CN106062556B - 尿样品分析方法、尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒 - Google Patents

尿样品分析方法、尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的尿样品分析方法、尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒。

Description

尿样品分析方法、尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒
【技术领域】
本发明涉及用于检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的尿样品分析方法、尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒。
【背景技术】
在肾－泌尿***中的感染症、炎症性病变、变性病变、结石症、肿瘤等疾病中，根据各自的疾病，尿中出现各种有形成分。作为有形成分，可举出红细胞、管型、白细胞、上皮细胞、酵母样真菌、***等。分析尿中的这些的成分对于肾－泌尿***的疾病或异常部位的推定重要。例如，红细胞是对于判断从肾脏的肾小球至尿道的途径中有无出血有用的尿中有形成分。
管型是以Tamm-Horsfall粘蛋白质和尿中血浆蛋白质(主要是白蛋白)的凝固沉淀物作为基质的固体成分，主要由远曲小管及集合管形成。此仅由基质组成的管型被称为透明管型，但随肾脏或肾小管的状态而在透明管型中封入细胞等各种成分，发生进一步变性的管型。因此，管型是对于掌握肾脏及肾小管的病态或障碍的程度有用的尿中有形成分。
在管型及红细胞等尿中有形成分的分析中，广泛进行通过将对尿进行离心分离而得到的沉淀物(有形成分)用显微镜观察的目测检查。另外，在近年也开发出使用流式细胞仪的自动分析法。例如，在专利文献1～4中记载了，为了稀释用试剂及尿中有形成分的染色，通过将用含花青苷系染料的3,3'-二己基-2,2'-碘化氧杂碳花青苷(DiOC6(3))的染色用试剂处理的尿样品用流式细胞仪测定，分析尿中有形成分的方法。
另一方面，在尿中也存在作为形状与管型极其类似的成分的粘液丝或细菌或盐类等凝集体。由于尿样品中的管型的数是临床上重要的信息，所以在管型的检测时，辨别管型和粘液丝等与管型类似的成分变得重要。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1:特开平11-23446号公报
专利文献2:特开平9-329596号公报
专利文献3:特开平8-240520号公报
专利文献4:特开平8-170960号公报
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
本发明旨在提供，与以往技术比，可不使红细胞溶血地高精度检测红细胞，可再将管型与粘液丝等混杂物区别而高精度检测的尿样品分析方法。另外，本发明旨在提供适宜在该方法中使用的尿样品分析用试剂及尿样品分析用试剂盒。
【解决课题的技术方案】
本发明人经锐意探讨的结果发现，通过作为用于对尿中有形成分进行染色的染料，使用特定的花青苷系荧光染料，可不实质上损伤红细胞地检测红细胞，并且区别检测管型和粘液丝，从而完成本发明。
从而，本发明提供尿样品分析方法，其包括：将尿样品和含选自3,3'-碘化二乙基氧杂碳花青苷(DiOC2(3))、3,3-碘化二丙基氧杂碳花青苷(DiOC3(3))、3,3'-碘化二丁基氧杂花青苷(DiOC4(3))及3,3-碘化二戊基氧杂碳花青苷(DiOC5(3))的至少1种荧光染料的第1试剂混合而调制测定样品的工序，及检测在调制工序中得到的测定样品中所含的作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的工序。
另外，本发明提供用于检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的尿样品分析用试剂，其含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料。
再者，本发明提供用于检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的尿样品分析用试剂盒，其含：含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料的第1试剂、及含作为分散剂的表面活性剂的第2试剂。
【发明效果】
由本发明能不使红细胞实质上损伤地检测红细胞，并且能高精度检测管型及红细胞。
【附图说明】
【图1】是显示尿样品分析用试剂之一例的图。
【图2】是显示尿样品分析用试剂盒之一例的图。
【实施方式】
[尿样品分析方法]
本实施方式的尿样品分析方法(以下，也简称为“方法”)在尿中有形成分之中以红细胞、管型、结晶成分及粘液丝作为分析对象，特别是，对于管型及红细胞的分析适宜。
在管型中有各种各样的种类，已知上述的仅由基质组成的透明管型、封入有肾小管上皮细胞的上皮管型、封入有红细胞的红细胞管型、封入有白细胞的白细胞管型、封入有脂肪颗粒的脂肪管型、封入有颗粒成分(主要是变性的上皮细胞)的颗粒管型、管型的全体或一部分均质且如蜡一样变性的蜡样管型。在本实施方式中，管型的种类无特别限定。
在本实施方式中，红细胞的种类无特别限定，也可为正常红细胞及异常红细胞之任何。
在本实施方式的方法中，首先进行将尿样品和含选自3,3'-碘化二乙基氧杂碳花青苷(DiOC2(3))、3,3-碘化二丙基氧杂碳花青苷(DiOC3(3))、3,3'-碘化二丁基氧杂花青苷(DiOC4(3))及3,3-碘化二戊基氧杂碳花青苷(DiOC5(3))的至少1种荧光染料的第1试剂混合而调制测定样品的工序。
在本实施方式中，尿样品只要是含尿中有形成分的液体样品，就无特别限定，但优选是自受试者采集的尿。再有，以自受试者采集的尿作为样品使用时，有随时间经过而尿中有形成分劣化的担忧，所以优选为在采集后24小时以内、特别3～12小时以内将尿样品在本实施方式的方法中使用。
在本实施方式的方法中使用的第1试剂是用于对含至少管型及红细胞的尿中有形成分进行染色的试剂。可在第1试剂中使用的荧光染料的DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)也各自被称为NK-85、NK-2605、NK-5587及NK-2453，均可从株式会社林原生物化学研究所得到。在以往的分析方法中，为了尿中有形成分的染色，使用含花青苷系染料的3,3'-二己基-2,2'-碘化氧杂碳花青苷(DiOC6(3))的染色用试剂。本发明人发现，相比用含此DiOC6(3)的染色用试剂处理尿样品，用含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料的染色用试剂处理尿样品更能保持样品中的红细胞的形态，可正确地检测红细胞。另外，在本实施方式的方法中，红细胞的膜成分及管型被这些染料良好地染色，但粘液丝几乎未被染色。以下显示这些染料的结构式。
【化1】
第1试剂中的荧光染料可为1种，也可为2种以上。第1试剂中的荧光染料的浓度优选设定为，在调制的测定样品中，以可至少对管型及红细胞适宜地进行染色的终浓度含该荧光染料。测定样品中的终浓度根据上述的荧光染料的种类适宜设定。例如，当作为荧光染料使用DiOC3(3)时，测定样品中的终浓度是0.1μg/mL以上200μg/mL以下，优选是1μg/mL以上20μg/mL以下。
第1试剂可通过使上述的荧光染料溶解于适宜的溶剂而得到。溶剂只要是可使上述的荧光染料溶解的水性溶剂，就无特别限定，例如，可举出水、水溶性有机溶剂、及这些的混合物。在这些中，特别优选为水溶性有机溶剂。作为水溶性有机溶剂，例如，可举出碳原子数1～3的低级醇、乙二醇、二甲基亚砜(DMSO)等。
在本实施方式中，根据需要，也可在调制工序中进一步混合用于稀释尿样品的稀释用试剂。作为那样的稀释用试剂，优选为水或缓冲液。缓冲液只要是在pH是5以上9以下、优选为6.5以上8.6以下、更优选为7.0以上7.8以下的范围有缓冲作用的缓冲剂的水溶液，就无特别限定。作为那样的缓冲剂，例如，可举出Tris、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPS等Good缓冲剂等。
在本实施方式中，在调制工序中，优选进一步混合含作为分散剂的表面活性剂的第2试剂。通过进一步混合这样的第2试剂，可使抑制管型的正确的检测的细菌或盐类等混杂物的凝集体分散、除去。
第2试剂可通过使表面活性剂溶解于适宜的溶剂而得到。溶剂只要是可使表面活性剂溶解，就无特别限定，例如，可举出水、水溶性有机溶剂、及这些的混合物。作为水溶性有机溶剂，例如，可举出碳原子数1～3的低级醇、乙二醇、DMSO等。在本实施方式中，特别优选为水。再有，第2试剂也可通过使表面活性剂溶解于上述的稀释用试剂而调制。
在第2试剂中使用的表面活性剂的种类无特别限定，可自阳离子性表面活性剂、非离子性表面活性剂、阴离子性表面活性剂及两性表面活性剂适宜选择。第2试剂中所含的表面活性剂可为1种，也可为2种以上。含2种以上的表面活性剂时，其组合可任意地选择。
在本实施方式中，作为阳离子性表面活性剂，可使用选自季铵盐型表面活性剂及吡啶鎓盐型表面活性剂的至少1种。作为季铵盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(I)所表示的总碳原子数9～30的表面活性剂。
【化2】
上述的式(I)中，R1是碳原子数6～18的烷基或烯基；R2及R3互相相同或不同，是碳原子数1～4的烷基或烯基；R4是碳原子数1～4的烷基或烯基、或者苄基；X-是卤素离子。
上述的式(I)中，作为R1，优选为碳原子数6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别优选为直链的烷基。作为更具体的R1，可举出辛基、癸基及十二烷基。作为R2及R3，优选为甲基、乙基及丙基。作为R4，优选为甲基、乙基及丙基。
作为吡啶鎓盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(II)所表示的表面活性剂。
【化3】
在上述的式(II)中，R1是碳原子数6～18的烷基或烯基；X-是卤素离子。
在上述的式(II)中，作为R1，优选为碳原子数6、8、10、12及14的烷基或烯基，特别优选为直链的烷基。作为更具体的R1，可举出辛基、癸基及十二烷基。
作为上述的阳离子性表面活性剂的具体例，可举出十二烷基三甲基溴化铵、癸基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基氯化铵、辛基三甲基溴化铵、辛基三甲基氯化铵、肉豆蔻基三甲基溴化铵、肉豆蔻基三甲基氯化铵、十二烷基吡啶鎓氯化物等。在这些中特别优选为十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)。
在本实施方式中，作为非离子性表面活性剂，可适宜地使用以下的式(III)所表示的聚氧乙烯系非离子表面活性剂。
R1-R2-(CH2CH2O)n-H(III)
在上述的式(III)中，R1是碳原子数8～25的烷基、烯基或炔基；R2是-O-、-COO-或
【化4】
n是10～50的整数。
作为上述的非离子性表面活性剂的具体例，可举出聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯甾醇、聚氧乙烯蓖麻子油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基胺、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚等。
在本实施方式中，作为阴离子性表面活性剂，可使用选自羧酸盐型表面活性剂、磺酸盐型表面活性剂及硫酸酯盐型表面活性剂的至少1种。作为羧酸盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(IV)所表示的表面活性剂。
R1-COO-Y+ (IV)
在上述的式(IV)中，R1是碳原子数8～25的烷基、烯基或炔基；Y+是碱金属离子。
在上述的式(IV)中，作为R1优选为碳原子数12～18的直链的烷基。上述的羧酸盐型表面活性剂在现有技术中作为肥皂被知，例如，可举出月桂酸钠、硬脂酸钠、油酸钠等。
作为磺酸盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(V)所表示的表面活性剂。
【化5】
在上述的式(V)中，m及n是0以上的整数，m和n之和是8～25；Y+是碱金属离子。
在上述的式(V)中，m和n之和优选是9～18。上述的式(V)所表示的磺酸盐型表面活性剂在现有技术中作为烷基苯磺酸盐被知，例如，可举出直链癸基苯硫酸钠、直链十一烷基苯硫酸钠、直链十二烷基苯硫酸钠、直链十三烷基苯硫酸钠及直链十四烷基苯硫酸钠等。
另外，作为磺酸盐型表面活性剂，也可使用以下的式(VI)及(VII)的各自所表示的表面活性剂的混合物。
CH3(CH2)j-CH＝CH-(CH2)k-SO3 -Y+ (VI)
在上述的式(VI)中，j及k是0以上的整数，j和k之和是10～25的整数；Y+是碱金属离子。
CH3(CH2)m-CH(-OH)-(CH2)n-SO3 -Y+ (VII)
在上述的式(VII)中，m及n是0以上的整数，m和n之和是10～25的整数；Y+是碱金属离子。
在上述的式(VI)中，j和k之和是11～15的整数，在上述的式(VII)中，m和n之和优选是12～16的整数。上述的式(VI)及(VII)各自表示的表面活性剂在现有技术中作为α-烯烃磺酸盐被知，例如，可举出1-十四烯磺酸钠、十六烯磺酸钠、3-羟基十六烷基-1-磺酸钠、十八烯-1-磺酸钠及3-羟基-1-十八烷磺酸钠等。
作为硫酸酯盐型表面活性剂，例如，可举出以下的式(VIII)所表示的表面活性剂。
R1-O-SO3 -Y+ (VIII)
在上述的式(VIII)中，R1是碳原子数10～25的烷基、烯基或炔基；Y+是碱金属离子。
在上述的式(VIII)中，作为R1，优选为碳原子数10～18的直链的烷基，特别优选为碳原子数12的直链的烷基。上述的式(VIII)所表示的硫酸酯盐型表面活性剂在现有技术中作为高级醇硫酸酯盐被知，例如，可举出癸基硫酸钠、十一烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、十三烷基硫酸钠及十四烷基硫酸钠等。
另外，作为硫酸酯盐型表面活性剂，也可使用以下的式(IX)所表示的表面活性剂。
R1-O-(CH2CH2O)n-SO3 -Y+ (IX)
在上述的式(IX)中，R1是碳原子数10～25的烷基、烯基或炔基；n是1～8的整数；Y+是碱金属离子或铵离子。
在上述的式(IX)中，作为R1，优选为碳原子数12～18的直链的烷基，特别优选为碳原子数12的直链的烷基。上述的式(IX)所表示的硫酸酯盐型表面活性剂在现有技术中作为聚氧乙烯烷基硫酸酯盐被知，例如，可举出十二烷基醚硫酸酯钠等。
另外，作为硫酸酯盐型表面活性剂，也可使用以下的式(X)所表示的表面活性剂。
R1-CH(-SO3 -)-COOCH3Y+ (X)
在上述的式(X)中，R1是碳原子数8～25的烷基、烯基或炔基；Y+是碱金属离子。
在上述的式(X)中，作为R1，优选为碳原子数10～18的直链的烷基，特别优选为碳原子数12的直链的烷基。上述的式(X)所表示的硫酸酯盐型表面活性剂在现有技术中作为α-磺基脂肪酸酯被知，例如，可举出2-磺基十四烷酸-1-甲基酯钠盐及2-磺基十六烷酸-1-甲基酯钠盐等。
在本实施方式中，作为两性表面活性剂，可使用选自氨基酸型两性表面活性剂及甜菜碱型两性表面活性剂的至少1种。作为氨基酸型两性表面活性剂，例如可举出以下的式(XI)所表示的表面活性剂。
R1-N+H2-CH2CH2COO- (XI)
在上述的式(XI)中，R1是碳原子数8～25的烷基、烯基或炔基。
在上述的式(XI)中，作为R1，优选为碳原子数12～18的直链的烷基。作为上述的氨基酸型两性表面活性剂，例如，可举出3-(十二烷基氨基)丙烷酸及3-(十四烷-1-基氨基)丙烷酸等。
作为甜菜碱型两性表面活性剂，例如，可举出以下的式(XII)所表示的表面活性剂。
【化6】
在上述的式(XII)中，R1是碳原子数6～18的烷基或烯基；R2是碳原子数1～4的烷基或烯基；R3是碳原子数1～4的烷基或烯基、或者苄基；n是1或2。
作为甜菜碱型两性表面活性剂，例如，可举出十二烷基二甲基氨基醋酸甜菜碱及硬脂基二甲基氨基醋酸甜菜碱等。
第2试剂中的表面活性剂的浓度优选设定为，在如上述一样调制的测定样品中，以不使红细胞溶血，并且可使混杂物的凝集体分散的终浓度含该表面活性剂。测定样品中的表面活性剂的终浓度可适宜设定，但优选是3ppm以上30ppm以下。
在本实施方式中，为了防止pH变化导致的红细胞的溶血，可将第2试剂的pH设为5以上9以下、优选为6.5以上8.6以下、更优选为7.0以上7.8以下的范围。从而，第2试剂也可为了将pH保持一定而含缓冲剂。作为那样的缓冲剂，与上述的稀释用试剂中使用的缓冲剂相同。
在尿样品中有时含磷酸铵、磷酸镁、碳酸钙等无晶性盐类。在本实施方式中，为了使这些的无晶性盐类的影响降低，第2试剂也可含鳌合剂。鳌合剂只要是能除去无晶性盐类的鳌合剂，就无特别限定，可自现有技术中公知的脱钙剂、脱镁剂等适宜选择。具体而言，可举出乙二胺四醋酸盐(EDTA盐)、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、甲基-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPO等，在这些中特别优选为EDTA盐。
第2试剂中的鳌合剂的浓度，在如上述一样调制的测定样品中，优选设定为以可降低无晶性盐类的影响的终浓度含该鳌合剂。测定样品中的终浓度根据上述的鳌合剂的种类适宜设定。例如，在作为鳌合剂使用EDTA2钾(EDTA-2K)时，测定样品中的终浓度是0.1mM以上500mM以下，优选是1mM以上100mM以下。
在尿中存在酵母样真菌及红细胞时，在由流式细胞仪的分析中，已知有酵母样真菌和红细胞的分级分离不太良好的情况。从而，第2试剂也可含使酵母样真菌的细胞膜损伤的物质。作为那样的物质，可举出2-苯氧基乙醇、苄基醇、苯乙基醇、1-苯氧基-2-丙醇、苯酚、醋酸苯酯、苯并噻唑等，在这些中特别优选为2-苯氧基乙醇。通过使用含这样的物质的第2试剂，酵母样真菌的染色性变化，红细胞和酵母样真菌的分级分离改善。
已知尿的渗透压分布在50～1300mOsm/kg的广泛围，但在测定样品中渗透压过低或过高时，有红细胞损伤的担忧。测定样品中的适宜的渗透压是100mOsm/kg以上600mOsm/kg以下，优选是150mOsm/kg以上500mOsm/kg以下。尿的渗透压过高时，可通过用稀释用试剂或第2试剂稀释适宜调节渗透压。相反，尿的渗透压过低时，第2试剂也可含渗透压补偿剂。作为那样的渗透压补偿剂，可举出无机盐类、有机盐类、糖类等。作为无机盐类，可举出氯化钠、溴化钠等。作为有机盐类，可举出丙酸钠、丙酸钾、丙酸铵草酸盐等。作为糖类，可举出山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等。
在本实施方式中，将尿样品、第1试剂和第2试剂混合的顺序无特别限定，也可将这些同时混合。优选为，先混合尿样品和第2试剂，向其中进一步混合第1试剂。或者，也可先混合第1试剂和第2试剂，向其中进一步混合尿样品。
在本实施方式中，将尿样品、第1试剂和第2试剂的混合比例无特别限定，根据各试剂中所含的成分浓度适宜确定即可。例如，尿样品和第1试剂的混合比例可从以体积比1:0.01～1的范围确定。另外，尿样品和第2试剂的混合比例可从以体积比1:0.5～10的范围确定。再有，尿样品的量根据第1试剂和第2试剂适宜确定即可。尿样品的量从不使测定时间变得过长的观点优选为1000μL以下。尿样品的量10～1000μL左右对于测定是充分的。
调制工序中的温度条件是10～60℃、优选为35～45℃。也可将各试剂预先加温而达这些温度。另外，也可在将尿样品和第1试剂及/或第2试剂混合后，温育1秒钟～5分钟、优选为5～60秒钟。
在本实施方式的方法中，进行检测在上述的调制工序中得到的测定样品中所含的作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的工序。
在得到的测定样品中，尿中有形成分、特别管型及红细胞由上述的荧光染料染色。从而，通过使用荧光显微镜观察测定样品中的各有形成分的形状及染色的程度等，可检测这些的有形成分。
在优选的实施方式中，在上述的检测工序之前，还进行向测定样品中所含的尿中有形成分照射光而取得光学信息的工序。此光学信息的取得工序优选由流式细胞仪进行。在由流式细胞仪的测定中，通过在染色的尿中有形成分通过流动池时向该有形成分照射光，可作为自该有形成分发的信号得到光学信息。作为那样的光学信息，优选为散射光信息及荧光信息。
散射光信息一般只要是可用市售的流式细胞仪测定的散射光的信息，就无特别限定，例如，可举出前方散射光(例如，光接收角度0～20度附近)或侧方散射光(光接收角度90度附近)等散射光的强度及波形信息等。更具体而言，作为散射光信息，可举出散射光强度、散射光脉宽及散射光积分值等。在现有技术中，已知侧方散射光反映细胞的核或颗粒等内部信息，前方散射光反映细胞的大小的信息。在本实施方式中，优选使用前方散射光的信息。
荧光信息只要是将适当的波长的激发光照射到染色的尿中有形成分而测定激发的荧光而得到的信息，就无特别限定，例如，可举出荧光的强度及波形信息。更具体而言，作为荧光信息，可举出荧光强度、荧光脉宽及荧光积分值等。再有，荧光自被第1试剂中所含的荧光染料染色的有形成分内的核酸等发出。另外，光接收波长可根据第1试剂中所含的荧光染料适宜选择。
在本实施方式中，流式细胞仪的光源无特别限定，可适宜选择对于荧光染料的激发适宜的波长的光源。例如，使用红色半导体激光、蓝色半导体激光、氩激光、He-Ne激光、汞弧光灯等。特别是，由于半导体激光与气体激光比非常地廉价，从而适宜。
在本实施方式的方法中进行上述的取得工序时，在检测工序中，基于在该取得工序中得到的光学信息，检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞。再有，在“检测”中，不仅发现测定样品中存在尿中有形成分，也包括对尿中有形成分进行分类及计数。
在本实施方式中，尿中有形成分的检测优选通过制成以散射光信息和荧光信息作为二轴的散点图，将得到的散点图使用适当的解析软件解析来进行。例如，在以X轴作为荧光强度，以Y轴作为前方散射光强度描绘散点图时，根据各尿中有形成分的粒子尺寸及染色性(核酸含量)，在散点图上出现各自的集团(群集)。在本实施方式的方法中，可将至少管型及红细胞作为在各自不同的区域出现的2种集团进行检测。另外，可由解析软件在散点图上设包围各集团的窗，对各窗中的粒子数进行计数。
[尿样品分析用试剂]
本实施方式的尿样品分析用试剂11(以下，也简称为“试剂”)是用于检测作为尿样品中的有形成分的至少管型及红细胞的试剂。本实施方式的试剂含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料。再有，对于本实施方式的试剂与对于本实施方式的尿样品分析方法中使用的第1试剂所述的相同。
在本发明的范围内也包括，含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料的试剂用于检测作为尿样品中的有形成分的至少管型及红细胞的用途。在图1显示本实施方式的试剂11之一例。
[尿样品分析用试剂盒]
本实施方式的尿样品分析用试剂盒(以下，也简称为“试剂盒”)是用于检测作为尿样品中的有形成分的至少管型及红细胞的试剂盒。此试剂盒含：含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料的第1试剂，及含作为分散剂的表面活性剂的第2试剂。
对于试剂盒中所含的第1试剂及第2试剂与对于本实施方式的尿样品分析方法中使用的第1试剂及第2试剂所述的相同。
在本实施方式中，优选将第1试剂和第2试剂收容到不同的容器中，作为具备这些的2试剂型的试剂盒。在图2显示含容器中收容的第1试剂22及容器中收容的第2试剂33的本实施方式的试剂盒之一例。
在本发明的范围内也包括试剂盒用于检测作为尿样品中的有形成分的至少管型及红细胞的用途，所述试剂盒含：含选自DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及DiOC5(3)的至少1种荧光染料的第1试剂，及含作为分散剂的表面活性剂的第2试剂。
接下来，由实施例详细地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。
【实施例】
【实施例1】
在实施例1中，探索能对管型进行染色、并且能由对管型和粘液丝染色的差进行判别的染料。再有，管型和粘液丝的判别通过在荧光显微镜下观察样品进行。另外，也进行由流式细胞仪的测定。
(1)尿样品
作为尿样品，使用含管型及粘液丝的尿。
(2)试剂
·染色用试剂
作为染色用试剂，调制含表1所示的各染料的染色液1～29。再有，这些染色液均为使染料溶解于乙二醇(NACALAI TESQUE株式会社)至成1mg/mL的浓度而调制。
【表1】
染色液 染料名 基本骨架 提供者
1 DioC2(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
2 DioC3(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
3 DioC4(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
4 DioC5(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
5 DioC6(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
6 DioC7(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
7 DioC18(3) 花青苷 株式会社林原生物化学研究所
8 SYTO 花青苷 Life Technologies公司
9 YO-PRO 花青苷 Life Technologies公司
10 NK-359 苯乙烯基 株式会社林原生物化学研究所
11 NK-361 苯乙烯基 株式会社林原生物化学研究所
12 FM4-64 苯乙烯基 Life Technologies公司
13 FITC 呫吨 Life Technologies公司
14 钙黄绿素 呫吨 株式会社林原生物化学研究所
15 二乙酸荧光素 呫吨 株式会社林原生物化学研究所
16 荧光素 呫吨 株式会社林原生物化学研究所
17 BCECF-AM 呫吨 株式会社林原生物化学研究所
18 若丹明123 呫吨 株式会社林原生物化学研究所
19 酸红97 偶氮 株式会社林原生物化学研究所
20 酸橙8 偶氮 株式会社林原生物化学研究所
21 橙番红花精G 偶氮 株式会社林原生物化学研究所
22 NBD-Cl 苯并噁二唑 株式会社林原生物化学研究所
23 Astrazone橙G 次甲基 株式会社林原生物化学研究所
24 Astrazone橙R 次甲基 株式会社林原生物化学研究所
25 若杜林橙 吖啶 株式会社林原生物化学研究所
26 AY 吖啶 株式会社林原生物化学研究所
27 吖啶黄盐酸盐 吖啶 株式会社林原生物化学研究所
28 3,6-二氨基-10-甲基-吖啶鎓氯化物 吖啶 株式会社林原生物化学研究所
29 吖啶橙2GNX 吖啶 株式会社林原生物化学研究所
·稀释用试剂
作为稀释用试剂，使用HEPES-OH(100mM、pH7)(株式会社同仁化学研究所)。再有，溶剂使用经逆渗透膜过滤的水。
(3)由荧光显微镜的观察及结果
将尿样品(200μL)、稀释用试剂(580μL)和各染色液(20μL)混合，于40℃反应1分钟而调制测定样品。进而，将得到的测定样品中的管型及粘液丝由荧光显微镜B×51(Olympus株式会社制)观察。观察的结果，上述的29种染料之中，能对管型进行染色、并且能由对管型和粘液丝染色的差进行判别的染料是DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3)及DioC7(3)的仅6种。在使用这些染料时，相比粘液丝，管型被更良好地染色，结果，可进行管型和粘液丝的判别。
(4)由流式细胞仪的测定及结果
受由荧光显微镜的观察结果，对于分别用染色液1～6染色的样品探讨，是否由流式细胞仪也能辨别管型和粘液丝。样品的测定使用流式细胞仪UF-1000i(Sysmex株式会社制)进行。此由流式细胞仪的测定的具体的工序如下。首先，将尿样品(200μL)、稀释用试剂(580μL)和各染色液(20μL)混合，于40℃反应60秒钟而调制测定样品。进而，向测定样品照射光，取得前方散射光强度、侧方散射光强度、荧光强度及荧光的积分值。再有，作为流式细胞仪的光源，使用激发波长488nm的半导体激光。从荧光强度及荧光的积分值，算出相对管型的粘液丝的荧光强度比及荧光总和比。结果示于表2。
【表2】
染色液 染料 荧光总和比(管型/粘液丝) 荧光强度比(管型/粘液丝)
1 DioC2(3) 3.4 4.3
2 DioC3(3) 3.2 4.9
3 DioC4(3) 5.3 5.9
4 DioC5(3) 3.5 4.4
5 DioC6(3) 1.2 1.2
6 DioC7(3) 1.3 1.3
表2显示，在使用染色液1～6之任何时，荧光强度比及荧光总和比也均为1.2以上。特别是得知，在使用染色液1～4时，荧光强度比及荧光总和比高。结果显示，DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)及DioC5(3)适宜于由流式细胞仪辨别管型和粘液丝。
【实施例2】
在实施例2中，探讨DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3)及DioC7(3)对红细胞的影响(溶血)。再有，对红细胞的影响基于测定样品中的红细胞数进行评价。
(1)红细胞样品
将自健康自愿者采集的人血液用生理盐水(大塚制药工场)稀释1000倍，调制红细胞样品。
(2)试剂
作为染色用试剂，使用与实施例1相同的染色液1～6。作为稀释用试剂，使用与实施例1相同的缓冲液。
(3)测定及结果
样品的测定使用流式细胞仪UF-1000i(Sysmex株式会社制)进行。再有，与实施例1同样地调制测定样品。进而，向测定样品照射光，取得荧光强度及前方散射光强度。再有，作为流式细胞仪的光源，使用激发波长488nm的半导体激光。进而，基于这些的测定值，对测定样品中的红细胞数进行计数。结果示于表3。
【表3】
染色液 染料 红细胞总数 红细胞数(细胞/μL)
1 DioC2(3) 16591 2127
2 DioC3(3) 15934 2043
3 DioC4(3) 16185 2075
4 DioC5(3) 14058 1802
5 DioC6(3) 44 6
6 DioC7(3) 39 5
如表3所示，当使用染色液5及6时，与使用染色液1～4时比，测定样品中的红细胞的数显著地减少。这显示由染色用试剂中的DioC6(3)及DioC7(3)的影响而红细胞溶血。从而，在将DioC6(3)及DioC7(3)用于尿样品的染色时，难以对该样品中的红细胞正确地进行计数。与此相对，得知DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)及DioC5(3)与DioC6(3)及DioC7(3)比，给红细胞带来的影响极其小，适宜于尿样品中的红细胞的测定。
【实施例3】
在实施例3中，将使用流式细胞仪的本实施方式的尿样品分析方法的临床性能与目测检查的结果比较而进行评价。
(1)尿样品
作为尿样品，使用由显微镜观察判断为未出现管型的阴性尿待测样品(42待测样品)。
(2)试剂
·染色用试剂
作为染色用试剂，使用与实施例1相同的染色液2(含有DioC3(3))。
·稀释用试剂
作为稀释用试剂，调制下述的组成的稀释液1及2。再有，在稀释液1及2中，将经逆渗透膜过滤的水作为溶剂使用。
稀释液1：HEPES-OH(100mM、pH7)及EDTA-2K(25mM)(中部Chelest株式会社)
稀释液2：HEPES-OH(100mM、pH7)、EDTA-2K(25mM)及DTAB(10ppm)(东京化成工业株式会社)
(3)测定及结果
样品的测定使用流式细胞仪UF-1000i(Sysmex株式会社制)进行。此由流式细胞仪的测定的具体的工序如下。首先，将尿样品(200μL)、稀释用试剂(580μL)和各染色液(20μL)混合，于40℃反应10秒钟而调制测定样品。进而，向得到的测定样品照射光，取得前方散射光强度、侧方散射光强度及荧光强度。再有，作为流式细胞仪的光源，使用激发波长488nm的半导体激光。基于这些的测定值算出测定样品中的管型的数，由流式细胞仪(FCM)求出判断为阴性的待测样品数。另外，以由目测(显微镜观察)的阴性待测样品数作为参照，求出由FCM分析管型的特异度。结果示于表4。
【表4】
稀释液1 稀释液2
由目测得到的阴性待测样品数 42 42
由FCM得到的阴性待测样品数 30 36
特异度(％) 71.4 85.7
表4显示，使用含DioC3(3)的染色用试剂和稀释液处理尿样品，通过用FCM测定得到的测定样品，可以70％以上的特异度分析尿样品。另外，通过用作为分散剂含阳离子性表面活性剂的DTAB的稀释液处理尿样品，特异度升高。这被认为是由于由DTAB的作用而与管型类似的混杂物减少。
本申请关于2014年2月28日申请的日本国专利申请特愿2014-039281号，将其专利权利要求、说明书、附图及摘要的全部作为参照并入本说明书中。
【符号的说明】
11：尿样品分析用试剂
22：第1试剂
33：第2试剂

Claims (8)

1.尿样品分析方法，其包括：
将尿样品、第1试剂和第2试剂混合而调制测定样品的工序，其中
所述第1试剂含选自3,3’-碘化二乙基氧杂碳花青苷、3,3-碘化二丙基氧杂碳花青苷、3,3’-碘化二丁基氧杂花青苷及3,3-碘化二戊基氧杂碳花青苷的至少1种荧光染料，
所述第2试剂含分散剂，其中所述分散剂是十二烷基三甲基溴化铵，及
检测在调制工序中得到的测定样品中所含的作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的工序。
2.权利要求1所述的尿样品分析方法，其中第2试剂还含鳌合剂。
3.权利要求2所述的尿样品分析方法，其中鳌合剂是乙二胺四醋酸盐(EDTA盐)。
4.权利要求1所述的尿样品分析方法，其还包括向在调制工序中得到的测定样品中所含的尿中有形成分照射光而取得光学信息的工序，
检测工序是基于取得的光学信息，检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的工序。
5.权利要求4所述的尿样品分析方法，其中光学信息是散射光信息及荧光信息。
6.用于检测作为尿中有形成分的至少管型及红细胞的尿样品分析用试剂盒，其含：
第1试剂，其含选自3,3’-碘化二乙基氧杂碳花青苷、3,3-碘化二丙基氧杂碳花青苷、3,3’-碘化二丁基氧杂花青苷及3,3-碘化二戊基氧杂碳花青苷的至少1种荧光染料，及
第2试剂，其含作为分散剂的表面活性剂，其中所述表面活性剂是十二烷基三甲基溴化铵。
7.权利要求6所述的尿样品分析用试剂盒，其中第2试剂还含鳌合剂。
8.权利要求7所述的尿样品分析用试剂盒，其中鳌合剂是乙二胺四醋酸盐(EDTA盐)。
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