CN106068274A - 多聚体Fc蛋白 - Google Patents
多聚体Fc蛋白 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106068274A CN106068274A CN201580011851.9A CN201580011851A CN106068274A CN 106068274 A CN106068274 A CN 106068274A CN 201580011851 A CN201580011851 A CN 201580011851A CN 106068274 A CN106068274 A CN 106068274A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- multimeric
- fusionprotein
- residue
- domain
- igg4
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
- C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/524—CH2 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/526—CH3 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/528—CH4 domain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
- C07K2317/53—Hinge
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
- C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
Abstract
本发明涉及结合人Fc受体的多聚体融合蛋白。本发明还涉及包含所述蛋白的药物组合物,以及它们在治疗免疫性病症中的用途。融合蛋白在位置309上的半胱氨酸残基不存在的情况下包含尾部。
Description
本发明涉及结合人Fc受体的多聚体融合蛋白。本发明还涉及包含所述多聚体融合蛋白的治疗组合物,以及它们在治疗免疫性病症中的用途。
背景
免疫性病症包括具有不同病征、症状、病因学和致病机制的多种疾病。许多这类疾病的特征在于致病性抗体和/或致病性免疫复合物的积极参与。在某些疾病诸如ITP(可变地称为免疫性血小板减少症、免疫性血小板紫癜、特发性血小板减少性紫癜)中,针对致病性抗体的靶抗原(Hoemberg,Scand HJ Immunol,第74卷(5),p489-495,2011)和疾病进程是相当清楚的。通常利用多种常规药剂(作为单一疗法或组合地)来治疗此类免疫性病症。此类药剂的实例是皮质类固醇(其与许多副作用相关)、静脉注射免疫球蛋白(IVIG)和抗D。
抗体,通常被称为免疫球蛋白,是包含通过链间二硫键保持在一起的两条相同的重(H)链和两条相同的轻(L)链的Y形分子。每一条链由在序列上变化的并且负责抗原结合的一个可变结构域(V)组成。每一条链还由至少一个恒定结构域(C)组成。在轻链中,存在单个恒定结构域。在重链中,存在至少3个,有时4个恒定结构域,这取决于同种型(IgG、IgA和IgD具有3个,IgM和IgE具有4个)。
在人中,存在称为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM的5个不同种类或同种型的免疫球蛋白。所有这些种类具有基本的4链Y形结构,但它们相异在于它们的重链(分别称为α、δ、ε、γ和μ)。IgA还可被进一步细分成2个亚类,称为IgA1和IgA2。存在4个亚类的IgG,称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。
抗体的Fc结构域通常包含每一条重链的至少最后两个恒定结构域,所述恒定结构域二聚化以形成Fc结构域。Fc结构域负责提供抗体效应子功能,包括决定抗体半衰期(原理上通过对FcRn的结合)、遍布身体的分布、固定补体的能力以及对细胞表面Fc受体的结合。
抗体同种型之间的差异最明显地在于Fc结构域中,并且这导致在对抗原结合后不同效应子功能的触发。结构差异还导致抗体的聚合状态的差异。因此,IgG、IgE和IgD通常是单体,而IgM以五聚体和六聚体两种形式存在,IgA在血清中主要以单体形式存在并且在浆液粘液性分泌中主要以二聚体形式存在。
静脉注射免疫球蛋白(IVIG)是来自成千上万的健康血液供体的混合免疫球蛋白。IVIG最初被用作IgG替代疗法来预防具有低IgG水平的患者的机会致病菌感染(综述于Baerenwaldt,Expert Rev Clin Immunol,第6卷(3),p425-434,2010中)。在具有ITP的儿童中发现IVIG的抗炎性质(Imbach,Helv Paediatri Acta,第36卷(1),p81-86,1981)后,IVIG现被许可用于治疗ITP、Guillain-Barré综合征、川崎病和慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(Nimmerjahn,Annu Rev Immunol,第26卷,p513-533,2008)。
在牵涉致病性免疫复合物的疾病中,已有人提出,少部分成分免疫球蛋白级分不成比例地有效。据观测,微量(通常1-5%)的IgG以多聚体形式存在于IVIG内。大多数该多聚体级分被认为是二聚物和较少量的三聚体及更高级形式。还已提出,另外的二聚体可在输注后通过接受者的抗独特型抗体的结合形成。有一种理论认为,这些多聚体形式因它们增强的亲合力而与免疫复合物竞争对低亲和力Fcγ受体的结合(Augener,Blut,第50卷,p249-252,1985;Teeling,Blood第98卷(4),p1095-1099,2001;Machino,Y.,Clin ExpImmunol,第162卷(3),p415-424,2010;Machino,Y.等,BBRC,第418卷,p748-753,2012)。另一个理论是IVIG内的IgG的唾液酸糖形式,尤其是高水平的α2-6唾液酸形式的存在,引起Fcγ受体激活状态的变化(Samuelsson,Science,第291卷,p484-486,2001;Kaneko,Science,第313卷,p670-673,2006;Schwab,European J Immunol第42卷,p826-830,2012;Sondermann,PNAS,第110卷(24),p9868-9872,2013)。
在牵涉致病性抗体的疾病中,已有人提出,向人施用的非常大剂量的IVIG(1-2g/kg)有效地越过了通过FcRn进行的正常IgG动态平衡机制。有效地供体IVIG对接受者IgG的巨大稀释导致患者致病性抗体的增强的分解代谢和较短的血清半衰期。其它提出的功效机制包括致病性抗体的抗独特型中和以及补体因子的瞬时减少(Mollnes,Mol Immunol,第34卷,p719-729,1997;Crow,Transfusion Medicine Reviews,第22卷(2),p103-116,2008;Schwab,I.和Nimmerjahn,F.Nature Reviews Immunology,第13卷,p176-189,2013)。
IVIG的临床使用存在明显的不利方面。IVIG因生产方法和供体库的固有差异而在制造商之间具有可变的产品质量(Siegel,Pharmacotherapy第25卷(11)p78S-84S,2005)。以非常大的剂量,通常以1-2g/kg的量级给予IVIG。该大剂量使得必须进行长持续时间的输注(4-8小时,有时持多天),这可令患者不悦并且可导致输注相关的不良事件。严重的不良事件可发生,IgA不足的个体中的反应是众所周知的。还可在接受IVIG的患者中观测到细胞因子释放,但这通过剂量和输注速率的细心控制得以大大地减少至最少。作为每患者使用的大量和对人供体的依赖的结果,IVIG的生产是昂贵的,并且全球供应受到严重限制。
总体上IVIG的不利方面意味着有必要在能够干扰致病性抗体和致病性免疫复合物的疾病生物学的分子的临床供应、管理和功效方面进行改善。
用作IVIG疗法的潜在替代的多聚体Fc融合蛋白已在文献中进行了描述。(Mekhaiel等;Nature Scientific Reports 1:124,2011年10月19日出版的)。Mekhaiel等描述了六聚hIgG1-FC-LH309/310CL-尾部(tailpiece)。该蛋白包含双突变,其中位置309上的亮氨酸被半胱氨酸取代,位置310上的组氨酸被亮氨酸取代。
在本发明的时候据信L309C/H310L双突变对于单体单元的聚合是必不可少的。(Mekhaiel等;2011)。然而,本发明人已出乎意料地产生了在不存在L309C/H310L双突变的情况下高效地组装成多聚体的多聚体融合蛋白。
在位置309上不存在半胱氨酸残基简化了多聚体融合蛋白的分离和纯化,从而改善了其可制造性。这也可降低免疫原性的潜力。另外,描述了大大改善本发明的多聚体融合蛋白的安全性和功效的的其它修饰。
因此,在本发明中,我们提供具有改进的可制造性和更大的功效的改进的多聚体融合蛋白,其解决了IVIG和现有技术替代方案的许多不利方面。可在细心控制的条件下大量产生所述蛋白,从而消除了有限供应和质量可变的问题。此外,更大的功效允许施用更小的剂量,从而降低了不良事件的风险。
由Mekhaiel等描述的蛋白质被开发来主要用作疫苗,并且通常将其与称为“融合伴侣”诸如抗原、病原体相关分子模式(PAMP)、药物、配体、受体、细胞因子或趋化因子的不同蛋白质融合。在一个实例中,本发明的蛋白质不包含融合伴侣。
多聚体融合蛋白已在现有技术中进行了描述,其中将来自IgM或IgA的羧基末端尾部添加至完整IgG分子恒定区的羧基端,以产生重组IgM样IgG。(Smith R.I.F.和Morrison,S.L.Biotechnology,第12卷,p683-688,1994;Smith R.I.F.等,J Immunol,第154卷,p2226-2236,1995;V.等,J Immunol,第156卷,p2858-2865,1996)。所研究的IgG分子是包含可变区的完整免疫球蛋白。相反,本发明的多聚体融合蛋白不包含抗体可变区。
因此,在本发明中,我们提供了具有改善的可制造性和更高的安全性和功效的改进的多聚体融合蛋白,其解决了IVIG和现有技术替代方案的许多不利方面。可在细心控制的条件下大量地重组产生所述蛋白,从而消除了有限供给和质量可变的问题。此外,更高的安全性和功效允许施用更小的剂量,并且显著降低不良事件的风险。
发明描述
本发明的多聚体融合蛋白已被统称为“Fc多聚体”并且这两个术语在本文中可互换使用。
除非另外定义,否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明的所属领域中的技术人员通常所理解的含义相同的含义。本文中提及的所有出版物和专利通过引用并入。
应理解的是,可组合本文所述的任何实施方案。
在本说明书中,除非另外指定,否则将EU编号***用于提及抗体结构域中的残基。该***最初由Edelman等,1969设计,并详细描述于如下文献中:Kabat等,1987。Edelman等,1969;“The covalent structure of an entireγG immunoglobulin molecule,”PNASBiochemistry第63卷pp78-85。Kabat等,1987;于Sequences of Proteins ofImmunological Interest,US Department of Health and Human Services,NIH,USA中。
当将位置编号和/或氨基酸残基赋予特定抗体同种型时,其旨在适用于任何其它抗体同种型的相应的位置和/或氨基酸残基,这是本领域技术人员已知的。当提及来源于IgM或IgA的尾部的氨基酸残基时,根据本领域的常规实践,给出的位置编号是天然存在的IgM或IgA中的残基的位置编号。
本发明提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体融合蛋白;其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域;
其中每一个重链Fc区在位置309上包含除半胱氨酸外的任意氨基酸残基,并且在其C末端与尾部融合,所述尾部使所述单体单元组装成多聚体;并且
其中每一个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白还包含融合伴侣。术语‘融合伴侣’具体排除一个或多个抗体可变结构域。通常,术语‘融合伴侣’是指抗原、病原体相关分子模式(PAMP)、药物、配体、受体、细胞因子或趋化因子。
所述融合伴侣(当存在时)被融合至重链Fc区或每一个重链Fc区的N末端。可将融合伴侣直接融合至重链Fc区的N末端。或者,其可通过间插氨基酸序列来进行间接融合,所述间插序列可包括铰链。例如,可在融合伴侣与重链Fc区之间提供短的接头序列。
在一个实例中,本发明的蛋白质不包含融合伴侣。
具体地,本发明的多聚体融合蛋白不包含一个或多个抗体可变区,通常所述分子不包含VH或VL抗体可变区。在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白不包含Fab片段。
本发明的多聚体融合蛋白的每一个多肽单体单元包含抗体Fc结构域。
本发明的抗体Fc结构域可来源于任何合适的物种。在一个实施方案中,所述抗体Fc结构域来源于人Fc结构域。
抗体Fc结构域可来源于任何适合的种类的抗体,包括IgA(包括亚类IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包括亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)和IgM。在一个实施方案中,抗体Fc结构域来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个实施方案中,抗体Fc结构域来源于IgG1。在一个实施方案中,抗体Fc结构域来源于IgG4。
抗体Fc结构域包含两条多肽链,每一条称为重链Fc区。两个重链Fc区二聚化以产生抗体Fc结构域。虽然抗体Fc结构域内的两个重链Fc区可彼此不同,但应理解的是,这些重链Fc区将通常是彼此相同的。因此当在本文的下文中使用术语‘重链Fc区’时,这用于指与相同重链Fc区二聚化以产生抗体Fc结构域的单个重链Fc区。
通常,每一个重链Fc区包含两个或三个重链恒定结构域或由两个或三个重链恒定结构域组成。
在天然抗体中,IgA、IgD和IgG的重链Fc区由两个重链恒定结构域(CH2和CH3)组成,并且IgE和IgM的重链Fc区由3个重链恒定结构域(CH2、CH3和CH4)组成。这些结构域二聚化以产生Fc结构域。
在本发明中,重链Fc区可包含来自一个或多个不同种类(例如两个或三个不同种类)的抗体的重链恒定结构域。
在一个实施方案中,重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中,重链Fc区包含来源于IgG2的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中,重链Fc区包含来源于IgG3的CH2和CH3结构域。
在一个实施方案中,重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域。
本发明的多聚体融合蛋白已被统称为“Fc多聚体”并且这两个术语在本文中可互换使用。
本发明人已出乎意料地发现,CH3结构域在控制本发明的多聚体融合蛋白的单体单元的多聚化中起着重要作用。出乎意料地发现聚合取决于Fc区所源自的IgG亚类而变化。包含来源于IgG1的CH2结构域和CH3结构域的Fc多聚体非常高效地组装成六聚体,约80%的分子以六聚体形式存在。与此相反,包含来源于IgG4的CH2结构域和CH3结构域的Fc多聚体形成较低水平的六聚体。包含其中CH2结构域来源于一个特定的IgG亚类并且CH3结构域来源于一个不同的IgG亚类的杂交Fc区的Fc多聚体的调查显示,形成六聚体的能力主要由CH3结构域编码。来源于IgG1的CH3结构域的存在显著增加六聚化。其中CH2结构域来源于IgG1并且CH3结构域来源于IgG4的杂交Fc-多聚体是正好与IgG1野生型同样高效地组装,约80%的分子被发现为六聚体。(实施例4和图3)。因此,与野生型IgG4 Fc多聚体相比,用IgG1的CH3结构域替代IgG4的CH3结构域提高了六聚化的水平。所得的杂交体具有形成高水平的六聚体同时保持IgG4的许多期望的性质的有利方面。
另外,已知IgG1的CH3结构域赋予热稳定性。(Garber和Demarest,Biochem andBiophys Res Comm,第355卷p751-757 2007)。因此,包含来源于IgG1的CH3结构域的杂交Fc多聚体将还具有改善的稳定性。
因此,在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG1的CH3结构域。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域。
因此,在一个实施方案中,本发明提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域;
其中每一个重链Fc区在位置309上包含除半胱氨酸外的任意氨基酸残基,并且在其C末端上与使单体单元组成成多聚体的尾部融合;和
其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域,并且任选地所述多肽单体单元不包含抗体可变区。
本发明人已经证实,CH3结构域的位置355上的氨基酸对于六聚化是至关重要的。已发现在IgG1 CH3结构域的位置355上通常发现的精氨酸残基促进特别高效的六聚化。参见本文中下文所述的实施例4。
因此,在一个实施方案中,所述重链Fc区在位置355上包含精氨酸残基。
半胱氨酸残基对在IgG1 CH3结构域的位置355上通常发现的精氨酸残基的取代(R355C)增加六聚体形成,其超过野生型IgG1的六聚体形成。参见本文中下文所述的实施例4。
因此,在一个实施方案中,重链Fc区在位置355上包含半胱氨酸残基。
在本发明的Fc多聚体(其包含来源于IgG4的CH3结构域)中,在位置355上用精氨酸残基对谷氨酰胺残基进行的取代(Q355R)显著增加六聚化。因此,IgG4 Fc多聚体的较低六聚化的问题可通过单个氨基酸取代解决。这具有所得的Fc多聚体以高效率组装成六聚体同时保持IgG4的特征性质的有利方面。
因此,在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH3结构域,其中位置355上的谷氨酰胺残基已被另一种氨基酸取代。
因此,在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH3结构域,其中位置355上的谷氨酰胺残基已被精氨酸残基(Q355R)或半胱氨酸残基(Q355C)取代。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgM的CH4结构域。所述IgM CH4结构域通常位于CH3结构域与尾部之间。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG的CH2和CH3结构域和来源于IgM的CH4结构域。
应理解的是,用于产生本发明的重链Fc区的重链恒定结构域可包括上述天然存在的恒定结构域的变体。此类变体相较于野生型恒定结构域可包含一个或多个氨基酸变异。在一个实例中,本发明的重链Fc区包含至少一个在序列上与野生型恒定结构域不同的恒定结构域。应理解的是,所述变体恒定结构域可比野生型恒定结构域长或短。优选地,所述变体恒定结构域与野生型恒定结构域具有至少50%同一性或与其相似。如本文中所用,术语“同一性”是指在对齐的序列中的任何特定位置上,氨基酸残基在两个序列之间是相同的。如本文中所用,术语“相似性”是指在对齐的序列中的任何特定位置上,氨基酸残基在序列之间具有相似的类型。例如,可用亮氨酸取代异亮氨酸或缬氨酸。通常可彼此取代的其它氨基酸包括但不限于:
-苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸(具有芳香族侧链的氨基酸);
-赖氨酸、精氨酸和组氨酸(具有碱性侧链的氨基酸);
-天冬氨酸和谷氨酸(具有酸性侧链的氨基酸);
-天冬酰胺和谷氨酰胺(具有酰胺侧链的氨基酸);和
-半胱氨酸和甲硫氨酸(具有含硫侧链的氨基酸)。
可容易地计算同一性和相似性的程度(Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,编辑,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing.Informaticsand Genome Projects,Smith,D.W.,编辑,Academic Press,New York,1993;ComputerAnalysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.,编辑,HumanaPress,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;和Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,编辑,M Stockton Press,New York,1991)。在一个实例中,变体恒定结构域与野生型恒定结构域具有至少60%同一性或相似性。在另一个实例中,所述变体恒定结构域具有70%同一性或相似性。在另一个实例中,所述变体恒定结构域具有80%同一性或相似性。在另一个实例中,所述变体恒定结构域具有90%同一性或相似性。在另一个实例中,所述变体恒定结构域具有95%同一性或相似性。
每一个重链Fc区在其C末端与使多肽单体单元组装成多聚体融合。
IgM和IgA以共同的H2L2抗体单元的共价多聚体形式天然地存在于人中。当IgM已整合J链时其以五聚体形式存在,或者当其不存在J链时,其以六聚体形式存在。IgA以单体和二聚体的形式存在。IgM和IgA的重链具有至C末端恒定结构域的18个氨基酸延伸(称为尾部(tailpiece))。该尾部包括在多聚体的重链之间形成二硫键的半胱氨酸残基,并且据信在多聚化中具有重要作用。所述尾部还含有糖基化位点。
本发明的尾部可包含任何合适的氨基酸序列。其可以是在天然存在的抗体中被发现的尾部,或者可选择地,其可以是在长度和/或组成上与天然尾部相异的经修饰的尾部。其它经修饰的尾部可以是完全合成的,并且可被设计来具有用于多聚化的期望性质,诸如长度、柔性和半胱氨酸组成。
尾部可来源于任何合适的物种。抗体尾部在进化上是保守的,并且在大多数物种包括原始物种诸如真骨鱼类中被发现。在一个实施方案中,本发明的尾部来源于人抗体。
在一个实施方案中,尾部包含如表1中所示的来自人IgM或IgA的18个氨基酸的尾部序列的全部或部分。
可将尾部与重链Fc区的C末端直接融合。或者,可通过间插氨基酸序列将其间接融合。例如,可在尾部与重链Fc区之间提供短的接头序列。
本发明的尾部可包括上述天然序列的变体或片段。IgM或IgA尾部的变体通常具有与表1中显示的18个氨基酸位置中的8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个位置中的天然序列同一的氨基酸序列。片段通常包含8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个或17个氨基酸。尾部可以是杂交IgM/IgA尾部。还可设想变体的片段。
表1 尾部序列
本发明的每一个重链Fc区可任选地在其N末端具有天然铰链区或经修饰的铰链区。
天然铰链区是通常发现于天然存在的抗体中Fab与Fc结构域之间的铰链区。经修饰的铰链区是在长度和/或组成上与天然铰链区相异的任何铰链。此类铰链可以包括来自其它物种的铰链区,诸如人、小鼠、大鼠、兔、鲨鱼、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼(llama)或山羊的铰链区。其它经修饰的绞链区可包含来源于与所述重链Fc区的抗体种类或亚类不同的种类或亚类的抗体的铰链区。或者,所述经修饰的铰链区可包含天然铰链的部分或重复单元(其中所述重复中的每一个单元来源于天然铰链区)。在其它替代方案中,可通过将一个或多个半胱氨酸或其它残基转换成中性残基诸如丝氨酸或丙氨酸,或通过将适当地放置的残基转换成半胱氨酸残基来改变天然铰链区。通过此类方法,可增加或减少该铰链区中的半胱氨酸残基的数目。其它经修饰的铰链区可以是完全合成的,并且可被设计来具有所需的性质,诸如长度、半胱氨酸组成和柔性。
许多经修饰的铰链区早已在例如US5677425、WO9915549、WO2005003170、WO2005003169、WO2005003170、WO9825971和WO2005003171中进行了描述,并且这些通过引用并入本文。
合适的铰链序列的实例示于表2中。
在一个实施方案中,所述重链Fc区在其N末端具有完整铰链区。
在一个实施方案中,所述重链Fc区和铰链区来源于IgG4,并且铰链区包含突变序列CPPC(SEQ ID NO:11)。相较于含有序列CPPC的IgG1,人IgG4的核心铰链区含有序列CPSC(SEQ ID NO:12)。存在于IgG4序列中的丝氨酸残基导致该区域中柔性增加,因此一定比例的分子在同一蛋白质链内形成二硫键(链内二硫化键),而非桥连IgG分子中的另一重链以形成链间二硫化键。(Angal S.等,Mol Immunol,第30卷(1),p105-108,1993)。将丝氨酸残基改变成脯氨酸以产生与IgG1相同的核心序列允许完全形成IgG4铰链区中的链间二硫化键,从而减少在纯化的产物中的异质性。该改变的同种型被称为IgG4P。
表2.铰链序列
本发明的多聚体融合蛋白可包含2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个或12个或更多个多肽单体单元。此类蛋白质可选择地分别被称为二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚,十聚体、十一聚体、十二聚体等。
多聚体融合蛋白可包含具有一系列数目的多肽单体单元的不同大小的多聚体融合蛋白的混合物。
在一个实施方案中,本发明的多聚体融合蛋白包含6或12个多肽单体单元。
在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白为六聚体。
因此,在一个实例中,本发明提供了由6个多肽单体单元组成的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元由抗体Fc结构域和尾部区组成;
其中每一个抗体Fc结构域由两个重链Fc区组成,其中位置309上的氨基酸残基为除半胱氨酸外的任何氨基酸残基;和任选地,每一个重链Fc区在N末端上具有铰链区;和
其中将所述尾部区与每一个重链Fc区的C末端融合,并使单体单元组装成多聚体。
在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白是纯化的六聚体。在一个实例中,术语‘纯化的’意指大于80%的六聚体,例如大于90%或95%的六聚体。
应理解的是,可使用任何适当的方法诸如本文中下述的分析大小排阻层析来测定样品中的六聚体的量。
在一个实例中,本发明提供了包含以不止一种多聚体形式(例如六聚体和十二聚体)存在的本发明的多聚体融合蛋白的混合物,但其中已对所述混合物进行了富集,以富集所述多聚体融合蛋白的六聚体形式。
在一个实例中,这样的混合物可包含大于80%的六聚体。在一个实例中,这样的混合物可包含大于85%、90%或95%的六聚体。
本发明的每一个多肽单体单元包括两条单独的多肽链。特定多肽单体单元内的两条多肽链可以彼此相同,或它们可彼此不同。在一个实施方案中,两条多肽链彼此相同。
类似地,特定多聚体融合蛋白内的多肽单体单元可彼此相同,或它们可彼此不同。在一个实施方案中,多肽单体单元彼此相同。
在一个实施方案中,多肽单体单元的多肽链包含如图2中提供的任选地具有可选择的铰链或尾部序列的氨基酸序列。
因此,在一个实例中,本发明还提供了包含两个或更多个,优选6个多肽单体单元或由其组成的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元包含两个相同的多肽链,每条多肽链包含SEQID NO 26至47的任一个中给出的序列或由其组成,以及
其中每一个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在一个实例中,本发明还提供了包含两个或更多个,优选6个多肽单体单元或由其组成的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元包含两条相同的多肽链,每一条多肽链包含选自如下序列的序列或由所述序列组成:SEQ ID No:26、SEQ ID No:27、SEQ ID No:28、SEQ ID No:29、SEQ ID No:30、SEQ ID No:31、SEQ ID No:32、SEQ ID No:33、SEQ ID No:34、SEQ ID No:35、SEQ ID No:36、SEQ ID No:37、SEQ ID No:38、SEQ ID No:39、SEQ ID No:40、SEQ IDNo:41、SEQ ID No:42、SEQ ID No:43、SEQ ID No:44、SEQ ID No:45、SEQ ID No:46和SEQID No:47;以及
其中任选地每一个多肽单体单元不包含抗体可变区。
在一个实例中,当铰链和尾部可根据在SEQ ID NO 26至47中给出的序列发生变化时,本发明提供了包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域;
其中,每一个重链Fc区包括含SEQ ID NO 26至29的任一个的氨基酸6至222中或SEQ ID NO 32至47的任一个的氨基酸6至222中给出的序列或SEQ ID NO 30或31的氨基酸6至333中给出的序列或由所述序列组成,并且所述Fc区在其C末端与使单体单元组装成多聚体的尾部融合,以及
其中所述多肽单体单元不包含抗体可变区。
通常,除了C末端上的尾部以外,每一个重链Fc区还在N末端上包含铰链序列。
如本文下面所述的,本发明的多聚体融合蛋白可包含一个或多个突变,所述突变改变蛋白质的功能性质,例如,对Fc受体诸如FcRn或白细胞受体的结合、对补体的结合的突变、经修饰的二硫键结构或改变的糖基化模式。应当理解的是,可以以任何合适的方式组合任何这些突变以获得所需的功能性质,和/或将所述突变与其它突变组合,以改变蛋白质的功能性质。
在本发明中,已产生了特别适合用于治疗免疫性病症的Fc多聚体。所述Fc多聚体已被工程化来具有以下性质:
Fc多聚体蛋白用于治疗免疫性病症的效力应当尽可能高。可通过如实施例6中所述,测量抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用来测定效力。
不想要的副作用应当尽可能低。不想要的副作用可通过分别如实施例8、15和16中所述的测量细胞因子释放、C1q结合和血小板活化来测定。
包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的无任何另外的突变的野生型IgG1 Fc多聚体可能不太适合用于治疗免疫性病症,因为,尽管其表现出高的抑制吞噬作用的效力,但其也显示了高水平的不想要的副作用(通过细胞因子释放、C1q结合和血小板活化测量的)。
包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域的野生型IgG4 Fc多聚体产生极低水平的不想要的副作用,尽管其效力低于IgG1的效力。尽管如此,如图7中显示的,野生型IgG4 Fc多聚体的效力仍然显著高于IVIG的效力。
在一个实例中,本发明还提供了已被工程化来组合IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的所需性质而没有不期望的性质的Fc多聚体蛋白。如下面表3中显示的,这些Fc多聚体展示有效水平的效力,同时使不期望的副作用降至可耐受水平。预期这些Fc多聚体特别适用于治疗免疫性病症。
表3
在一个实例中,本发明提供了包含一个或多个突变的多聚体融合蛋白,与未经修饰的亲代多聚体融合蛋白相比,所述多聚体融合蛋白减少细胞因子释放和/或减少血小板活化和/或减少C1q结合。在一个实例中,所述未经修饰的亲代是含有来源于IgG1的CH2和CH3结构域的本发明的多聚体融合蛋白。
可通过本领域中已知的任何合适的方法测量细胞因子释放、血小板活化和C1q结合。在一个实例中,在全血细胞因子释放测定中测量细胞因子释放。
在一个实例中,使用CD62p作为活化标志物通过流式细胞术来测量血小板活化。
在一个实例中,通过ELISA测量C1q结合。
在一个实例中,本发明提供了包含一个或多个突变的多聚体融合蛋白,与未经修饰的亲代多聚体融合蛋白相比,所述多聚体融合蛋白增强抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用的效力。在一个实例中,所述未经修饰的亲代是含有来源于IgG4的CH2和CH3结构域或来源于IgG4的CH2结构域和来自IgG1的CH3结构域的本发明的多聚体融合蛋白。
用于测量抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用的适当的测定在本领域中是公知的并且在本文中的实施例中进行了描述。
因此,在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白的每一个重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域,其中位置234上的亮氨酸残基和/或位置331上的脯氨酸残基和/或位置327上的丙氨酸和/或位置296上的酪氨酸已被另一种氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域,其中位置234上的亮氨酸残基已被苯丙氨酸残基取代并且位置331上的脯氨酸残基已被丝氨酸残基取代(L234F/P331S)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体。
在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白的每一个重链Fc区包含来自IgG4的CH2结构域和来源于IgG4或IgG1的CH3结构域,其中选自位置234上的苯丙氨酸残基、位置296上的苯丙氨酸残基、位置327上的甘氨酸残基、位置330上的丝氨酸残基和位置331上的丝氨酸残基的一个或多个氨基酸残基已被另一种氨基酸取代。
在一个实例中,本发明的多聚体融合蛋白的每一个重链Fc区包含来自IgG4的CH2结构域和来源于IgG4或IgG1的CH3结构域,其中选自F234、F234和F296、G327、G327和S331、S330和S331以及G327和S330的一个或多个氨基酸残基或氨基酸对已被另一种氨基酸取代。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代(F234L)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代并且位置296上的苯丙氨酸残基已被酪氨酸残基取代(F234L/F296Y)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置330上的丝氨酸残基已被酪氨酸残基取代(G327A/S330A)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(G327A/S331P)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置330上的丝氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(S330A/S331P)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代(F234L)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代,并且位置296上的苯丙氨酸残基已被酪氨酸残基取代(F234L/F296Y)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代,并且位置330上的丝氨酸残基已被丙氨酸残基取代(G327A/S330A)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代,并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(G327A/S331P)。
在一个实施方案中,所述重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体,其中位置330上的丝氨酸残基已被丙氨酸残基取代,并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(S330A/S331P)。
本发明的多聚体融合蛋白可显示相较于对应的多肽单体单元和/或天然免疫球蛋白改变的对一种或多种Fc受体(FcR)的结合。可增加或减少对任何特定Fc受体的结合。在一个实施方案中,本发明的多聚体融合蛋白包含改变其Fc受体结合特征谱的一个或多个突变。
如本文中所用,术语“突变”可包括一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失。
人细胞可表达选自FcαR、FcεR、FcγR、FcRn和聚糖受体的许多膜结合的FcR。一些细胞还能表达可溶性(胞外域)FcR(综述见Fridman等,(1993)JLeukocyte Biology 54:504-512)。可根据IgG结合的亲和力(高/低)和生物效应(激活/抑制)进一步划分FcγR。人FcγRI被广泛地认为是唯一的‘高亲和力’受体,而所有其它FcγRI被认为是中至低亲和力受体。FcγRIIb凭借其胞内ITIM基序而为具有‘抑制’功能性的唯一受体,而其它所有的则凭借其ITAM基序或与共同的FcγR-γ链配对而被认为是‘激活性的’。FcγRIIIb也是独特的,因为虽然是活化的,但其通过GPI锚与细胞缔合。总之,人表达六个‘标准’FcγR:FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FcγRIIIa、FcγRIIIb。除了这些序列以外,还有大量跨这些家族的序列或同种异型变体。已发现这些序列中的一些具有重要的功能性后果,因此有时被认为是它们自己的受体亚型。实例包括FcγRIIaH134R、FcγRIIbI190T、FcγRIIIaF158V和FcγRIIIbNA1、FcγRIIIbNA2、FcγRIIIbSH。已显示每一个受体序列对于IgG的4个亚类:IgG1、IgG2、IgG3和IgG4具有不同的亲和力(Bruhns Blood(1993)第113卷,p3716-3725)。其它物种具有稍微不同的FcγR的数目和功能性,小鼠***是迄今研究得最充分的,并且由4种FcγR:FcγRI、FcγRIIb、FcγRIII、FcγRIV组成(Bruhns,Blood(2012)第119卷,p5640-5649)。细胞上的人FcγRI因其对于IgG1/IgG3/IgG4的亲和力(~10-8M)和这些IgG在血清中的浓度(~10mg/ml)而通常被认为在正常血清条件下被单体IgG‘占据’。因此,在其表面上具有FcγRI的细胞被认为能够通过结合的多特异性IgG来替代地进行它们的抗原性环境的‘筛选’或‘取样’。其他具有较低的对于IgG亚类的亲和力(在~10-5–10-7M的范围内)的受体通常被认为是‘未被占据的’。低亲和力受体因而固有地对牵涉免疫复合物的抗体的检测以及通过所述复合物的活化敏感。抗体免疫复合物中的增加的Fc密度导致对低亲和力FcγR的结合‘亲合力’的功能性亲和力增加。这已使用许多方法在体外获得了证明(ShieldsR.L.等,J Biol Chem,第276卷(9),p6591-6604,2001;Lux等,J Immunol(2013)第190卷,p4315-4323)。其还已被显示为是使用抗-RhD治疗人的ITP中的主要作用模式(CrowTransfusion Medicine Reviews(2008)第22卷,p103-116)。
许多细胞类型表达多种类型的FcγR,因此IgG或抗体免疫复合物对具有FcγR的细胞的结合可取决于生物背景而具有多个复杂结果。最简单地,细胞可接收活化、抑制或混合信号。这可导致事件诸如吞噬作用(例如巨噬细胞和嗜中性粒细胞)、抗原加工(例如树突状细胞)、减少的IgG产生(例如B-细胞)或脱粒(例如嗜中性粒细胞、肥大细胞)。有数据支持来自FcγRIIb的抑制信号可主导活化信号的抑制(Proulx Clinical Immunology(2010)135:422-429。
细胞因子是调节免疫***的细胞或实现靶细胞诸如病毒感染或癌前宿主细胞的杀伤的高度强效蛋白质的家族。高水平的效力已被研究来将它们本身用作治疗性蛋白或在与靶向部分融合后用作治疗性蛋白。IL-2、TNFα、G-CSF、GM-CSF、IFNα、IFNβ、IFNγ已全部被研究来用于人。通过广泛的副作用或不良事件证明它们的极端效力,所述副作用或不良事件导致在具有严重或威胁生命的病况的患者中相当有限的用途。
可在全身性施用治疗性蛋白诸如抗体或免疫球蛋白后引发体内细胞因子的产生。细胞因子的产生可以是短寿的和短暂的,诸如在通过输注或皮下注射的施用过程中和在所述施用后不久。例如,已知静脉注射免疫球蛋白的输注导致可与常见输注相关事件:发热、恶寒和恶心相关的TNFα、IL-6、IL-8和IFNγ产生(Aukrust P等,Blood,第84卷,p2136-2143,1994)。细胞因子的产生可以是更长寿的并且因效应细胞的活化(例如如在所谓的‘肿瘤裂解综合征’中)而与药物作用模式相关。当药物的施用引起‘细胞因子风暴’时,极端实例是威胁生命的(Suntharalingam G等,N Engl J Med,第355卷,p1018-1028,2006)。
存在明确的对理解工程化重组蛋白的细胞因子释放风险和使所述细胞因子释放风险降至最低的需要。含有抗体的Fc结构域并且能够成为功能性多价体的重组蛋白需要特别关注。
在多聚体Fc结构域的目前研究中,采用全血细胞因子释放测定来研究目标在于使细胞因子释放降至最低的诱变的作用。(实施例7)。
血小板(platelet)(血小板(thrombocyte))是在血液非常丰富的小的无核细胞。血小板与凝血因子和其它细胞一起通过形成血凝块参与止血。血小板牵涉许多疾病。低血小板计数“血小板减少症”可由许多因素引起,并且导致增加的瘀伤和出血。无故凝血“血栓”包括事件,诸如中风和深静脉血栓形成。人和非人灵长类动物血小板,但非小鼠血小板在其表面上表达FcγRIIa。血小板可通过预先形成的“致密颗粒”和“α颗粒”以及高效免疫因子(immunokine)和其它分子(诸如组胺、血清素、血栓素、PAF、PDGF、TGFγ、IL1β和许多其它分子)的释放非常快速地响应血管损伤(Semple Nature Reviews Immunology 2011 11:265-274)。
血小板在机制上牵涉向人施用的药物的毒理学。已发现某些抗体特别引人关注,因为它们的靶抗原和Fc结构域能够与血小板相互作用,活化它们并导致血栓形成(Horsewood 1991 78(4):1019-1026)。对于抗-CD40Mab已提出了直接双结合的机制(Langer Thrombosis and Haemostasis 2005 93:1127-1146)。或者,血栓形成可通过与可与血小板相互作用的靶分子交联的抗体间接引起,诸如在“HIT综合征'(肝素诱导的血小板减少症)中。未分级分离的肝素与约12%的受者的静脉血栓形成相关(Levine Chest 2006130:681-687)。在其它诸如Mab靶向VEGF的实例中,作用机理可能涉及充当VEGF、抗体与血小板之间的桥梁的肝素(Scappaticci 2007J National Cancer Institute 99:1232-1239;Meyer J.Thrombosis and Haemostasis 2009 7:171-181)。血栓形成也可由聚集的IgG引起,从而当生产IgG时产品质量是重要的,当生产多聚体Fc结构域时,可能特别重要(Ginsberg J.Experimental Medicine 1978 147:207-218)。
血小板活化是血栓形成的前兆,但并不必然导致血栓形成。体外可通过血清素释放测定或根据活化标志CD62p、CD63或PAC-1观察血小板活化。可通过全血、富含血小板的血浆或洗涤的血小板聚集测定在体外直接观测血小板聚集。还可将在血小板上表达人FcγRIIa的转基因小鼠用于在体内研究血栓形成或减少的凝血。多聚体Fc结构域蛋白的构建在血栓形成方面造成了可预知的风险,因此,在本发明中,已采用Fc工程化和血小板活化测定来理解和确保所述Fc多聚体的安全性。
FcRn在维持IgG在成人和儿童的血清中的长半寿期中具有至关重要的作用。该受体在酸化囊泡(pH<6.5)中结合IgG,从而保护IgG分子免受降解,随后在血液中在较高的pH7.4下释放IgG。
FcRn是不同的白细胞Fc受体,并且相反地,具有与MHC I类分子的结构相似性。它是由非共价附接于膜结合的链的β2-微球蛋白链组成的异二聚体,所述膜结合的链包括3个胞外域。这些结构域之一(包括碳水化合物链)与β2-微球蛋白一起与Fc的CH2与CH3结构域之间的位点相互作用。该相互作用包括对IgG上的组氨酸残基(其在pH<6.5下带正电荷)产生的盐桥。在较高的pH下,His残基失去它们的正电荷,FcRn-IgG相互作用被减弱并且IgG解离。
用作IVIG疗法的潜在替代的多聚体Fc融合蛋白已在文献中进行了描述,但该蛋白不结合人FcRn。因此它在体内具有减少的功能性。(Mekhaiel等;Nature ScientificReports 1:124,2011年10月19日出版)。
Mekhaiel等描述了多聚人Fc融合蛋白六聚hIgG1-Fc-LH309/310CL-尾部。该蛋白包含双突变,其中位置309上的亮氨酸被半胱氨酸取代,位置310上的组氨酸被亮氨酸取代。因为H310对于对人FcRn的结合是至关重要的,因此由Mekhaiel描述的蛋白不能结合人FcRn。
在本发明的时候据信L309C/H310L双突变对于单体单元的聚合是必不可少的。(Mekhaiel等;2011)。然而,本发明人已出乎意料地产生了在不存在L309C/H310L双突变的情况下高效地组装成多聚体的多聚体融合蛋白。
通过L309C突变产生的半胱氨酸残基被认为与相邻单体单元上的L309C半胱氨酸形成链间二硫键。由于这些二硫键与H310非常靠近,因此它们的存在可导致FcRn结合受阻。在本发明的多聚体融合蛋白中,L309C突变的不存在允许对FcRn的结合不受阻碍。
此外,位置309上不存在半胱氨酸残基简化了多聚体融合蛋白的分离和纯化,从而改善了其可制造性。这也可降低免疫原性的潜力。
此外,通过保留位置310和优选地还有位置435上的组氨酸残基,本发明的多聚体融合蛋白能够结合人FcRn,并且被保护免受降解,从而导致更长的半寿期和更大的功能性。
因此,在一个实施方案中,本发明的多聚体融合蛋白结合人FcRn。
在一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白在位置310上,优选也在位置435上具有组氨酸残。这些组氨酸残基对于人FcRn结合是重要的。在一个实施方案中,位置310和435上的组氨酸残基是天然残基,即,位置310和435未被突变。或者,这些组氨酸残基的一个或两个可作为突变的结果存在。
本发明的多聚体融合蛋白可包含改变其对FcRn的结合的一个或多个突变。所述改变的结合可以是增加的结合或减少的结合。
在一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白包含一个或多个突变,以便其以比对应的天然免疫球蛋白更大的亲和力和亲合力结合FcRn。
在一个实施方案中,通过用谷氨酰胺残基取代位置250上的苏氨酸残基(T250Q)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用酪氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基(M252Y)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基(S254T)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基(T256E)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置307上的苏氨酸残基(T307A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用脯氨酸残基取代位置307上的苏氨酸残基(T307P)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用半胱氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308C)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用苯丙氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308F)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用脯氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308P)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置311上的谷氨酰胺残基(Q311A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用精氨酸残基取代位置311上的谷氨酰胺残基(Q311R)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用亮氨酸残基取代位置428上的甲硫氨酸残基(M428L)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用赖氨酸残基取代位置433上的组氨酸残基(H433K)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用苯丙氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(N434F)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用酪氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(N434Y)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用酪氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基,用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基和用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基(M252Y/S254T/T256E)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用脯氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基和用酪氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(V308P/N434Y)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用酪氨酸残基取代位置252上的甲硫氨酸残基,用苏氨酸残基取代位置254上的丝氨酸残基,用谷氨酸残基取代位置256上的苏氨酸残基,用赖氨酸残基取代位置433上的组氨酸残基和用苯丙氨酸残基取代位置434上的天冬酰胺残基(M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白包含一个或多个突变,以便其以比对应的天然免疫球蛋白更低的亲和力和亲合力结合FcRn。在一个实施方案中,将位置310上的组氨酸残基突变成另一个氨基酸残基。在一个实例中,用亮氨酸残基取代位置310上的组氨酸残基(H310L)。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变以改变FcRn结合。
本发明的多聚体融合蛋白可包含增加其对FcγRIIb的结合的一个或多个突变。FcγRIIb是人中的唯一抑制性受体和在B细胞上发现的唯一Fc受体。B细胞以及它们的致病性抗***于许多免疫性疾病的中心,因此多聚体融合蛋白可为这些疾病提供改进的疗法。
在一个实施方案中,通过用天冬氨酸残基取代位置238上的脯氨酸残基(P238D)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置258上的谷氨酸残基(E258A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(S267A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用谷氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(S267E)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用苯丙氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(L328F)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置258上的谷氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基(E258A/S267A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用谷氨酸残基取代位置267上的丝氨酸残基和用苯丙氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(S267E/L328F)来突变Fc结构域。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变以增加FcγRIIb结合。
在本发明的一个实施方案中,我们提供了展示减少的对FcγR的结合的多聚体融合蛋白。减少的对FcγR的结合可提供用于治疗牵涉致病性抗体的免疫性疾病的改进的疗法。
在本发明的一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白包含减少其对FcγR的结合的一个或多个突变。
在一个实施方案中,将减少对FcγR的结合的突变用于包含来源于IgG1的Fc结构域的本发明的多聚体融合蛋白中。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基(L234A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置234上的苯丙氨酸残基(F234A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用精氨酸残基取代位置236上的甘氨酸残基(G236R)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297上的天冬酰胺残基来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置298上的丝氨酸残基(S298A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用精氨酸残基取代位置328上的亮氨酸残基(L328R)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L234A/L235A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置234上的苯丙氨酸残基和用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(F234A/L235A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用精氨酸残基取代位置236上的甘氨酸残基和用精氨酸残基取代位置328亮氨酸残基(G236R/L328R)来突变Fc结构域。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变以减少FcγR结合。
在本发明的一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白包含减少其对FcγRIIIa的结合而不影响其对FcγRII的结合的一个或多个突变。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置239上的丝氨酸残基(S239A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置269上的谷氨酸残基(E269A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置293上的谷氨酸残基(E293A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用苯丙氨酸残基取代位置296上的酪氨酸残基(Y296F)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置303上的缬氨酸残基(V303A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用甘氨酸残基取代位置327上的丙氨酸残基(A327G)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置338上的赖氨酸残基(K338A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置376上的天冬氨酸残基(D376A)来突变Fc结构域。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变以减少FcγRIIIa结合。
本发明的多聚体融合蛋白可包含改变其对补体的结合的一个或多个突变。改变的补体结合可以是增加的结合或减少的结合。
在一个实施方案中,所述蛋白包含减少其对C1q的结合的一个或多个突变。经典补体途径的引发始于六聚C1q蛋白对结合抗原的IgG和IgM的CH2结构域的结合。本发明的多聚体融合蛋白不具有抗原结合位点,因此预期不能显示显著的对C1q的结合。然而,减少C1q结合的一个或多个突变的存在将确保它们在不存在抗原接合的情况下不激活补体,从而提供了具有更大安全性的改进的疗法。
因此,在一个实施方案中,本发明的多聚体融合蛋白包含一个或多个突变来减少其对C1q的结合。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置234上的亮氨酸残基(L234A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用谷氨酸残基取代位置235上的亮氨酸残基(L235E)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置237上的甘氨酸残基(G237A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置322上的赖氨酸残基(K322A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基取代位置331上的脯氨酸残基(P331A)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,通过用丝氨酸残基取代位置331上的脯氨酸残基(P331S)来突变Fc结构域。
在一个实施方案中,所述多聚体融合蛋白包含来源于IgG4的Fc结构域。IgG4具有比IgG1天然上更低的补体激活特征谱,但也具有更弱的FcγR的结合。因此,在一个实施方案中,包含IgG4的多聚体融合蛋白还包含增加FcγR结合的一个或多个突变。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变以减少C1q结合。
本发明的多聚体融合蛋白包含一个或多个突变来产生或除去半胱氨酸残基。半胱氨酸残基通过在单个多肽单体单元对之间形成二硫桥在多聚体融合蛋白的自发组装中具有重要作用。或者,它们可用于游离SH基团的化学修饰。因此,通过改变半胱氨酸残基的数目和/位置,有可能修饰多聚体融合蛋白的结构以产生治疗性质得到改善的蛋白质。
本发明的多聚体融合蛋白在位置309上不包含半胱氨酸残基。位置309上的氨基酸残基可以是除半胱氨酸外的任意氨基酸残基。在一个实施方案中,位置309上的氨基酸残基是在对应的天然存在的抗体中发现的野生型残基。例如,在天然存在的人IgG1、IgG3和IgG4中的位置309上发现的野生型残基是亮氨酸残基,在天然存在的IgG2中发现的野生型残基是缬氨酸残基。
在一个实施方案中,通过用半胱氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308C)来突变抗体Fc结构域。
在本发明的一个实施方案中,我们提供了包含更少的二硫键和/或糖基化位点的具有改善的可制造性的多聚体融合蛋白。这些蛋白具有不太复杂的二硫键构造和翻译后糖基化模式,从而对于生产来说更简单和不太昂贵。
在一个实施方案中,通过将核心铰链序列CPPC突变成SPPS来除去铰链区中的两个二硫键。
在一个实施方案中,通过用丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸残基取代位置575上的半胱氨酸残基(C575S、C575T或C575A)来除去尾部中的二硫键。
在一个实施方案中,将核心铰链序列CPPC突变成SPPS,并用丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸残基取代位置575上的尾部半胱氨酸残基(C575S、C575T或C575A)。
在一个实施方案中,本发明的多聚体融合蛋白包含基本上非共价的结构域间相互作用。
在一个实施方案中,在细胞中表达本发明的多聚体融合蛋白,以便实用比例的产物是六聚体。
实用比例优选大于或等于50%,例如50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-100%。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297上的天冬酰胺残基来除去CH2结构域中的糖基化位点。除了改善的可制造性外,如本文上文描述的,这些无糖基突变体还减少FcγR结合。
在一个实施方案中,通过用丙氨酸残基(N563A)或谷氨酰胺残基(N563Q)取代位置563上的天冬酰胺残基来除去尾部中的糖基化位点。
在一个实施方案中,CH2结构域中的糖基化位点和尾部中的糖基化位点均通过用丙氨酸残基或谷氨酰胺残基取代位置297上的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基或谷氨酰胺残基取代位置563上的天冬酰胺残基(N297A/N563A或N297A/N563Q或N297Q/N563A或N297Q/N563Q)来除去。
应理解的是,可组合任何上文所列的突变。
本发明还提供了编码本发明的多肽单体单元的多肽链或其组成部分的分离的DNA序列。所述DNA序列可包含合成DNA(例如通过化学加工产生的)、cDNA、基因组DNA或其任意组合。
可通过本领域技术人员众所周知的方法获得编码本发明的多肽单体单元的多肽链的DNA序列。例如,可按需要从所述测定的DNA序列或基于对应的氨基酸序列合成编码多肽单体单元的多肽链的部分或全部的DNA序列。在SEQ ID NO 50-59中提供了根据本发明的合适的DNA序列的实例。
分子生物学的标准技术可用于制备编码本发明的多肽单体单元的多肽链的DNA序列。可使用寡核苷酸合成技术完全或部分合成所需的DNA序列。适当时可使用定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术。
本发明还涉及包含本发明的一个或多个DNA序列的克隆载体或表达载体。因此,提供了包含编码本发明的多肽单体单元的多肽链或其构成部分的一个或多个DNA序列的克隆载体或表达载体。
籍以构建载体的一般方法、转染方法和培养方法对于本领域技术人员来说是众所周知的。在这方面,参考“Current Protocols in Molecular Biology”,1999,F.M.Ausubel(编辑),Wiley Interscience,New York和由Cold Spring Harbor Publishing制作的Maniatis Manual。
还提供了包含含有编码本发明的多聚体融合蛋白的一个或多个DNA序列的一个或多个克隆载体或表达载体的宿主细胞。任何合适的宿主细胞/载体***可用于表达编码本发明的多聚体融合蛋白的DNA序列。可使用细菌例如大肠杆菌(E.coli)和其它微生物***诸如酿酒酵母(Saccharomyces)或毕赤酵母(Pichia),或还可使用真核生物(例如哺乳动物)宿主细胞表达***。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞。用于本发明的中国仓鼠卵巢(CHO细胞)的合适类型可包括CHO和CHO-K1细胞,包括dhfr-CHO细胞,诸如CHO-DG44细胞和CHO-DXB11细胞(可将所述细胞与DHFR选择标记一起使用),或CHOK1-SV细胞(可将所述细胞与谷氨酰胺合成酶选择标记一起使用)。其它合适的宿主细胞包括NSO细胞。
本发明还提供了用于产生根据本发明的多聚体融合蛋白的方法,所述方法包括在适合用于表达所述融合蛋白和组装成多聚体的条件下培养含有本发明的载体的宿主细胞,以及分离和任选地纯化所述多聚体融合蛋白。
从宿主细胞以优良水平表达本发明的多聚体融合蛋白。因此所述多聚体融合蛋白的性质有助于商业加工。
本发明的多聚体融合蛋白使用任何合适的方法来产生。在一个实施方案中,可在使聚集降至最低的条件下产生本发明的多聚体融合蛋白。在一个实例中,可通过向培养基、培养上清液或纯化介质中添加防腐剂来使聚集降至最低。合适的防腐剂的实例包括硫醇封端剂,诸如N-乙基马来酰亚胺、碘乙酸、β-巯基乙醇、β-巯基乙胺、谷胱甘肽或半胱氨酸。其它实例包括二硫化物抑制剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)或低于pH6.0的酸化。
在一个实施方案中,提供了用于纯化本发明的多聚体融合蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:以非结合模式进行阴离子交换层析,以便杂质保留在柱子上并且抗体被洗脱。
在一个实施方案中,纯化使用在FcRn、FcγR或C反应蛋白柱上的亲和捕获。
在一个实施方案中,纯化使用蛋白A。
用于所述方法的合适的离子交换树脂包括Q.FF树脂(由GE-Healthcare提供)。可以例如在约8的pH下进行所述步骤。
所述方法还可包括例如在约4至5(诸如4.5)的pH下进行的应用阳离子交换层析的初始捕获步骤。所述阳离子交换层析可以例如应用树脂诸如CaptoS树脂或SP sepharoseFF(由GE-Healthcare提供)。随后可应用离子盐溶液诸如氯化钠(例如以200mM的浓度)从树脂洗脱抗体或片段。
因此,适当时,层析步骤可包括一个或多个洗涤步骤。
纯化方法还可包括一个或多个过滤步骤,诸如渗滤步骤。
可根据分子大小,例如通过大小排阻层析分离具有所需数目的多肽单体单元的多聚体。
因此,在一个实施方案中,提供了以基本上纯的形式(特别地不含或基本上不含内毒素和/或宿主细胞蛋白或DNA)存在的根据本发明的纯化的多聚体融合蛋白。
如上文中使用的纯的形式旨在指至少90%的纯度,诸如91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%w/w或更纯。
基本上不含内毒素通常旨在指1EU/mg抗体产物或更少诸如0.5或0.1EU/mg产物的内毒素含量。
基本上不含宿主细胞蛋白或DNA通常旨在指,适当时,400μg/mg抗体产物或更少诸如100μg/mg或更少,特别地20μg/mg的宿主细胞蛋白和/或DNA含量。
由于本发明的多聚体融合蛋白在病理性病况的治疗和/或预防中是有用的,因此本发明还提供了包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种组合的本发明的多聚体融合蛋白的药物或诊断组合物。因此,提供了本发明的蛋白用于制造药剂的用途。所述组合物通常将作为通常包含药学上可接受的载体的无菌药物组合物的部分提供。本发明的药物组合物可额外地包含药学上可接受的赋形剂。
本发明还提供了用于制备药物或诊断组合物的方法,所述方法包括添加本发明的多聚体融合蛋白并将其与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体的一种或多种混合在一起。
所述多聚体融合蛋白可以是药物或诊断组合物中的唯一活性成分,或可伴有其它活性成分(包括其它抗体成分或非抗体成分诸如甾类或其它药物分子)。
所述药物组合物适当地包含治疗有效量的本发明的多聚体融合蛋白。如本文中所用,术语“治疗有效量”是指治疗、改善或预防被靶向的疾病或病况,或表现出可检测的治疗或预防效果所需的治疗剂的量。对于任何药,最初可在细胞培养测定中或在动物模型中(通常在啮齿类动物、兔、狗、猪或灵长类动物中)评估治疗有效量。还可使用动物模型来测定适当的施用浓度范围和途径。随后使用这样的信息来决定用于在人中施用的有用剂量和途径。
用于人受试者的精确的治疗有效量将取决于疾病状态的严重度、受试者的一般健康、受试者的年龄、体重和性别、饮食、施用时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/响应。该量可通过常规实验来测定并且在临床医生的判断内。一般地,所述治疗有效量会是0.01mg/kg至500mg/kg,例如0.1mg/kg至200mg/kg,诸如100mg/kg。可方便地以含有每剂量预定量的本发明的活性剂的单位剂量形式提供药物组合物。
根据本公开的多聚体融合蛋白的治疗剂量在体内未显示明显的毒理学效应。
在根据本发明的多聚体融合蛋白的一个实施方案中,单个剂量可提供至多90%的循环IgG水平的降低。
可单独地向患者施用组合物,或可将其与其它药剂、药物或激素组合(例如,同时地、相继地或分开地)施用。
在一个实施方案中,将根据本公开的多聚体融合蛋白与免疫抑制疗法诸如甾类(具体地***)一起应用。
在一个实施方案中,可将根据本公开的多聚体融合蛋白与利妥昔单抗或其它B细胞疗法组合应用。
在一个实施方案中,将根据本公开的多聚体融合蛋白与任何B细胞或T细胞调节剂或免疫调节剂一起应用。实例包括氨甲蝶呤、霉酚酸酯(mycophenylate)和硫唑嘌呤。
施用本发明的多聚体融合蛋白的剂量取决于待治疗的病况的性质、现有疾病的程度,以及取决于所述多聚体融合蛋白是被预防性使用还是用于治疗现有病况。
剂量的频率将取决于所述多聚体融合蛋白的半寿期和其作用的持续时间。如果所述多聚体融合蛋白具有短的半寿期(例如2至10小时),则可能必需提供每日一个或多个剂量。或者,如果所述多聚体融合蛋白长的半寿期(例如2至15天)和/或长效药效学效应,则可只需提供每日一次、每周一次或甚至每1或2个月一次的剂量。
在一个实施方案中,每两周即每月两次递送剂量。
如本文中使用的半寿期旨在指分子在循环中,例如在血清/血浆中的持续时间。
如本文中使用的药效学是指根据本公开的多聚体融合蛋白的生物作用的特征谱和具体地持续时间。
药学上可接受的载体本身不应当诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体产生并且应当是无毒的。合适的载体可以是大的缓慢代谢的大分子诸如蛋白质、多肽、脂质体、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性病毒颗粒。
可使用药学上可接受的盐,例如无机酸盐诸如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐和硫酸盐,或有机酸盐诸如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐和苯甲酸盐。
治疗组合物中的药学上可接受的载体可额外地含有液体,诸如水、盐水、甘油和乙醇。此外,辅助性物质,诸如润湿剂或乳化剂或pH缓冲物质,可以存在于此类组合物中。此类载体使得药物组合物能够配制为片剂、丸剂、糖衣片、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液,以用于被患者摄取。
用于施用的合适形式包括适于肠胃外(例如通过注射或输注,例如通过快速团注或连续输注)施用的形式。当该产品用于注射或输注时,其可采用油性或含水媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式,并且其可含有配制剂,诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。蛋白可以以纳米颗粒的形式存在。或者,抗体分子可以干燥形式存在,用于在使用前利用适当的无菌液体重构。
一旦配制,就可向受试者直接施用本发明的组合物。待治疗的受试者可以是动物。然而,在一个或多个实施方案中,所述组合物适用于向人受试者施用。
适当地在根据本公开的制剂中,最终制剂的pH与所述多聚体融合蛋白的等电点的值不相似,例如,如果该蛋白的pI在8-9的范围内或更高,则pH值为7的制剂可以是适当的。尽管不希望受理论束缚,但据认为这可最终提供具有改善的稳定性的最终制剂,例如所述多聚体融合蛋白保留在溶液中。
在一个实例中,在4.0至7.0的范围内的pH下的药物制剂包含:1至200mg/mL的根据本公开的蛋白质分子、1至100mM的缓冲液、0.001至1%的表面活性剂、a)10至500mM的稳定剂,b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张度剂或c)5至500mM的张度剂。
本发明的药物组合物可以通过许多途径施用,包括、但不限于口服、静脉内、肌内、动脉内、髓内、鞘内、心室内、透皮、经皮(例如,参见WO98/20734)、皮下、腹膜内、鼻内、肠内、局部、舌下、***内或经直肠途径。还可将喷射注射器用于施用本发明的药物组合物。通常,可将药物组合物制备为可注射剂,制备为液体溶液或悬浮液。也可制备适合用于液体介质中的溶液或悬浮液的固体形式(在注射之前)。
所述组合物的直接递送通常通过皮下、腹膜内、静脉内或肌内注射来实现,或其被递送至组织的间隙空间。还可将组合物施用至病灶中。剂量治疗可以是单次剂量方案或多次剂量方案。
应该理解的是,所述组合物中的活性成分将是蛋白质分子。这样,其在胃肠道中会易于降解。因此,如果将通过使用胃肠道的途径施用所述组合物,则所述组合物将需要含有保护蛋白质免受降解但在其已被从胃肠道吸收后释放所述蛋白质的药剂。
药学上可接受的载体的详尽论述可在Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company,N.J.1991)中获得。
在一个实施方案中,可将制剂提供为用于局部施用(包括吸入)的制剂。
合适的可吸入制剂包括可吸入粉剂、含喷射剂气体的计量气溶胶或不含喷射剂气体的可吸入溶液。根据本公开的含有活性物质的可吸入粉剂可纯粹由上述活性物质组成或由上述活性物质与可生理上可接受的赋形剂的混合物组成。这些可吸入粉剂可包括单糖(例如葡萄糖或***糖)、二糖(例如乳糖、蔗糖、麦芽糖)、寡糖和多糖(例如葡聚糖)、多元醇(例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇)、盐(例如氯化钠、碳酸钙)或这些的互相之间的混合物。适当地使用单糖或二糖,使用乳糖或葡萄糖,所述糖特别地但不唯一地以其水合物的形式存在。
用于肺中的组合物的颗粒需要小于10微米的粒度,诸如1-9微米,例如1至5μm。活性成分(诸如抗体或片段)的粒度是最重要的。
可用于制备可吸入气溶胶的喷射剂气体在本领域中是众所周知的。合适的喷射剂气体选自烃,诸如正丙烷、正丁烷或异丁烷,和卤代烃诸如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的氯代或氟代衍生物。可单独使用上述喷射剂气体本身或以其混合物使用上述喷射剂气体。
特别合适的喷射剂气体是选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227的卤代烷烃衍生物。在上述卤代烃中,TG134a(1,1,1,2-四氟乙烷)和TG227(1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷)及其混合物是特别合适的。
含喷射剂气体的可吸入气溶胶还可含有其它成分如助溶剂、稳定剂、表面活性剂(表面活化剂)、抗氧化剂、润滑剂和用于调节pH的手段(means)。所有这些成分在本领域中是已知的。
根据本发明的含喷射剂气体的可吸入气溶胶可含有按重量计至多5%的活性物质。根据本发明的气溶胶含有例如按重量计0.002%至5%、按重量计0.01%至3%、按重量计0.015%至2%、按重量计0.1%至2%、按重量计0.5%至2%或按重量计0.5%至1%的活性成分。
或者,还可通过施用液体溶液或悬浮制剂,例如使用装置诸如雾化器,例如连接至压缩机的雾化器(例如,连接至由Pari Respiratory Equipment,Inc.,Richmond,Va.制造的Pari Master(R)压缩机的Pari LC-Jet Plus(R)雾化器)来进行至肺的局部施用。
可递送以溶液或悬浮液的形式分散在溶剂中的本发明的多聚体融合蛋白。可将其悬浮在适当的生理溶液例如盐水或其它药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中。本领域中已知的缓冲溶液可含有每1ml水中0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠、8.0mg至9.0mg NaCl、0.15mg至0.25mg聚山梨醇酯、0.25mg至0.30mg无水柠檬酸和0.45mg至0.55mg柠檬酸钠,以获得约4.0至5.0的pH。悬浮液可使用例如冻干的蛋白质。
治疗性混悬剂或溶液制剂还可含有一种或多种赋形剂。赋形剂在本领域中是众所周知的,并且包括缓冲剂(例如,柠檬酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂)、氨基酸、尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白质(例如,血清白蛋白)、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨糖醇和甘油。可将溶液或悬浮液包封在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌生产方法以基本上无菌的形式提供该制剂。
这可包括生产和用于制剂的经缓冲的溶剂/溶液的过滤灭菌、蛋白质在无菌经缓冲的溶剂溶液中的无菌悬浮,以及通过本领域普通技术人员熟悉的方法将制剂分配至无菌容器中。
可以例如以包装在箔包封袋中的单次剂量单位(例如,密封在塑料容器或小瓶中的)提供根据本公开的可雾化制剂。每一个小瓶在例如2ml的溶剂/溶液缓冲液的体积中包含单位剂量。
本文中公开的多聚体融合蛋白可适用于通过喷雾进行的递送。
也设想了可通过使用基因疗法施用本发明的蛋白质。为了实现该目的,将在适当的DNA元件控制下编码蛋白质分子的多肽链的DNA序列引入到患者,以便从DNA序列表达所述多肽链和原位组装所述多肽链。
在一个实施方案中,我们提供了用于治疗的本发明的多聚体融合蛋白。
在一个实施方案中,我们提供了用于治疗免疫性病症的本发明的多聚体融合蛋白。
在一个实施方案中,我们提供了本发明的多聚体融合蛋白用于制备用于治疗免疫性病症的药剂的用途。
可使用本发明的多聚体融合蛋白治疗的免疫性病症的实例包括免疫性血小板减少症(ITP)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、川崎病和Guillain-Barre综合征(GBS)。
本发明还提供了用于控制自身免疫性疾病的多聚体融合蛋白(或包含其的组合物),所述疾病是例如急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性坏死性出血性白质脑炎、艾迪生病、丙种球蛋白血症、斑秃、淀粉样变性、ANCA相关性血管炎、强直性脊柱炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗磷脂综合征(APS)、自身免疫性血管性水肿、自身免疫性再生障碍性性贫血、自身免疫性自主神经功能异常、自身免疫性肝炎、自身免疫性高脂血症、自身免疫性免疫缺陷、自身免疫性内耳病(AIED)、自身免疫性心肌炎、自身免疫性胰腺炎、自身免疫性视网膜病、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、自身免疫性甲状腺疾病、自身免疫性荨麻疹、轴突&纳尔神经病变、巴洛病、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、Castleman病、乳糜泻、美洲锥虫病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss syndrome)、瘢痕性类天疱疮/良性黏膜类天疱疮、克罗恩病、Cogans综合征、冷凝集素病、先天性心脏传导阻滞、柯萨奇病毒性心肌炎、CREST病、原发性混合型冷球蛋白血症、脱髓鞘神经病变、疱疹样皮炎、皮肌炎、德维克病(视神经脊髓炎)、扩张型心肌病、盘状红斑狼疮、心肌梗死后综合征、子宫内膜异位症、嗜酸性血管中心纤维化、嗜酸性筋膜炎、结节性红斑、实验性变应性脑脊髓炎、伊文思综合征、纤维化肺泡炎、巨细胞性动脉炎(颞动脉炎)、肾小球肾炎、肺出血肾炎综合征、多血管炎肉芽肿肉芽肿病(GPA)(见Wegener's)、格雷夫斯病、Guillain-Barre综合征、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、溶血性贫血、Henoch-Schonlein紫癜、妊娠疱疹、低丙球蛋白血症、特发性血补体过少小管间质性肾炎、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病、IgG4相关疾病、IgG4相关性硬化性疾病、免疫调节脂蛋白、炎症性主动脉瘤、炎性假瘤、包涵体肌炎、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、间质性膀胱炎、幼年型关节炎、幼年型糖尿病、川崎综合征、Kuttner’s瘤、Lambert-Eaton综合征、白细胞碎裂性血管炎、扁平苔藓、硬化性苔癣、木样结膜炎、线状IgA病(LAD)、红斑狼疮(SLE)、莱姆病、慢性纵隔纤维化病、梅尼埃病、显微镜下多血管炎(Microscopicpolyangiitis)、米库利兹综合征、混合型***病(MCTD)、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren’sulcer)、Mucha-Habermann病、多灶性纤维硬化、多发性硬化症、重症肌无力、肌炎、发作性睡病、视神经脊髓炎(Devic's)、中性粒细胞减少症、眼瘢痕性类天疱疮、视神经炎、Ormond’s病(腹膜后纤维化)、复发性风湿病、PANDAS(与链球菌相关的小儿自身免疫性神经精神障碍)、副肿瘤性小脑变性、副蛋白血症多神经病(Paraproteinemic polyneuropathies)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、Parry Romberg综合征、Parsonnage-Turner综合征、睫状体扁平部炎(外周葡萄膜炎)、寻常型天疱疮、主动脉周围炎、动脉周围炎、周围神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血、POEMS综合征、结节性多动脉炎、I型、II型&III型自身免疫性多腺综合征、风湿性多肌痛、多肌炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、孕激素性皮炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、银屑病、银屑病性关节炎、特发性肺纤维化、坏疽性脓皮病、单纯红细胞再生障碍、雷诺现象、反射***感神经营养不良、Reiter’s综合征、复发性多软骨病、下肢不宁综合征、腹膜后纤维化(Ormond’s病)、风湿热、类风湿关节炎、慢性纤维性甲状腺炎、结节病、施密特综合征、巩膜炎、硬皮病、舍格伦综合征、***与睾丸自身免疫、僵硬人综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、Susac’s综合征、交感性眼炎、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、托洛萨-亨特综合征、横贯性脊髓炎、溃疡性结肠炎、未分化***病(UCTD)、葡萄膜炎、血管炎、水疱性皮肤病、白癜风、Waldenstrom巨球蛋白血症、暖特发性溶血性贫血和韦格纳肉芽肿(现称为具有多血管炎肉芽肿(GPA)。
在一个实施方案中,将根据本公开的多聚体融合蛋白及片段用于治疗或预防癫痫或惊厥。
在一个实施方案中,将根据本发明的多聚体融合蛋白及片段用于治疗或预防多发性硬化。
在实施方案中,将本公开的多聚体融合蛋白及片段用于治疗或预防同种免疫疾病/适应症,所述疾病/适应症包括:
·因抗HLA抗体而引起的移植供体不匹配
·胎儿和新生儿同种免疫性血小板减少症,FNAIT(或新生儿同种免疫性血小板减少症,NAITP或NAIT或NAT,或胎儿-母体同种免疫性血小板减少症,FMAITP或FMAIT)。
另外的适应症包括:含Fc生物药剂学药物从人患者的快速清除,和多聚体融合蛋白疗法与其它疗法-IVIg、Rituxan、血浆置换术的组合。例如多聚体融合蛋白疗法可用于以下Rituxan疗法。
在一个实施方案中,将本公开的多聚体融合蛋白用于治疗或预防神经病学病症诸如:
·慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病(CIDP)
·Guillain-Barre综合征
·副蛋白血症多神经病
·视神经脊髓炎(NMO,NMO谱系病症或NMO谱系疾病),以及
·重症肌无力。
在一个实施方案中,将本公开的多聚体融合蛋白用于皮肤病诸如:
·大疱性类天疱疮
·寻常型天疱疮
·ANCA相关血管炎
·扩张型心肌病
在一个实施方案中,将本公开的多聚体融合蛋白用于免疫学或血液病学病症诸如:
·特发性血小板减少性紫癜(ITP)
·血栓性血小板减少性紫癜(TTP)
·暖特发性溶血性贫血
·肺出血肾炎综合征
·因抗HLA抗体而引起的移植供体不匹配
在一个实施方案中,所述病症选自重症肌无力、视神经脊髓炎(Neuro-myelitisOptica)、CIDP、Guillaume-Barre综合征、副蛋白血症多神经病、难治性癫痫、ITP/TTP、溶血性贫血、肺出血肾炎综合征、ABO不匹配、狼疮性肾炎、肾血管炎、硬皮病、纤维化肺泡炎、扩张型心肌病、格雷夫斯病、1型糖尿病、自身免疫性糖尿病、天疱疮、硬皮病、红斑狼疮、ANCA血管炎、皮肌炎、舍格伦综合征(Sjogren’s Disease)和类风湿关节炎。
在一个实施方案中,所述病症选自自身免疫性多内分泌腺病综合征1型(APECED或Whitaker’s综合征)和2型(施密特综合征);普秃;重症肌无力危象;甲状腺危象;甲状腺相关性眼病;甲状腺眼病;自身免疫性糖尿病;自身抗体相关性脑炎和/或脑病;落叶型天疱疮;大疱性表皮松解;疱疹样皮炎;Sydenham’s舞蹈症;急性运动性轴突神经病(AMAN);米-费综合征;多灶性运动神经病(MMN);斜视性眼阵挛;炎症性肌病;艾萨克综合征(自身免疫性神经性肌强直)、副肿瘤综合征和边缘***脑炎。
根据本公开的多聚体融合蛋白可用于治疗或预防。
本发明还提供了降低个体中不期望的抗体的浓度的方法,所述方法包括向个体施用治疗有效量的本文所述的多聚体融合蛋白的步骤。
本发明的多聚体融合蛋白还可用于诊断,例如用于牵涉Fc受体的疾病状态诸如B细胞相关淋巴瘤的体内诊断和成像。
图例
图1根据本发明的表达构建体和多聚体融合蛋白的实例。SP为信号肽,CH2和CH3为重链恒定结构域,TP为尾部。
图2示例性序列
2(a)多肽单体单元的多肽链的示例性氨基酸序列。在每一个序列中,尾部序列被加下划线,并且任何突变以粗体显示并加下划线。铰链以粗体显示。在包含来自IgM的CH4结构域的构建体中,该区域以斜体显示。
2(b)包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域或来源于IgG4的CH2和CH3结构域的Fc多聚体多肽链的示例性氨基酸序列。在每一个序列中,IgG1与IgG4之间差异的位置以粗体显示并被突出显示。
2(c)被设计来组合IgG1的某些选择的性质和IgG4的某些选择的性质的Fc多聚体的示例性氨基酸序列。突变以粗体显示并加下划线。
2(d)具有通过结构域交换工程化的杂交重链Fc区的Fc多聚体的示例性氨基酸序列。
2(e)具有杂交重链Fc区和另外的突变的Fc多聚体的示例性氨基酸序列,所述Fc多聚体已被工程化来组合IgG1的某些选择的性质和IgG4的某些选择的性质。
2(f)B72.3信号肽的DNA和氨基酸序列。(i)DNA序列,(ii)氨基酸序列。
2(g)Fc多聚体的示例性DNA序列。
图3CH3结构域在Fc多聚体组装中的作用
3(a)显示IgG1/IgG4 CH3结构域交换对Fc多聚体的六聚化的作用的大小排阻层析描记线。
3(b)CH3结构域中的点突变对IgG1 Fc IgM tp的六聚化的作用。
3(c)通过点突变Q355R获得高水平的IgG4 Fc IgM tp的六聚化。
3(d)R355的诱变对IgG1 Fc IgM tp中的所有其它氨基酸的作用。
图4通过表面等离子体共振分析测量的Fc多聚体对FcRn的结合。所述描记线表明多聚体结合的浓度范围:2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM、0.0390625μM。所示Fc多聚体在位置310上均包含组氨酸。
4(a)hIgG1 Fc多聚体IgM tp L309C对低密度FcRn的结合。
4(b)hIgG1 Fc多聚体IgM tp对低密度FcRn的结合。
4(c)hIgG1 Fc多聚体IgM tp L309C对高密度FcRn的结合。
4(d)hIgG1 Fc多聚体IgM tp对高密度FcRn的结合。
图5 Fc多聚体抑制巨噬细胞吞噬作用。数据显示来源于人IgG1或IgG4的Fc多聚体通过单独的IgM尾部,或IgM尾部和L309C聚合成六聚体或十二聚体形式,其全部表现出比人IVIG显著更好的效力和最高水平的抑制。
图6 Fc多聚体抑制巨噬细胞吞噬作用。数据显示在IgG1与IgG4 Fc区之间所选择的不同位置上包含单交换型突变(cross-over mutation)的Fc多聚体的抑制作用。
图7 Fc多聚体抑制巨噬细胞吞噬作用。数据显示被设计用于治疗免疫性病症的Fc多聚体的抑制作用。
图8 Fc多聚体刺激细胞因子释放。数据表明,具有和不具有L309C的野生型IgG1Fc多聚体均刺激非常高水平的细胞因子释放。观测到的细胞因子水平高于由阳性对照抗CD52抗体Campath产生的所述水平。形成鲜明对比的是,包含FcγR和C1q惰性“LALA”突变(L234A L235A)的IgG4 Fc多聚体和IgG1 Fc多聚体产生的细胞因子释放实际为零。
图9 Fc多聚体刺激细胞因子释放。数据显示在于IgG1与IgG4 Fc区之间相异的所选择的位置上包含单交换型突变的Fc多聚体的作用。
图10 Fc多聚体刺激细胞因子释放。数据显示用调节细胞因子释放的突变工程化的Fc多聚体的作用。
图11 Fc多聚体抑制FcRn介导的IgG再循环。
图12 Fc多聚体在急性血小板减少症的体内模型中阻止血小板损失。该图显示使用Balb/c小鼠的5个独立实验的汇总结果。
图13 Fc多聚体在慢性血小板减少症的体内模型中阻止血小板损失。
(a)在第3天施用的单次10mg/kg Fc多聚体的剂量。
(b)在第3、4、5和6天施用的四个连续日剂量,10mg/kg/剂量。
图上每一个点的组大小为n=6。
图14 Fc多聚体结合C1q。
图15 Fc多聚体的血小板活化。
实施例
实施例1:分子生物学
使用标准分子生物学方法(包括PCR、限制性连接克隆、点诱变(Quikchange)和Sanger测序)组装Fc多聚体DNA序列。将表达构建体克隆入适合用于在CHO细胞进行瞬时和稳定表达的表达质粒(pNAFL,pNAFH)。合适的表达载体的其它实例包括pCDNA3(Invitrogen)。
根据本发明的表达构建体和多聚体融合蛋白的示意图示于图1中。
在图2(a)–(e)中提供了显示多肽单体单元的多肽链的示例氨基酸序列的示意图。在每一个序列中,尾部序列被加下划线,任何突变以粗体显示并加下划线。在包含来自IgM的CH4结构域的构建体中,该区域以斜体显示。
IgG1/IgG4交换型突变
构建各种Fc多聚体变体,其中Fc结构域中的某些关键氨基酸残基被设计来匹配在IgG1中发现的那些关键氨基酸,而其它关键氨基酸残基被设计来匹配在IgG4中发现的那些关键氨基酸。IgG1和IgG4彼此相异在于如表4中概括的CH2结构域中的7个位置和CH3结构域中的6个位置。
表4
在图2(b)中提供了显示包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域或来源于IgG4的CH2和CH3结构域的Fc多聚体多肽链的示例性氨基酸序列的示意图。在每一个序列中,在IgG1与IgG4之间相异的位置以粗体显示和突出显示。
在图2(c)中提供了显示被设计来组合IgG1的某些选择的性质和IgG4的某些选择的性质的Fc多聚体的示例性氨基酸序列的示意图。突变以粗体显示并加下划线。
应该理解的是,可使用IgG1或IgG4的Fc结构域序列作为起始点并产生相关突变来产生特定目标序列。例如,具有突变F234L的IgG4 CH2结构域与具有突变H268Q、K274Q、Y296F、A327G、A330S和P331S的IgG1 CH2结构域相同。
Fc区结构域交换(exchange)
还构建了包含杂交重链Fc区的Fc多聚体变体,其中CH2结构域来源于一个特定的IgG亚类并且CH3结构域来自不同的IgG亚类。在图2(d)中提供了显示具有杂交重链Fc区的Fc多聚体的示例性氨基酸序列。
在图2(e)中提供了显示具有杂交重链Fc区和另外的突变的Fc多聚体的示例性氨基酸序列的示意图,该氨基酸序列被设计成组合IgG1的某些选择的性质和IgG4的某些选择的性质。
实施例2:表达
使用利用lipofectamine或电穿孔转染的HEK293或CHO细胞的‘瞬时’表达进行小规模的表达。以在50–2000ml的范围内的规模将培养物在摇瓶或搅拌袋中于CD-CHO(Lonza)或ProCHO5(Life Technologies)培养基中生长5-10天。通过离心除去细胞,并培养物上清液于4℃贮存直至纯化。在除去细胞后将防腐剂添加至一些培养物中。
结果表明,所述多聚体融合蛋白表达良好。
发现了用于表达多聚体融合蛋白的信号肽对所获得的表达水平具有影响。来自抗体B72.3的信号肽导致比现有技术中描述的IL-2信号肽序列更高的表达水平。
B72.3信号肽的DNA和氨基酸序列示于图2f中。
实施例3:纯化和分析
在确认/调整pH为≥6.5后,通过蛋白A层析和使用pH3.4缓冲液的梯度洗脱(stepelution)从培养物上清液纯化Fc多聚体。立即使用1M Tris pH8.5将洗脱物中和至~pH7.0,随后于4℃贮存。使用S200柱和级分收集将分析型大小排阻层析用于分离Fc结构域的各种多聚体形式。分析级分,并在G3000HPLC和还原及非还原SDS-PAGE分析后将其混合。使用鲎试验(LAL)测试内毒素,并且用于测定的样品<1EU/mg。
发现多聚体融合蛋白表达,并且主要以六聚体形式得以纯化,一些蛋白质以十二聚体或其它形式存在。结果表明,所述蛋白在位置309上不存在半胱氨酸的情况下有效地组装成多聚体。
在防腐剂存在下纯化多聚体融合蛋白减少了聚集的倾向,从而产生结构更均一的改良制剂。被表明为有效防腐剂的实例包括硫醇封端剂,例如N-乙基马来酰亚胺(NEM)和谷胱甘肽(GSH);和二硫化物抑制剂诸如乙二胺四乙酸(EDTA)。
实施例4:CH3结构域在Fc多聚体组装中的作用
出乎意料地发现多聚化的程度取决于Fc区所源自的IgG亚类。包含来源于IgG1的CH2结构域和CH3结构域的Fc多聚体非常高效地组装成六聚体,约80%的分子以六聚体形式存在。相反,包含来源于IgG4的CH2结构域和CH3结构域的Fc多聚体形成较低水平的六聚体。包含其中CH2结构域来源于一个特定IgG亚类并且CH3结构域来源于不同的IgG亚类的杂交Fc区的Fc多聚体的调查表明,形成六聚体的能力主要由CH3结构域编码。来源于IgG1的CH3结构域的存在显著增加六聚化。其中CH3结构域来源于IgG1并且CH2结构域来源于IgG4的杂交Fc多聚体正好与IgG1野生型一样高效地六聚化,约80%的分子被发现为六聚体。因此,利用IgG1的CH3结构域替代IgG4的CH3结构域相较于野生型IgG4 Fc多聚体提高了六聚化的水平。所得的杂交体具有以下优点:高水平形成六聚体同时保持IgG4的许多所需性质。图3(a)。
IgG1与IgG4的CH3结构域相异在于如实施例1中所述的6个位置。始于包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的Fc多聚体,进而将这些位置中的每一个位置从IgG1残基突变成IgG4残基。结果表明,位置355上的氨基酸对于六聚化是至关重要的。在野生型IgG1中的位置355上发现的氨基酸(精氨酸)促进高效的六聚化。在野生型IgG4中发现的该位置上的氨基酸(谷氨酰胺)导致较低的六聚化。在IgG1与IgG4 CH3结构域之间相异的其它位置不影响六聚化。图3(b)。
在包含来源于IgG4的CH3结构域的Fc多聚体中,在位置355上用精氨酸残基取代谷氨酰胺残基(Q355R)导致高水平的六聚化。因此,IgG4 Fc多聚体的较低六聚化的问题可通过单个氨基酸取代来解决。这具有以下优点:所得的Fc多聚体高效组装成六聚体同时保持IgG4的特征性质。图3(c)。
在IgG1 Fc多聚体中,在位置355上用半胱氨酸取代精氨酸(R355C)使六聚体形成增加至超过野生型IgG1的六聚体形成。尽管我们不希望受理论束缚,但该结果表明,位置355上的半胱氨酸残基可以能够与尾部中的半胱氨酸形成二硫键。R355至所有其它氨基酸的诱没有导致IgG1 Fc多聚体的六聚体形成的进一步增加。图3(d)。
实施例5:Fc多聚体与FcR的相互作用的亲和力测量
多聚体融合蛋白与Fc受体(FcR)(包括FcγR和FcRn)的相互作用的亲和力/亲合力测量可使用公知的方法(包括表面等离体共振、竞争性ELISA和竞争性结合研究)对具有FcR的细胞系进行。通过非特异性固定或标签特异性捕获至Biacore T200上的BIAcore传感器芯片上,将FcR的可溶性胞外域(ECDs)用于表面等离子体共振实验。以人FcRnα链胞外域与β2微球蛋白之间的非共价复合物形式提供人FcRn胞外域。以不同浓度和流速将多聚体融合蛋白对受体进行滴定,以最佳地测定相互作用的强度。使用Biacore T200评估软件分析数据。
图4显示通过表面等离子体共振分析测量的多聚体融合蛋白对FcRn的结合的数据。描记线表明多聚体结合的浓度范围:2.5μM、1.25μM、0.625μM、0.3125μM、0.15625μM、0.078125μM、0.0390625μM。所示Fc多聚体在位置310上均包含组氨酸。
(a)人IgG1 Fc多聚体IgM tp L309C对低密度FcRn的结合。
(b)人IgG1 Fc多聚体IgM tp对低密度FcRn的结合。
(c)人IgG1 Fc多聚体IgM tp L309C对高密度FcRn的结合。
(d)人IgG1 Fc多聚体IgM tp对高密度FcRn的结合。
在(a)和(c)中使用的构建体在位置309上含有亮氨酸至半胱氨酸的取代。
结果表明,在位置310上包含组氨酸的Fc多聚体结合人FcRn。
还产生许多掺入被认为增加对人FcRn的结合的突变的Fc多聚体。
表5显示在pH6.0下突变的单体人IgG1 Fc片段对人FcRn的结合的解离常数。所述突变导致增加的对人FcRn的结合。然而,单体片段的相互作用的强度仍然很弱,解离常数在微摩尔范围内。如本发明中描述的突变的Fc结构域的多聚化可赋予亲合力益处,因此极大地增强了相互作用的强度。
表5.突变的单体IgG1 Fc片段在pH6.0下对人FcRn的结合
样品突变 | KD(M) | KD(μM) |
IgG1 Fc,WT | 9.78E-07 | 0.98 |
IgG1 Fc,L309S | 1.25E-06 | 1.25 |
IgG1 Fc,Q311A | 7.69E-07 | 0.77 |
IgG1 Fc,T307A | 5.65E-07 | 0.57 |
IgG1 Fc,T307P | 6.93E-07 | 0.69 |
IgG1 Fc,V308C | 7.00E-07 | 0.70 |
IgG1 Fc,V308F | 3.32E-07 | 0.33 |
IgG1 Fc,V308P | 1.36E-07 | 0.14 |
IgG1 Fc,WT | 1.07E-06 | 1.07 |
实施例6:巨噬细胞对B细胞靶的吞噬作用
设计测定来测量人巨噬细胞对B细胞的抗体依赖性吞噬作用。为了制备巨噬细胞,首先通过密度梯度离心从新鲜血液分离人外周血单核细胞(PBMC)。然后通过将PBMC在6孔组织培养物包被的板中于37℃温育1小时来选择单核细胞,随后除去非贴壁细胞。通过在巨噬细胞集落刺激因子(MCSF)中培养5天来将贴壁单核细胞分化成巨噬细胞。随后通过分离PBMC从分开的(同种异体的)供体制备人B细胞,然后使用MACS(B细胞分离试剂盒II,Miltenyi Biotech)通过阴性选择来纯化B细胞。在一些测定中,利用羧基琥珀酰亚胺酯(CFSE)(Molecular Probes)标记B细胞。在抗CD20mAb(利妥昔单抗)存在的情况下,以1:5的比率共培养分化的巨噬细胞和B细胞以诱导B细胞的抗体依赖性吞噬作用。以指定的浓度添加多聚体融合蛋白或对照,并将细胞在37℃5%CO2下温育1-24小时。在每一个时间点结束时,将细胞离心,并在4℃重悬浮于FACS缓冲液中,以终止进一步吞噬作用,并用抗CD19别藻蓝蛋白(APC)对B细胞表面染色,随后通过流式细胞术进行分析。巨噬细胞可通过它们的自发荧光/侧向散射特性相区分,B细胞通过它们的CFSE/CD19标记相区分。对于CD19标记呈阴性的CFSE阳性巨噬细胞被假定含有被吞噬的B细胞。
结果表明,本发明的多聚体融合蛋白抑制人巨噬细胞耗尽B细胞。(图5)。数据显示,来源于人IgG1或IgG4的Fc多聚体通过单独的IgM尾部,或IgM尾部和L309C聚合成六聚体或十二聚体形式,全部表现出比人IVIG显著更好的的抑制的效力和最高水平。
所述十二聚体形式和六聚体形式同样有效的证明对于产品生产和安全性是有益的,因为无需从六聚体除去微量十二聚体的额外纯化。
使用CFSE染色的B细胞的流式细胞术分析确认作用机制是巨噬细胞吞噬作用的抑制,而非通过其它方式的B细胞杀伤或细胞凋亡。
为了评估任何给定的Fc多聚体构建体抑制巨噬细胞吞噬作用的能力,在本文上述测定中测量其活性,并将其与IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的活性相比较。随后基于其浓度对比效应曲线与针对IgG1和IgG4野生型Fc多聚体获得的所述曲线的可视比较,将每一个突变体的活性概括为“IgG1-样”、“高”、“中等”、“低”或“IgG4-样”。
在IgG1与IgG4 Fc区之间相异的8个位置中每一个位置上包含单交换型突变的Fc多聚体的结果示于图6中,并概括于表6中。
包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的野生型IgG1 Fc多聚体强效抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用。IgG1 Fc多聚体中的单突变中的两个(A330S,K409R)对抑制吞噬作用的效力没有影响。单突变中的6个突变(L234F、H268Q、K274Q、Y296F、A327G和P331S)导致抑制吞噬作用的效力的适度减小。残基L234F和A327G特别引人注意,因为突变这些残基显著减少细胞因子释放(参见实施例8),同时保持相对高的抑制吞噬作用的效力。该性质的组合将用于治疗自身免疫性病症。
野生型IgG4 Fc多聚体抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用,但不如IgG1 Fc多聚体那么强效。IgG4 Fc多聚体中的单突变中的两个(F234L和G327A)适度增强了抑制吞噬作用的效力。IgG4中的突变中的6个(Q268H、Q274K、F296Y、S330A、S331P、R409K),当被个别地突变时,对抑制吞噬作用没有影响。残基F234L和G327A特别引人注意,因为虽然个别地突变这些位置的任一个增强了IgG4 Fc多聚体在抑制吞噬作用中的效力,但它们对增加细胞因子产生没有影响(参见实施例8)。该性质的组合将用于治疗自身免疫性病症。
表6
Fc多聚体 | 吞噬作用抑制的效力 |
IgG1 F c IgM tp L309 | “IgG1-样”的标准 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 H268Q | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 K274Q | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 Y296F | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 A327G | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 A330S | IgG1-样 |
IgG1 Fc IgM tp L309 P331S | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 K409R | IgG1-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 | “IgG4-样”的标准 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 Q268H | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 Q274K | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F296Y | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A | 低 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S330A | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S331P | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 R409K | IgG4-样 |
被设计用于治疗免疫性病症的其它Fc多聚体构建体的结果示于图7中并概括于表7中。
野生型IgG1和IgG4 Fc多聚体比IVIG更强效地抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用。
包含L234F(其减少细胞因子产生)或L234F和P331S(减少细胞因子产生和C1Q结合,参见实施例8和15)的IgG1 Fc多聚体相对于野生型IgG1 Fc多聚体在抑制吞噬作用中具有适度减小的效力,但相对于野生型IgG4 Fc多聚体或IVIG仍然是高度强效的。
包含突变F234L;F234L和F296Y;G327A和S331P;S330A和S331P;或G327A和S330A的IgG4 Fc多聚体相较于野生型IgG4 Fc多聚体在抑制吞噬作用中具有增强的效力。
表7.
Fc多聚体 | 吞噬作用抑制的效力 |
IgG1 Fc IgM tp L309 | “IgG1-样”的标准 |
IgG4 Fc IgM tp L309 | “IgG4-样”的标准 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F | 高 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F P331S | 高 |
杂交Fc IgG4-CH2 IgG1-CH3 IgM tp L309 | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L F296Y | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S330A | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S331P | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S330A S331P | 中等 |
实施例7:IgG FITC珠粒的THP1细胞吞噬作用
在第7代将THP1细胞铺板,计数并以5x105个细胞/ml将其重悬。将200μl细胞添加至96孔平底板的每一个孔(1x105个细胞/孔)。将用兔IgG(Cambridge bioscienceCAY500290-1ea)涂覆的珠粒直接添加至每一个孔中,混合(1:10的稀释度,10μl/孔),并静置如下时间点:1h、2h、4h、8h。通过将珠粒添加至冰上的冰冷缓冲液中的细胞来使0时间点起作用。在每一个时间点结束时,将细胞以300g离心3分钟。将细胞重悬于含有台盼蓝储液的1:20稀释液的FACS缓冲液中,持续2分钟。用150μl FACS缓冲液洗涤细胞,将其离心并重悬于200μl FACS缓冲液中,转移至圆底板,准备用于FACS。将细胞再离心一次,并重悬于200μl FACS缓冲液中,随后通过流式细胞术进行分析。将THP1细胞门控于前向和侧向光散射,将珠粒的摄取测量为FITC荧光。
实施例8:人全血细胞因子释放测定
从供体采集新鲜血液于锂肝素真空采血管(vacutainer)中。将目标Fc多聚体构建体或对照于无菌PBS中连续稀释至指定的浓度。将12.5μl的Fc多聚体或对照添加至测定板,随后添加237.5μl的全血。将板在37℃无CO2补充下温育24小时。将板以1800rpm离心5分钟,并取出血清以进行细胞因子分析。按照制造商的操作方案通过Meso Scale Discoverycytokine multiplex进行细胞因子分析,并在Sector Imager 6000上进行读取。
结果示于图8中。数据显示,具有和不具有L309C的野生型IgG1 Fc多聚体均刺激非常高水平的细胞因子释放。观测到的细胞因子水平高于由阳性对照Campath产生的细胞因子水平。形成鲜明对比的是,包含FcγR和C1q惰性“LALA”突变(L234A L235A)的IgG4 Fc多聚体和IgG1 Fc多聚体产生的细胞因子释放实际为零。
为了评估任何给定的Fc多聚体构建体对细胞因子释放的影响,在本文上述的测定中测量其活性,并将其与IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的活性相比较。随后基于其浓度对比效应曲线与针对IgG1和IgG4野生型Fc多聚体获得的所述曲线的可视比较,将突变体的活性概括为“IgG1-样”、“高”、“中等”、“低”或“IgG4-样”。
在IgG1与IgG4 Fc区之间相异的所选择的位置上包含单交换型突变的Fc多聚体的结果示于图9中,并概括于表8中。
结果表明,包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的野生型IgG1 Fc多聚体刺激极显著水平的细胞因子释放。所示结果是针对IFNγ的。对于TNFα观测到类似结果。
IgG1 Fc多聚体中的单突变中的两个(L234F,A327G)显著减少细胞因子的释放。单突变中的一个(Y296F)产生适度细胞因子释放的减少。突变中的一个(P331S)显著增加细胞因子释放。突变中的3个(H268Q、K274Q、A330S)对细胞因子释放没有影响。
形成鲜明对比的是,包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域的野生型IgG4 Fc多聚体实际不产生细胞因子释放。没有一个单交换型突变对IgG4 Fc多聚体的细胞因子释放具有任何影响,甚至IgG1 Fc多聚体中经显示对于细胞因子释放是重要的位置上的那些单交换型突变对IgG4 Fc多聚体的细胞因子释放亦没有任何影响。
表8
Fc多聚体 | IFNγ释放的刺激 |
IgG1 Fc IgM tp L309 | “IgG1-样”的标准 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F | 低 |
IgG1 Fc IgM tp L309 H268Q | IgG1-样 |
IgG1 Fc IgM tp L309 K274Q | IgG1-样 |
IgG1 Fc IgM tp L309 Y296F | 中等 |
IgG1 Fc IgM tp L309 A327G | 低 |
IgG1 Fc IgM tp L309 A330S | IgG1-样 |
IgG1 Fc IgM tp L309 P331S | 高于IgG1 |
IgG1 Fc IgM tp L309 K409R | 高于IgG1 |
IgG4 Fc IgM tp L309 | “IgG4-样”的标准 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 Q268H | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 Q274K | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F296Y | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S330A | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S331P | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 R409K | IgG4-样 |
被设计来调节细胞因子释放的其它Fc多聚体构建体的结果示于图10中和概括于表9中。
数据显示,IgG1 Fc多聚体的细胞因子释放可通过包含单独的或与P331S组合的L234F减少至几乎与IVIG相等的水平。此类Fc多聚体可用于治疗免疫性病症。所有含有经显示具有其它有用性质,例如吞噬作用的效力增强(实施例6)的突变的IgG4 Fc多聚体实际上保持零水平的细胞因子释放,从而可用于治疗免疫性病症。
表9.通过Fc多聚体的细胞因子释放
Fc多聚体 | IFNγ释放的刺激 |
IgG1 Fc IgM tp L309 | “IgG1-样”的标准 |
IgG4 Fc IgM tp L309 | “IgG4-样”的标准 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F | 低 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F P331S | 中等 |
杂交Fc IgG4-CH2 IgG1-CH3 IgM tp L309 | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L F296Y | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S330A | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S331P | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S330A S331P | IgG4-样 |
实施例9:对培养中的细胞中的IgG再循环的影响
使用已用具有遗传霉素选择标记的人FcRn和人β2M双基因载体稳定转染的Madin-Darby犬肾(MDCK)II细胞进行基于细胞的测定。选择能够再循环和胞吞转运(transcytose)人IgG的稳定细胞克隆,将该克隆用于所有随后的研究。它会被称为MDCK II克隆15。利用食蟹猴(“克隆40”)或小鼠FcRn转染的等同的MDCK细胞系已被以类似的方式产生,以用于与上述测定等同的测定。
建立体外测定来检查本发明的多聚体融合蛋白抑制FcRn的IgG再循环能力的能力。简言之,在存在或不存在多聚体融合蛋白的情况下将MDCK II克隆15细胞与生物素化的人IgG(1μg/ml)在酸性缓冲液(pH 5.9)中温育以允许对FcRn的结合。在60分钟的脉冲时间后,去除所有过量的蛋白质,并将细胞在允许表面暴露的结合的IgG释放至上清液中的中性pH缓冲液(pH 7.2)中温育。使用MSD测定检测再循环并从而释放至上清液中的IgG的量来观察FcRn的抑制。
将MDCK II克隆15细胞以每孔15,000个细胞铺板于96孔板中,并在37℃,5%CO2下温育过夜。在存在或不存在多聚体融合蛋白的情况下将细胞与1μg/ml的生物素化人IgG(Jackson)在HBSS+(Ca/Mg)pH 5.9+1%BSA中于37℃,5%CO2下一起温育1小时。用HBSS+pH5.9洗涤细胞,随后在37℃,5%CO2下于HBSS+pH 7.2中温育2小时。取出裂解物和上清液,使用MSD测定(使用抗-人IgG捕获抗体(Jackson)和链霉抗生物素蛋白-sulpho tag呈现抗体(reveal antibody)(MSD))分析其总的IgG。通过非线性回归(Graphpad Prism)分析抑制曲线以测定EC50。
结果表明,本发明的多聚体融合蛋白抑制FcRn-介导的IgG再循环。(图11)。在位置309上具有和不具有半胱氨酸的保留位置310上的天然组氨酸残基的人IgG1 Fc/IgM尾部多聚体,以浓度依赖性方式阻断FcRn-介导的IgG吞噬转运和再循环。数据明显地显示,不存在L309C的形式比具有L309C的形式更强效。尽管我们不希望受理论束缚,但该差异可能归因于与位置310上的组氨酸残基相邻的L309C二硫键造成的位阻,位置310上的组氨酸残基在FcRn结合中起着关键作用。
表10显示突变对Fc多聚体的阻断活性的影响。在包含IgG1 Fc/IgM尾部或IgG4Fc/IgM尾部的Fc多聚体中测试增加对FcRn的结合的3个突变V308F、V308P和T307A。结果显示Fc多聚体阻断FcRn-介导的IgG细胞内摄取和IgG再循环的能力的显著提高。数据表明,这些突变用于提高包含IgG1或IgG4 Fc区的Fc多聚体的效力的效用。
已显示亮氨酸对位置310上的组氨酸的取代(H310L)破坏Fc多聚体阻断FcRn-介导的IgG细胞内摄取和IgG再循环的能力。结果表明,保留位置310上的组氨酸的Fc多聚体具有好得多的对FcRn的结合,并且是IgG细胞内摄取和IgG再循环的更强效的阻断剂。数据确认本发明的Fc多聚体可提供具有更长半衰期和更大的功效的新的改进的治疗组合物。
表10.突变对Fc多聚体阻断IgG细胞内摄取和IgG再循环的影响
实施例10:Fc多聚体在急性ITP中的功效
在其中通过施用抗-CD41诱导血小板损失的ITP的小鼠模型中研究了Fc多聚体的功效。该抗体结合血小板表面上的糖蛋白IIb,从而将它们靶向破坏。
ITP体内操作方案
在给药以获得基线血小板数目之前从小鼠尾巴采集5μl血液样品。
给小鼠静脉内施用1mg/kg或10mg/kg Fc多聚体。
1小时后,腹膜内施用1μg的大鼠抗-小鼠CD41 IgG1抗体(MWReg30)/小鼠。
在抗-CD41施用后24小时进行终端心脏穿刺。
FACs染色操作方案
从尾静脉采集5μl血液。对于终端样品,通过心脏穿刺将血液采集至肝素管中,并取出5μl用于染色。
将100μl抗体混合物添加至5μl血液样品,并在黑暗中于4℃温育20分钟。
添加5ml的FACs缓冲液。
将每一个样品以1:4稀释以在‘V形’底的板中产生200μl的终体积,并将其保持在冰上直至准备在Becton Dickinson FACs Canto获取。
表11.
抗体名称/克隆 | 抗体颜色 | 稀释度 | 提供商/批号 |
CD45(30-F11) | PerCPCy5.5 | 1/400 | Ebio E08336-1633 |
CD42d(1C2) | PE | 1/200 | Ebio E14346-104 |
Fc block | 1/200 |
FACS获取
以1.5μl/秒的流速收集一组体积为150μl的样品。将阈值设置在200。
在FlowJo软件上进行分析。血小板计数来源于CD45-/CD42d+门控细胞。
基于以1/4000稀释初始5μl血液样品并且通过FACs仪运行150μl的该样品(其相当于0.1875μl的待分析的原始样品)的事实,针对样品稀释度校正细胞计数。5/0.1875=x26.7的倍增因数(针对血小板/μl)。
试剂
功能级纯化的大鼠抗小鼠CD41(Ebiosciences,MWReg30,批号E11914-1632)
不含内毒素的PBS(Sigma,D8537)
FACs缓冲液:0.1%FCS,2mM EDTA
结果
1mg/kg剂量的人多聚体融合蛋白(‘Fc多聚体’)耐受良好。然而在该模型中它们在该剂量上是无效的。
使用10mg/kg人Fc多聚体观测至阳性结果。
具有IgM或IgA尾部的Fc多聚体显著抑制通过注射1μg/小鼠抗-CD41引起的血小板减少。
结果表明,Fc多聚体在急性免疫性血小板减少症的体内模型中阻止血小板损失。以10mg/kg的剂量使用具有和不具有L309C的人IgG1 Fc/IgM尾部多聚体和具有L309C的人IgG4 Fc/IgM尾部多聚体实现了统计上显著的血小板损失的减少。(图12)因此,通过单独的尾部或经由L309C二硫化物和尾部六聚化的多聚体融合蛋白在体内是有效的。人IVIG在该模型中仅在1000mg/kg的高得多的剂量下具有活性。在10mg/kg的等效剂量上,发现IVIG在阻止血小板损失中是无活性的。
实施例11:Fc多聚体在慢性ITP中的功效
在慢性ITP的小鼠模型中研究Fc多聚体的功效,在所述模型中,通过使用微型泵施用抗-CD41,进行持续的一段时间来诱导血小板损失。
ITP体内操作方案
在给药以获得基线血小板数目之前采集5ul尾巴出血。
皮下植入以82.5ug/ml(57.75ul大鼠抗-小鼠CD41Ab+642.25ul PBS/BSA(1.5mg/ml))的浓度含有大鼠抗-小鼠CD41的alzet微型泵。所述泵具有0.5ul/小时的流速,每天施用等量的0.99ug的抗-CD41。
每日进行5ul尾巴出血以获取血小板计数。
在当已达到稳定状态的血小板计数时的时间点上,给小鼠静脉内施用1g/kg IVIg或一定剂量范围的Fc多聚体。
在第7天,进行终端心脏穿刺。
FACs染色操作方案
通过尾静脉采集5ul血液。对于终端样品,通过心脏穿刺将血液采集至肝素管中,并取出5ul用于染色。
添加100ul抗体混合物,并在黑暗中于4℃温育20分钟。
添加5ml的FACs缓冲液
将每一个样品以1:4稀释以在v形底的板中产生200ul的终体积,并将其保持在冰上直到准备在BD FACs Canto上获取。
表12.
抗体名称/克隆 | 抗体颜色 | 稀释度 | 提供商/批号 |
CD45(30-F11) | PerCPCy5.5 | 1/400 | Ebio E08336-1633 |
CD42d(1C2) | PE | 1/200 | Ebio E14346-104 |
Fc block | 1/200 |
FACS获取
以1.5μl/秒的流速收集一组体积为150μl的样品。将阈值设置在200。
在FlowJo软件上进行分析。血小板计数来源于CD45-/CD42d+门控细胞。
基于以1/4000稀释初始5ul血液样品并且通过FACs仪运行150ul的该样品(其相当于0.1875ul的待分析的原始样品)的事实,针对样品稀释度校正细胞计数。5/0.1875=x26.7的倍增因数(针对血小板/ul)。
试剂
功能级纯化的大鼠抗小鼠CD41(Ebiosciences,MWReg30,批号E11914-1632)
不含内毒素的PBS(Sigma,D8537)
FACs缓冲液:0.1%FCS,2mM EDTA
10mg/kg IgG1 IgM tp,(ID:PB0000238),EWBE-017553,5.69mg/mg,内毒素<0.35EU/mg
IgG1 Fc IgM tp L309C,(ID:PB0000198),EWBE-017400,6.49mg/ml,内毒素<0.46EU/mg
IVIg:Gammunex批号26NK1N1。
结果表明,多聚体融合蛋白在慢性免疫性血小板减少症的体内模型中阻止血小板损失。图13显示使用(a)在第3天施用的单次剂量的10mg/kg Fc多聚体;和(b)在第3、4、5和6天施用的四个连续日剂量(10mg/kg/天)实现的效应。多剂量的Fc多聚体增加它们阻止血小板损失的效力。人IVIG只有在1000mg/kg的高得多的剂量下才有效。
实施例12:通过质谱法进行的六聚Fc多聚体的二硫键和聚糖分析
方法
在8M尿素存在的情况将纯化的六聚Fc多聚体样品(100ug)于55mM Tris-HClpH8.0中变性,通过与22mM碘乙酰胺(IAM)在37℃下温育60分钟来给游离巯基加帽。使用超滤将尿素浓度降至6M,并用LysC/胰蛋白酶混合物(Promega)在37℃消化蛋白质3小时。用5体积的缓冲液进一步稀释样品,在37℃下继续消化过夜。收集肽,用Waters Oasis HLB药筒进行脱盐,使用离心蒸发器进行干燥,以及在含有0.2%甲酸(溶剂A)的水中进行重构。
将样品(7.5uL,~7ug)以150uL/分钟上样至利用溶剂A平衡过的2.1x150mm C18柱(Waters 1.7u PST 300A)上并在40℃下操作。通过60分钟至50%的溶剂B(4:4:1的乙腈:1-丙醇:水/0.2%甲酸)的梯度将肽洗脱至以MSE+ve-ion模式操作的Waters Xevo质谱仪中。在洗脱过程中,在100-1900m/z的范围内收集由低和高碰撞能的交替扫描组成的MSE数据。运行后,通过将10mM Tris(羟丙基)膦(THP)溶液直接添加至自动采样瓶并在室温下温育>1小时来还原消化物。随后第二次分析还原的样品。
使用Waters BiopharmaLynxTM(BPL)针对相关的Fc多聚体序列搜索MSE数据。从THP还原的消化物中的标记的IAM对游离肽的比率计算游离二硫化键硫醇的比例。从在消化物中检测到的各种糖肽异形体测定聚糖特征谱。
结果
具有和不具有L309C的Fc多聚体(IgG1Fc/IgM尾部)的聚糖分析的结果示于表13中。聚糖结构示于表8中。
数据表明,N297(IgG1 Fc区中的糖基化位点)的高占据率,在该位置上发现少于10%的游离天冬酰胺残基。N297上的糖基化主要是岩藻糖基化双触角复合物,主要是G0F。IgM尾部位点N563的占据率为约50%,高于在天然IgM中发现的约20%的水平。N563上的糖基化主要是高甘露糖。
表13.聚糖分析
链间二硫键的分析结果示于表14中。对于链内二硫键也获得类似的结果。数据表明,Fc多聚体中高比例的半胱氨酸残基被二硫键键合。没有显著量的无规二硫键合的证据,并且在还原之前以高水平发现所有预期的二肽。
表14.链间二硫键
实施例13:Fc多聚体对C1q的结合
使用来自Abnova Corporation的C1q ELISA试剂盒(目录编号:KA1274,批号:V14-111723527),通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量Fc多聚体对C1q的结合。以500μg/ml至4μg/ml的5倍稀释度滴定Fc多聚体构建体。将100μl的各Fc多聚体构建体添加至适当的孔,并搅拌1小时以使得能够结合。随后按照制造商的操作方案进行所述测定,在酶标仪上在450nm的吸光度进行分析。
为了评估任何给定的Fc多聚体构建体对C1q的结合,测量其活性,并将该活性与IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的活性相比较。随后基于其浓度对比效应曲线与针对IgG1和IgG4野生型Fc多聚体获得的所述曲线的可视比较,将突变体的活性概括为“IgG1-样”、“高”、“中等”、“低”或“IgG4-样”。
结果示于图14中并概括于表15中。
结果表明,包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的野生型IgG1 Fc多聚体强烈地结合C1q。相反,包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域的野生型IgG4 Fc多聚体非常弱地结合C1q。发现在Fc多聚体中确定C1q结合的优势残基是位置331上的脯氨酸(P331)。丝氨酸对该脯氨酸残基的取代(P331S)有效地减少具有来源于IgG1的CH2结构域的Fc多聚体中C1q的结合。相反的突变体(S331P)增加具有来源于IgG4的CH2结构域的Fc多聚体中C1q的结合。
表15.Fc多聚体对C1q的结合
Fc多聚体 | C1q结合 |
IgG1 Fc IgM tp L309 | “IgG1-样”的标准 |
IgG4 Fc IgM tp L309 | “IgG4-样”的标准 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F | IgG1-样 |
IgG1 Fc IgM tp L309 P331S | 低 |
IgG1 Fc IgM tp L309 L234F P331S | IgG4-样 |
杂交Fc IgG4-CH2 IgG1-CH3 IgM tp L309 | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 F234L F296Y | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S330A | IgG4-样 |
IgG4 Fc IgM tp L309 G327A S331P | 中等 |
IgG4 Fc IgM tp L309 S330A S331P | 中等 |
实施例14:血小板活化
通过流式细胞术分析Fc多聚体的血小板活化。在RMPI培养基中制备2倍稀释的Fc多聚体,并将其转移至FACS管。终浓度从100μg/ml降至3.12μg/ml。每管添加5μl新鲜全血(最少来自2个人供体)。使用抗-CD42b标记的Mab门控血小板,利用针对标志:CD62p、CD63和PAC-1的Mab进行活化。(Becton Dickinson,BD CD42b APC Cat:551061,BD CD62p PE Cat:550561,BD CD63PE-Cy-7Cat:561982,BD PAC-1 FITC Cat:340507)。通过添加500μl 1%的多聚甲醛固定细胞,随后通过流式细胞术进行分析。
发现CD62p是3个测试的标志中最敏感的标志。
为了评估任何给定的Fc多聚体构建体的血小板活化,测量其活性,并将该活性与IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的活性相比较。随后基于其浓度对比效应曲线与针对IgG1和IgG4野生型Fc多聚体获得的所述曲线的可视比较,将突变体的活性概括为“IgG1-样”、“高”、“中等”、“低”或“IgG4-样”。
CD62p表达的诱导结果示于图15中,并概括于表16中。
结果表明,包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的野生型IgG1 Fc多聚体导致显著水平的血小板活化。
我们已在实施例8中显示,两个突变(L234F和A327G)对于减少来自IgG1 Fc多聚体的细胞因子释放是有用的。在这两个突变当中,L234F相较于IgG1野生型Fc结构域具有下降得多的水平的血小板活化,而具有A327G突变的Fc多聚体保持显著水平的血小板活化。因此,L234F是非常有用的突变——它减少细胞因子释放和血小板活化,在抑制巨噬细胞吞噬作用中只具有少量的效力损失。
P331S(实施例13中显示为有用的C1q减少突变)至L234F的添加(L234F P331S)导致低水平的血小板活化。该双突变体是实现低细胞因子、低血小板活化和零C1q结合的工具。因此,该突变的组合是特别有用的,并且预期为治疗免疫性病症提供新疗法。
L234F相对于A327G可占优势,因为三联L234F A327G P331S突变具有低血小板活化。
包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域的野生型IgG4 Fc多聚体实际上未导致血小板活化。
将该CH3结构域转换成IgG1的CH3结构域保留这些降低的水平的血小板活化。
F234L突变具有低水平的血小板活化(和增强的效力)——但与野生型IgG4 Fc多聚体相比血小板活化得以增强。
可将F296Y与F234L组合而不额外地增强血小板活化。该观察结果是重要的,因为F234L F296Y与IgG4野生型Fc多聚体相比具有增强的效力。因此该突变的组合是特别有用的,并且预期为治疗免疫性病症提供新疗法。
G327A突变没有增加血小板活化。鉴于IgG1 Fc多聚体中的相反突变A327G的结果(其保持高水平的血小板活化),该观测是出乎意料的。
也具有相对于IgG4WT增强的效力的某些双突变(G327A S330A、G327A S331P和S330A S331P)具有极低水平的血小板活化(IgG4样),并且预期其为治疗免疫性病症提供新疗法。
表16.Fc多聚体的血小板活化
实施例15:Fc多聚体变体的工程化
先前的实施例举例说明已产生特别适合用于治疗免疫性病症的Fc多聚体。工程化目标为产生具有以下性质的Fc多聚体对Fc多聚体进行工程化:
抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用。
Fc多聚体的效力应当尽可能高。
细胞因子释放。
Fc多聚体对细胞因子释放的刺激应当尽可能低。
C1q结合。
Fc多聚体对C1q的结合应当尽可能低。
血小板活化。
通过Fc多聚体的血小板活化应当尽可能低。
然而,先前实施例中的工作已说明,可能必需要在最大效力与略微较低的效力之间折衷,以实现降低的副作用。
包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域的无任何另外的突变的野生型IgG1 Fc多聚体可能不太适合用于治疗免疫性病症,因为尽管其表现出高效力的吞噬作用的抑制,但其也显示通过细胞因子释放、C1q结合和血小板活化测量的高水平的不想要的副作用。
包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域的野生型IgG4 Fc多聚体产生极低水平的不想要的副作用,尽管其效力相对于IgG1的效力较低。然而,如图7中显示的,野生型IgG4 Fc多聚体的效力仍然显著高于IVIG的效力。
已设计了组合IgG1和IgG4野生型Fc多聚体的所需性质而没有不想要的性质的Fc多聚体。如表17中显示的,这些Fc多聚体表现出有效水平的效力,同时使不想要的副作用降至可耐受的水平。预期这些Fc多聚体特别适用于治疗免疫性病症。
表17
Claims (75)
1.一种包含两个或更多个多肽单体单元的多聚体融合蛋白;
其中每一个多肽单体单元包含含有两个重链Fc区的抗体Fc结构域;
其中每一个重链Fc区在位置309上包含除半胱氨酸外的任意氨基酸残基,并且在其C末端与尾部融合,所述尾部使所述单体单元组装成多聚体;并且
其中每一个多肽单体单元不包含抗体可变区。
2.权利要求1的多聚体融合蛋白,其中所述抗体Fc结构域来源于IgG。
3.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中所述重链Fc区包含来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的CH2和CH3结构域。
4.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于的IgG1的CH3结构域。
5.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其在位置355上包含精氨酸残基。
6.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其在位置355上包含半胱氨酸残基。
7.权利要求1至3的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH3结构域,其中位置355上的谷氨酰胺残基已被精氨酸残基(Q355R)或半胱氨酸残基(Q355C)取代。
8.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgM的CH4结构域。
9.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中尾部来源于IgM或IgA。
10.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区在其N末端具有铰链区。
11.权利要求10的多聚体融合蛋白,其中所述铰链区包含突变的序列CPPC。
12.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含6个或12个多肽单体单元。
13.权利要求1-6和9-12的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域,其中位置234上的亮氨酸残基和/或位置331上的脯氨酸残基已被另一种氨基酸取代。
14.权利要求1-13的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG1的CH2和CH3结构域,其中位置234上的亮氨酸残基已被苯丙氨酸残基取代并且位置331上的脯氨酸残基已被丝氨酸残基取代(L234F/P331S)。
15.权利要求1-12的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来自IgG4的CH2和CH3结构域,其中选自位置234上的苯丙氨酸残基、位置296上的苯丙氨酸残基、位置327上的甘氨酸残基、位置330上的丝氨酸残基和位置331上的丝氨酸残基的一个或多个氨基酸残基已被另一种氨基酸取代。
16.权利要求1-12或15的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代(F234L)。
17.权利要求1-12或15的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代并且位置296上的苯丙氨酸残基已被酪氨酸残基取代(F234L/F296Y)。
18.权利要求1-12或15的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置330上的丝氨酸残基已被丙氨酸残基取代(G327A/S330A)。
19.权利要求1-12或15的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置327上的甘氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(G327A/S331P)。
20.权利要求1-12或15的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含来源于IgG4的CH2和CH3结构域,其中位置330上的丝氨酸残基已被丙氨酸残基取代并且位置331上的丝氨酸残基已被脯氨酸残基取代(S330A/S331P)。
21.权利要求1-12的任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区是包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1的CH3结构域的杂交体。
22.权利要求21的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区中选自位置234上的苯丙氨酸残基、位置296上的苯丙氨酸残基、位置327上的甘氨酸残基、位置330上的丝氨酸残基和位置331上的丝氨酸残基的一个或多个氨基酸残基已被另一种氨基酸取代。
23.权利要求21的多聚体融合蛋白,其中位置234上的苯丙氨酸残基已被亮氨酸残基取代,并且位置296上的苯丙氨酸残基已被酪氨酸残基取代(F234L/F296Y)。
24.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含增加抑制巨噬细胞对抗体包被的靶细胞的吞噬作用的效力的一个或多个突变。
25.权利要求24的多聚体融合蛋白,其包含选自F234L、F234L和F296Y、G327A、G327A和S331P、S330A和S331P以及G327A和S330A的一个或多个突变。
26.权利要求25的多聚体融合蛋白,其中所述重链Fc区包含来源于IgG4的CH2结构域和来源于IgG1或IgG4的CH3结构域。
27.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含减少细胞因子释放的一个或多个突变。
28.权利要求27的多聚体融合蛋白,其包含选自L234F、L234F和P331S、A327G以及Y296F的一个或多个突变。
29.权利要求28的多聚体融合蛋白,其中所述重链Fc区包含来源于IgG1的CH2结构域和CH3结构域。
30.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含减少血小板活化的一个或多个突变。
31.权利要求30的多聚体融合蛋白,其包含选自L234F以及L234F和P331S的一个或多个突变。
32.权利要求31的多聚体融合蛋白,其中所述重链Fc区包含来源于IgG1的CH2结构域和CH3结构域。
33.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含改变其Fc受体结合特征谱的一个或多个突变。
34.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其结合FcRn。
35.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含增加其对FcRn的结合的一个或多个突变。
36.权利要求35的多聚体融合蛋白,其包含选自T250Q、M252Y、S254T、T256E、T307A、T307P、V308C、V308F、V308P、Q311A、Q311R、M428L、H433K、N434F以及N434Y的一个或多个突变。
37.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含增加其对FcγRIIb的结合的一个或多个突变。
38.权利要求37的多聚体融合蛋白,其包含选自E258A、S267A、S267E以及L328F的一个或多个突变。
39.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含减少其对FcγR的结合的一个或多个突变。
40.权利要求39的多聚体融合蛋白,其包含选自L234A、L235A、G236R、N297A、N297Q、S298A以及L328R的一个或多个突变。
41.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其包含减少其对C1q的结合的一个或多个突变。
42.权利要求41的多聚体融合蛋白,其包含选自K322A、P331A、P331S以及L234F和P331S的一个或多个突变。
43.权利要求42的多聚体融合蛋白,其中所述重链Fc区包含来源于IgG1的CH2结构域和CH3结构域。
44.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中所述Fc结构域来源于IgG4并且额外地包含增加FcγR结合的一个或多个突变。
45.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中通过用半胱氨酸残基取代位置308上的缬氨酸残基(V308C)来突变所述Fc结构域。
46.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中通过将核心铰链序列CPPC突变成SPPS来除去所述铰链区中的两个二硫键。
47.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中通过用丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸残基取代位置575上的半胱氨酸残基(C575S、C575T或C575A)来除去所述尾部中的二硫键。
48.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中将核心铰链序列CPPC突变成SPPS,并用丝氨酸、苏氨酸或丙氨酸残基取代位置575上的尾部半胱氨酸残基(C575S、C575T或C575A)。
49.权利要求48的多聚体融合蛋白,其包含基本上非共价的结构域间相互作用。
50.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中通过用丙氨酸残基(N297A)或谷氨酰胺残基(N297Q)取代位置297上的天冬酰胺残基来除去CH2结构域中的糖基化位点。
51.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中通过用丙氨酸残基(N563A)或谷氨酰胺残基(N563Q)取代位置563上的天冬酰胺残基来除去尾部中的糖基化位点。
52.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中所述CH2结构域中的糖基化位点和所述尾部中的糖基化位点均通过用丙氨酸残基或谷氨酰胺残基取代位置297上的天冬酰胺残基和用丙氨酸残基或谷氨酰胺残基取代位置563上的天冬酰胺残基(N297A/N563A或N297A/N563Q或N297Q/N563A或N297Q/N563Q)来除去。
53.权利要求1的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区包含SEQ ID NO 26至30的任一个的氨基酸6至222中或SEQ ID NO 32至47的任一个的氨基酸6至222中给出的序列或SEQID NO 30和31的氨基酸6至333中给出的序列或由所述序列组成。
54.权利要求53的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区还包含具有SEQ ID NO:3至25的任一个中给出的序列的铰链区。
55.权利要求1的多聚体融合蛋白,其中每一个多肽单体单元包含两条相同的多肽链或由其组成,每一条多肽链包含SEQ ID NO 26至47的任一个中给出的序列或由其组成。
56.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其为六聚体或主要为六聚体。
57.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区中的位置309上的氨基酸是亮氨酸残基。
58.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其中每一个重链Fc区在位置310上包含组氨酸残基。
59.前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白,其为纯化的六聚体。
60.一种混合物,其包含以不止一种多聚体形式存在的根据权利要求1至58的任一项的多聚体融合蛋白,其中已对所述混合物进行了富集,以富集所述多聚体融合蛋白的六聚体形式。
61.权利要求60的混合物,其中混合物中大于80%的是六聚体。
62.一种分离的DNA序列,其编码根据前述权利要求任一项的多聚体融合蛋白的多肽单体单元的多肽链或其组成部分。
63.权利要求62的分离的DNA,其包含在SEQ ID NO 50至59的任一个中给出的序列或由其组成。
64.克隆载体或表达载体,其包含根据权利要求62或权利要求63的一种或多种DNA序列。
65.宿主细胞,其包含根据权利要求64的一种或多种克隆载体或表达载体。
66.一种方法,其用于产生根据权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白,所述方法包括在适合蛋白质表达并组装成多聚体的条件下培养根据权利要求65的宿主细胞,以及分离和任选地纯化所述多聚体融合蛋白。
67.一种药物组合物,其包含与药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合的权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白。
68.权利要求67的药物组合物,其额外地包含其它活性成分。
69.用于治疗的权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白或权利要求67或68的药物组合物。
70.权利要求1至59的任一项的多聚体融合蛋白或权利要求63或64的药物组合物,其用于治疗免疫性病症。
71.权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白用于制备用于治疗免疫性病症的药剂的用途。
72.权利要求70或71的用途,其中所述免疫性病症选自免疫性血小板减少症、Guillain-Barre综合征、川崎病和慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病。
73.权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白,其包含调节细胞因子释放的一个或多个突变。
74.权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白,其包含调节对C1q的结合的一个或多个突变。
75.权利要求1-59的任一项的多聚体融合蛋白,其包含调节血小板活化的一个或多个突变。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1403913.5 | 2014-03-05 | ||
GB201403912A GB201403912D0 (en) | 2014-03-05 | 2014-03-05 | Proteins |
GB201403913A GB201403913D0 (en) | 2014-03-05 | 2014-03-05 | Proteins |
GB1403912.7 | 2014-03-05 | ||
GB201405952A GB201405952D0 (en) | 2014-04-02 | 2014-04-02 | Proteins |
GB1405952.1 | 2014-04-02 | ||
GB201412646A GB201412646D0 (en) | 2014-07-16 | 2014-07-16 | Proteins |
GB1412646.0 | 2014-07-16 | ||
PCT/EP2015/054687 WO2015132364A1 (en) | 2014-03-05 | 2015-03-05 | Multimeric fc proteins |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN106068274A true CN106068274A (zh) | 2016-11-02 |
Family
ID=52629578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201580011851.9A Pending CN106068274A (zh) | 2014-03-05 | 2015-03-05 | 多聚体Fc蛋白 |
Country Status (15)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11352414B2 (zh) |
EP (1) | EP3114143B1 (zh) |
JP (1) | JP6851200B2 (zh) |
KR (1) | KR20160130463A (zh) |
CN (1) | CN106068274A (zh) |
AU (1) | AU2015226100B2 (zh) |
BR (1) | BR112016020368A2 (zh) |
CA (1) | CA2939198A1 (zh) |
IL (1) | IL247096A0 (zh) |
MX (1) | MX2016010951A (zh) |
RU (1) | RU2016139006A (zh) |
SG (1) | SG11201606597QA (zh) |
TW (1) | TW201619188A (zh) |
UY (1) | UY36021A (zh) |
WO (1) | WO2015132364A1 (zh) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110546162A (zh) * | 2017-03-28 | 2019-12-06 | 礼进生物医药控股有限公司 | 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法 |
CN110785185A (zh) * | 2017-06-05 | 2020-02-11 | 詹森生物科技公司 | 具有非对称ch2-ch3区突变的工程化多特异性抗体和其他多聚体蛋白 |
CN112004550A (zh) * | 2017-12-14 | 2020-11-27 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | 用于治疗视神经脊髓炎的重组IgG Fc多聚体 |
CN114786721A (zh) * | 2019-12-06 | 2022-07-22 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | Fc多聚体的稳定组合物 |
WO2023025309A1 (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 一种cdc平台抗体 |
Families Citing this family (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160130463A (ko) | 2014-03-05 | 2016-11-11 | 유씨비 바이오파마 에스피알엘 | 다량체 Fc 단백질 |
IL286367B2 (en) | 2014-05-02 | 2023-03-01 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods relating to engineered fc constructs |
CN107743494B (zh) | 2015-06-02 | 2022-04-29 | 诺和诺德股份有限公司 | 具有极性重组延伸体的胰岛素 |
GB201511787D0 (en) * | 2015-07-06 | 2015-08-19 | Ucb Biopharma Sprl | Proteins |
GB201513033D0 (en) * | 2015-07-23 | 2015-09-09 | Ucb Biopharma Sprl | Proteins |
EP3325011B3 (en) | 2015-07-24 | 2023-03-15 | Gliknik Inc. | Fusion proteins of human protein fragments to create orderly multimerized immunoglobulin fc compositions with enhanced complement binding |
MA43348A (fr) | 2015-10-01 | 2018-08-08 | Novo Nordisk As | Conjugués de protéines |
MX2018008339A (es) * | 2016-01-27 | 2018-09-17 | CSL Behring Lengnau AG | Multimeros fc de inmunoglobulina g recombinante. |
GB201607979D0 (en) * | 2016-05-06 | 2016-06-22 | Liverpool School Tropical Medicine | Monomeric proteins and uses thereof |
SG10202011624SA (en) | 2016-05-23 | 2021-01-28 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods related to engineered fc constructs |
CA3026420A1 (en) | 2016-06-07 | 2017-12-14 | Gliknik Inc. | Cysteine-optimized stradomers |
BR112019001156A2 (pt) | 2016-07-22 | 2019-04-30 | Gliknik Inc | proteínas de fusão de fragmentos de proteína humana para criar composições de fc de imunoglobulina multimerizadas ordenadas com ligação de receptor fc reforçada |
EP3551227A4 (en) | 2016-12-09 | 2020-07-29 | Gliknik Inc. | METHOD FOR TREATING INFLAMMABLE DISEASES WITH MULTI-VALUE FC COMPOUNDS |
KR20190095929A (ko) | 2016-12-09 | 2019-08-16 | 글리크닉 인코포레이티드 | 다합체화 스트라도머인 gl-2045의 제조 최적화 |
EP3565588A4 (en) | 2017-01-06 | 2020-12-16 | Momenta Pharmaceuticals, Inc. | COMPOSITIONS AND METHODS RELATING TO MODIFIED FC CONSTRUCTIONS |
JP2020513019A (ja) | 2017-04-05 | 2020-04-30 | ノヴォ ノルディスク アー/エス | オリゴマー伸長インスリン−Fcコンジュゲート |
KR101913743B1 (ko) | 2017-04-07 | 2018-11-01 | 국민대학교 산학협력단 | 혈중 반감기 연장을 위한 항체 Fc 변이체들 |
CN112236449A (zh) * | 2018-03-16 | 2021-01-15 | 利物浦热带医学院 | 嵌合fc受体结合蛋白及其用途 |
KR102232659B1 (ko) * | 2018-07-16 | 2021-03-26 | 전북대학교 산학협력단 | 항원전달용 폴리펩타이드, 이를 포함하는 Fc-융합 단백질 및 이의 용도 |
CA3150680A1 (en) | 2019-09-13 | 2021-03-18 | Helen Zhihui CAO | RECOMBINANT IGG FC MULTIMERS FOR THE TREATMENT OF IMMUNE COMPLEX-MEDIATED KIDNEY DISORDERS |
WO2023239940A1 (en) * | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Research Development Foundation | Engineered fcriib selective igg1 fc variants and uses thereof |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011073692A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | The University Of Nottingham | Proteins, nucleic acid molecules and compositions |
WO2013049254A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Jn Biosciences Llc | Hybrid constant regions |
WO2014022592A1 (en) * | 2012-08-02 | 2014-02-06 | Jn Biosciences Llc | Antibodies or fusion proteins multimerized via cysteine mutation and a mu tailpiece |
Family Cites Families (45)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5677425A (en) | 1987-09-04 | 1997-10-14 | Celltech Therapeutics Limited | Recombinant antibody |
US20020147326A1 (en) * | 1996-06-14 | 2002-10-10 | Smithkline Beecham Corporation | Hexameric fusion proteins and uses therefor |
US5980898A (en) | 1996-11-14 | 1999-11-09 | The United States Of America As Represented By The U.S. Army Medical Research & Material Command | Adjuvant for transcutaneous immunization |
GB9625640D0 (en) | 1996-12-10 | 1997-01-29 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
US6114515A (en) | 1997-08-25 | 2000-09-05 | Smithkline Beecham Corporation | PIGRL-1, a member of immunoglobulin gene superfamily |
GB9720054D0 (en) | 1997-09-19 | 1997-11-19 | Celltech Therapeutics Ltd | Biological products |
CA2323757C (en) | 1998-04-02 | 2011-08-02 | Genentech, Inc. | Antibody variants and fragments thereof |
AU3655899A (en) | 1998-04-20 | 1999-11-08 | Regents Of The University Of California, The | Modified immunoglobulin molecules and methods for use thereof |
US6737056B1 (en) * | 1999-01-15 | 2004-05-18 | Genentech, Inc. | Polypeptide variants with altered effector function |
MY129566A (en) | 1999-01-19 | 2007-04-30 | Nestle Sa | A hypoallergenic composition containing tolerogenic peptides inducing oral tolerance |
US6475749B1 (en) | 1999-08-11 | 2002-11-05 | The Regents Of The University Of California | Rh hybrid antibody |
DE10001372A1 (de) | 2000-01-14 | 2001-08-02 | Deutsches Krebsforsch | Anti-CD3-Einzelketten-Antikörper mit humanem Cmu3- und Cmu4- Domänen |
PL206701B1 (pl) | 2001-03-07 | 2010-09-30 | Merck Patent Gmbh | Immunoglobulinowe białko fuzyjne, kodujący je kwas nukleinowy, replikujący wektor ekspresji zawierający taki kwas nukleinowy, eukariotyczna komórka gospodarza zawierająca taki wektor ekspresji oraz sposób zwiększania ekspresji takiego białka fuzyjnego |
KR100453877B1 (ko) | 2001-07-26 | 2004-10-20 | 메덱스젠 주식회사 | 연쇄체화에 의한 면역 글로블린 융합 단백질의 제조 방법 및 이 방법에 의해 제조된 TNFR/Fc 융합 단백질, 상기 단백질을 코딩하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는벡터, 및 상기 벡터에 의한 형질전환체 |
US20040132101A1 (en) | 2002-09-27 | 2004-07-08 | Xencor | Optimized Fc variants and methods for their generation |
US7317091B2 (en) | 2002-03-01 | 2008-01-08 | Xencor, Inc. | Optimized Fc variants |
ES2562177T3 (es) | 2002-09-27 | 2016-03-02 | Xencor Inc. | Variantes de Fc optimizadas y métodos para su generación |
US8388955B2 (en) * | 2003-03-03 | 2013-03-05 | Xencor, Inc. | Fc variants |
JP2007536898A (ja) | 2003-07-01 | 2007-12-20 | セルテック アール アンド ディ リミテッド | 修飾抗体Fabフラグメント |
GB0315457D0 (en) | 2003-07-01 | 2003-08-06 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
GB0315450D0 (en) | 2003-07-01 | 2003-08-06 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
US20060134105A1 (en) | 2004-10-21 | 2006-06-22 | Xencor, Inc. | IgG immunoglobulin variants with optimized effector function |
WO2005063815A2 (en) | 2003-11-12 | 2005-07-14 | Biogen Idec Ma Inc. | Fcϝ receptor-binding polypeptide variants and methods related thereto |
WO2006019447A1 (en) | 2004-07-15 | 2006-02-23 | Xencor, Inc. | Optimized fc variants |
NZ596865A (en) | 2006-06-12 | 2013-07-26 | Emergent Product Dev Seattle | Single-chain multivalent binding proteins with effector function |
EP2083017A4 (en) | 2006-09-14 | 2011-01-12 | Med & Biological Lab Co Ltd | ANTIBODIES HAVING INCREASED ADCC ACTIVITY AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME |
NZ581395A (en) | 2007-05-14 | 2012-08-31 | Biogen Idec Inc | Single-chain fc (scfc) regions, binding polypeptides comprising same, and methods related thereto |
MX2009013004A (es) | 2007-06-01 | 2010-01-20 | Univ Maryland | Agentes de union al receptor de la region constante fc de inmunoglobulina. |
SG190627A1 (en) * | 2008-03-13 | 2013-06-28 | Biotest Ag | Agent for treating disease |
JP2012515556A (ja) * | 2009-01-23 | 2012-07-12 | バイオジェン・アイデック・エムエイ・インコーポレイテッド | 低下したエフェクタ機能を有する安定化Fcポリペプチドおよび使用方法 |
CN102781963B (zh) | 2009-10-27 | 2018-02-16 | Ucb医药有限公司 | 功能修饰性NAv1.7抗体 |
TWI588157B (zh) | 2010-07-28 | 2017-06-21 | 吉林尼克公司 | 產生依序多聚體化免疫球蛋白fc組合物之天然人類蛋白質片段之融合蛋白 |
UA117901C2 (uk) | 2011-07-06 | 2018-10-25 | Ґенмаб Б.В. | Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування |
US9688756B2 (en) | 2011-12-21 | 2017-06-27 | Amgen Inc. | Variant Fc-polypeptides with enhanced binding to the neonatal Fc receptor |
KR102041412B1 (ko) | 2011-12-30 | 2019-11-11 | 한미사이언스 주식회사 | 면역글로불린 Fc 단편 유도체 |
EP2869845B1 (en) | 2012-07-06 | 2019-08-28 | Genmab B.V. | Dimeric protein with triple mutations |
EP2880169B1 (en) | 2012-08-02 | 2017-05-17 | F. Hoffmann-La Roche AG | Method for producing monomeric and multimeric molecules and uses thereof |
US9683044B2 (en) | 2012-08-20 | 2017-06-20 | Gliknik Inc. | Molecules with antigen binding and polyvalent FC gamma receptor binding activity |
JP2015536317A (ja) | 2012-10-17 | 2015-12-21 | リバプール・スクール・オブ・トロピカル・メディスン | 免疫調節タンパク質 |
KR20160127821A (ko) | 2014-03-05 | 2016-11-04 | 유씨비 바이오파마 에스피알엘 | 다량체 Fc 단백질 |
KR20160130463A (ko) * | 2014-03-05 | 2016-11-11 | 유씨비 바이오파마 에스피알엘 | 다량체 Fc 단백질 |
WO2015158867A1 (en) | 2014-04-16 | 2015-10-22 | Ucb Biopharma Sprl | Multimeric fc proteins |
IL286367B2 (en) | 2014-05-02 | 2023-03-01 | Momenta Pharmaceuticals Inc | Compositions and methods relating to engineered fc constructs |
WO2016139365A1 (en) | 2015-03-05 | 2016-09-09 | Ucb Biopharma Sprl | Polymeric fc proteins and methods of screening to alter their functional characteristics |
GB201511787D0 (en) | 2015-07-06 | 2015-08-19 | Ucb Biopharma Sprl | Proteins |
-
2015
- 2015-03-05 KR KR1020167027642A patent/KR20160130463A/ko unknown
- 2015-03-05 AU AU2015226100A patent/AU2015226100B2/en active Active
- 2015-03-05 JP JP2016555527A patent/JP6851200B2/ja active Active
- 2015-03-05 WO PCT/EP2015/054687 patent/WO2015132364A1/en active Application Filing
- 2015-03-05 RU RU2016139006A patent/RU2016139006A/ru not_active Application Discontinuation
- 2015-03-05 BR BR112016020368-2A patent/BR112016020368A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-03-05 US US15/123,038 patent/US11352414B2/en active Active
- 2015-03-05 UY UY0001036021A patent/UY36021A/es not_active Application Discontinuation
- 2015-03-05 CN CN201580011851.9A patent/CN106068274A/zh active Pending
- 2015-03-05 SG SG11201606597QA patent/SG11201606597QA/en unknown
- 2015-03-05 TW TW104107000A patent/TW201619188A/zh unknown
- 2015-03-05 EP EP15708208.2A patent/EP3114143B1/en active Active
- 2015-03-05 CA CA2939198A patent/CA2939198A1/en not_active Abandoned
- 2015-03-05 MX MX2016010951A patent/MX2016010951A/es unknown
-
2016
- 2016-08-03 IL IL247096A patent/IL247096A0/en unknown
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011073692A1 (en) * | 2009-12-18 | 2011-06-23 | The University Of Nottingham | Proteins, nucleic acid molecules and compositions |
WO2013049254A1 (en) * | 2011-09-26 | 2013-04-04 | Jn Biosciences Llc | Hybrid constant regions |
WO2014022592A1 (en) * | 2012-08-02 | 2014-02-06 | Jn Biosciences Llc | Antibodies or fusion proteins multimerized via cysteine mutation and a mu tailpiece |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110546162A (zh) * | 2017-03-28 | 2019-12-06 | 礼进生物医药控股有限公司 | 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法 |
CN110546162B (zh) * | 2017-03-28 | 2021-09-07 | 礼进生物医药科技(上海)有限公司 | 用于增强肿瘤微环境中免疫应答的治疗剂和方法 |
CN110785185A (zh) * | 2017-06-05 | 2020-02-11 | 詹森生物科技公司 | 具有非对称ch2-ch3区突变的工程化多特异性抗体和其他多聚体蛋白 |
CN112004550A (zh) * | 2017-12-14 | 2020-11-27 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | 用于治疗视神经脊髓炎的重组IgG Fc多聚体 |
CN114786721A (zh) * | 2019-12-06 | 2022-07-22 | 康诺贝林伦瑙有限公司 | Fc多聚体的稳定组合物 |
WO2023025309A1 (zh) * | 2021-08-27 | 2023-03-02 | 三生国健药业(上海)股份有限公司 | 一种cdc平台抗体 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US11352414B2 (en) | 2022-06-07 |
AU2015226100A1 (en) | 2016-08-25 |
MX2016010951A (es) | 2016-11-29 |
UY36021A (es) | 2015-09-30 |
EP3114143A1 (en) | 2017-01-11 |
SG11201606597QA (en) | 2016-09-29 |
KR20160130463A (ko) | 2016-11-11 |
TW201619188A (zh) | 2016-06-01 |
BR112016020368A2 (pt) | 2018-01-23 |
EP3114143B1 (en) | 2020-07-08 |
AU2015226100B2 (en) | 2020-05-07 |
IL247096A0 (en) | 2016-09-29 |
RU2016139006A (ru) | 2018-04-05 |
WO2015132364A1 (en) | 2015-09-11 |
JP2017512063A (ja) | 2017-05-18 |
JP6851200B2 (ja) | 2021-03-31 |
US20170088603A1 (en) | 2017-03-30 |
CA2939198A1 (en) | 2015-09-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN106068274A (zh) | 多聚体Fc蛋白 | |
CN106132994A (zh) | 多聚体Fc蛋白 | |
CN106255704A (zh) | 多聚体Fc蛋白 | |
JP7303126B2 (ja) | 抗bcma重鎖のみ抗体 | |
US20180044416A1 (en) | Polymeric Fc proteins and methods of screening to alter their functional characteristics | |
ES2713859T3 (es) | Proteínas de unión, incluyendo anticuerpos, derivados de anticuerpo y fragmentos de anticuerpo, que se unen específicamente a CD154 y usos de los mismos | |
JP7240335B2 (ja) | 抗bcma重鎖のみ抗体 | |
US20090155255A1 (en) | Cd23 binding molecules and methods of use thereof | |
BR112016013347B1 (pt) | Anticorpo monoclonal humano neutralizante anti-il-33, composição farmacêutica, inibidor da expressão de citocinas, molécula de ácido nucleico, vetor, célula bacteriana transgênica, método de produção e uso dos mesmos | |
CN108473571A (zh) | 结合人Fc受体的融合蛋白 | |
WO2017036905A1 (en) | Multimeric proteins which bind to human fc-receptors | |
JP2023537331A (ja) | Cd47抗体及びその応用 | |
CN105636987A (zh) | 新型抗-Fc-γ受体IIB抗体及其用途 | |
JP2022542884A (ja) | Fcrnアンタゴニストで抗体媒介性障害を処置する方法 | |
US20240025995A1 (en) | Dual targeted immune regulating compositions | |
WO2023036815A1 (en) | Targeted regulation of platelet and megakaryocyte activation by heteroreceptor co-clustering |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20161102 |
|
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |