CN106119384A - 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了嗜水气单胞菌在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用，并提供了一种嗜水气单胞菌核酸分析方法，用上下游引物对待分析核酸进行扩增，利用扩增核酸样本制备待测样本，利用遗传分析仪对待测样本进行检测分析，其中扩增过程中使用的上游引物为5’‑ GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT‑3’，下游引物为5’‑ GAGCGGCTGGATGCGGTTGT ‑3’。本发明中提供的嗜水气单胞菌的核酸分析方法可用于法医检测中，用以判断溺亡者是否真正死于溺亡。

Description

一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用
技术领域
本发明涉及法医学领域，具体涉及一种嗜水气单胞菌核酸的分析方法以及该分析方法在判断溺亡者真实死因上的应用。
背景技术
在法医学检案实践中，时常遇到溺死案件的检验鉴定。由于我国江河湖海众多，环境复杂，以及尸体腐败等因素影响，溺死鉴定问题一直为法医病理学工作者所关注。尽管硅藻检验作为鉴定溺死的重要辅助手段已得到普遍认可，但易受尸检，取材和检验过程污染。单从水中尸体的肺检出硅藻不足以鉴定溺死，多器官未检出硅藻亦不能排除溺死，故硅藻检验的作用受到一定限制。国内外许多学者已研究了一些其他辅助鉴定溺死的方法，如血液生物化学，组织化学，叶绿素（A）等检验技术。但各种方法均存在一定误差和局限性。因此，鉴定溺死时最好采用多种检验方法进行综合分析判定。能够研发出一种高灵敏、高检出率的广泛应用于确定溺死者是否真正溺死、有助于溺死区域的检测方法和技术，对于当前法医行业具有重要的意义。
与传统的硅藻形态学检验方法相比，PCR扩增技术检测微生物DNA标记用于溺死鉴定主要有以下优点： ①检测范围广，除可应用于藻类分类及鉴定外，还可用于小微型浮游生物及不能用显微镜进行形态辨别的浮游生物检验；②灵敏度高，所需样本量明显小于传统硅藻检验法；③可用于推断死因是否真正为溺死。利用浮游生物的保守序列从DNA中分离出各种类的变异序列，可以在定性的同时揭示群落特征，如进一步建立不同水域和同一水域不同时间浮游生物群落特征变化监控***，并与传统硅藻检验法相结合，对溺死鉴定则有更重要的实用价值。
发明内容
发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供了一种对嗜水气单胞菌的分析方法，以及利用对嗜水气单胞菌的分析方法在法医检测中，具体是在判断溺亡者真实死因上的应用。
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛分布于自然界的各种水体，是多种水生动物的原发性致病菌，该菌是弧菌科气单胞菌属，为革兰氏阴性短杆菌，极端单鞭毛，没有芽胞和荚膜，刚从病灶上分离的病原菌常两个相连。在普通琼脂平板培养基上进行培养形成的菌落圆形、边缘光滑、中央凸起、肉色、灰白色或略带淡桃红色有光泽，发育良好。嗜水气单胞菌在水温14.0-40.5℃范围内都可繁殖，以28.0-30.0℃为最适温度。PH 值在6-11范围内均可生长；最适PH 值为7.27；嗜水气单胞菌可在含盐量0‰-4‰的水生存，最适盐度为0.5‰。从溺亡者脏器中提取嗜水气单胞菌核酸并用PCR技术进行扩增，然后进行检测并与水样中的嗜水气单胞菌核酸进行比对，通过检出率和核酸测序结果的比对，即可判断溺亡者是否真正死于溺亡，同时有助于找出真正的溺亡区域。
本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：
本发明中提供一种嗜水气单胞菌在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。
本发明提供一对检测嗜水气单胞菌的引物对，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示。
本发明还提供一种嗜水气单胞菌核酸分析方法，利用上述引物对待分析核酸进行扩增，利用扩增产物制备待测样本，对待测样本进行核酸分析。进一步地，上游引物5’端均以FAM荧光标记。
本发明提供一种嗜水气单胞菌核酸分析方法，分析方法为：PCR反应体系为20μL，内含10μL Taq酶，上下游引物各0.75μL，7.5μL去离子水，1μL待分析核酸；PCR循环参数：94℃预变性10min；94℃变性40s，分别于55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，最后在72℃继续延伸10min，将温度降至4℃保存待使用，即得核酸PCR扩增产物样本。
待测样本的制备方法为将样本核酸PCR扩增产物、甲酰胺、ILSCC500混合，其中样本核酸PCR产物、甲酰胺、ILSCC500的体积分别为1μL、9μL、1μL。
本发明还提供一种上述嗜水气单胞菌核酸分析方法在法医检测过程中的应用，具体是应用于判断溺亡者是否真正死于溺亡。
进一步地，所述的应用方法为：取溺水者脏器组织，提取该脏器组织中的核酸，使用如权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，对其进行检测分析，确认PCR扩增产物是否来源于嗜水气单胞菌，根据嗜水气单胞菌的检出率判断溺亡者是否真正为溺亡。
本发明还提供一种判断溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡区域的方法，具体为：取溺水者脏器组织，检测脏器组织中是否含有嗜水气单胞菌，根据检测结果判断溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡区域。该判断方法中，检测脏器中是否含有嗜水气单胞菌的方法可使用本发明中使用的嗜水气单胞菌核酸分析方法。
本发明具有如下有益效果：
1、本发明提出了嗜水气单胞菌在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。
2、本发明中提供了一种对嗜水气单胞菌核酸分析方法，提供了分析该核酸序列的上游引物及下游引物，并同时提供了相适配的扩增方法及具体的扩增参数，并将该方法引用到利用嗜水气单胞菌判断溺亡者真正死因的应用中。
3、本发明还提供了将上述嗜水气单胞菌核酸分析方法应用于法医检测中的应用，在溺亡者脏器中提取嗜水气单胞菌核酸并用PCR技术进行扩增，然后进行检测并与水样中的嗜水气单胞菌核酸进行比对，通过检出率和核酸测序结果的比对，即可判断溺亡者是否真正死于溺亡，同时有助于找出真正的溺亡区域。
附图说明
附图1为本发明中嗜水气单胞菌；
附图2为毛细管电泳仪检测分析脏器中嗜水气单胞菌核酸结果（正向引物荧光标记）；
附图3 为本发明实施例中嗜水气单胞菌核酸扩增产物测序结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细的说明。
实施例1 引物设计及引物特异性证明
根据嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila ）的haemolysin基因设计出一对上下游引物：
上游引物（如SEQ ID NO.1所示）：
5’- GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT-3’，
下游引物（如SEQ ID NO.2所示）：
5’- GAGCGGCTGGATGCGGTTGT -3’。
实施例2 引物对的异性验证
利用上述引物对对不同样本的DNA进行PCR扩增，上游引物5’端均以FAM荧光标记，选取多种水中微藻、常见微生物以及不同样本的DNA进行特异性验证。
附图中标号对应的DNA样本来源对应如下：
1、Marker 2、衣藻 3、土壤藻 4、四列藻 5、假鱼腥藻 6、骨条藻 7、脆杆藻 8、满江红鱼腥藻 9、扁藻 10、女人 11、男人 12、舟行藻 13、小环藻 14、菱形藻 15、针杆藻 16、直链藻 17、小球藻 18、蓝藻 19、硅鞭金藻 20、白色念珠菌 21、嗜水气单胞菌 22、阴性对照 23、Marker
扩增后，通过银染显带，得到如附图1所示结果。由附图1结果可见，只有21号样本显阳性，即可证明上述引物可以特异扩增嗜水气单胞菌
实施例3 小鼠组对照实验
人为溺死小鼠组（n=15）、小鼠机械处死后入水组（n=15）和非溺死小鼠的空白对照组（n=5）肝、肾（体循环脏器）的检材中提取的藻类DNA在相同条件下经本文引物PCR扩增，银染显带，显示阳性结果的判定为检出，检出率结果见表1。经χ2检验，生前入水组与死后入水组各种脏器间阳性率具有统计学差异（P<0.05，表1）。
表1 嗜水气单胞菌在各组实验小鼠体循环脏器检出例数及阳性率
由上述实验结果可看出，利用本发明中的方法，对小鼠脏器中的DNA进行扩增，利用检出阳性结果来确认小鼠死因的方法检出率可达93%，考虑到溺亡过程中吸入水的不同及个体差异，可认定本发明中的方法可有效判断小鼠是否真正为溺死，同时可协助判断溺亡水域。
进一步地，由实施例中数据可看出，肝脏中的检出率比肾脏要高。
实施例4 嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用
利用实施例设计的引物对可以设计一种嗜水气单胞菌核酸分析方法，本实施例中将本发明中的嗜水气单胞菌核酸分析方法应用于法医检测中，具体应用于确认溺水者是否为溺亡以及寻找溺对应的溺亡区域。本实施例中采用的溺水者确认为真实溺水死亡人员。
法医检测步骤为如下：
步骤一：
剪取溺水者脏器组织；
步骤二：
提取该脏器组织中的核酸，使用实施例1中的引物进行PCR扩增；
步骤2中，利用核酸提取仪提取脏器组织中的核酸，扩增过程中使用的上游引物为5’-GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT-3’，下游引物为5’- GAGCGGCTGGATGCGGTTGT -3’。
正向引物5’端均以FAM荧光标记，能实现在毛细管电泳仪中的荧光检测。
PCR反应体系为20μL，内含10μL Taq酶，上下游引物各0.75μL，7.5μL去离子水，1μL待分析核酸；PCR循环参数：94℃预变性10min；94℃变性40s，分别于55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，最后在72℃继续延伸10min，将温度降至4℃保存待使用，即得核酸PCR产物样本。其中上下游引物浓度为10pmol/μL。
待测样本的制备方法为将样本核酸PCR扩增产物、甲酰胺、ILSCC500混合，其中样本核酸PCR产物、甲酰胺、ILSCC500的体积为1μL、9μL、1μL。
步骤三：
对上述样本核酸的PCR扩增产物（待测样本）进行检测分析。
本实施例中，核酸分析使用的仪器为ABI3130XL遗传分析仪，也可采用其他有效分析仪器。
利用毛细管电泳仪检测分析脏器中嗜水气单胞菌核酸结果（正向引物荧光标记）如附图2所示，结果表明，阳性样本的PCR产物结果为127bp大小的条带，即可判断该样本中含有嗜水气单胞菌，该样本可判定为溺水身亡，与已知死因相符。
PCR扩增产物测序图如附图3所示。
PCR扩增产物测序为：TGGCTGGATGCGGTTGTGATCCACGTCGTAGCCCATGCCCCAGACGGTGGCCGTCTTGGAGGAGAGCAGGGACTCCGCGGTCGCGTATTGATCGCGCACCCAGCTGAAACTCACCTTCTGGGCG。
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明实施例的技术方案而非对其进行限制，尽管参照较佳实施例对本发明实施例进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解依然可以对本发明实施例的技术方案进行修改或者等同替换，而这些修改或者等同替换亦不能使修改后的技术方案脱离本发明实施例技术方案的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市刑事科学技术研究所
<120> 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 引物β-actinF1
<400> 1
GCCGAGCGCCCAGAAGGTGAGTT 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 引物β-actinR1
<400> 2
GAGCGGCTGGATGCGGTTGT 20

Claims (10)

1.嗜水气单胞菌在判断溺亡者是否真正死于溺亡的应用。
2.一对检测嗜水气单胞菌的引物对，其特征在于，所述引物对包括上游引物和下游引物，上游引物的序列如SEQ IDNo.1所示，下游引物的序列如SEQ IDNo.2所示。
3.一种嗜水气单胞菌核酸分析方法，其特征在于：利用权利要求1所述引物对待分析核酸进行扩增，利用扩增产物制备待测样本，对待测样本进行核酸分析。
4.如权利要求3所述嗜水气单胞菌核酸分析方法，其特征在于：上游引物5’端均以FAM荧光标记。
5.如权利要求3所述嗜水气单胞菌核酸分析方法，其特征在于：PCR反应体系为20μL，内含10μL Taq酶，上下游引物各0.75μL，7.5μL去离子水，1μL待分析核酸；PCR循环参数：94℃预变性10min；94℃变性40s，分别于55℃退火40s，72℃延伸40s，共35个循环，最后在72℃继续延伸10min，将温度降至4℃保存待使用，即得核酸PCR扩增产物样本。
6.如权利要求3所述嗜水气单胞菌核酸分析方法，其特征在于：待测样本的制备方法为将样本核酸PCR扩增产物、甲酰胺、ILSCC500混合，其中样本核酸PCR产物、甲酰胺、ILSCC500的体积分别为1μL、9μL、1μL。
7.一种如权利要求3-6任一所述嗜水气单胞菌核酸分析方法在法医检测过程中的应用，其特征在于：具体是应用于判断溺亡者是否真正死于溺亡。
8.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述的应用方法为：取溺水者脏器组织，提取该脏器组织中的核酸，使用如权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，对其进行检测分析，确认PCR扩增产物是否来源于嗜水气单胞菌，根据嗜水气单胞菌的检出率判断溺亡者是否真正为溺亡。
9.一种判断溺亡者是否真正死于溺亡和/或找出真正溺亡区域的方法，其特征在于：取溺水者脏器组织，检测脏器组织中是否含有嗜水气单胞菌，根据检测结果判断溺亡者是否真正死于溺亡，以及找出真正的溺亡区域。
10.如权利要求9所述方法，其特征在于：所述检测脏器中是否含有嗜水气单胞菌的方法参照如权利要求3-6任一所述嗜水气单胞菌核酸分析方法。
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