糖(LPS)及Enbrel分別自Chondrex(Isle d'Abeau,France)、Sigma(P4252,L'Isle d'Abeau,France)、Whyett(25 mg可注射之注射器，France)Acros Organics(Palo Alto,CA)獲得。所用所有其他試劑均為試劑級且所有溶劑均為分析級。
3.1.2動物
達克古提大鼠(Dark Agouti rat)(雄性，7-8週齡)係自Harlan Laboratories(Maison-Alfort,France)獲得。大鼠保持12小時之白天/黑夜循環(0700-1900)。溫度維持在22℃，且隨意提供食物及水。
3.1.3膠原蛋白誘發之關節炎(CIA)
實驗前一天，用0.05 M乙酸製備CII溶液(2 mg/mL)且在4℃下儲存。在即將進行免疫之前，在冰水浴中，在預先冷卻之玻璃瓶中用均質機混合等體積之佐劑(IFA)與CII。若未形成乳液，則可能需要額外佐劑及長時間均質化。第1天，將0.2 mL溶液經皮內注射至每隻大鼠 尾巴之基部處，在第9天，執行第二次追加皮內注射(含2 mg/mL CII溶液之CFA 0.1 mL生理食鹽水)。此免疫方法係改編自公開之方法(Sims等人，2004；Jou等人，2005)。
3.1.4研究設計
在大鼠CIA模型中測試化合物之治療作用。將大鼠隨機分入同等組，且每組含10隻大鼠。所有大鼠在第1天進行免疫且在第9天進行追加注射。自第16天至第30天，進行治療性給藥。用媒劑(MC 0.5%)處理陰性對照組且用Enbrel(10 mg/kg，3×週，皮下)處理陽性對照組。通常測試3種劑量之所關注化合物，例如1、3、10 mg/kg，口服。
3.1.5關節炎之臨床評估
根據Khachigian 2006,Lin等人，2007及Nishida等人，2004)之方法，對關節炎進行評分。利用關節炎評分對四隻爪中每一隻之腫脹程度分級如下：0-無症狀；1-輕度，但諸如踝或腕之一種關節類型確定的發紅及腫脹，或侷限於個別趾之明顯發紅及腫脹，不管受影響趾之數量如何；2-中度，兩種或兩種以上關節類型之發紅及腫脹；3-重度，包括趾在內之全部爪均發紅及腫脹；4-最大程度之肢體發炎，涉及多個關節(每隻動物之最大累積臨床關節炎評分為16分)(Nishida等人，2004)。
為了允許多項研究之綜合分析，如下對臨床評分值進行校正：臨床評分之AUC(AUC分數)：計算各個別大鼠自第1天至第14天之曲線下面積(AUC)。用每隻動物之AUC除以在獲得關於該動物之資料之研究中所獲得的媒劑之平均AUC且乘以100(亦即，該AUC表示為每項研究中平均媒劑AUC之百分比)。
臨床評分自第1天至第14天增加(終點分數)：用每隻動物之臨床評分差異除以在獲得關於該動物之資料之研究中所獲得的媒劑之平均臨床評分差異且乘以100(亦即，該差異表示為每項研究中媒劑之平 均臨床評分差異之百分比)。
3.1.6關節炎發作後之體重改變(%)
臨床上，體重減輕與關節炎相關(Shelton等人，2005；Rall,2004；Walsmith等人，2004)。因此，可使用關節炎發作後之體重改變作為評價治療劑在大鼠模型中之作用的非特異性終點。關節炎發作後之體重改變(%)計算如下： 小鼠：
大鼠：
3.1.7放射學
獲取各個別動物之後爪的X射線照片。對每一照片指定隨機不知情身分識別碼，且利用放射線學拉森氏評分系統(Larsen's score system)，由兩個獨立的評分員對骨侵蝕之嚴重程度分級如下：0-正常，具有完整骨輪廓及正常關節間隙；1-略有異常，任一個或兩個外部蹠骨顯示輕微的骨侵蝕；2-確定的早期異常，任何三個至五個外部蹠骨顯示骨侵蝕；3-中度破壞性異常，所有外部蹠骨以及任一個或兩個內部蹠骨顯示確定的骨侵蝕；4-重度破壞性異常，所有蹠骨顯示確定的骨侵蝕且至少一個內部蹠骨關節完全侵蝕，一些骨關節輪廓部分地保留；5-斷肢性異常，無骨輪廓。此評分系統係改編自Salvemini等人，2001；Bush等人，2002；Sims等人，2004；Jou等人，2005。
3.1.8組織學
在放射學分析後，將小鼠之後爪固定於10%磷酸鹽緩衝之福馬林(formalin)(pH 7.4)中，用快速骨脫鈣劑脫鈣以進行精細組織學(Laboratories Eurobio)，且包埋於石蠟中。為確保詳盡地評價關節炎 性關節，切割至少四個連續切片(5 μm厚)且中間每一切片系列為100 μm。用蘇木精及曙紅(H&E)對切片染色。對滑膜炎症以及骨及軟骨損害執行雙盲組織學檢查。在每隻爪中，使用4點量表評估4個參數。該等參數為細胞浸潤、關節翳嚴重程度、軟骨侵蝕及骨侵蝕。如下執行評分：1-正常；2-輕度；3-中度；4-明顯。該四個分數加在一起且表示為另一分數，稱為「RA總分」。
3.1.9踵骨(腓側跗骨)之顯微電腦斷層攝影(μCT)分析：
在RA中觀察到的骨降解尤其出現在皮層骨處且可藉由μCT分析揭露(Sims NA等人，Arthritis Rheum.50(2004)2338-2346：Targeting osteoclasts with zoledronic acid prevents bone destruction in collagen-induced arthritis；OsteL等人，ECTC Montreal 2007：A high throughput method of measuring bone architectural disturbance in a murine CIA model by micro-CT morphometry)。在踵骨掃描及3D容積重建之後，以計算機垂直於骨縱軸分離之每一載片上存在之離散物體的數量來量測骨降解。降解的骨越多，則量測到的離散物體越多。分析沿踵骨均勻分佈(間隔約10.8 μm)之1000個切片。
3.1.10穩態PK
在第7天或第11天，在以下時間點用肝素鋰作為抗凝血劑在眶後竇(retro-orbital sinus)處收集血液樣品：給藥前、1小時、3小時及6小時。對全血樣品進行離心且所得血漿樣品在-20℃下儲存以待分析。藉由LC-MS/MS方法測定每一測試化合物之血漿濃度，在該方法中，質譜儀係以正離子電噴霧模式操作。使用Winnonlin®(Pharsight®,United States)計算藥物動力學參數，且假定給藥前血漿含量等於24小時之血漿含量。
3.2敗血性休克模型
脂多糖(LPS)之注射可誘導可溶性腫瘤壞死因子(TNF-α)迅速釋放 至周圍中。此模型用於分析活體內TNF釋放之推定阻斷劑。
以一次口服預定劑量來處理每組6隻BALB/cJ雌性小鼠(20 g)。30分鐘後，腹膜內注射LPS(15 μg/kg；大腸桿菌血清型0111：B4)。90分鐘後，對小鼠實施安樂死且收集血液。使用市售ELISA套組測定循環TNF α含量。使用***(5 μg/kg)作為參考消炎化合物。
3.3 MAB模型
MAB模型允許快速評估治療劑對RA樣發炎反應之調節(Kachigian LM.Nature Protocols(2006)2512-2516：Collagen antibody-induced arthritis)。對DBA/J小鼠靜脈內注射針對膠原蛋白II之mAb混合液。一天後，起始化合物治療(媒劑：10%(v/v)HPβCD)。三天後，小鼠接受腹膜內LPS注射(50微克/小鼠)，引起炎症之迅速發作。持續化合物治療，直至mAb注射後10天。藉由量測爪腫脹且記錄每隻爪之臨床評分來讀取炎症。提供四肢之累積臨床關節炎評分以顯示炎症之嚴重程度。使用0-4量表，將評分系統應用於每一肢體，其中4分為最嚴重之炎症。
0 無症狀
1 輕度，但諸如踝或腕之一種關節類型確定的發紅及腫脹，或侷限於個別趾之明顯發紅及腫脹，不管受影響趾之數量如何
2 中度，兩種或兩種以上關節類型之發紅及腫脹
3 重度，包括趾在內之全部爪均發紅及腫脹
4 最大程度之肢體發炎，涉及多個關節
3.4腫瘤學模型
Wernig等人，Cancer Cell 13,311,2008及Geron等人，Cancer Cell 13,321,2008描述了用於驗證小分子對JAK2驅動之脊髓增生性疾病之功效的活體內模型。
3.5小鼠IBD模型
Wirtz等人，2007描述了用於驗證小分子對IBD之功效的活體外及活體內模型。
3.6小鼠哮喘模型
Nials等人，2008；Ip等人，2006；Pernis等人，2002；Kudlacz等人，2008描述了用於驗證小分子對哮喘之功效的活體外及活體內模型。
實例4：藥物動力學、DMPK及毒性分析 4.1熱力學溶解性
室溫下，在玻璃小瓶中製備1 mg/mL測試化合物於0.2M磷酸鹽緩衝液(pH 7.4)或0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH 3.0)中之溶液。
室溫下，在Rotator drive STR 4(Stuart Scientific,Bibby)中以速度3.0旋轉該等樣品24小時。
24小時後，將800 μL樣品轉移至艾本德管中且以14000 rpm離心5分鐘。隨後將200 μL樣品上清液轉移至MultiscreenR溶解性板(MultiscreenR Solubility Plate；Millipore,MSSLBPC50)中且藉助於真空岐管將上清液過濾(10-12" Hg)至潔淨的Greiner聚丙烯V型底96孔板(目錄號651201)中。將5 μL濾液稀釋至95 μL(F20)用於在含標準曲線之板(Greiner，目錄號651201)中培育之相同緩衝液中。
在DMSO中新鮮製備化合物之標準曲線，以在DMSO中按2倍稀釋率稀釋之10 mM DMSO儲備液(5000 μM)開始且隨後在DMSO中進一步稀釋直到19.5 μM。隨後，將3 μL如自5000 μM得到之稀釋液系列轉移至97 μL乙腈-緩衝劑混合物(50/50)中。最終濃度範圍為2.5至150 μM。
用密封墊(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)密封板，且在室溫下，在LCMS(ZQ 1525，來自Waters)上，使用Quanoptimize在最佳條 件下量測樣品，以測定該分子之正確質量。
在LCMS上，以1 mL/min流動速率分析樣品。溶劑A為15 mM氨且溶劑B為乙腈。使樣品在來自Waters之XBridge C18 3.5μM(2.1×30 mm)管柱上在正離子噴霧下運行。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且範圍為5% B至95% B。
藉助於Masslynx套裝軟體分析峰面積且將樣品之峰面積對標準曲線作圖以獲得化合物之溶解度。
溶解度值係以μM或μg/mL為單位報導。
4.2水溶性 4.2.1：水溶性2%DMSO程序
以在DMSO中之10 mM儲備液開始，在DMSO中製備化合物之連續稀釋液。將該稀釋液系列轉移至96 NUNC Maxisorb平底板(目錄號442404)中且在室溫下添加0.2M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)或0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH3.0)。
最終濃度範圍為200 μM至2.5 μM，分5個相等的稀釋步驟。最終DMSO濃度不超過2%。將200 μM芘添加至每一96孔板之隅角點，且用作參考點以便在顯微鏡上校準Z軸。
密封分析板且在以230 rpm振盪下，在37℃下培育1小時。隨後，在白光顯微鏡下掃描該等板，得到每一濃度之沈澱物的個別圖像。分析該沈澱物，且轉化成數字，繪製於圖表上。化合物看來完全溶解之第一濃度為所報導之濃度，然而，真實濃度在此濃度與一個更高稀釋步驟之間的某處。
根據此方案量測之溶解度值係以μg/mL為單位報導。
4.2.1：水溶性3%DMSO程序
以在DMSO中之10 mM儲備液開始，在DMSO中製備化合物之連續稀釋液。將該稀釋液系列轉移至96 NUNC Maxisorb平底板(目錄號 442404)中且在室溫下添加0.1M磷酸鹽緩衝液(pH7.4)或0.1M檸檬酸鹽緩衝液(pH3.0)。
最終濃度範圍為300 μM至18.75 μM，分5個相等的稀釋步驟。最終DMSO濃度不超過3%。將200 μM芘添加至每一96孔板之隅角點，且用作參考點以便在顯微鏡上校準Z軸。
密封分析板且在以230 rpm振盪下，在37℃下培育1小時。隨後，在白光顯微鏡下掃描該等板，得到每一濃度之沈澱物的個別圖像。分析該沈澱物，且用軟體工具轉化成數字，其可繪製於圖表上。化合物看來完全溶解之第一濃度為所報導之濃度，然而，真實濃度在此濃度與一個更高稀釋步驟之間的某處。
根據此方案量測之溶解度值係以μg/mL為單位報導。
4.3血漿蛋白結合(平衡透析)
在DMSO中將化合物於DMSO中之10 mM儲備液稀釋5倍。此溶液在新鮮解凍之人類、大鼠、小鼠或犬血漿(BioReclamation INC)中進一步稀釋，且最終濃度為10 μM且最終DMSO濃度為0.5%(在PP-Masterblock 96孔板(Greiner，目錄號780285)中5.5 μL於1094.5 μL血漿中)。
準備具有***物之Pierce Red Device板(ThermoScientific，目錄號89809)且在緩衝液室中填充750 μL PBS並在血漿室中填充500 μL加料血漿。在以230 rpm振盪下，在37℃下培育板4小時。培育後，在96孔圓底PP深孔板(Nunc，目錄號278743)中將兩個腔室中之120 μL轉移至360 μL乙腈中且用鋁箔蓋密封。混合樣品且在冰上置放30分鐘。隨後，在4℃下以1200 rcf離心該板30分鐘，且將上清液轉移至96孔v型底PP板(Greiner,651201)中，以供在LCMS上分析。
用密封墊(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)密封板，且在室溫下，在LCMS(ZQ 1525，來自Waters)上，使用Quanoptimize在最佳條 件下量測樣品，以測定該分子之正確質量。
在LCMS上，以1 mL/min流動速率分析樣品。溶劑A為15 mM氨且溶劑B為乙腈。使樣品在來自Waters之XBridge C18 3.5μM(2.1×30 mm)管柱上在正離子噴霧下運行。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且範圍為5% B至95% B。
來自緩衝液室及血漿室中之化合物的峰面積視為100%化合物。由該等結果導出結合至血漿之百分比且以結合至血漿之百分比報導。
藉由顯微鏡檢查在PBS中最終測試濃度之化合物之溶解度以指示是否觀察到沈澱。
4.4微粒體穩定性 4.4.1微粒體穩定性1小時培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中，在182 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將化合物於DMSO中之10 mM儲備液稀釋1000倍，且在37℃下預培育。
將40 μL脫離子水添加至聚丙烯Matrix 2D條形碼標記之儲存管(Thermo Scientific)之孔中且在37℃下預培育。
在182 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中製備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)工作儲備液且置放於冰上待用。在脫離子水中製備含有MgCl2、葡萄糖-6-磷酸及NADP+之輔因子且置放於冰上待用。
製備含有所關注物種(人類、小鼠、大鼠、犬)之肝微粒體(Xenotech)、先前所述之G6PDH及輔因子的最終工作溶液且此混合物在室溫下培育不超過20分鐘。
在Matrix管中，將30 μL預加熱之化合物稀釋液添加至40 μL預加熱之水中且添加30 μL微粒體混合物。最終反應濃度為3 μM化合物、1 mg微粒體、0.4 U/mL GDPDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸及1.3 mM NADP+。
為量測殘留化合物之百分比，在時間零時，添加MeOH或ACN(1：1)至孔中，隨後添加微粒體混合物。用Matrix Sepra sealsTM(Matrix，目錄號4464)密封板且振盪數秒，以確保所有組分完全混合。
在37℃、300 rpm下培育未停止之樣品且在培育1小時後，用MeOH或ACN(1：1)停止反應。
停止反應後，混合樣品且在冰上置放30分鐘以使蛋白質沈澱。隨後，在4℃下以1200 rcf離心該等板30分鐘，且將上清液轉移至96孔v型底PP板(Greiner,651201)中，以供在LCMS上分析。
用密封墊(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)密封該等板，且在室溫下，在LCMS(ZQ 1525，來自Waters)上，使用Quanoptimize在最佳條件下量測樣品，以測定母分子之正確質量。
在LCMS上，以1 mL/min流動速率分析樣品。溶劑A為15 mM氨且溶劑B為MeOH或乙腈，此取決於所用停止溶液。使樣品在來自Waters之XBridge C18 3.5μM(2.1×30 mm)管柱上在正離子噴霧下運行。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且範圍為5% B至95% B。
時間0時母體化合物之峰面積視為100%殘留。1小時培育後殘留之百分比係自時間0來計算且計算為殘留百分比。藉由顯微鏡檢查在緩衝液中最終測試濃度之化合物之溶解度且報導結果。
有關微粒體穩定性之資料表示為在60分鐘後殘留化合物總量之百分比。
4.4.2微粒體穩定性30分鐘培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中，在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將化合物於DMSO中之10 mM儲備液稀釋至6 μM，且在37℃下預加溫。
在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將700 U/mL之葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶(G6PDH,Roche,10127671001)工作儲備液按1：700之倍率稀釋。在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將含有0.528 M MgCl2.6H2O(Sigma,M2670)、0.528 M葡萄糖-6-磷酸(Sigma,G-7879)及0.208 M NADP+(Sigma,N-0505)之輔因子混合物按1：8之倍率稀釋。
製備含有1 mg/mL所關注物種(人類、小鼠、大鼠、犬...)之肝微粒體(Provider,Xenotech)、0.8 U/mL G6PDH及輔因子混合物(6.6 mM MgCl2、6.6 mM葡萄糖-6-磷酸、2.6 mM NADP+)之工作溶液。在室溫下，將此混合物預培育15分鐘，但決不應超過20分鐘。
預培育後，一起添加等量之化合物稀釋液及含有微粒體之混合物，且在300 rpm下培育30分鐘。對於0分鐘之時間點，將2體積之MeOH添加至化合物稀釋液中，之後添加微粒體混合物。在培育期間，最終濃度為：3 μM測試化合物或對照化合物、0.5 mg/mL微粒體、0.4 U/mL G6PDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸及1.3 mM NADP+。
培育30分鐘後，用2體積MeOH停止反應。
在兩個時間點，混合樣品，離心且收集上清液以在LC-MS/MS上進行分析。參考零時間點樣品之儀器反應(亦即，峰高度)(作為100%)以便測定殘留化合物之百分比。在分析設計中包括標準化合物普萘洛爾(Propanolol)及維拉帕米(Verapamil)。
有關微粒體穩定性之資料表示為在30分鐘後殘留化合物總量之百分比。
4.5 Caco2滲透性
如下文所述執行雙向Caco-2分析。Caco-2細胞係自歐洲細胞培養物收藏中心(European Collection of Cell Cultures，ECACC；目錄號86010202)獲得且在24孔Transwell板(Fisher TKT-545-020B)中細胞培養21天後使用。
將2×105個細胞/孔接種於由DMEM+GlutaMAXI+1% NEAA+10% FBS(FetalClone II)+1%青黴素/鏈黴素組成之平板培養基中。每2至3天更換培養基。
在含有25 mM HEPES(pH7.4)之漢克斯氏平衡鹽溶液(Hanks' Balanced Salt Solution)中製備測試化合物及參考化合物(普萘洛爾及若丹明123(rhodamine123)或長春花鹼，均購自Sigma)，並以10 μM濃度添加至Transwell板組件之頂室(125 μL)或底側室(600 μL)中，且最終DMSO濃度為0.25%。
將50 μM螢光黃(Lucifer Yellow，Sigma)添加至所有孔中之供體緩衝液中，藉由監測螢光黃之滲透來評估細胞層之完整性。由於螢光黃(LY)無法自由地滲透親脂性障壁，故LY之高轉運程度指示細胞層之不良完整性。
在迴旋振盪器處以150 rpm振盪之同時，在37℃下培育1小時後，自頂室(A)及底室(B)取得70 μL等分試樣且添加至96孔板中之100 μL含有分析型內標物(0.5 μM卡馬西平(carbamazepine))之50：50乙腈：水溶液中。
在含有150 μL來自底側面及頂面之液體的潔淨96孔板中，用Spectramax Gemini XS(Ex 426 nm及Em 538 nm)量測螢光黃。
藉由高效液相層析法/質譜法(LC-MS/MS)量測樣品中化合物之濃度。
由以下關係計算表觀滲透性(Papp)值：Papp=[化合物]受體最終×V受體/([化合物]供體最終×V供體)/Tinc×V供體/表面積×60×10-6 cm/s
V=腔室體積
Tinc=培育時間
表面積=0.33 cm2
使用Papp B>A/Papp A>B之比率來計算流出率，作為來自頂室表面之活性流出物的指示。
使用以下分析驗收標準：普萘洛爾：Papp(A>B)值20(×10-6 cm/s)
若丹明123或長春花鹼：Papp(A>B)值<5(×10-6 cm/s)，且流出率5。
螢光黃滲透性：100 nm/s
4.6 MDCKII-MDR1滲透性
MDCKII-MDR1細胞為馬丁達比犬(Madin-Darby canine)腎上皮細胞，過表現人多重藥物抗性(MDR1)基因，編碼P-醣蛋白(P-gp)。細胞係自荷蘭癌症研究院(Netherlands Cancer Institute)獲得，且在24孔Millicell細胞培養***板(Millipore,PSRP010R5)中進行細胞培養3至4天後使用。如下文所述執行雙向MDCKII-MDR1滲透性分析。
將3×105個細胞/毫升(1.2×105個細胞/孔)接種於由DMEM+1% Glutamax-100+1%抗生素/抗真菌劑+10% FBS(Biowest,S1810)組成之平板培養基中。使細胞在含CO2之恆溫箱中保持3至4天。接種後24小時及實驗當天更換培養基。
在杜貝卡氏磷酸鹽緩衝生理食鹽水(D-PBS,pH7.4)中製備測試化合物及參考化合物(安普那韋(amprenavir)及普萘洛爾)且以10 μM(在安普那韋情況下為0.5 μM)最終濃度添加至Millicell細胞培養***板組件之頂室(400 μL)或底側室(800 μL)中，且最終DMSO濃度為1%。
將100 μM螢光黃(Sigma)添加至所有供體緩衝液中，以便藉由監測螢光黃之滲透來評估細胞單層之完整性。螢光黃為針對旁細胞路徑之螢光標記物，且其用作每一單層中之內對照物以在該分析期間驗證緊密連接之完整性。
在迴旋振盪器處以150 rpm振盪之同時，在37℃下培育1小時後， 自頂室(A)及底室(B)取得75 μL等分試樣且添加至96孔板中之225 μL含有分析型內標物(10 ng/mL華法林(warfarin))之乙腈：水溶液(2：1)中。在實驗開始時，亦執行供體溶液之等分試樣以獲得初始(Co)濃度。
藉由高效液相層析法/質譜法(LC-MS/MS)量測樣品中化合物之濃度。
在含有150 μL來自所有接受器孔(底側面或頂面)之液體的96孔板中，用Fluoroscan Ascent FL Thermo Scientific(Ex 485 nm及Em 530 nm)量測螢光黃。
4.7微粒體穩定性 4.7.1微粒體穩定性1小時培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中，在182 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將化合物於DMSO中之10 mM儲備液稀釋1000倍，且在37℃下預培育。
將40 μL脫離子水添加至聚丙烯Matrix 2D條形碼標記之儲存管(Thermo Scientific)之孔中且在37℃下預培育。
在182 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中製備葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)工作儲備液且置放於冰上待用。在脫離子水中製備含有MgCl2、葡萄糖-6-磷酸及NADP+之輔因子且置放於冰上待用。
製備含有所關注物種(人類、小鼠、大鼠、犬)之肝微粒體(Xenotech)、先前所述之G6PDH及輔因子的最終工作溶液且此混合物在室溫下培育不超過20分鐘。
在Matrix管中，將30 μL預加熱之化合物稀釋液添加至40 μL預加熱之水中且添加30 μL微粒體混合物。最終反應濃度為3 μM化合物、1 mg微粒體、0.4 U/mL GDPDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸及1.3 mM NADP+。
為量測殘留化合物之百分比，在時間零時，添加MeOH或ACN(1：1)至孔中，隨後添加微粒體混合物。用Matrix Sepra sealsTM(Matrix，目錄號4464)密封板且振盪數秒，以確保所有組分完全混合。
在37℃、300 rpm下培育未停止之樣品且在培育1小時後，用MeOH或ACN(1：1)停止反應。
停止反應後，混合樣品且在冰上置放30分鐘以使蛋白質沈澱。隨後，在4℃下以1200 rcf離心該等板30分鐘，且將上清液轉移至96孔v型底PP板(Greiner,651201)中，以供在LCMS上分析。
用密封墊(MA96RD-04S,www.kinesis.co.uk)密封該等板，且在室溫下，在LCMS(ZQ 1525，來自Waters)上，使用Quanoptimize在最佳條件下量測樣品，以測定母分子之正確質量。
在LCMS上，以1 mL/min流動速率分析樣品。溶劑A為15 mM氨且溶劑B為MeOH或乙腈，此取決於所用停止溶液。使樣品在來自Waters之XBridge C18 3.5μM(2.1×30 mm)管柱上在正離子噴霧下運行。溶劑梯度具有2分鐘之總運行時間且範圍為5% B至95% B。
時間0時母體化合物之峰面積視為100%殘留。1小時培育後殘留之百分比係自時間0來計算且計算為殘留百分比。藉由顯微鏡檢查在緩衝液中最終測試濃度之化合物之溶解度且報導結果。
有關微粒體穩定性之資料表示為在60分鐘後殘留化合物總量之百分比。
4.7.2微粒體穩定性30分鐘培育程序
在96深孔板(Greiner，目錄號780285)中，在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將化合物於DMSO中之10 mM儲備液稀釋至6 μM，且在37℃下預加溫。
在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將700 U/mL之葡萄糖-6-磷酸脫 氫酶(G6PDH,Roche,10127671001)工作儲備液按1：700之倍率稀釋。在105 mM磷酸鹽緩衝液(pH7.4)中將含有0.528 M MgCl2.6H2O(Sigma,M2670)、0.528 M葡萄糖-6-磷酸(Sigma,G-7879)及0.208 M NADP+(Sigma,N-0505)之輔因子混合物按1：8之倍率稀釋。
製備含有1 mg/mL所關注物種(人類、小鼠、大鼠、犬...)之肝微粒體(Provider,Xenotech)、0.8 U/mL G6PDH及輔因子混合物(6.6 mM MgCl2、6.6 mM葡萄糖-6-磷酸、2.6 mM NADP+)之工作溶液。在室溫下，將此混合物預培育15分鐘，但決不應超過20分鐘。
預培育後，一起添加等量之化合物稀釋液及含有微粒體之混合物，且在300 rpm下培育30分鐘。對於0分鐘之時間點，將2體積之MeOH添加至化合物稀釋液中，之後添加微粒體混合物。在培育期間，最終濃度為：3 μM測試化合物或對照化合物、0.5 mg/mL微粒體、0.4 U/mL G6PDH、3.3 mM MgCl2、3.3 mM葡萄糖-6-磷酸及1.3 mM NADP+。
培育30分鐘後，用2體積MeOH停止反應。
在兩個時間點，混合樣品，離心且收集上清液以在LC-MS/MS上進行分析。參考零時間點樣品之儀器反應(亦即，峰高度)(作為100%)以便測定殘留化合物之百分比。在分析設計中包括標準化合物普萘洛爾及維拉帕米。
有關微粒體穩定性之資料表示為在30分鐘後殘留化合物總量之百分比。
4.8在齧齒動物中進行之藥物動力學研究 4.8.1動物
史泊格多利大鼠(Sprague-Dawley rat)(雄性，5-6週齡)係自Janvier(法國)獲得。處理前使大鼠適應環境至少7天，且保持12小時之白天/黑夜循環(0700-1900)。溫度維持在約22℃，且隨意提供食物 及水。投與測試化合物之前2天，大鼠經歷手術，在異氟烷麻醉下將導管置放於頸靜脈中。手術後，將大鼠單獨圈養。在口服給藥前至少16小時及之後6小時使大鼠禁食。隨意提供水。
4.8.2藥物動力學研究
在PEG200/生理食鹽水(60/40)中(對於靜脈內途徑)以及在0.5%甲基纖維素及10%羥丙基-β-環糊精pH 3中(對於口服途徑)調配化合物。以單次食道管飼法經口給與5 mg/kg測試化合物，給藥體積為5 mL/kg；以及以快速注射法經由尾靜脈經靜脈內給與1 mg/kg測試化合物，給藥體積5 mL/kg。每組由3隻大鼠組成。利用肝素鋰作為抗凝血劑，在以下時間點經由頸靜脈收集血液樣品：0.05小時、0.25小時、0.5小時、1小時、3小時、5小時及8小時(靜脈內途徑)，以及0.25小時、0.5小時、1小時、3小時、5小時、8小時及24小時(口服途徑)。或者，利用肝素鋰作為抗凝血劑，在以下時間點於眶後竇處收集血液樣品：0.25小時、1小時、3小時及6小時(口服途徑)。以5000 rpm離心全血樣品10分鐘且所得血漿樣品在-20℃下儲存以待分析。
4.8.3血漿中化合物含量之定量
藉由LC-MS/MS方法測定每一測試化合物之血漿濃度，在該方法中，質譜儀係以正離子電噴霧模式操作。
4.8.4藥物動力學參數之測定
使用Winnonlin®(Pharsight®,United States)計算藥物動力學參數。
4.9 7天之大鼠毒性研究
以雄性史泊格多利大鼠執行利用測試化合物之7天口服毒性研究，以評估藉由管飼法在每天100、300及500 mg/kg之日劑量(恆定劑量體積為每天5 mL/kg)下之毒性潛能及毒物動態學。
在含30%(v/v)HPβCD之純水中調配測試化合物。每組包括5隻主 要的雄性大鼠以及3隻觀察動物(satellite animal)用於毒物動態學分析。第四組以相同頻率、劑量體積且藉由相同投藥途徑僅給與含30%(v/v)HPβCD之水，且充當媒劑對照組。
該研究之目標係測定不能鑑別出不良事件(無可觀察之不良反應水準-NOAEL)的最低劑量。
4.10肝細胞穩定性
McGinnity等人，Drug Metabolism and Disposition 2008,32,11,1247描述了評價肝細胞中之代謝清除率的模型。
4.11 QT延長之傾向
在hERG膜片鉗分析中評估QT延長之潛力。
4.10習知之全細胞膜片鉗
使用由Pulse v8.77軟體(HEKA)控制之EPC10放大器執行全細胞膜片鉗記錄。串聯電阻通常小於10 MΩ且經補償超過60%，記錄未進行漏減。電極係由GC150TF移液管玻璃(Harvard)製造。
外部浸浴溶液含有：135 mM NaCl、5 mM KCl、1.8 mM CaCl2、5 mM葡萄糖、10 mM HEPES，pH 7.4。
內部膜片移液管溶液含有：100 mM葡糖酸鉀、20 mM KCl、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5mM Na2ATP、2 mM麸胱甘肽、11 mM EGTA、10 mM HEPES，pH 7.2。
使用Biologic MEV-9/EVH-9快速灌注系統灌注藥物。
所有記錄均在穩定表現hERG通道之HEK293細胞上執行。在使用兩個鉑棒(Goodfellow)錨定於記錄室中之12 mm圓形蓋片(German glass,Bellco)上培養細胞。使用持續1000 ms之+40 mV啟動脈衝隨後持續2000 ms之-50 mV尾電流脈衝來誘發hERG電流，保持電位為-80 mV。每20秒施加脈衝，且所有實驗均在室溫下執行。
熟習此項技術者將理解，前述描述為示範性及說明性的，且意 欲說明本發明及其較佳實施例。經由常規實驗，技術人員將認識到在不偏離本發明精神之情況下可作出之明顯修改及變更。因此，預期本發明不由以上描述界定，而是由以下申請專利範圍及其等效物界定。
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本說明書中引用之所有出版物，包括(但不限於)專利及專利申請案，均以引用之方式併入本文中，就如同特定且個別地指示各個別出版物係如同完整陳述一般以引用之方式併入本文中。
自前述描述，本發明組合物及方法之各種修改及改變將為熟習此項技術者所知。在所附申請專利範圍之範疇內的所有該等修改均意欲包括在其中。
應瞭解，諸如各種化合物之不同細胞滲透能力之因素可有助於在活體外生物化學及細胞分析中區分各化合物之活性。
本申請案中所提供且陳述之本發明化合物之化學名稱中至少一部分可為利用市售化學命名軟體程式自動生成且未獨立進行驗證。執行此功能之代表性程式包括Open Eye Software,Inc.銷售之Lexichem命名工具及MDL,Inc.銷售之Autonom軟體工具。在指定化學名稱與所描繪之結構不同的情況下，將以所描繪之結構為準。
本文所示化學結構係使用ChemDraw®或ISIS®/DRAW製定。出現在本文結構中之碳、氧或氮原子上之任何開放價態均指示氫原子之存在。當結構中存在對掌性中心但未顯示關於該對掌性中心之具體立體化學時，該結構涵蓋與該對掌性結構有關之兩種對映異構體。

Claims (10)

  1. 一種根據式I之化合物， 或醫藥學上可接受之鹽，或溶劑合物，或該等醫藥學上可接受之鹽之溶劑合物
  2. 一種醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑及醫藥有效量之如請求項1之化合物
  3. 如請求項2之醫藥組合物，其包含另一治療劑。
  4. 如請求項1之化合物，或如請求項2或3之醫藥組合物，其用於製造藥劑。
  5. 如請求項1之化合物，或如請求項2或3之醫藥組合物，其用於製造供治療或預防過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病的藥劑。
  6. 如請求項1之化合物或其醫藥學上可接受之鹽，或如請求項2或3之醫藥組合物，其用於醫藥中。
  7. 如請求項1之化合物，或如請求項2或3之醫藥組合物，其用於治療或預防過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病。
  8. 一種用於治療或預防過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟 骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病之方法，其包括投與足以實現該治療或預防之量的如請求項1之化合物，或如請求項2或3之醫藥組合物。
  9. 如請求項6之方法，其中如請求項1之化合物，或如請求項2或3之醫藥組合物係與另一治療劑組合投與。
  10. 如請求項3之醫藥組合物，或如請求項7之方法，其中該另一治療劑為用於治療或預防過敏性或發炎病況、自體免疫疾病、增生性疾病、移植排斥反應、涉及軟骨代謝減弱之疾病、先天性軟骨畸形及/或與IL6或干擾素分泌過多有關之疾病的藥劑。
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