CN106957913B

CN106957913B - 一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法

Info

Publication number: CN106957913B
Application number: CN201710193091.9A
Authority: CN
Inventors: 王荦; 常亚青; 丁君
Original assignee: Dalian Ocean University
Current assignee: Dalian Ocean University
Priority date: 2017-03-28
Filing date: 2017-03-28
Publication date: 2020-06-16
Anticipated expiration: 2037-03-28
Also published as: CN106957913A

Abstract

一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，用于检测的三组探针VF2、VF3和VF4，探针序列如下：VF2(5’‑3’)：CGTTATCAACTTGCGATGCTGTAGGGGTG；VF3(5’‑3’)：CTTAGCTGCCTAACTTCTTGAGAACGAACC G；VF4(5’‑3’)：GGTGTCGTTAATAGCGGCATCTCTTGA；将探针经氨基修饰后，制成基因芯片，将待测样品DNA提取后，进行PCR扩增后，进行荧光标记，与基因芯片杂交后，利用扫描仪检测结果。优点是：该方法能快速高效检测海胆致病菌强壮弧菌，并且特异性高和敏感性强的特点，提高了鉴定海胆养殖区环境及生物体致病菌强壮弧菌的能力。

Description

一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法

技术领域

本发明涉及一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法。

背景技术

随着海胆养殖业的发展及养殖环境的污染，海胆养殖业面临着严重的病害威胁。其中，强壮弧菌是引起海胆细菌性疾病的一种重要致病菌。

对于海产品病原菌检测及鉴定的现阶段大多数都停留在微生物学检验水平上，但其存在培养周期长，操作繁琐，特异性差等缺点；并且自然环境可供培养的微生物仅有不到1％，给检测带来了一定的困难。而细菌检测基因芯片多采用细菌学上较保守的基因，如16SrRNA基因，但由于其信息位点较少，因此构建的***稳定性较差，用于鉴定亲缘关系较接近的细菌，容易产生偏差，引起假阳性，影响检测结果的准确性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，该检测方法可以快速、准确鉴定海胆致病菌强壮弧菌，并且具有灵敏度高的特点。

本发明的技术解决方案是：

一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其具体步骤是：

(1)基因芯片的制作

用于检测的三组探针VF2、VF3和VF4，探针序列如下：

VF2(5’-3’)：CGTTATCAACTTGCGATGCTGTAGGGGTG；

VF3(5’-3’)：CTTAGCTGCCTAACTTCTTGAGAACGAACCG；

VF4(5’-3’)：GGTGTCGTTAATAGCGGCATCTCTTGA；

将VF2、VF3和VF4探针在5’端加上15个T的间隔臂，并在探针5’端进行氨基修饰；用双蒸水将经氨基修饰的探针稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；使用点样仪在醛基化基片上进行非接触式点样，然后将点样后的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海胆致病菌强壮弧菌的基因芯片；

(2)待测样品DNA提取

将环境中的水样、泥样或生物样品进行取样，然后提取待测样品的DAN，备用；

(3)样品PCR扩增

用于检测强壮弧菌(Vibrio fortis)引物是：

VF2和VF3探针使用的引物基因序列如下：

上游引物：CTTTACTCGCGTAACCTTGA；

下游引物：CCATCGTAGCCCTTTCTGT；

VF4探针使用的引物基因序列如下：

上游引物：CTGGAACTGAGACACGGTCC；

下游引物：GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT；

将步骤(2)提取的样品的DNA作为扩增模板，分别以探针对应的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

(4)PCR扩增产物与芯片杂交

将PCR扩增产物进行荧光标记，将基因芯片进行预杂交，然后，将经荧光标记后的PCR扩增产物与经预杂交的基因芯片进行杂交，离心干燥后，放于微阵列芯片扫描仪上检测，收集检测结果，在探针点样位置具有特异性信号，判定为阳性，在探针点样位置未出现特异性信号，为阴性。

进一步的，步骤(3)进行PCR扩增时，首先在95℃预变性5min；然后95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

进一步的，预杂交时，使用鲑精DNA用预杂交缓冲液稀释后进行预杂交。

进一步的，预杂交缓冲液与鲑精DNA的体积比为10:1。

本发明的有益效果：

以membrane protein为靶基因设计特异性探针，通过基因芯片技术检测强壮弧菌，具有快速、灵敏、准确性高、重复性强的特点，该方法能快速高效检测海胆致病菌强壮弧菌，并且特异性高和敏感性强，提高了鉴定海胆养殖区环境及生物体致病菌强壮弧菌的能力，避免了检测过程中假阴性的发生。

附图说明

图1为强壮弧菌VF2和VF3特异性探针基因芯片验证结果图；

图2为强壮弧菌VF4特异性探针基因芯片验证结果图；

图3为强壮弧菌VF2和VF3特异性探针基因芯片的检测结果；

图4为副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用VF4特异性探针基因芯片的检测结果；

图5为强壮弧菌VF4特异性探针基因芯片的检测结果。

具体实施方式

实施例1探针的设计及合成

1、目标检测菌种及靶基因

本发明选择海胆养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌强壮弧菌作为检测对象，使用membrane protein为靶基因；

2、探针设计

本发明采用18-30bp的寡核苷酸探针。探针参数基本要求是特异性和高效性的杂交，应满足以下条件：①探针Tm值保持相近，在上下10℃范围内浮动；②形成二聚体和发夹结构的连续互补碱基数少于4个；③探针与非目标基因序列的连续匹配碱基数少于7个碱基；④探针与目标基因的错配碱基数少于4个碱基。

本发明针对海胆致病菌强壮弧菌共设计3条探针，如表1所示：

表1探针信息表

3、探针合成

将表1的探针在5’端加上15个T的间隔臂，以减少DNA杂交时的空间位阻，提高杂交效率。同时在探针5’端进行氨基修饰，以备下一步与玻璃片上的醛基交联，将探针固定在玻片上。如表2所示：

表2

实施例2基因芯片的制作

利用实施例1设计的探针制备用于海胆养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌强壮弧菌，具体步骤如下：

1、探针母液的配制

用双蒸水将合成的探针(表2)稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；

2、点样前的准备

取100μL移至96孔板的A1、B1、C1孔，在D1孔加入100μL点样缓冲液；

3、点样

用美国Bio-Dot公司的AD1500基因芯片点样仪按照预先设定好的程序在醛基化基片上进行非接触式点样；每点点样量为0.5μL，点直径为200μm，点心间距为1.5mm，点样时环境相对湿度55-65％，温度23℃；

4、基因芯片的制备

将表2中经合成的检测探针以点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次；

5、点样后的处理

将点完样的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海胆致病菌强壮弧菌的基因芯片。

实施例3

用于检测海胆养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌强壮弧菌基因芯片(实施例2制备的)的使用方法，具体步骤如下：

1、待测样品采集及处理

将获得的水样用8μm无菌滤膜除去杂质，之后用0.22μm的滤膜过滤并收集滤膜，用无菌铝箔包裹，-20℃下保存；

泥样取自养殖环境底部2-5cm处底泥100g，采集样品于冰盒中运送至实验室；

海胆(动物样品)用无菌剪刀剪取，无菌水冲洗3次，装入冻存管，放入液氮保存。

2、模板DNA制备

水样和泥样DNA分别用OMEGA水样DNA提取试剂盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，海胆样品致病菌DNA用天根细菌基因组试剂盒提取。

3、引物和探针的设计

从强壮弧菌致病弧菌相应基因序列以及部分相邻菌种的上述基因的序列，进行多基因序列比对，对每种致病菌引物进行设计，从而建立了由3条寡核苷酸探针和2对引物组成的检测海胆养殖区环境及生物体中重要的常见致病菌强壮弧菌基因芯片。

表3强壮弧菌的靶基因的扩增引物

4、PCR扩增

(1)PCR反应体系

将表4中所示试剂分别加入PCR管中，震荡混匀，瞬时离心。

表4 PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		Mix	12.5
上游引物(20μmol/L)	0.2
		下游引物(20μmol/L)	1
模板DNA	1
		ddH<sub>2</sub>O	10.3

(2)PCR反应条件

将提取的DNA作为PCR扩增模板，分别以对应的引物和PCR扩增条件进行反应，用1％琼脂糖凝胶电泳检测、观察PCR扩增效果。

表5 PCR反应条件

5、荧光标记PCR产物

(1)取各模板PCR合并后的产物8μL于无菌的0.2mL离心管中，作为模板；

(2)向每个样品管中加入杂交缓冲液8μL和1μL，震荡混匀，瞬时离心

(3)将离心后的样品管放入PCR仪，99℃变性3min，立即冰浴3min，瞬时离心，然后，进行下一步芯片杂交。

6、杂交

(1)芯片预杂交

①将预杂交缓冲液在50℃预热；

②预杂交缓冲液与鲑精DNA按照体积比10:1的比例混合，置于PCR仪上99℃变性5min，立即冰浴3min，然后用移液器加到芯片的点样区，用适当大小的原位杂交专用盖玻片覆盖点样区；

③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，1h；预杂交结束后，用ddH2O冲洗，后离心干燥。

(2)样品与芯片杂交

①将芯片正面朝上，平放于桌面，将芯片围栏贴于各点样区之间，放上芯片盖片(有凸台的一面朝向芯片)，上端先接触芯片，再缓缓盖下；

②用移液器通过盖玻片加样孔缓慢注入16μL荧光标记后的样品，样品会凭借液体表面张力在盖玻片下面的凹台和芯片表面之间形成一道液膜；(注意：不要震动盖片或芯片，以免破坏液膜。)

③将芯片放入湿盒，置于水浴锅，65℃，2h，避光；

④杂交完毕的芯片依次用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)、洗液C(0.1×SSC)在振荡培养箱中150r/min各洗15min。

7、扫描芯片

芯片洗涤完毕后，离心干燥，放于微阵列芯片扫描仪上检测，电脑收集数据。

8、结果判定

一个有效的杂交结果要符合二点要求：(1)空白点的信号平均值，即背景平均值要小于10；(2)质控点信号的平均值要高于背景平均值10倍以上。阳性杂交信号还要符合：(1)阳性点的信号平均值要高于背景平均值10倍以上；(2)阳性点与质控点的平均值比值要在0.4以上。非特异性信号的判定标准为：(1)阳性点与质控点的平均值比值要小于0.35；(2)非特异性点的信号平均值要小于8倍的背景平均信号值。

实施例4

将实施例2制备得到的用于检测海胆致病菌强壮弧菌的基因芯片的特异性效果验证

将VF2和VF3探针以点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次，做成基因芯片。将海胆致病菌强壮弧菌实验菌株靶基因的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后再进行杂交显色，用于基因芯片特异性验证。验证结果如图1所示。

将VF4探针以点阵形式分布在醛基基片上，每条探针重复3次，做成基因芯片。将实验海胆致病菌强壮弧菌菌株靶基因的扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测合格后再进行杂交显色，用于基因芯片特异性验证。验证结果如图2所示。

这3条探针都能特异性结合海胆致病菌强壮弧菌的靶基因，无非特异性杂交信号。因此，所有自主设计的探针具有高度的特异性。

实施例5

将实施例2制备得到的用于检测海胆养殖区环境及生物体中重要的致病菌强壮弧菌的基因芯片的具体应用效果检测

采用模式菌株：强壮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用VF2和VF3探针制作的基因芯片利用发明方法进行检测；其中，强壮弧菌的检测结果如图3所示，在相应VF2和VF3探针的点样位置，有特异性信号；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用本发明的探针进行检测，均没有特异性信号，其检测结果如图4所示。采用模式菌株：强壮弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用VF4探针制作的基因芯片利用本发明方法进行检测；其中，强壮弧菌的检测结果如图5所示，在相应探针的点样位置，有特异性信号；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鳗弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌用本发明的探针进行检测，均没有特异性信号，其检测结果与图4相同，未出现特异性信号。

从海胆养殖池的随机选取海胆样品用无菌剪刀剪取，无菌水冲洗3次，然后用天根细菌基因组试剂盒提取海胆致病菌DNA，用VF2和VF3探针制作的基因芯片利用本发明方法进行检测，在基因芯片的相应VF2和VF3探针点样位置，具有特异性信号(其检测结果与图3相同)，该样品海胆致病菌强壮弧菌呈阳性。将本发明的基因芯片对海胆致病菌强壮弧菌进行灵敏度评价，将海胆致病菌强壮弧菌进行梯度稀释，基因芯片检测下限为650拷贝的基因组DNA，检测灵敏度和PCR相当。

从预养殖海胆的养殖池内将获得的水样用8μm无菌滤膜除去杂质，之后用0.22μm的滤膜过滤并收集滤膜，用无菌铝箔包裹，-20℃下保存；泥样取自养殖环境底部2-5cm处底泥100g，采集样品于冰盒中运送至实验室；水样和泥样DNA分别用OMEGA水样DNA提取试剂盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，将水样和泥样中提取的DNA用VF4探针制作的基因芯片利用本发明方法进行检测，在基因芯片的相应VF4探针点样位置，具有特异性信号(其检测结果与图5相同)，该样品养殖区海胆致病菌强壮弧菌呈阳性。

以上仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连海洋大学

<120> 一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 1

cgttatcaac ttgcgatgct gtaggggtg 29

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 2

cttagctgcc taacttcttg agaacgaacc g 31

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 3

ggtgtcgtta atagcggcat ctcttga 27

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 4

ctttactcgc gtaaccttga 20

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 5

ccatcgtagc cctttctgt 19

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 6

ctggaactga gacacggtcc 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 7

ggagttagcc ggtgcttctt 20

Claims

1.一种海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其特征是：

具体步骤是：

（1）基因芯片的制作

用于检测的三组探针VF2、 VF3和 VF4，探针序列如下：

VF2，5’-3’：CGTTATCAACTTGCGATGCTGTAGGGGTG；

VF3，5’-3’：CTTAGCTGCCTAACTTCTTGAGAACGAACCG；

VF4，5’-3’：GGTGTCGTTAATAGCGGCATCTCTTGA；

将VF2、 VF3和 VF4探针在5’端加上15个T的间隔臂，并在探针5’端进行氨基修饰；用双蒸水将经氨基修饰的探针稀释成100μmol/L的母液，再用点样缓冲液稀释至浓度20μmol/L；使用点样仪在醛基化基片上进行非接触式点样，然后将点样后的芯片放到盛有探针固定增效剂的可密闭的敞口容器内，密闭后静置于30℃烘箱过夜，得到用于检测海胆致病菌强壮弧菌的基因芯片；

（2）待测样品DNA提取

将环境中的水样、泥样或生物样品进行取样，然后提取待测样品的DNA，备用；

（3）样品PCR扩增

用于检测强壮弧菌（Vibrio fortis）引物是：

VF2和VF3探针使用的引物基因序列如下：

上游引物：CTTTACTCGCGTAACCTTGA；

下游引物：CCATCGTAGCCCTTTCTGT；

VF4探针使用的引物基因序列如下：

上游引物：CTGGAACTGAGACACGGTCC；

下游引物：GGAGTTAGCCGGTGCTTCTT；

将步骤（2）提取的样品的DNA作为扩增模板，分别以探针对应的引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；

（4）PCR扩增产物与芯片杂交

将PCR扩增产物进行荧光标记，将基因芯片进行预杂交，然后，将经荧光标记后的PCR扩增产物与经预杂交的基因芯片进行杂交，离心干燥后，放于微阵列芯片扫描仪上检测，收集检测结果，在探针点样位置具有特异性信号，判定为阳性，在探针点样位置未出现特异性信号，为阴性；

该方法为非疾病的诊断和治疗方法。

2.根据权利要求1所述的海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其特征是：步骤（3）进行PCR扩增时，首先在95℃预变性5min；然后95℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其特征是：预杂交时，使用鲑精DNA用预杂交缓冲液稀释后进行预杂交。

4.根据权利要求3所述的海胆致病菌强壮弧菌的检测方法，其特征是：预杂交缓冲液与鲑精DNA的体积比为10:1。