CN102337349A - 一种多重pcr快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法 - Google Patents
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Abstract
一种应用多重PCR快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法。利用嗜水气单胞菌16rDNA基因保守区序列、外毒素基因以及群体感应信号基因序列设计三对引物，建立多重PCR的快速检测方法。该方法特异性高，操作方便，检测成本低，时间短，能同时检测大批量样品，可以标准化为产品，可以满足检验检疫部门大批量检测水产动物致病性嗜水气单胞菌的需要。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测致病性嗜水气单胞菌的分子生物学方法，本发明还涉及该方法在水产动物嗜水气单胞菌疾病诊断上的应用。
背景技术
随着水产动物集约化养殖规模的不断扩大，其病害发生日益频繁，严重制约了水产养殖业的健康发展。水产动物疾病病原众多，用传统的微生物分离培养再做鉴定已经不能满足水产动物病害防治的需要。因此，建立快速、准确、灵敏的病原检测方法是及时控制和预防疾病发生的前提。传统的微生物学检测方法，费时费力，一般需要5-7d,另外免疫学方法如ELISA等则需要制备血清，并且其灵敏度相对较低，特异性差，难以推广。自从PCR技术建立以来，其灵敏度高、特异性强、操作简便快速等优点，使得该技术在疾病诊断中得以广泛应用。单一PCR尽扩增一个基因，不能准确确定某一病原菌的特性，多重PCR则增加了其准确性。
发明内容：
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种多重PCR检测致病性嗜水气单胞菌的方法。
本发明的另一个目的是将上述建立的方法在水产动物疾病诊断中的应用。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
1、 DNA模板的制备
①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物并在组织、心、肝、血液等，匀浆，取1.0ml，10000g离心10min,沉淀用蒸馏水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1ml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，10000g离心10min,上清液即为DNA模板。
②取健康相同水生动物的①中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。
2、多重PCR三对引物分别为：A：Aero, B: 16S rDNA, C: QS
3、 多重PCR反应体系为：
10×PCR buffer 2.5μL（已加Mg2+，终浓度为1.5mmol/L）
dNTP mixture 2μL (终浓度为0.25mmol/L)
引物 上下游各2μL（终浓度0.5μmol/L）
DNA模板 1μL
Ex Taq 1μL
ddH2O 14.51μL
总体积 251μL
4、多重PCR反应条件94℃ 5min；65℃ 1min；72℃ 2min，30个循环，72延迟10min。
5、取10μL多重PCR反应产物，按常规DNA琼脂糖凝胶电泳方法检测，凝胶浓度为0.8-1.2%。在凝胶成像***中照相，如出现图1的条带则致病菌为嗜水气单胞菌。
为尽量避免多重PCR检测嗜水气单胞菌带来的假阳性，将3对引物同时在一个PCR体系中进行扩增，构成多重PCR检测法。三对引物分别是根据嗜水气单胞菌的16Sr DNA保守序列基因、溶血素基因和群体感应信号分子基因设计的，对致病性嗜水气单胞菌有较强的特异性。与普通PCR检测方法相比，本发明采用多重PCR有更高的特异性和准确性；与免疫学方法ELISA检测方法相比，多重PCR省事省力，检测时间短、实验条件相对要求低。
附图说明
图1是运用多重PCR检测致病性嗜水气单胞菌电泳结果图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1
1、无菌操作取具有嗜水气单胞菌（A. hydrophila）（具体操作和鉴定参照Chopra A.K., Houston C.W., Peterson J.W. & Jin G.-F. (1993)Cloning, expression, and sequence analysis of a cytolytic enterotoxin gene from Aeromonas hydrophila. Canadian Journal of Microbiology 39, 513–523.，菌种鉴定人为） 感染典型临床症状的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）溃烂的肌肉组织10g，用匀浆器匀浆。取匀浆液1g装入1.5ml离心管中10000g离心10min，弃上清，沉淀用蒸馏水重悬，再10000g离心10min，加入1ml蒸馏水重悬，盖上离心管，放入沸水中煮沸10min,10000g离心10min,将上清转移至一新无菌离心管中，作为多重PCR的DNA模板。
2、DNA模板的制备
①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物并在组织、心、肝、血液等，匀浆，取1.0ml，10000g离心10min,沉淀用蒸馏水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1ml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，10000g离心10min,上清液即为DNA模板。
②取健康相同水生动物的①中相同组织按上述方法制的的DNA模板为阴性模板。
3、多重PCR三对引物分别为：A：Aero, B: 16S rDNA, C: QS
4、多重PCR反应体系为：
10×PCR buffer 2.5μL（已加Mg2+，终浓度为1.5mmol/L）
dNTP mixture 2μL (终浓度为0.25mmol/L)
引物 上下游各2μL（终浓度0.5μmol/L）
DNA模板 1μL
Ex Taq 1μL
ddH2O 14.51μL
总体积 251μL
5、PCR反应过程
取200μLPCR反应管，在反应管中分别加入10×PCR缓冲液2.5μL、dNTP混合液终浓度0.25mmol/L，引物A、B、C上下游引物各2μL，DNA模板1μL，Ex Taq酶2U，加入双蒸水至总体积25μL，将PCR反应管放入PCR仪中，以94℃ 5min；94℃1min,65℃ 2min,72℃2min，30个循环；72℃延续10min扩增，终止PCR反应，取10μL进行DNA凝胶电泳，在凝胶成像***中能看到如图1的三条清晰条带，证明引起该异育银鲫疾病的病原为致病性嗜水气单胞菌，这三条带从大到小分别是QS基因：900bp; 16S rDNA基因：685bp; Aero基因：462bp。（证明依据，具体参照Dorsch M., Ashbolt N.J., Cox P.T. & Goodman A.E. (1994)Rapid identification of Aeromonas species using 16S rDNAtargeted oligonucleotide primers: a molecular approach based on screening of environmental isolates. Journal of Applied Bacteriology 77, 722–726。
Swift S, Karlyshev AV, Fish L, Durant EL, Winson MK, Chhabra SR, Williams P, Macintyre S, Stewart GS: Quorum sensing in Aeromonas hydrophila and Aeromonas salmonicida: identification of the LuxRI homologs AhyRI and AsaRI and their cognate N-acylhomoserine lactone signal molecules. J. Bacteriol. 1997, 179: 5271-5281。）
SEQUENCE LISTING
<110> 中华人民共和国江苏出入境检验检疫局，中国药科大学
<120> 一种多重PCR快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaaaggttga tgcctaatac gta 23
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<212> DNA
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<213> 人工序列
<400> 5
tcagatgtct ccatttcagt gtt 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ccatgactgt caattgcagg atc 23
Claims (1)
1.一种应用多重PCR快速检测致病性嗜水气单胞菌的方法，其特征按一下步骤：
DNA模板的制备
①取具有嗜水气单胞菌感染自然发病的水产动物病灶组织、心、肝、血液等，匀浆，取1.0ml，10000g离心10min,沉淀用蒸馏水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1ml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，10000g离心10min,上清液即为DNA模板；
②取健康相同水生动物的心、肝、血液等，匀浆，取1.0ml，10000g离心10min,沉淀用蒸馏水悬浮，再10000g离心10min，将沉淀悬浮于1ml的蒸馏水中，沸水煮8-10min，10000g离心10min,上清液即为DNA阴性模板；
多重PCR三对引物分别为：A：Aero1、Aero2, B: 16S rDNA1、16S rDNA1、, C: QS1、QS2
多重PCR反应体系为：
10×PCR buffer 2.5μL（已加Mg2+，终浓度为1.5mmol/L）
dNTP mixture 2μL (终浓度为0.25mmol/L)
引物 上下游各2μL（终浓度0.5μmol/L）
DNA模板 1μL
Ex Taq 1μL
ddH2O 14.51μL
总体积 251μL
多重PCR反应条件94℃ 5min；65℃ 1min；72℃ 2min，30个循环，72延迟10min；
取10μL多重PCR反应产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳，凝胶浓度为0.8-1.2%。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106119384A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-11-16 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用 |
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2011
- 2011-11-09 CN CN2011103512563A patent/CN102337349A/zh active Pending
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|---|---|---|---|---|
| CN106119384A (zh) * | 2016-08-04 | 2016-11-16 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用 |
| CN106119384B (zh) * | 2016-08-04 | 2019-12-20 | 广州市刑事科学技术研究所 | 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用 |
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