CN107502678A - 一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 - Google Patents
一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107502678A CN107502678A CN201710997320.2A CN201710997320A CN107502678A CN 107502678 A CN107502678 A CN 107502678A CN 201710997320 A CN201710997320 A CN 201710997320A CN 107502678 A CN107502678 A CN 107502678A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sample
- dna
- plasmid
- pcr
- blue algae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 title claims abstract description 57
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims abstract description 55
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims abstract description 41
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 25
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims abstract description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 15
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims abstract description 14
- 239000002352 surface water Substances 0.000 claims abstract description 11
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims abstract description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 8
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims abstract description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 27
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 18
- 230000004087 circulation Effects 0.000 claims description 16
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 claims description 14
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 14
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 13
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 12
- 239000003292 glue Substances 0.000 claims description 12
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 7
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 claims description 7
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 6
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 claims description 6
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 4
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 230000009182 swimming Effects 0.000 claims description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000010977 jade Substances 0.000 claims description 2
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 claims 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 108010067094 microcystin Proteins 0.000 description 9
- SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N Cyanoginosin Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](C)[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(=C)N(C)C(=O)CC[C@H](C(O)=O)N(C)C(=O)[C@@H](C)[C@@H]1\C=C\C(\C)=C\[C@H](C)[C@@H](O)CC1=CC=CC=C1 SRUWWOSWHXIIIA-UKPGNTDSSA-N 0.000 description 8
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 7
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 241001062009 Indigofera Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- NWFNSTOSIVLCJA-UHFFFAOYSA-L copper;diacetate;hydrate Chemical compound O.[Cu+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O NWFNSTOSIVLCJA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 1
- 238000002242 deionisation method Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000012851 eutrophication Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 231100000784 hepatotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- -1 mcy) Code generation Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008239 natural water Substances 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 244000038651 primary producers Species 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置，该方法包括：取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；以获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；选取饱满的单菌落接种于培养液中振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品浓度与临界循环数对应的标准曲线；取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置，特别是涉及一种利用藻毒素产毒基因检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置。
背景技术
湖泊水体富营养化会引发蓝藻水华的爆发，蓝藻水华已成为我国乃至世界所面临的重大环境污染问题之一。蓝藻水华中有部分蓝藻能产生藻毒素，例如铜绿微囊藻，铜绿微囊藻是水体中最为常见的蓝藻，它是水体中的初级生产者，在水环境中发挥着重要的作用。铜绿微囊藻可以产生微囊藻毒素(microcystin，MC)，它是一种环状的寡肽肝毒素，在全世界很多国家的天然水体中都能检测到微囊藻毒素。微囊藻毒素(microcystin，MC)影响浮游植物、无脊椎动物和脊椎动物的生长。MC可以导致水体内细菌、原生动物和其他浮游植物(包括硅藻和绿藻)中毒，抑制它们生长繁殖，改变食物链结构，使得铜绿微囊藻成为优势藻种。MC不仅对水体中其他生物具有危害作用，而且还对湖泊、河流生态、牲畜和人类水源供给带来负面影响，研究表明，生活在蓝藻水华高发地区的人群，肝癌发病率要明显高于其他地区，因此，针对产微囊藻毒素蓝藻的检测的研究已成为环保领域的研究热点。
通过形态学观察等传统微生物方法来区分产毒和不产毒蓝藻是极其困难的。现有研究结果表明，MC由微囊藻毒素基因簇(microcystin synthetase gene clusters，mcy)编码生成，基因簇位于染色体上，包含由10个基因组成的两个方向相反的操纵子，除了基因mcyA和mcyB，基因mcyD也参与了MC的编码合成，其中基因mcyD参与编码合成MC的Adda(Adda是微囊藻毒素毒性表达所必需的基团)，而Adda与MC的毒性密切相关，每个产MC的蓝藻中只有一个mcyD的基因拷贝,因此可以通过检测mcyD基因的拷贝数来检测产微囊藻毒素蓝藻。
现有技术一般采用PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应)技术扩增mcyD片段来实现产毒蓝藻的检测，但是采用一般的PCR技术扩增mcyD片段只能定性区分蓝藻是否产微囊藻毒素，不能定量检测水体中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
发明内容
为克服上述现有技术存在的不足，本发明之目的在于提供一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置，以提供一种操作简便、易于掌握并可快速准确的测定地表水中产微囊藻毒素蓝藻的浓度的产微囊藻毒素蓝藻的定量检测技术。
为达上述及其它目的，本发明提出一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，包括如下步骤：
步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；
步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；
步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；
步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；
步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；
步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。
进一步地，于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息为：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’，下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’；反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟；最后通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物。
进一步地，于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
进一步地，于步骤四中，将经步骤三纯化后的DNA***质粒载体中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
进一步地，于步骤五中，选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。
进一步地，步骤七进一步包括：
加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；
设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照；
进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；
反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，并分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
进一步地，于步骤七中，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒。
为达到上述目的，本发明还提供一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置，包括：
DNA样本提取单元，用于通过取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；
PCR扩增单元，以所述DNA样本提取单元获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；
纯化单元，用于对PCR扩增产物进行纯化；
质粒转化单元，用于将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；
鉴定分析单元，用于选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；
标准曲线建立单元，用于将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
定量PCR检测单元，用于取所述DNA样本提取单元得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。
进一步地，所述PCR扩增单元采用PCR反应体系为50μL，引物信息为：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’，下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’；反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟；最后通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物。
进一步地，所述定量PCR检测单元通过如下步骤实现：
加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；
设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照；
进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；
反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，并分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
与现有技术相比，本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置通过设计微囊藻毒素合成酶基因mcyD的引物，提取待检测样本的DNA，进行定量PCR检测，根据标准曲线计算出待测样本的mcyD基因的拷贝数和产微囊藻毒素蓝藻的浓度，实现了一种操作简便、易于掌握且可以快速准确的测定地表水中产微囊藻毒素蓝藻的浓度的产微囊藻毒素蓝藻检测技术。
附图说明
图1为本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法的步骤流程图；
图2为本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置的***架构图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例并结合附图说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭示的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明亦可通过其它不同的具体实例加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不背离本发明的精神下进行各种修饰与变更。
图1为本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法的步骤流程图。如图1所示，本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，包括如下步骤：
步骤101，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。
步骤102，以步骤101获得的DNA样本为模板进行PCR扩增。具体地，PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’。反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟。通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。
步骤103，对PCR扩增产物进行纯化：利用DNA胶回收试剂盒(例如Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒)进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功；
步骤104，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落。具体地，将步骤103中纯化后的DNA***质粒载体pMD18-T中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落；
步骤105，选取饱满的单菌落(即挑选步骤104中转化好的单个白色菌落)接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析，在本发明具体实施例中，步骤105通过PCR方法和公司测序进行鉴定和测序分析，具体地，将挑取的单个白色菌落扩大培养，以此为模板进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行电泳分析，观察目的片段大小，确认是否将目的片段成功转入到质粒中，同时将PCR产物胶回收纯化，送去测序，以进一步验证目的片段是否成功转入到质粒中；
步骤106，将经过鉴定分析的步骤104中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，进行梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
步骤107，取步骤101中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR的测定获得待测样本，根据标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。具体地，加入实时定量PCR所需试剂(例如按照Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行操作)，反应体系为20μL，2μLDNA样品，同时设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照，进行实时定量PCR反应(例如应用ABI公司的Stepone plus Detection System)，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，进而分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
以下将通过一具体实施例来进一步说明本发明的检测过程：
1)取7月、8月和9月地表水水样进行产微囊藻毒素蓝藻的定量分析。水样经过微孔过滤后，将滤膜保存至-20℃，用于后续实验分析。实验结束后进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。
2)以步骤1)中的DNA样本为模板进行PCR扩增，反应体系为50μL。引物信息如下：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’、下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’。反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟。通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物；
3)对目标基因(即PCR扩增产物)进行纯化：利用Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒进行胶回收，对目标基因进行纯化，通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功；
4)质粒转化过程：将步骤3)中纯化后的DNA***质粒载体pMD18-T中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落；
5)选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，用于菌液PCR鉴定和测序分析；
6)将经过鉴定分析的步骤4)中的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线y＝-0.3123x+14.002，R2＝0.9961；
7)取步骤1)中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR的测定获得待测样本，根据标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。按照Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行操作，加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品。同时设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照。应用ABI公司的Stepone plus Detection System进行实时定量PCR反应，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数(见表1)，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，进而分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
表1水样中产微囊藻毒素基因mcyD的拷贝数
图2为本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置的***架构图。如图2所示，本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置，包括：DNA样本提取单元201、PCR扩增单元202、纯化单元203、质粒转化单元204、鉴定分析单元205、标准曲线建立单元206以及定量PCR检测单元207。
DNA样本提取单元201，用于通过取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本。
PCR扩增单元202，用于以DNA样本提取单元201获得的DNA样本为模板进行PCR扩增。具体地，PCR反应体系为50μL，引物信息如下：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’。反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟。通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认产物。
纯化单元203，用于对PCR扩增产物进行纯化。在本发明具体实施例中，纯化单元203利用DNA胶回收试剂盒(例如Axygen的DNA柱式胶回收试剂盒)进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％(wt/vol)的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
质粒转化单元204，用于将纯化后的DNA进行质粒转化，获得转化了质粒的白色菌落。具体地，将纯化单元203纯化后的DNA***质粒载体pMD18-T中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
鉴定分析单元205，用于选取饱满的单菌落(即挑选质粒转化单元204中转化好的单个白色菌落)接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析，在本发明具体实施例中，鉴定分析单元205通过PCR方法和公司测序进行鉴定和测序分析，具体地，鉴定分析单元205将挑取的单个白色菌落扩大培养，以此为模板进行PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行电泳分析，观察目的片段大小，确认是否将目的片段成功转入到质粒中，同时将PCR产物胶回收纯化，送去测序，以进一步验证目的片段是否成功转入到质粒中；
标准曲线建立单元206，用于将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，进行梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线。
定量PCR检测单元207，用于取DNA样本提取单元201中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR的测定获得待测样本，根据标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。具体地，定量PCR检测单元207加入实时定量PCR所需试剂(例如按照Premix Ex TaqTM试剂盒说明进行操作)，反应体系为20μL，2μLDNA样品，同时设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照，进行实时定量PCR反应(例如应用ABI公司的Stepone plus Detection System)，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒；反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，进而分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
综上所述，本发明一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置通过设计微囊藻毒素合成酶基因mcyD的引物，提取待检测样本的DNA，进行定量PCR检测，根据标准曲线计算出待测样本的mcyD基因的拷贝数和产微囊藻毒素蓝藻的浓度，实现了一种操作简便、易于掌握且可以快速准确的测定地表水中产微囊藻毒素蓝藻的浓度的产微囊藻毒素蓝藻检测技术。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何本领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围，应如权利要求书所列。
Claims (10)
1.一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，包括如下步骤：
步骤一，取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；
步骤二，以步骤一获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；
步骤三，对PCR扩增产物进行纯化；
步骤四，将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；
步骤五，选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；
步骤六，将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
步骤七，取步骤一中得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。
2.如权利要求1所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于：于步骤二中，采用PCR反应体系为50μL，引物信息为：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’，下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’；反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟；最后通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物。
3.如权利要求1所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于：于步骤三中，利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收，对PCR扩增产物进行纯化，并通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认回收是否成功。
4.如权利要求1所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于：于步骤四中，将经步骤三纯化后的DNA***质粒载体中，并进一步转化到DH5α感受态大肠杆菌溶液，然后涂布到加入Amp抗性的LB固体培养基上，通过蓝白斑筛选，挑选转化了质粒的白色菌落。
5.如权利要求1所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于：于步骤五中，选取饱满的单菌落接种于含有Amp的液体LB培养液中，于37℃、200转/分钟振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析。
6.如权利要求1所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于，步骤七进一步包括：
加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；
设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照；
进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；
反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，并分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
7.如权利要求6所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法，其特征在于：于步骤七中，采用两步法进行PCR扩增，反应条件为：预变性，1个循环，95℃30秒；PCR反应，40个循环，95℃5秒，60℃30秒。
8.一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置，包括：
DNA样本提取单元，用于通过取地表水水样，经过微孔过滤后，将滤膜进行总DNA提取纯化，得到DNA样本；
PCR扩增单元，以所述DNA样本提取单元获得的DNA样本为模板进行PCR扩增；
纯化单元，用于对PCR扩增产物进行纯化；
质粒转化单元，用于将纯化后的DNA进行质粒转化过程，获得转化了质粒的白色菌落；
鉴定分析单元，用于选取饱满的单菌落接种于培养液中，并振荡培养过夜，以用于菌液PCR鉴定和测序分析；
标准曲线建立单元，用于将经过鉴定分析的白色菌落提取质粒，测定质粒浓度后，梯度稀释，将稀释后的质粒作为标准样品，建立标准样品的浓度与临界循环数对应的一元线性回归曲线，即得到标准曲线；
定量PCR检测单元，用于取所述DNA样本提取单元得到的DNA样本作为模板，进行定量PCR测定获得待测样本，根据所述标准曲线确定待测样本中的DNA浓度。
9.如权利要求8所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置，其特征在于：所述PCR扩增单元采用PCR反应体系为50μL，引物信息为：上游引物5’-GCCCACAAAACCCCAACTC-3’，下游引物5’-TTTCTGCCTAATCTTTTCCCCTCT-3’；反应程序为：95℃预变性5分钟，随后94℃30秒，退火温度60℃40秒和72℃延伸40秒，进行30个循环，最终72℃延伸10分钟；最后通过1.5％的琼脂糖凝胶电泳确认PCR扩增产物。
10.如权利要求8所述的一种检测产微囊藻毒素蓝藻的装置，其特征在于，所述定量PCR检测单元通过如下步骤实现：
加入实时定量PCR所需试剂，反应体系为20μL，2μLDNA样品；
设置进行阴性对照和阳性对照，以去离子水作为阴性对照，以产微囊藻毒素蓝藻的DNA作为阳性对照；
进行实时定量PCR反应，进行PCR扩增；
反应结束后，将DNA样本的循环阈值Ct与标准曲线对照，计算DNA样本的mcyD基因的拷贝数，从而得到原水中mcyD基因的拷贝数，并分析得到水样中产微囊藻毒素蓝藻的浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710997320.2A CN107502678A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201710997320.2A CN107502678A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107502678A true CN107502678A (zh) | 2017-12-22 |
Family
ID=60701952
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201710997320.2A Pending CN107502678A (zh) | 2017-10-24 | 2017-10-24 | 一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107502678A (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108796103A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-13 | 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司 | 一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法 |
| CN109706212A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-03 | 苏州高新区自来水有限公司 | 水中蓝藻快速检测方法 |
| CN111902546A (zh) * | 2018-03-26 | 2020-11-06 | 巴克曼实验室国际公司 | 量化物质中的生物负荷的方法 |
| WO2023035334A1 (zh) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司 | 一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品 |
-
2017
- 2017-10-24 CN CN201710997320.2A patent/CN107502678A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111902546A (zh) * | 2018-03-26 | 2020-11-06 | 巴克曼实验室国际公司 | 量化物质中的生物负荷的方法 |
| CN108796103A (zh) * | 2018-07-04 | 2018-11-13 | 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司 | 一种检测产2-甲基异莰醇菌株的标准品及制备、检测方法 |
| CN109706212A (zh) * | 2019-01-24 | 2019-05-03 | 苏州高新区自来水有限公司 | 水中蓝藻快速检测方法 |
| WO2023035334A1 (zh) * | 2021-09-13 | 2023-03-16 | 上海城市水资源开发利用国家工程中心有限公司 | 一种定量检测藻蓝蛋白的方法及其专用标准品 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107502678A (zh) | 一种检测产微囊藻毒素蓝藻的方法及装置 | |
| CN105177135B (zh) | 一种微小卡罗藻的检测方法 | |
| CN105331714B (zh) | 一种荔枝霜疫霉菌lamp引物及其快速检测方法 | |
| CN101974522B (zh) | 用于马鹿茸真伪鉴别的引物及探针、试剂盒和方法 | |
| CN103352078A (zh) | 一种基于lamp技术检测大豆尖镰孢菌的方法及使用的引物组合物 | |
| CN109468395A (zh) | 一种检测支原体的引物、试剂盒、检测方法和应用 | |
| CN103820554B (zh) | 检测番茄溃疡病菌的交叉引物恒温扩增试剂盒及专用引物 | |
| CN102676664B (zh) | 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法 | |
| CN107345246B (zh) | 一种硅藻rbcL基因分析方法及其在法医检测中的应用 | |
| CN102634580B (zh) | 同时检测多种致病菌的检测用引物及检测方法 | |
| CN105296479B (zh) | 一种桑树青枯病鉴定的特异性引物及其应用 | |
| CN112176080B (zh) | 特异性检测剑麻紫色卷叶病植原体的巢式pcr引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN106119384B (zh) | 一种嗜水气单胞菌核酸分析方法及在法医检测中的应用 | |
| CN104946754A (zh) | 一种定量检测土壤中青枯菌的方法及其检测试剂盒 | |
| CN105331688B (zh) | 一种检测鲜活农产品中致病菌的五重pcr检测方法及其检测试剂盒 | |
| CN109371110B (zh) | 一种杨树细菌性溃疡病菌的lamp检测试剂盒 | |
| CN104962660B (zh) | 一种杂色蛤物种实时荧光pcr特异性检测体系及应用 | |
| CN104120121A (zh) | 用于鉴定琉球螫蝇的dna条形码标准基因及应用 | |
| CN110878373A (zh) | 一种致病疫霉菌的重组酶聚合酶扩增检测试剂盒及其应用 | |
| CN103602727B (zh) | 一种快速检测青枯菌的检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN107488718A (zh) | 检测c60纳米颗粒物对微囊藻毒素生成影响的方法及装置 | |
| CN105063187A (zh) | 一种快速检测灰葡萄孢菌对sdhi类杀菌剂抗性的方法及引物组合物 | |
| CN101451164A (zh) | 一种用于检测菊花褪绿斑驳类病毒的方法 | |
| CN105838788A (zh) | 一种蓝鳕鱼实时荧光pcr特异性检测体系及应用 | |
| CN106868134B (zh) | 一种海参养殖水体长石莼、硬石莼和萱藻孢子/配子的实时定量pcr检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20171222 |