TWI719665B

TWI719665B - 用以鑑別鴿子性別之引子組、在場快速鑑別鴿子性別之方法及套組

Info

Publication number: TWI719665B
Application number: TW108136420A
Authority: TW
Inventors: 王佩華; 賴芳裕
Original assignee: 翊洋科技股份有限公司
Priority date: 2019-10-08
Filing date: 2019-10-08
Publication date: 2021-02-21
Also published as: TW202115254A

Abstract

本發明提供一種用以鑑別鴿子性別之引子組以及包含該引子組之方法及套組，其中該引子組係以SEQ ID NO：1之核苷酸序列作為標靶序列。該方法包含(a)提供來自一鴿子之基因體DNA；(b)以該基因體DNA為模板，並使用該引子組進行恆溫重組酶聚合酶擴增反應；及(c)使用一側流層析裝置/試驗片檢測擴增子，得到檢測結果。本發明提供之用以鑑別鴿子性別之套組，其包含該引子組、一反應劑及一側流層析裝置/試驗片。透過本發明之方法及套組，可在場簡易、即時且準確地鑑別鴿子性別，且在鴿子出生不久即可鑑別。

Description

用以鑑別鴿子性別之引子組、在場快速鑑別鴿子性別之方法及套組

本發明係關於鑑別鴿子性別之引子組、方法及套組，尤其是關於適於使用重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)反應及側流層析裝置/試驗片(lateral flow device/strip)技術，以在場快速鑑別鴿子性別之引子組、方法及套組。

鳥類雌雄之外型差異可分為雙態鳥類(dimorphic birds)及單態鳥類(monomorphic birds)，前者雌雄外型差異大或者是外觀顏色不同，很容易由外型分辨雌雄，如雞、鴛鴦及孔雀等；後者雌雄外型幾乎沒有差異，如鴿子及鸚鵡等，此等單態鳥類無論雛鳥或成鳥皆不易分辨性別。分辨性別在學術上有益於做族群研究、動物行為研究、演化研究及野生動物物種管理，實務上可分析家禽之育種策略、精進圈養繁殖計畫及助益刑事案件等，因此如鴿子等商業價值高之禽類之雌雄鑑別技術受到相當關注，技術不斷進步。

鴿子性別分辨方法可分為下列幾種：1.性腺(gonadal)鑑定：性腺性別鑑定係利用腹腔鏡或泄殖腔鏡伸入泄殖腔觀察，雌鴿之泄殖腔左側可見輸卵管，雄鴿之泄殖腔兩側可見圓錐狀乳突。此方法需要特殊儀器，具侵入性且耗時長。2.由生殖器或羽毛顏色外型鑑定：Nowicki等人(1996)觀察雛鴿之泄殖腔口，發現雄鴿之泄殖腔口呈馬蹄形，上緣蓋住下緣，雌鴿則是顛倒過來。研究指出某些鴿子品種之毛色基因具有性聯遺傳的性質，最著名的是Texaner品系，雌鴿之脖子具有環頸紅色羽絨，擴至翅膀呈條紋狀，雄鴿則是全身白色，此差異係因褪色基因(StF)表現不同所引起。一般雌雄成鴿之外型差異很小，大致上雄鴿之體型較雌鴿大，雄鴿之喙及腿較強壯、頭較大、喙較長、脖子通常較細且長。3.行為鑑定：雌雄之行為鑑定通常形塑自賀爾蒙系統，在某些狀況下可觀察到雌雄鴿的行為差異，尤其在交配時期，雄鴿會尋找雌鴿，發出咕咕聲，並排斥其他雄鴿，伸展其尾部與地面磨擦；產蛋後雌雄鴿輪流菢蛋，雄鴿在白天菢蛋，雌鴿則在晚上。上述方法均為傳統之鴿子性別辨識方法，皆具有侵入性、準確性低、時效性差等缺點，為了在鴿子出生早期即可準確分辨性別，近期研究皆朝向DNA檢測發展。

雌雄鳥類帶有不同的性染色體，雄鳥有兩個Z染色體，雌鳥有一個Z染色體及一個W染色體，兩個染色體具有不同的基因或DNA序列，可據此發展性別鑑定方法，其中以PCR技術及瓊脂醣膠體電泳分析為基礎的方法在近期蓬勃發展。Chromodomain helicase DNA binding 1 (CHD1)是第一個被認為具有性聯標識特性，可用於非平胸鳥類(non-ratite)性別鑑定的基因，它是一個高度保留的區域，有些內含子(intron)之序列與大小在CHD1W與CHD1Z染色體間是不同的，幾個研究利用這些特性設計不同的引子，成功地透過PCR辨別鳥類的性別。另外在果蠅發現的性聯標識Nipped-B homolog (NIPBL)和RAS p21 protein activator 1 (RASA1)基因，其中NIPBL已成為一廣用性標識，RASA1也有用於雉科動物的報告。0.6 kb EcoRI fragment (EE0.6)是在W染色體上一段具保留性的DNA片段，EE0.6在W與Z染色體上的差異亦被利用於多種鳥類的性別鑑定。

CHD1片段最常用於鴿子的性別鑑定，P2與P8為常規的引子，若使用限制性片段長度多態性(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)方法，則採用 BsuRI限制酶。因瓊脂醣膠體電泳法無法大量且快速進行，Huang等人(2011)利用CHD1片段重新設計引子，分別為雌鴿特有之CHD-W引子(dove-W)及雌雄鴿共有之引子(dove-ZW)，另加入常規的P2引子，可產生兩個大小不同的PCR片段(P2/dove-W(252-bp)及P2/dove-ZW(104-bp))，兩片段之熔點(melting temperature, Tm)由熔解曲線分析(melting curve analysis, MCA)得知分別為約 79.0-79.5°C及77.5°C，因此雌鴿檢體在機器上會顯現兩個Tm波鋒，雄鴿檢體在機器上則顯現一個Tm波鋒。此法免去耗時的瓊脂醣膠體電泳分析，提供一個可短時間大量檢測的方法。Chan等人(2012)則以恆溫式圈環形核酸增幅法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)取代PCR，與PCR不同的是LAMP在恆溫下進行(60-65°C)，所需時間少於60分鐘。他們設計雌鴿專屬引子，經過LAMP擴增，瓊脂醣膠體電泳分析結果是雄鴿樣本的位置沒有任何產物，雌鴿樣本的位置有多重產物；直接觀察反應溶液，可見雌鴿樣本有白色沉澱，係焦磷酸鎂造成，雄鴿樣本則無；若加入硫酸銅，則雄鴿樣本形成白色環狀，雌鴿樣本則無。此法可減免傳統PCR與瓊脂醣膠體電泳分析過程。

有鑑於此，本發明人致力於研發簡易、即時且準確的鴿子性別檢測套組，此套組必須能在鴿子出生不久即可檢測，且不必後送實驗室及無使用機器，任何養鴿戶在現場即可操作，以克服傳統基因檢測中操作步驟繁瑣的缺點，第一步驟基因增幅使用PCR需儀器自動控制DNA複製時的溫度，完成全反應需至少90分鐘，且PCR儀器價格昂貴；第二步驟檢視結果最常使用之瓊脂醣膠體電泳分析同樣需電源與儀器，且從製膠到跑膠是複雜又耗時的過程。使用傳統步驟完成一個檢體的檢測需要至少3.5小時，且需多樣儀器。

是以，本發明提供一種用以鑑別鴿子性別之引子組，其係以SEQ ID NO：1之核苷酸序列作為標靶序列，SEQ ID NO：1之核苷酸序列為CTCCCAAGGATGAGGAACTGTGCAAAACAGGTATCTCTGGGTTTTGACCAACTAACTTCTTGTTGTTGTGTTTCTTTGTTTTTTCATTACTGTTGTTTTTGGCTTGTACTTTTCACCCCCCATTTTTGACAGGCTAGATAGCACATTATTAAAATGTTTTAGTCACATAGCTTTGAACTACTTAATCTGAAATTCCAGATCAGCTTTAATGGAAGTGAAGGGAAATGCAGTAGAAGCAGAAGATATTCTGGATCTGATAGTGACTCCATGTCAGAAAGAAAACGACCAAAAAAACGTGGACGACCACGAACTATTCCTCGAGAAAATATTAAAGGATTTAGCGATGCAGA。

進一步地，該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子；其中，SEQ ID NO：2序列為ACTAACTTCTTGTTGTTGTGTTTCTTTGTTT，SEQ ID NO：3為TTTAATATTTTCTCGAGGAATAGTTCGTG。

本發明另提供一種在場快速鑑別鴿子性別之方法，包括：(a)提供來自一鴿子之基因體DNA(genomic DNA，gDNA)；(b)以該gDNA為DNA模板，並使用上述之引子組，其中該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記，進行重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)反應；及(c)使用一側流層析裝置/試驗片(lateral flow device/strip)檢測該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)，得到檢測結果。其中該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區；所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合至該擴增子之該第一標記或該第二標記；所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該擴增子之該第二標記或該第一標記，以抑制與該移動報告子結合之該擴增子進一步地側流層析；所述控制區提供一控制作用物。

進一步地，該第一標記及該第二標記係選自於生物素(biotin)、螢光素衍生物(fluorescein derivatives)、玫瑰紅衍生物(rhodamine derivatives)、級聯藍(Cascade Blue)、螢光黃(Lucifer yellow)、5-溴-2-去氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)、二硝基酚(dinitrophenol，DNP)、地谷新配質(digoxygenin，DIG)、及短肽標記序列；且該第一標記與該第二標記不相同。

進一步地，該第一標記係螢光素衍生物FAM。

進一步地，該第二標記係生物素。

進一步地，該移動報告子係一種金、二氧化矽(silica)、硒、聚苯乙烯(polystyrene)、三聚氰胺樹脂(melamine resin)、聚甲基丙烯酸鹽(polymethacrylate)、苯乙烯/二乙烯苯(styrene/divinylbenzene)共聚物或聚乙烯基甲苯(polyvinyltoluene)之微粒。

進一步地，該鴿子不限年齡。

進一步地，該gDNA係萃取自該鴿子之血液或羽毛之毛囊。

本發明又提供一種在場快速鑑別鴿子性別之套組，其包括：一上述之引子組，該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記；一反應劑，用以進行重組酶聚合酶擴增反應；及一側流層析裝置/試驗片。其中，該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區，所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)之該第一標記或該第二標記，所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該第二標記或該第一標記，所述控制區提供一控制作用物。

相較於習知技術，本發明之鑑別鴿子性別之引子組、在場快速鑑別鴿子性別之方法及套組可供在場簡易、即時且準確地檢測鴿子性別，擴增反應及檢視結果的過程不需任何需電源的複雜儀器，並大幅縮短時程，可由任何人在恆溫條件下大量操作而快速得知檢測結果，且在鴿子出生不久即可採用，便利又有助於精進圈養繁殖計畫。

本文中所稱之「包含或包括」意指不排除一或多個其他組件、步驟、操作和/或元素的存在或添加至所述之組件、步驟、操作和/或元素。「約或接近」或「基本上」意指具有接近於允許指定誤差的數值或範圍，以避免被任何不合理之第三方違法或不公平地使用為理解本發明揭示之精確或絕對數值。「一」意指該物的語法對象之一個或一個以上(即，至少為一)。

[本發明之引子組]

本發明一方面提供一種用以鑑別鴿子性別之引子組，其中引子的設計係以鳥類性染色體CHD-Z(雄雌鴿均有此性染色體)與CHD-W(雌鴿特有之性染色體)兩段DNA序列(SEQ ID NO：4與SEQ ID NO：1)為基礎，選擇兩段DNA之間相同及不同的片段，設計多個正向引子、逆向引子及探針，經反覆試驗，篩出一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，此第一引子及第二引子所形成的引子對，能特異性地針對CHD-W之DNA序列(SEQ ID NO：1)夾出欲擴增之片段，因此，若採用本發明之引子組，能夠夾出片段並於後續擴增實驗中擴增出擴增子者，代表為雌鴿，而無法夾出片段故無法於後續擴增實驗中擴增出擴增子者，代表為雄鴿。因此，本發明之引子組可藉以成功辨識鴿子性別，且結果穩定呈現。

[本發明之方法]

本發明另一方面提供一種在場快速鑑別鴿子性別之方法，包括：(a)提供來自一鴿子之基因體DNA(genomic DNA，gDNA)；(b)以該gDNA為DNA模板，並使用上述之引子組，其中該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記，進行重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)反應；及(c)使用一側流層析裝置/試驗片(lateral flow device/strip)檢測該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)，得到檢測結果。其中該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區；所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合至該擴增子之該第一標記或該第二標記；所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該擴增子之該第二標記或該第一標記，以抑制與該移動報告子結合之該擴增子進一步地側流層析；所述控制區提供一控制作用物。其中，陽性試驗結果(即，檢測區產生顏色標記)代表該鴿子性別為雌性。

本發明中，所述之鴿子可為任何品種、任何齡期的鴿子。於一較佳實施例中，該鴿子係週齡至少1-2週。於一更佳實施例中，該鴿子係週齡至少1週。因出生不久的鴿子較易受控制，便於在鑑定性別後套掛腳環，並從早期開始採行飼養計畫。例如，賽鴿以雌鴿為優，較乖巧順服，相對地，雄鴿容易到處飛行尋找雌鴿，因此賽鴿場一般優先培育雌鴿。

本發明中，所述之鴿子之gDNA可採自任何部位之鴿子體細胞，例如血液或羽毛之毛囊等。於一較佳實施例中，該gDNA係萃取自該鴿子之血液。例如，可由鴿子之翼根靜脈抽血、或輕輕刺破鴿子之鼻翼採血等。

較佳地，該第一及第二標記係選自於半抗原(haptens)，例如生物素(biotin)、螢光素衍生物(如FITC或FAM)、玫瑰紅衍生物(如TAMRA)、級聯藍(Cascade Blue)、螢光黃(Lucifer yellow)、5-溴-2-去氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)、二硝基酚(dinitrophenol，DNP)、地谷新配質(digoxygenin，DIG)及短肽標記序列(即，可產生特異性抗體的短肽)。更佳地，該第一標記係FAM，該第二標記係生物素，在這種情況下，在該擴增步驟中產生的擴增子會標記有FAM及生物素。

本文所述之「重組酶聚合酶擴增」係一種使用重組酶作用物於目標寡核苷酸以標靶DNA，結合聚合酶以合成DNA之方法。首先，一重組酶作用物與一第一及第二核酸引子(即本文中之引子組，包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記)接觸，以形成一第一及第二核酸蛋白引子。接著，該第一及第二核酸蛋白引子與雙股標靶序列(即本文中之CHD-W之DNA序列(SEQ ID NO：1))接觸，在所述第一股之第一部分形成一第一雙股結構，且在所述第二股之第二部分形成一第二雙股結構，所以所述第一核酸引子之3’端與所述第二核酸引子係目標朝向各個已知的模板DNA分子。第三，所述第一及第二核酸蛋白引子之3’端藉由DNA聚合酶產生第一及第二雙股核酸，及核酸的第一及第二置換股。最後，重複該第二及第三步驟直至達到所需的擴增度。RPA所需的反應劑如美國專利US 2015/0240298A1所述，其整體在此以參考方式包括在內。

接續於擴增步驟之後，該擴增產物滴加至一側流層析裝置/試驗片。該側流層析裝置/試驗片包含一基質，其可使加入緩衝液之該擴增產物持續產生毛細作用或側向層析流至該側流層析裝置的遠端。一般而言，該側流層析裝置之該基質為試驗片的形式。較佳地，該基質係由硝化纖維素膜、聚二氟亞乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)、尼龍或單一多孔材料基材所組成。該側流層析裝置在近端包含一樣本墊及一接合墊，在遠端或鄰近遠端包含一檢測區(又稱檢測線)及一控制區(又稱控制線)。該樣本墊係用以承載擴增產物，且當該擴增產物側向流至該接合墊，在接合墊中之具有一第一作用物的移動報告子將會特異性地結合至該擴增子之該第一標記或該第二標記。

所稱之「移動報告子」係指微粒，其可由廣泛的各種物質組成，但較佳係由一種或多種基本上惰性的物質所組成，例如金、二氧化矽(silica)、硒、聚苯乙烯(polystyrene)、三聚氰胺樹脂(melamine resin)、聚甲基丙烯酸鹽(polymethacrylate)、苯乙烯/二乙烯苯(styrene/divinylbenzene)共聚物或聚乙烯基甲苯(polyvinyltoluene)等標記有第一作用物之微粒。該微粒較佳係非多孔的。該微粒可包含一物質使側流層析裝置上檢測區及控制區的結果顯像。更便利地，此一物質將係一種染料或其他有色物質，以藉由肉眼可觀察，或該物質例如可為一種標記物質，使其可透過產生一有色物質(如酵素或其他催化標記物)或藉由螢光、發光或磁力作用(如使用螢光計、光度計或磁感應)顯像。

該第一作用物係選自具有該第一標記或該第二標記且有特異性結合或反應能力的作用物。因此，該第一作用物可以是一種抗體、抗體片段(如Fab、F(ab′)2及scfv片段)、受體或其他結合配偶體。該第一作用物本身可與酵素或催化物質接合，使偵測產物顯像而受偵測。當該第二標記係生物素且該第一作用物設計用以結合該第二標記，則該第一作用物可為鏈黴親合素(streptavidin)或抗生物素蛋白(avidin)，更佳係一種抗生物素(anti-biotin)抗體。

該檢測區係提供一第二作用物，其可特異性地結合所述第二標記或所述第一標記。第二作用物結合該第二標記或該第一標記是取決於該第一作用物且應不同於該第一作用物之該結合配體。例如，若該第一作用物係設計用以結合該第二標記，則該第二作用物應結合該第一標記。較佳地，該第一標記係FAM，該第二標記係生物素，且該第一作用物係設計用以結合該第二標記，則該第一作用物可以是鏈黴親和素、抗生物素蛋白或一種抗生物素抗體，且該第二作用物可以是抗FAM (anti-FAM)抗體。

該檢測區提供檢測結果。即，該檢測區利用第二作用物，結合第一或第二標記，從而固定擴增子(其中每一擴增子應結合至移動報告子)，因此可顯示樣本中是否具有欲偵測的基因片段之結果。「陽性」檢測結果較佳係由在檢測區中顯現可目視的顏色訊號，且代表該鴿子性別為雌鴿，該顏色訊號係由該移動報告子提供。當該移動報告子為金微粒，該可目視顏色訊號將會是略帶粉色的紅色。

該控制區係側流層析裝置/試驗片上有別於檢測區的一個區域。較佳地，該控制區係位於該檢測區和該側流層析裝置/試驗片之該遠端之間。該控制區提供一陽性控制結果。該陽性控制結果可顯示該移動報告子已成功流過該試驗片。因此，在最簡單的情況下，該控制區係提供一控制作用物，其特異性地結合該第一作用物，在這種情況下，該控制區結合且固定該移動報告子，從而提供一結果顯示該移動報告子是否成功流過試驗片上的基質。

[本發明之套組]

本發明也包含一套組，用以進行根據本發明所述之該方法。

本文所稱之「套組」係關於一套反應劑的組合，適用於根據本發明之方法偵測一標靶DNA，結合一或多個類型的元件或組成(例如其他類型的生化反應劑、容器、適合用以商業販售之包裝、該反應劑限制的基質、電子硬體組件等)。

本發明之用以在場快速鑑別鴿子性別之套組包括：一上述之引子組，該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記；一反應劑，用以進行重組酶聚合酶擴增反應；及一側流層析裝置/試驗片。其中，該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區，所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)之該第一標記或該第二標記，所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該第二標記或該第一標記，所述控制區提供一控制作用物。

[實施例]

以下本文揭示將以參考實施例具體描述。然而，本文揭示並非限制於所述實施例。

本實施例是以在場(on farm)試驗為例，描述如下：

試驗動物與DNA樣本：DNA樣本係自鴿場取15-20隻雛鴿，由其翼根靜脈採血，一次採血可做多次試驗。

一、基因體DNA萃取

基因體DNA之萃取可採用傳統方法或簡易方法如下：

1. 傳統萃取方法：取3-10 μL血球層於1.5 mL微量離心管中，加入 1 mL基因體DNA分離試劑(Genomic DNA Isolation Reagent)(真興實業股份有限公司，臺灣)，徐緩沖散沉澱物，並於室溫靜置15分鐘；加入500 μL 氯仿，徐緩反轉離心管數次；以13000 x g於4℃離心20分鐘；取上層液移至另一個1.5 mL微量離心管，再加入500 μL氯仿，徐緩反轉離心管數次；以13000 x g於4℃離心20分鐘；吸取上層液移至另一個1.5 mL離心管，再加入0.7-0.8倍體積之異丙醇，反轉離心管數次，待白色絲狀物出現；去除上層液，加入1000 μL 75%酒精，以離心機(Kubota，Model 8420) 1000 x g短暫離心使DNA沉澱，此步驟重複兩次；將酒精吸去後於室溫風乾；加入50 μL滅菌去離子水回溶，待DNA完全溶解後，保存於-20℃備用；利用超微量分光光度計(NanoDrop® ND-1000)檢測其260/280及230/280 OD比值及濃度後，將DNA儲存於-20℃備用。

2.簡易萃取方法：例如，使用M-iCodeTM核酸萃取試劑組(芯世代生技醫藥股份有限公司，臺灣)萃取粗gDNA。步驟包括：取5-10 μL鴿子全血及400 μL萃取液加入1.5 mL微量離心管，並用力搖晃或震盪混合均勻；再將核酸萃取棒試紙端***與檢體混合之萃取液中，靜置5秒；取400 μL洗滌液至1.5 mL微量離心管，將核酸萃取棒浸入洗滌液中，上下清洗30次；清洗完後將核酸萃取棒***任何核酸擴增試劑(例如已配置好之PCR反應液)，放置20秒，取出並丟棄核酸萃取棒，即可接著進行擴增反應。

傳統及簡易萃取方法中以後者為佳，簡易方法可克服傳統gDNA萃取方法中需使用多種試劑且多次使用離心機等缺點，快速又便利。

二、重組酶聚合酶擴增

使用TwistAmp® basic kit (TwistDx Inc.，美國馬里蘭州劍橋)進行RPA。步驟包括：準備反應混合液於1.5 mL微量離心管(包括10 μM本發明之第一引子2.4 μL、10 μM本發明之第二引子2.4 μL、無引子再水合緩衝液(primer free rehydration buffer) 29.5 μL、gDNA及水，共13.2 μL)，混合均勻；將此混合液加入凍乾之TwistAmp® basic reaction，混勻；加入2.5 μL醋酸鎂，混勻以啟動反應；靜置於39°C加熱平板20分鐘，完成增幅反應。

重組酶聚合酶擴增方法克服了傳統PCR增幅中需使用昂貴的PCR儀器、加熱至高溫、多次變換溫度並循環、耗時長等缺點。

三、結果檢視

使用核酸快速檢測(Nucleic Acid Rapid Detection，NARD)套組(睿嘉生物科技股份有限公司，臺灣)檢測擴增產物。步驟包括：取恆溫增幅的反應液2-10 μL至1.5 mL微量離心管，加入NARD緩衝液至1.5 mL微量離心管至100μL，混勻；將NARD層析試紙***1.5 mL微量離心管液面之下，等待約10-15分鐘，即可檢視結果。

其中，NARD層析試紙係與擴增產物反應之快速呈色試紙，該試紙之兩條測試線分別固定抗生物素抗體及抗FAM抗體，因此可與標記有生物素及FAM之擴增產物反應呈色。測試結果中，若NARD層析試紙之兩條測試線(即檢驗區和控制區)皆有陽性反應而呈色，表示擴增產物中含有標記生物素之擴增子及標記FAM之擴增子，即所測試之DNA樣本具有CHD-W基因特有之DNA序列，則可知該測試對象為雌鴿；若NARD層析試紙上僅一條控制區的測試線有陽性反應而呈色，表示實驗無法產生擴增產物，僅移動報告子能與控制區的控制作用物作用而呈色，則可知該測試對象為雄鴿。

[比較例]

為確認本發明之引子組、方法及套組是否可成功鑑別鴿子性別，於此，以如前述之萃取及擴增方法，取 2 μL擴增產物，以 2% 瓊脂醣膠體進行電泳，確認前述實施例結果與傳統之瓊脂醣膠體電泳法是否相同。

如圖1及2所示，以代表性樣本1至8為例，圖1中圖上至下依序為樣本1至4，圖中圖上至下依序為樣本5至8。可以觀察到，比較例(圖左)與實施例(圖右)呈現出的性別鑑定結果相同，即樣本2、4及7為雌鴿，其他為雄鴿。

因此，本發明之檢測方法可克服傳統瓊脂醣膠體電泳分析中需使用電源與儀器、過程繁雜耗時等缺點，有利於進行在場即時檢測。

綜上所述，本發明之鑑別鴿子性別之引子組、方法及套組可供在場簡易、即時且準確地檢測鴿子性別，DNA萃取、擴增反應及檢視結果的過程不需任何需電源的複雜儀器，並大幅縮短時程，可由任何人在恆溫條件下大量操作而快速得知檢測結果，且在鴿子5 至7天即可採用，便利又有助於精進圈養繁殖計畫。

以上已將本發明做一詳細說明，惟以上所述者，僅為本發明之一較佳實施例而已，當不能以此限定本發明實施之範圍，即凡依本發明申請專利範圍所作之均等變化與修飾，皆應仍屬本發明之專利涵蓋範圍內。

無。

圖1係鴿子性別鑑定結果，圖左為使用傳統瓊脂醣膠體電泳法之比較例，圖右為本發明一較佳實施例，由圖上至下依序為樣本1至4。

圖2係鴿子性別鑑定結果，圖左為使用傳統瓊脂醣膠體電泳法之比較例，圖右為本發明一較佳實施例，由圖上至下依序為樣本5至8。

無。

<110> 翊洋科技股份有限公司

<120> 用以鑑別鴿子性別之引子組、在場快速鑑別鴿子性別之方法及套組

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 350

<212> DNA

<213> Columba livia

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(350)

<400> 1

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子_結合

<220>

<221> 引子_結合

<222> (1)..(31)

<400> 2

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子_結合

<220>

<221> 引子_結合

<222> (1)..(29)

<400> 3

<210> 4

<211> 370

<212> DNA

<213> Columba livia

<220>

<221> 基因

<222> (1)..(370)

<400> 4

Claims

一種用以鑑別鴿子性別之引子組，其係以SEQ ID NO：1之核苷酸序列作為標靶序列；其中，該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子。
一種在場快速鑑別鴿子性別之方法，包括：(a)提供來自一鴿子之基因體DNA(genomic DNA，gDNA)；(b)以該gDNA為DNA模板，並使用如申請專利範圍第1項所述之引子組，其中該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記，進行重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)反應；及(c)使用一側流層析裝置/試驗片(lateral flow device/strip)檢測該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)，得到檢測結果；其中該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區；所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合至該擴增子之該第一標記或該第二標記；所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該擴增子之該第二標記或該第一標記，以抑制與該移動報告子結合之該擴增子進一步地側流層析；所述控制區提供一控制作用物。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該第一標記及該第二標記係選自於生物素(biotin)、螢光素衍生物(fluorescein derivatives)、玫瑰紅衍生物(rhodamine derivatives)、級聯藍(Cascade Blue)、螢光黃(Lucifer yellow)、5-溴-2- 去氧尿苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)、二硝基酚(dinitrophenol，DNP)、地谷新配質(digoxygenin，DIG)、及短肽標記序列；且該第一標記與該第二標記不相同。
如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該第一標記係螢光素衍生物FAM。
如申請專利範圍第3項所述之方法，其中該第二標記係生物素。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該移動報告子係一種金、二氧化矽(silica)、硒、聚苯乙烯(polystyrene)、三聚氰胺樹脂(melamine resin)、聚甲基丙烯酸鹽(polymethacrylate)、苯乙烯/二乙烯苯(styrene/divinylbenzene)共聚物或聚乙烯基甲苯(polyvinyltoluene)之微粒。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該鴿子不限年齡。
如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該gDNA係萃取自該鴿子之血液或羽毛之毛囊。
一種在場快速鑑別鴿子性別之套組，其包括：一如申請專利範圍第1項所述之引子組，該引子組包括一具有SEQ ID NO：2序列之第一引子及一具有SEQ ID NO：3序列之第二引子，該第一引子及該第二引子分別具有一第一標記及一第二標記；一反應劑，用以進行重組酶聚合酶擴增反應；及一側流層析裝置/試驗片；其中，該側流層析裝置/試驗片依序包含(i)一樣品墊、(ii)一接合墊、(iii)一檢測區及(iv)一控制區，所述接合墊具有以一第一作用物標記之一移動報告子，該第一作用物特異性地結合該重組酶聚合酶擴增反應之產物(擴增子)之該第一標記或該第二標記，所述檢測區具有一第二作用物，其特異性地結合該第二標記或該第一標記，所述控制區提供一控制作用物。