WO2015129869A1 - 尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キット - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a urine sample analysis method, a urine sample analysis reagent, and a urine sample analysis reagent kit for detecting at least cylinders and red blood cells as urine components.
  • red blood cells are urinary components useful for determining the presence or absence of bleeding in the pathway from the glomeruli of the kidney to the urethra.
  • the cylinder is a solid component using a coagulated precipitate of Tamm-Horsfall mucoprotein and urinary plasma protein (mainly albumin) as a substrate, and is mainly formed by distal tubules and collecting tubes.
  • a cylinder made of only this substrate is called a glass cylinder, but depending on the state of the kidneys or tubules, various components such as cells may be enclosed in the glass cylinder, and a denatured cylinder may be generated. Therefore, the cylinder is a urinary component useful for grasping the pathological condition and degree of damage of the kidneys and tubules.
  • mucus thread which is a component very similar in shape to a cylinder, and aggregates such as bacteria and salts. Since the number of cylinders in the urine sample is clinically important information, it is important to discriminate between the cylinder and components similar to the cylinder such as a mucus thread when detecting the cylinder.
  • the present invention provides a urine sample analysis method capable of accurately detecting red blood cells without hemolysis as compared with the prior art, and further capable of accurately detecting a cylinder by distinguishing it from foreign matters such as mucus thread.
  • Another object of the present invention is to provide a reagent for urine sample analysis and a reagent kit for urine sample analysis that are preferably used in the method.
  • the present inventors have used a specific cyanine-based fluorescent dye as a dye for staining urinary formed components, thereby detecting red blood cells without substantially damaging them,
  • the present invention has been completed by finding that it can be detected separately from the mucus thread.
  • the present invention relates to a urine sample, 3,3′-diethyloxacarbocyanine iodide (DiOC2 (3)), 3,3-dipropyloxacarbocyanine iodide (DiOC3 (3)), 3,3 ′.
  • a method for analyzing a urine sample comprising: a step of preparing a urine sample; and a step of detecting at least a column and erythrocytes as a urinary component contained in a measurement sample obtained in the preparation step.
  • the present invention detects at least a column and erythrocytes as urine formed components containing at least one fluorescent dye selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3).
  • a reagent for analyzing a urine sample is provided.
  • the present invention includes a first reagent containing at least one fluorescent dye selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3), and a surfactant as a dispersant.
  • the present invention it is possible to detect red blood cells without substantially damaging them, and to detect cylinders and red blood cells with high accuracy.
  • the urine sample analysis method of the present embodiment (hereinafter also simply referred to as “method”) is intended for analysis of erythrocytes, cylinders, crystal components, and mucus threads in urine formed components, and is particularly suitable for analysis of cylinders and erythrocytes. is there.
  • cylinders there are various types of cylinders, including glass cylinders made of only the above-mentioned substrates, epithelial cylinders encapsulating tubular epithelial cells, erythrocyte cylinders encapsulating red blood cells, leukocyte cylinders encapsulating leukocytes, and fat granules.
  • a fat cylinder, a granule cylinder in which granule components (mainly degenerated epithelial cells) are encapsulated, and a wax-like cylinder in which the whole or a part of the cylinder is homogeneous and modified like a wax are known.
  • the type of cylinder is not particularly limited.
  • the type of red blood cells is not particularly limited, and may be normal red blood cells or abnormal red blood cells.
  • a urine sample 3,3′-diethyloxacarbocyanine iodide (DiOC2 (3)), 3,3-dipropyloxacarbocyanine iodide (DiOC3 (3)), 3 And a first reagent containing at least one fluorescent dye selected from 3,3'-dibutyloxacyanine iodide (DiOC4 (3)) and 3,3-dipentyloxacarbocyanine iodide (DiOC5 (3))
  • the step of preparing the measurement sample is performed.
  • the urine sample is not particularly limited as long as it is a liquid sample containing a urine formed component, but is preferably urine collected from a subject.
  • urine collected from a subject is used as a sample, the urine formed component may be deteriorated over time. Therefore, a urine sample is collected within 24 hours after collection, particularly within 3 to 12 hours. It is desirable to use it.
  • the first reagent used in the method of the present embodiment is a reagent for staining a urinary component containing at least a column and red blood cells.
  • the fluorescent dyes DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3) that can be used for the first reagent are also called NK-85, NK-2605, NK-5587 and NK-2453, respectively. Both are available from Hayashibara Biochemical Research Institute.
  • a staining reagent containing the cyanine dye 3,3′-dihexyl-2, 2′-oxacarbocyanine iodide (DiOC6 (3)) is used for staining urine components. It is used.
  • the present inventors have at least one selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3) rather than treating a urine sample with this staining reagent containing DiOC6 (3). It has been found that treatment of a urine sample with a staining reagent containing two fluorescent dyes can more retain the morphology of red blood cells in the sample and can detect red blood cells accurately. In the method of the present embodiment, the membrane component and column of erythrocytes are satisfactorily dyed by these dyes, but the mucus thread is hardly dyed. The structural formulas of these dyes are shown below.
  • the fluorescent dye in the first reagent may be one type or two or more types.
  • the concentration of the fluorescent dye in the first reagent is desirably set so that the fluorescent dye is contained at a final concentration so that at least the column and red blood cells can be appropriately stained in the prepared measurement sample.
  • the final concentration in the measurement sample is appropriately set according to the type of the fluorescent dye. For example, when DiOC3 (3) is used as the fluorescent dye, the final concentration in the measurement sample is 0.1 ⁇ g / mL or more and 200 ⁇ g / mL or less, preferably 1 ⁇ g / mL or more and 20 ⁇ g / mL or less.
  • the first reagent can be obtained by dissolving the above fluorescent dye in an appropriate solvent.
  • the solvent is not particularly limited as long as it is an aqueous solvent capable of dissolving the fluorescent dye, and examples thereof include water, a water-soluble organic solvent, and a mixture thereof. Among these, a water-soluble organic solvent is particularly preferable.
  • the water-soluble organic solvent include lower alcohols having 1 to 3 carbon atoms, ethylene glycol, dimethyl sulfoxide (DMSO) and the like.
  • a dilution reagent for diluting the urine sample may be further mixed in the preparation step.
  • a dilution reagent is preferably water or a buffer.
  • the buffer solution is not particularly limited as long as it is an aqueous solution of a buffering agent having a buffering action in a pH range of 5 to 9, preferably 6.5 to 8.6, more preferably 7.0 to 7.8.
  • buffering agents include Tris, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPS, MOPSO, BES, TES, HEPES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, etc. Good buffer.
  • a second reagent containing a surfactant as a dispersant in the preparation step.
  • a second reagent By further mixing such a second reagent, it is possible to disperse and remove aggregates of contaminants such as bacteria and salts that hinder accurate detection of the column.
  • the second reagent can be obtained by dissolving the surfactant in an appropriate solvent.
  • a solvent will not be specifically limited if surfactant can be dissolved,
  • the water-soluble organic solvent include lower alcohols having 1 to 3 carbon atoms, ethylene glycol, DMSO and the like. In the present embodiment, water is particularly preferable.
  • the second reagent may be prepared by dissolving a surfactant in the dilution reagent.
  • the type of the surfactant used for the second reagent is not particularly limited, and can be appropriately selected from a cationic surfactant, a nonionic surfactant, an anionic surfactant, and an amphoteric surfactant.
  • the surfactant contained in the second reagent may be one type or two or more types. When two or more surfactants are included, the combination can be arbitrarily selected.
  • At least one selected from a quaternary ammonium salt type surfactant and a pyridinium salt type surfactant can be used as the cationic surfactant.
  • the quaternary ammonium salt type surfactant include a surfactant having a total carbon number of 9 to 30 and represented by the following formula (I).
  • R 1 is an alkyl group or alkenyl group having 6 to 18 carbon atoms
  • R 2 and R 3 are the same or different from each other, and are an alkyl group or alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • R 4 is an alkyl or alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms, or a benzyl group;
  • X ⁇ is a halogen ion;
  • R 1 is preferably an alkyl group or alkenyl group having 6, 8, 10, 12, or 14 carbon atoms, and particularly preferably a linear alkyl group. More specific R 1 includes an octyl group, a decyl group, and a dodecyl group.
  • R 2 and R 3 are preferably a methyl group, an ethyl group and a propyl group.
  • R 4 is preferably a methyl group, an ethyl group or a propyl group.
  • pyridinium salt type surfactant examples include surfactants represented by the following formula (II).
  • R 1 is an alkyl group or alkenyl group having 6 to 18 carbon atoms;
  • X ⁇ is a halogen ion.
  • R 1 is preferably an alkyl group or alkenyl group having 6, 8, 10, 12, or 14 carbon atoms, and particularly preferably a linear alkyl group. More specific R 1 includes an octyl group, a decyl group, and a dodecyl group.
  • cationic surfactant examples include dodecyltrimethylammonium bromide, decyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride, octyltrimethylammonium bromide, octyltrimethylammonium chloride, myristyltrimethylammonium bromide, myristyltrimethylammonium chloride, dodecylpyridinium Examples include chloride. Among them, dodecyltrimethylammonium bromide (DTAB) is particularly preferable.
  • a polyoxyethylene nonionic surfactant represented by the following formula (III) is preferably used as the nonionic surfactant.
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 8 to 25 carbon atoms;
  • R 2 is —O—, —COO— or
  • N is an integer from 10 to 50.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene sterol, polyoxyethylene castor oil, polyoxyethylene sorbite fatty acid ester, polyoxyethylene alkylamine, polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl Examples include ether.
  • the anionic surfactant at least one selected from a carboxylate surfactant, a sulfonate surfactant, and a sulfate ester surfactant can be used.
  • a carboxylate type surfactant include surfactants represented by the following formula (IV).
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 8 to 25 carbon atoms;
  • Y + is an alkali metal ion.
  • R 1 is preferably a linear alkyl group having 12 to 18 carbon atoms.
  • the above carboxylate type surfactant is known as soap in the art, and examples thereof include sodium laurate, sodium stearate, sodium oleate and the like.
  • sulfonate type surfactant examples include surfactants represented by the following formula (V).
  • m and n are integers of 0 or more, and the sum of m and n is 8 to 25; Y + is an alkali metal ion.
  • the sum of m and n is preferably 9-18.
  • the sulfonate type surfactant represented by the above formula (V) is known in the art as an alkylbenzene sulfonate, and examples thereof include linear sodium decylbenzene sulfate, linear undecylbenzene sodium sulfate, linear Examples include sodium dodecylbenzene sulfate, linear sodium tridecylbenzene sulfate, and linear sodium tetradecylbenzene sulfate.
  • sulfonate surfactant a mixture of surfactants represented by the following formulas (VI) and (VII) may be used.
  • j and k are integers of 0 or more, and the sum of j and k is an integer of 10 to 25; Y + is an alkali metal ion.
  • m and n are integers of 0 or more, and the sum of m and n is an integer of 10 to 25; Y + is an alkali metal ion.
  • the sum of j and k is preferably an integer of 11 to 15, and in the above formula (VII), the sum of m and n is preferably an integer of 12 to 16.
  • the surfactants represented by the above formulas (VI) and (VII) are known in the art as ⁇ -olefin sulfonates, such as sodium 1-tetradecenesulfonate, sodium hexadecenesulfonate, 3 -Sodium hydroxyhexadecyl-1-sulfonate, sodium octadecen-1-sulfonate, sodium 3-hydroxy-1-octadecanesulfonate and the like.
  • sulfate ester type surfactant examples include surfactants represented by the following formula (VIII).
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 10 to 25 carbon atoms;
  • Y + is an alkali metal ion.
  • R 1 is preferably a linear alkyl group having 10 to 18 carbon atoms, and particularly preferably a linear alkyl group having 12 carbon atoms.
  • the sulfate ester type surfactant represented by the above formula (VIII) is known in the art as a higher alcohol sulfate ester salt, such as sodium decyl sulfate, sodium undecyl sulfate, sodium dodecyl sulfate, sodium tridecyl sulfate and Examples include sodium tetradecyl sulfate.
  • sulfate ester type surfactant a surfactant represented by the following formula (IX) may be used.
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 10 to 25 carbon atoms; n is an integer of 1 to 8; Y + is an alkali metal ion or an ammonium ion.
  • R 1 is preferably a linear alkyl group having 12 to 18 carbon atoms, particularly preferably a linear alkyl group having 12 carbon atoms.
  • the sulfate ester type surfactant represented by the above formula (IX) is known in the art as a polyoxyethylene alkyl sulfate ester salt, and examples thereof include sodium dodecyl ether sulfate ester.
  • sulfate ester type surfactant a surfactant represented by the following formula (X) may be used.
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 8 to 25 carbon atoms;
  • Y + is an alkali metal ion.
  • R 1 is preferably a linear alkyl group having 10 to 18 carbon atoms, particularly preferably a linear alkyl group having 12 carbon atoms.
  • the sulfate ester type surfactant represented by the above formula (X) is known in the art as ⁇ -sulfo fatty acid ester.
  • 2-sulfotetradecanoic acid-1-methyl ester sodium salt and 2-sulfo fatty acid ester are known.
  • hexadecanoic acid-1-methyl ester sodium salt is known in the art as ⁇ -sulfo fatty acid ester.
  • amphoteric surfactant at least one selected from amino acid type amphoteric surfactants and betaine type amphoteric surfactants can be used.
  • amino acid type amphoteric surfactant include surfactants represented by the following formula (XI).
  • R 1 is an alkyl group, alkenyl group or alkynyl group having 8 to 25 carbon atoms.
  • R 1 is preferably a linear alkyl group having 12 to 18 carbon atoms.
  • the amino acid type amphoteric surfactant include 3- (dodecylamino) propanoic acid and 3- (tetradec-1-ylamino) propanoic acid.
  • betaine amphoteric surfactants examples include surfactants represented by the following formula (XII).
  • R 1 is an alkyl or alkenyl group having 6 to 18 carbon atoms
  • R 2 is an alkyl or alkenyl group having 1 to 4 carbon atoms
  • R 3 is 1 to 4 carbon atoms
  • n is 1 or 2;
  • betaine-type amphoteric surfactant examples include dodecyldimethylaminoacetic acid betaine and stearyldimethylaminoacetic acid betaine.
  • the concentration of the surfactant in the second reagent is such that the surfactant is at a final concentration that does not hemolyze erythrocytes and can disperse the aggregates of contaminants in the measurement sample prepared as described above. It is desirable to set so that the agent is included. Although the final concentration of the surfactant in the measurement sample can be appropriately set, it is preferably 3 ppm or more and 30 ppm or less.
  • the pH of the second reagent in order to prevent hemolysis of erythrocytes due to pH change, can be in the range of 5 to 9, preferably 6.5 to 8.6, more preferably 7.0 to 7.8. . Therefore, the second reagent may contain a buffering agent in order to keep the pH constant.
  • a buffering agent is the same as the buffering agent used in the above-described dilution reagent.
  • Urine samples may contain amorphous salts such as ammonium phosphate, magnesium phosphate, calcium carbonate.
  • the second reagent may contain a chelating agent in order to reduce the influence of these amorphous salts.
  • the chelating agent is not particularly limited as long as it is a chelating agent capable of removing amorphous salts, and can be appropriately selected from decalcification agents, demagnesium agents, and the like known in the art. Specific examples include ethylenediaminetetraacetate (EDTA salt), CyDTA, DHEG, DPTA-OH, EDDA, EDDP, GEDTA, HDTA, HIDA, Methyl-EDTA, NTA, NTP, NTPO, EDDPO, etc. Of these, EDTA salts are particularly preferred.
  • the concentration of the chelating agent in the second reagent is preferably set so that the chelating agent is contained at a final concentration that can reduce the influence of amorphous salts in the measurement sample prepared as described above. .
  • the final concentration in the measurement sample is appropriately set according to the type of the chelating agent. For example, when EDTA 2 potassium (EDTA-2K) is used as a chelating agent, the final concentration in the measurement sample is 0.1 to 500 ⁇ m, preferably 1 to 100 ⁇ m.
  • the second reagent may contain a substance that damages the cell membrane of the yeast-like fungus.
  • examples of such substances include 2-phenoxyethanol, benzyl alcohol, phenethyl alcohol, 1-phenoxy-2-propanol, phenol, phenyl acetate, benzothiazole, and among them, 2-phenoxyethanol is particularly preferable.
  • the osmotic pressure of urine is distributed in a wide range of 50 to 1300 mOsm / kg. However, if the osmotic pressure is too low or too high in the measurement sample, the erythrocytes may be damaged.
  • An appropriate osmotic pressure in the measurement sample is 100 to 600 mOsm / kg, preferably 150 to 500 mOsm / kg.
  • the osmotic pressure of urine is too high, the osmotic pressure can be adjusted as appropriate by diluting with the reagent for dilution or the second reagent. Conversely, when the urine osmotic pressure is too low, the second reagent may contain an osmotic pressure compensating agent.
  • Examples of such osmotic pressure compensating agents include inorganic salts, organic salts, and saccharides.
  • inorganic salts include sodium chloride and sodium bromide.
  • organic salts include sodium propionate, potassium propionate, and ammonium propionate oxalate.
  • saccharide examples include sorbitol, glucose, mannitol and the like.
  • the order of mixing the urine sample, the first reagent, and the second reagent is not particularly limited, and these can be mixed simultaneously.
  • the urine sample and the second reagent are mixed first, and the first reagent is further mixed there.
  • the first reagent and the second reagent may be mixed first, and the urine sample may be further mixed there.
  • the mixing ratio of the urine sample, the first reagent, and the second reagent is not particularly limited, and may be appropriately determined according to the component concentration contained in each reagent.
  • the mixing ratio of the urine sample and the first reagent can be determined from a range of 1: 0.01 to 1 by volume ratio.
  • the mixing ratio of the urine sample and the second reagent can be determined from the range of 1: 0.5 to 10 by volume ratio.
  • the amount of the urine sample may be appropriately determined according to the first reagent and the second reagent.
  • the amount of the urine sample is preferably 1000 ⁇ L or less from the viewpoint of preventing the measurement time from becoming too long.
  • the amount of urine sample is about 10 to 1000 ⁇ L, which is sufficient for measurement.
  • the temperature condition in the preparation process is 10 to 60 ° C, preferably 35 to 45 ° C.
  • Each reagent may be preheated so as to reach these temperatures. Further, after mixing the urine sample with the first reagent and / or the second reagent, the sample may be incubated for 1 second to 5 minutes, preferably 5 to 60 seconds.
  • a step of detecting at least a column and red blood cells as urine formed components contained in the measurement sample obtained in the above preparation step is performed.
  • urine components in particular, cylinders and red blood cells are stained with the above-mentioned fluorescent dye. Therefore, these formed components can be detected by observing the shape of each formed component in the measurement sample and the degree of staining using a fluorescence microscope.
  • a step of irradiating the urine formed component contained in the measurement sample with light to acquire optical information is further performed.
  • This optical information acquisition step is preferably performed by a flow cytometer.
  • optical information can be obtained as a signal emitted from the formed component by irradiating the formed component with light when the stained formed component in urine passes through the flow cell. .
  • Such optical information is preferably scattered light information and fluorescence information.
  • the scattered light information is not particularly limited as long as it is information on scattered light that can be generally measured with a commercially available flow cytometer.
  • forward scattered light for example, around a light receiving angle of 0 to 20 degrees
  • side scattered light light received light
  • the intensity of scattered light such as an angle of about 90 degrees and waveform information.
  • the scattered light information includes scattered light intensity, scattered light pulse width, scattered light integrated value, and the like.
  • side scattered light is known to reflect internal information such as cell nuclei and granules
  • forward scattered light is known to reflect cell size information. In the embodiment, it is preferable to use information of forward scattered light.
  • the fluorescence information is not particularly limited as long as it is information obtained by irradiating the formed component in urine stained with excitation light of an appropriate wavelength and measuring the excited fluorescence.
  • the fluorescence intensity and waveform Information More specifically, the fluorescence information includes fluorescence intensity, fluorescence pulse width, fluorescence integral value, and the like.
  • fluorescence is emitted from the nucleic acid in the formed component stained with the fluorescent dye contained in the first reagent.
  • the light receiving wavelength can be appropriately selected according to the fluorescent dye contained in the first reagent.
  • the light source of the flow cytometer is not particularly limited, and a light source having a wavelength suitable for excitation of the fluorescent dye can be appropriately selected.
  • a red semiconductor laser, a blue semiconductor laser, an argon laser, a He—Ne laser, a mercury arc lamp, or the like is used.
  • a semiconductor laser is preferable because it is much cheaper than a gas laser.
  • the detection step at least a column and red blood cells are detected as urine components based on the optical information obtained in the acquisition step. “Detection” includes not only finding the presence of urinary components in the measurement sample but also classifying and counting urinary components.
  • the urinary component is detected by creating a scattergram having two axes of scattered light information and fluorescence information and analyzing the obtained scattergram using appropriate analysis software.
  • appropriate analysis software For example, when a scattergram is drawn with the X axis as the fluorescence intensity and the Y axis as the forward scattered light intensity, each group (cluster) is selected according to the particle size and stainability (nucleic acid content) of each urine component. ) Appears on the scattergram.
  • at least a column and red blood cells can be detected as two types of groups that appear in different regions.
  • the analysis software can provide a window surrounding each group on the scattergram, and the number of particles in each window can be counted.
  • the urine sample analysis reagent 11 (hereinafter also simply referred to as “reagent”) of the present embodiment is a reagent for detecting at least a column and red blood cells as a formed component in a urine sample.
  • the reagent of this embodiment contains at least one fluorescent dye selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3), and DiOC5 (3).
  • the reagent of this embodiment is the same as that described for the first reagent used in the urine sample analysis method of this embodiment.
  • the scope of the present invention includes at least one selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3) for detecting at least cylinders and red blood cells as tangible components in a urine sample. Also included is the use of reagents containing two fluorescent dyes.
  • FIG. 1 shows an example of the reagent 11 of this embodiment.
  • the reagent kit for urine sample analysis of the present embodiment is a reagent kit for detecting at least a column and red blood cells as a formed component in a urine sample.
  • This reagent kit includes a first reagent containing at least one fluorescent dye selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3), and a surfactant containing a surfactant as a dispersant. 2 reagents.
  • the first reagent and the second reagent included in the reagent kit are the same as those described for the first reagent and the second reagent used in the urine sample analysis method of the present embodiment.
  • the first reagent and the second reagent are housed in separate containers and a two-reagent type reagent kit including these is provided.
  • FIG. 2 shows an example of the reagent kit of this embodiment including the first reagent 22 accommodated in the container and the second reagent 33 accommodated in the container.
  • the scope of the present invention includes at least one selected from DiOC2 (3), DiOC3 (3), DiOC4 (3) and DiOC5 (3) for detecting at least cylinders and red blood cells as tangible components in a urine sample. Also included is the use of a reagent kit comprising a first reagent containing one fluorescent dye and a second reagent containing a surfactant as a dispersant.
  • Example 1 In Example 1, a dye capable of dyeing a cylinder and discriminating between the cylinder and a mucus thread by a difference in dyeing was searched for. In addition, discrimination
  • HEPES-OH 100 mM, pH 7
  • water filtered through a reverse osmosis membrane was used as a reagent for dilution.
  • the measurement sample was irradiated with light, and the forward scattered light intensity, the side scattered light intensity, the fluorescence intensity, and the integrated value of fluorescence were obtained.
  • a semiconductor laser having an excitation wavelength of 488 nm was used as a light source for the flow cytometer. From the fluorescence intensity and the integrated value of the fluorescence, the fluorescence intensity ratio and the fluorescence sum ratio with respect to the mucus thread of the cylinder were calculated. The results are shown in Table 2.
  • Example 2 In Example 2, the influence (hemolysis) on red blood cells by DioC2 (3), DioC3 (3), DioC4 (3), DioC5 (3), DioC6 (3) and DioC7 (3) was examined. The effect on red blood cells was evaluated based on the number of red blood cells in the measurement sample.
  • Red blood cell sample Human blood collected from healthy volunteers was diluted 1000 times with physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Factory) to prepare a red blood cell sample.
  • Reagents As staining reagents, the same staining solutions 1 to 6 as in Example 1 were used. The same buffer as in Example 1 was used as a dilution reagent.
  • Example 3 the clinical performance of the urine sample analysis method of the present embodiment using a flow cytometer was evaluated in comparison with the result of visual inspection.
  • Urine sample As urine samples, negative urine specimens (42 specimens) that were judged to have no column appeared by microscopic observation were used.
  • Reagent / staining reagent The same staining solution 2 (containing DioC3 (3)) as in Example 1 was used as a staining reagent.
  • -Dilution reagent Dilution liquids 1 and 2 having the following composition were prepared as dilution reagents.
  • water filtered through a reverse osmosis membrane was used as a solvent.
  • Diluent 1 HEPES-OH (100 mM, pH 7) and EDTA-2K (25 mM) (Chubu Crest Co., Ltd.)
  • Diluent 2 HEPES-OH (100 mM, pH 7), EDTA-2K (25 mM) and DTAB (10 ppm) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.)
  • the sample was measured using a flow cytometer UF-1000i (manufactured by Sysmex Corporation).
  • the specific steps of measurement with this flow cytometer are as follows. First, a urine sample (200 ⁇ L), a dilution reagent (580 ⁇ L), and each staining solution (20 ⁇ L) were mixed and reacted at 40 ° C. for 10 seconds to prepare a measurement sample. Then, the obtained measurement sample was irradiated with light, and the forward scattered light intensity, the side scattered light intensity, and the fluorescence intensity were obtained.
  • a semiconductor laser having an excitation wavelength of 488 nm was used as a light source for the flow cytometer.
  • a urine sample is processed with a staining reagent containing DioC3 (3) and a diluted solution, and the obtained measurement sample is measured with FCM to obtain a urine sample with a specificity of 70% or more. It was shown that it can be analyzed. In addition, the specificity was improved by treating the urine sample with a diluent containing the cationic surfactant DTAB as a dispersant. This is thought to be due to the reduction of contaminants similar to cylinders due to the action of DTAB.

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Abstract

　本発明は、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キットに関する。

Description

尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キット
　本発明は、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キットに関する。
　腎・尿路系における感染症、炎症性病変、変性病変、結石症、腫瘍などの疾患では、それぞれの疾患に応じて、尿中に種々の有形成分が出現する。有形成分としては、赤血球、円柱、白血球、上皮細胞、酵母様真菌、***などが挙げられる。尿中のこれらの成分を分析することは、腎・尿路系の疾患や異常部位の推定をする上で重要である。例えば、赤血球は、腎臓の糸球体から尿道に至る経路における出血の有無を判定するのに有用な尿中有形成分である。
　円柱は、Tamm-Horsfallムコタンパク質と尿中血漿タンパク質(主にアルブミン)との凝固沈殿物を基質とする固形成分であり、主に遠位尿細管及び集合管で形成される。この基質のみからなる円柱は硝子円柱と呼ばれるが、腎臓や尿細管の状態によっては硝子円柱に細胞などの種々の成分が封入され、さらに変性した円柱が生じることがある。そのため、円柱は、腎臓及び尿細管の病態や障害の程度を把握するのに有用な尿中有形成分である。
　円柱及び赤血球などの尿中有形成分の分析では、尿を遠心分離して得られる沈殿物(有形成分)を顕微鏡で観察することによる目視検査が広く行われている。また、近年ではフローサイトメータを用いた自動分析法も開発されている。例えば、特許文献１～４には、希釈用試薬及び尿中有形成分の染色のために、シアニン系色素の3,3'-ジヘキシル-2, 2'-オキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC6(3))を含む染色用試薬で処理した尿試料をフローサイトメータで測定することにより、尿中有形成分を分析する方法が記載されている。
　一方、尿中には、形状が円柱に極めて類似した成分である粘液糸や、細菌や塩類など凝集体も存在する。尿試料中の円柱の数は臨床的に重要な情報であるので、円柱の検出の際には、円柱と、粘液糸などの円柱に類似した成分とを弁別することが重要となる。
特開平１１－２３４４６号公報 特開平９－３２９５９６号公報 特開平８－２４０５２０号公報 特開平８－１７０９６０号公報
　本発明は、従来技術に比べて、赤血球を溶血させずに精度良く検出することができ、さらに円柱を粘液糸などの夾雑物と区別して精度良く検出することができる尿試料分析方法を提供することを目的とする。また、本発明は、その方法に好適に用いられる尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キットを提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討の結果、尿中有形成分を染色するための色素として、特定のシアニン系蛍光色素を用いることにより、赤血球を実質的に損傷させずに検出し、且つ円柱と粘液糸とを区別して検出することができることを見出して、本発明を完成した。
　よって、本発明は、尿試料と、3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC2(3))、3,3-ジプロピルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC3(3))、3,3'-ジブチルオキサシアニンアイオダイド(DiOC4(3))及び3,3-ジペンチルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC5(3))から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程とを含む、尿試料分析方法を提供する。
　また、本発明は、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬を提供する。
　さらに、本発明は、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬と、分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬とを含む、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬キットを提供する。
　本発明によれば、赤血球を実質的に損傷させずに検出し、且つ円柱及び赤血球を精度良く検出することを可能にする。
尿試料分析用試薬の一例を示す図である。 尿試料分析用試薬キットの一例を示す図である。
[尿試料分析方法]
　本実施形態の尿試料分析方法(以下、単に「方法」ともいう)は、尿中有形成分のうち赤血球、円柱、結晶成分及び粘液糸を分析対象とし、特に円柱及び赤血球の分析に好適である。
　円柱には様々な種類があり、上記の基質のみからなる硝子円柱、尿細管上皮細胞が封入された上皮円柱、赤血球が封入された赤血球円柱、白血球が封入された白血球円柱、脂肪顆粒が封入された脂肪円柱、顆粒成分(主に変性した上皮細胞)が封入された顆粒円柱、円柱の全体又は一部が均質で蝋のように変性した蝋様円柱が知られている。本実施形態において、円柱の種類は特に限定されない。
　本実施形態において、赤血球の種類は特に限定されず、正常赤血球及び異常赤血球のいずれであってもよい。
　本実施形態の方法では、まず、尿試料と、3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC2(3))、3,3-ジプロピルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC3(3))、3,3'-ジブチルオキサシアニンアイオダイド(DiOC4(3))及び3,3-ジペンチルオキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC5(3))から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬とを混合して測定試料を調製する工程が行われる。
　本実施形態において、尿試料は、尿中有形成分を含む液体試料であれば特に限定されないが、好ましくは被験者から採取した尿である。なお、被験者から採取した尿を試料として用いる場合、時間経過により尿中有形成分が劣化するおそれがあるので、採取後24時間以内、特に３～12時間以内に尿試料を本実施形態の方法に用いることが望ましい。
　本実施形態の方法に用いられる第１試薬は、少なくとも円柱及び赤血球を含む尿中有形成分を染色するための試薬である。第１試薬に用いうる蛍光色素のDiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)は、それぞれNK-85、NK-2605、NK-5587及びNK-2453とも呼ばれ、いずれも株式会社林原生物化学研究所から入手可能である。従来の分析方法では、尿中有形成分の染色のために、シアニン系色素の3,3'-ジヘキシル-2, 2'-オキサカルボシアニンアイオダイド(DiOC6(3))を含む染色用試薬が用いられている。本発明者らは、このDiOC6(3)を含む染色用試薬で尿試料を処理するよりも、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む染色用試薬で尿試料を処理する方が、試料中の赤血球の形態がより保持でき、赤血球を正確に検出できることを見出した。また、本実施形態の方法では、これらの色素により、赤血球の膜成分及び円柱は良好に染色されるが、粘液糸はほとんど染色されない。これらの色素の構造式を、以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
　第１試薬中の蛍光色素は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。第１試薬中の蛍光色素の濃度は、調製した測定試料中において、少なくとも円柱及び赤血球を適切に染色することができるような終濃度で該蛍光色素が含まれるように設定することが望ましい。測定試料中の終濃度は、上記の蛍光色素の種類に応じて適宜設定される。例えば、蛍光色素としてDiOC3(3)を用いる場合、測定試料中の終濃度は0.1μg/mL以上200μg/mL以下、好ましくは１μg/mL以上20μg/mL以下である。
　第１試薬は、上記の蛍光色素を適切な溶媒に溶解させることにより得ることができる。溶媒は、上記の蛍光色素を溶解させることができる水性溶媒であれば特に限定されず、例えば、水、水溶性有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。それらの中でも、水溶性有機溶媒が特に好ましい。水溶性有機溶媒としては、例えば、炭素数１～３の低級アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド(DMSO)などが挙げられる。
　本実施形態では、必要に応じて、調製工程において、尿試料を希釈するための希釈用試薬をさらに混合してもよい。そのような希釈用試薬としては、水又は緩衝液が好ましい。緩衝液は、pHを５以上９以下、好ましくは6.5以上8.6以下、より好ましくは7.0以上7.8以下の範囲にて緩衝作用を有する緩衝剤の水溶液であれば特に限定されない。そのような緩衝剤としては、例えば、Tris、MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPS、MOPSO、BES、TES、HEPES、DIPSO、TAPSO、POPSO、HEPPSO、EPPS、Tricine、Bicine、TAPSなどのグッド緩衝剤などが挙げられる。
　本実施形態では、調製工程において、分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬をさらに混合することが好ましい。このような第２試薬をさらに混合することにより、円柱の正確な検出を阻害する細菌や塩類などの夾雑物の凝集体を分散させ、除去することができる。
　第２試薬は、界面活性剤を適切な溶媒に溶解させることにより得ることができる。溶媒は、界面活性剤を溶解させることができれば特に限定されず、例えば、水、水溶性有機溶媒、及びこれらの混合物が挙げられる。水溶性有機溶媒としては、例えば、炭素数１～３の低級アルコール、エチレングリコール、DMSOなどが挙げられる。本実施形態においては、水が特に好ましい。なお、第２試薬は、上記の希釈用試薬に界面活性剤を溶解させることにより調製してもよい。
　第２試薬に用いられる界面活性剤の種類は特に限定されず、カチオン性界面活性剤、ノニオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤及び両性界面活性剤から適宜選択することができる。第２試薬に含まれる界面活性剤は１種類であってもよいし、２種類以上であってもよい。２種類以上の界面活性剤を含む場合、その組み合わせは任意に選択することができる。
　本実施形態においては、カチオン性界面活性剤として、第四級アンモニウム塩型界面活性剤及びピリジニウム塩型界面活性剤から選択される少なくとも１種を用いることができる。第四級アンモニウム塩型界面活性剤としては、例えば、以下の式(I)で表される、全炭素数が９～30の界面活性剤が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　上記の式(I)中、Ｒ1は炭素数６～18のアルキル基またはアルケニル基であり；Ｒ2及びＲ3は互いに同一又は異なって、炭素数１～４のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｒ4は炭素数１～４のアルキル基若しくはアルケニル基、又はベンジル基であり；Ｘ-はハロゲンイオンである。
　上記の式(I)中、Ｒ1としては、炭素数が６、８、10、12及び14のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ1としては、オクチル基、デシル基及びドデシル基が挙げられる。Ｒ2及びＲ3としては、メチル基、エチル基及びプロピル基が好ましい。Ｒ4としては、メチル基、エチル基及びプロピル基が好ましい。
　ピリジニウム塩型界面活性剤としては、例えば、以下の式(II)で表される界面活性剤が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　上記の式(II)中、Ｒ1は炭素数６～18のアルキル基またはアルケニル基であり；Ｘ-はハロゲンイオンである。
　上記の式(II)中、Ｒ1としては、炭素数が６、８、10、12及び14のアルキル基またはアルケニル基が好ましく、特に直鎖のアルキル基が好ましい。より具体的なＲ1としてはオクチル基、デシル基及びドデシル基が挙げられる。
　上記のカチオン性界面活性剤の具体例としては、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロライド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、オクチルトリメチルアンモニウムクロライド、ミリスチルトリメチルアンモニウムブロミド、ミリスチルトリメチルアンモニウムクロライド、ドデシルピリジニウムクロライドなどが挙げられる。それらの中でもドデシルトリメチルアンモニウムブロミド(DTAB)が特に好ましい。
　本実施形態においては、ノニオン性界面活性剤として、以下の式(III)で表されるポリオキシエチレン系ノニオン界面活性剤が好適に用いられる。
Ｒ1－Ｒ2－(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n－Ｈ　　(III)
　上記の式(III)中、Ｒ1は炭素数８～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｒ2は－Ｏ－、－ＣＯＯ－または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
 であり；ｎは10～50の整数である。
　上記のノニオン性界面活性剤の具体例としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンステロール、ポリオキシエチレンヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンアルキルアミン、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテルなどが挙げられる。
　本実施形態においては、アニオン性界面活性剤として、カルボン酸塩型界面活性剤、スルホン酸塩型界面活性剤及び硫酸エステル塩型界面活性剤から選択される少なくとも１種を用いることができる。カルボン酸塩型界面活性剤としては、例えば、以下の式(IV)で表される界面活性剤が挙げられる。
Ｒ1－ＣＯＯ-　Ｙ+　　(IV)
　上記の式(IV)中、Ｒ1は炭素数８～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
　上記の式(IV)中、Ｒ1としては炭素数が12～18の直鎖のアルキル基が好ましい。上記のカルボン酸塩型界面活性剤は、当該技術においてはセッケンとして知られ、例えば、ラウリン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　スルホン酸塩型界面活性剤としては、例えば、以下の式(V)で表される界面活性剤が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記の式(V)中、ｍ及びｎは０以上の整数であって、ｍとｎの和が８～25であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
　上記の式(V)中、ｍとｎの和が９～18であることが好ましい。上記の式(V)で表されるスルホン酸塩型界面活性剤は、当該技術においてはアルキルベンゼンスルホン酸塩として知られ、例えば、直鎖デシルベンゼン硫酸ナトリウム、直鎖ウンデシルベンゼン硫酸ナトリウム、直鎖ドデシルベンゼン硫酸ナトリウム、直鎖トリデシルベンゼン硫酸ナトリウム及び直鎖テトラデシルベンゼン硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
　また、スルホン酸塩型界面活性剤として、以下の式(VI)及び(VII)のそれぞれで表される界面活性剤の混合物を用いてもよい。
ＣＨ3(ＣＨ2)j－ＣＨ＝ＣＨ－(ＣＨ2)k－ＳＯ3 -　Ｙ+　　(VI)
　上記の式(VI)中、ｊ及びｋは０以上の整数であって、ｊとｋの和が10～25の整数であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
ＣＨ3(ＣＨ2)m－ＣＨ(－ＯＨ)－(ＣＨ2)n－ＳＯ3 -　Ｙ+　　(VII)
　上記の式(VII)中、ｍ及びｎは０以上の整数であって、ｍとｎの和が10～25の整数であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
　上記の式(VI)中、ｊとｋの和が11～15の整数であって、上記の式(VII)中、ｍとｎの和が12～16の整数であることが好ましい。上記の式(VI)及び(VII)でそれぞれ表される界面活性剤は、当該技術においてはα－オレフィンスルホン酸塩として知られ、例えば、１－テトラデセンスルホン酸ナトリウム、ヘキサデセンスルホン酸ナトリウム、３－ヒドロキシヘキサデシル－１－スルホン酸ナトリウム、オクタデセン－１－スルホン酸ナトリウム及び３－ヒドロキシ－１－オクタデカンスルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。
　硫酸エステル塩型界面活性剤としては、例えば、以下の式(VIII)で表される界面活性剤が挙げられる。
Ｒ1－Ｏ－ＳＯ3 -　　Ｙ+　　(VIII)
　上記の式(VIII)中、Ｒ1は炭素数10～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
　上記の式(VIII)中、Ｒ1としては、炭素数が10～18の直鎖のアルキル基が好ましく、特に炭素数が12の直鎖のアルキル基が好ましい。上記の式(VIII)で表される硫酸エステル塩型界面活性剤は、当該技術においては高級アルコール硫酸エステル塩として知られ、例えば、デシル硫酸ナトリウム、ウンデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、トリデシル硫酸ナトリウム及びテトラデシル硫酸ナトリウムなどが挙げられる。
　また、硫酸エステル塩型界面活性剤として、以下の式(IX)で表される界面活性剤を用いてもよい。
Ｒ1－Ｏ－(ＣＨ2ＣＨ2Ｏ)n－ＳＯ3 -　Ｙ+　　(IX)
　上記の式(IX)中、Ｒ1は炭素数10～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；ｎは１～８の整数であり；Ｙ+はアルカリ金属イオン又はアンモニウムイオンである。
　上記の式(IX)中、Ｒ1としては、炭素数が12～18の直鎖のアルキル基が好ましく、特に炭素数が12の直鎖のアルキル基が好ましい。上記の式(IX)で表される硫酸エステル塩型界面活性剤は、当該技術においてはポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩として知られ、例えば、ドデシルエーテル硫酸エステルナトリウムなどが挙げられる。
　また、硫酸エステル塩型界面活性剤として、以下の式(X)で表される界面活性剤を用いてもよい。
Ｒ1－ＣＨ(－ＳＯ3 -)－ＣＯＯＣＨ3　Ｙ+　　(X)
　上記の式(X)中、Ｒ1は炭素数８～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基であり；Ｙ+はアルカリ金属イオンである。
　上記の式(X)中、Ｒ1としては、炭素数が10～18の直鎖のアルキル基が好ましく、特に炭素数が12の直鎖のアルキル基が好ましい。上記の式(X)で表される硫酸エステル塩型界面活性剤は、当該技術においてはα－スルホ脂肪酸エステルとして知られ、例えば、２－スルホテトラデカン酸－１－メチルエステルナトリウム塩及び２－スルホヘキサデカン酸－１－メチルエステルナトリウム塩などが挙げられる。
　本実施形態において、両性界面活性剤として、アミノ酸型両性界面活性剤及びベタイン型両性界面活性剤から選択される少なくとも１種を用いることができる。アミノ酸型両性界面活性剤としては、例えば以下の式(XI)で表される界面活性剤が挙げられる。
Ｒ1－Ｎ+Ｈ2－ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ-　　(XI)
　上記の式(XI)中、Ｒ1は炭素数８～25のアルキル基、アルケニル基又はアルキニル基である。
　上記の式(XI)中、Ｒ1としては、炭素数が12～18の直鎖のアルキル基が好ましい。上記のアミノ酸型両性界面活性剤としては、例えば、３－(ドデシルアミノ)プロパン酸及び３－(テトラデカ－１－イルアミノ)プロパン酸などが挙げられる。
　ベタイン型両性界面活性剤としては、例えば、以下の式(XII)で表される界面活性剤が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記の式(XII)中、Ｒ1は炭素数６～18のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｒ2は炭素数１～４のアルキル基又はアルケニル基であり；Ｒ3は炭素数１～４のアルキル基若しくはアルケニル基、又はベンジル基であり；ｎは１又は２である。
　ベタイン型両性界面活性剤としては、例えば、ドデシルジメチルアミノ酢酸ベタイン及びステアリルジメチルアミノ酢酸ベタインなどが挙げられる。
　第２試薬中の界面活性剤の濃度は、上記のようにして調製した測定試料中において、赤血球を溶血させず、且つ夾雑物の凝集体を分散させることができるような終濃度で該界面活性剤が含まれるように設定することが望ましい。測定試料中の界面活性剤の終濃度は適宜設定できるが、好ましくは３ppm以上30 ppm以下である。
　本実施形態においては、pH変化による赤血球の溶血を防止するために、第２試薬のpHを５以上９以下、好ましくは6.5以上8.6以下、より好ましくは7.0以上7.8以下の範囲とすることができる。よって、第２試薬は、pHを一定に保つために緩衝剤を含んでいてもよい。そのような緩衝剤としては、上記の希釈用試薬に用いた緩衝剤と同様である。
　尿試料には、リン酸アンモニウム、リン酸マグネシウム、炭酸カルシウムなどの無晶性塩類が含まれている場合がある。本実施形態においては、これらの無晶性塩類の影響を低減させるために、第２試薬はキレート剤を含んでいてもよい。キレート剤は、無晶性塩類を除去可能なキレート剤であれば特に限定されず、当該技術において公知の脱カルシウム剤、脱マグネシウム剤などから適宜選択することができる。具体的には、エチレンジアミン四酢酸塩(EDTA塩)、CyDTA、DHEG、DPTA-OH、EDDA、EDDP、GEDTA、HDTA、HIDA、Methyl-EDTA、NTA、NTP、NTPO、EDDPOなどが挙げられ、それらの中でもEDTA塩が特に好ましい。
　第２試薬中のキレート剤の濃度は、上記のようにして調製した測定試料中において、無晶性塩類の影響を低減できるような終濃度で該キレート剤が含まれるように設定することが望ましい。測定試料中の終濃度は、上記のキレート剤の種類に応じて適宜設定される。例えば、キレート剤としてEDTA２カリウム(EDTA-2K)を用いる場合、測定試料中の終濃度は0.1 mM以上500 mM以下、好ましくは１mM以上100 mM以下である。
　尿中に酵母様真菌及び赤血球が存在する場合、フローサイトメータによる分析では、酵母様真菌と赤血球との分画があまり良好ではない場合があることが知られている。したがって、第２試薬は、酵母様真菌の細胞膜を損傷させる物質を含んでいてもよい。そのような物質としては、２－フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、フェネチルアルコール、１－フェノキシ－２－プロパノール、フェノール、酢酸フェニル、ベンゾチアゾールなどが挙げられ、それらの中でも２－フェノキシエタノールが特に好ましい。このような物質を含む第２試薬を用いることにより、酵母様真菌の染色性が変化して、赤血球と酵母様真菌との分画が改善される。
　尿の浸透圧は、50～1300 mOsm/kgと広範囲に分布していることが知られているが、測定試料において浸透圧が低すぎるか又は高すぎる場合、赤血球が損傷するおそれがある。測定試料における適切な浸透圧は100 mOsm/kg以上600 mOsm/kg以下、好ましくは150 mOsm/kg以上500 mOsm/kg以下である。尿の浸透圧が高すぎる場合は、希釈用試薬又は第２試薬で希釈することにより浸透圧を適宜調節することができる。反対に、尿の浸透圧が低すぎる場合は、第２試薬は浸透圧補償剤を含んでいてもよい。そのような浸透圧補償剤としては、無機塩類、有機塩類、糖類などが挙げられる。無機塩類としては、塩化ナトリウム、臭化ナトリウムなどが挙げられる。有機塩類としては、プロピオン酸ナトリウム、プロピオン酸カリウム、プロピオン酸アンモニウムシュウ酸塩などが挙げられる。糖類としては、ソルビトール、グルコース、マンニトールなどが挙げられる。
　本実施形態においては、尿試料と、第１試薬と、第２試薬とを混合する順序は特に限定されず、これらを同時に混合することもできる。好ましくは、尿試料と第２試薬とを先に混合し、ここへ第１試薬をさらに混合する。あるいは、第１試薬と第２試薬とを先に混合し、ここへ尿試料をさらに混合してもよい。
　本実施形態において、尿試料と、第１試薬と、第２試薬との混合割合は特に限定されず、各試薬に含まれる成分濃度に応じて適宜決定すればよい。例えば、尿試料と第１試薬との混合割合は、体積比で１：0.01～１の範囲から決定することができる。また、尿試料と第２試薬との混合割合は、体積比で１：0.5～10の範囲から決定することができる。なお、尿試料の量は、第１試薬と第２試薬に応じて適宜決定すればよい。尿試料の量は測定時間が長くなり過ぎないようにする観点から1000μL以下が好ましい。尿試料の量は10～1000μL程度で測定に十分である。
　調製工程における温度条件は、10～60℃、好ましくは35～45℃である。各試薬を予めこれらの温度となるように加温していてもよい。また、尿試料と、第１試薬及び／又は第２試薬とを混合した後、１秒～５分間、好ましくは５～60秒間インキュベーションしてもよい。
　本実施形態の方法では、上記の調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程が行われる。
　得られた測定試料においては、尿中有形成分、特に円柱及び赤血球が、上記の蛍光色素により染色されている。よって、蛍光顕微鏡を用いて、測定試料中の各有形成分の形状及び染色の程度などを観察することにより、これらの有形成分を検出することができる。
　好ましい実施形態においては、上記の検出工程の前に、測定試料に含まれる尿中有形成分に光を照射して光学的情報を取得する工程をさらに行う。この光学的情報の取得工程は、フローサイトメータにより行われることが望ましい。フローサイトメータによる測定では、染色された尿中有形成分がフローセルを通過する際に該有形成分に光を照射することにより、該有形成分から発せられるシグナルとして光学的情報を得ることができる。そのような光学的情報としては、散乱光情報および蛍光情報が好ましい。
　散乱光情報は、一般に市販されるフローサイトメータで測定できる散乱光の情報であれば特に限定されず、例えば、前方散乱光(例えば、受光角度０～20度付近)や側方散乱光(受光角度90度付近)などの散乱光の強度及び波形情報などが挙げられる。より具体的には、散乱光情報として、散乱光強度、散乱光パルス幅及び散乱光積分値などが挙げられる。当該技術においては、側方散乱光は、細胞の核や顆粒などの内部情報を反映し、前方散乱光は、細胞の大きさの情報を反映することが知られている。実施形態においては、前方散乱光の情報を用いることが好ましい。
　蛍光情報は、適当な波長の励起光を染色された尿中有形成分に照射して、励起された蛍光を測定して得られる情報であれば特に限定されず、例えば、蛍光の強度及び波形情報が挙げられる。より具体的には、蛍光情報として、蛍光強度、蛍光パルス幅及び蛍光積分値などが挙げられる。なお、蛍光は、第１試薬に含まれる蛍光色素によって染色された有形成分内の核酸などから発せられる。また、受光波長は、第１試薬に含まれる蛍光色素に応じて適宜選択することができる。
　本実施形態においては、フローサイトメータの光源は特に限定されず、蛍光色素の励起に好適な波長の光源を適宜選択することができる。例えば、赤色半導体レーザ、青色半導体レーザ、アルゴンレーザ、He-Neレーザ、水銀アークランプなどが使用される。特に半導体レーザは、気体レーザに比べて非常に安価であるので好適である。
　本実施形態の方法において上記の取得工程を行う場合、検出工程では、該取得工程で得られた光学的情報に基づいて、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する。なお、「検出」には、測定試料中に尿中有形成分の存在を見出すことだけではなく、尿中有形成分を分類及び計数することも含まれる。
　本実施形態において、尿中有形成分の検出は、散乱光情報と蛍光情報とを二軸とするスキャッタグラムを作成し、得られたスキャッタグラムを適当な解析ソフトを用いて解析することにより行われることが好ましい。例えば、Ｘ軸を蛍光強度とし、Ｙ軸を前方散乱光強度としてスキャッタグラムを描いた場合、各尿中有形成分の粒子サイズ及び染色性(核酸含有量)に応じて、それぞれの集団(クラスター)がスキャッタグラム上に出現する。本実施形態の方法においては、少なくとも円柱及び赤血球を、それぞれ異なる領域に出現する２種類の集団として検出することができる。また、解析ソフトによって、スキャッタグラム上にて各集団を囲むウィンドウを設け、各ウィンドウ中の粒子数を計数することができる。
[尿試料分析用試薬]
　本実施形態の尿試料分析用試薬１１(以下、単に「試薬」ともいう)は、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための試薬である。本実施形態の試薬は、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む。なお、本実施形態の試薬については、本実施形態の尿試料分析方法に用いた第１試薬について述べたことと同じである。
　本発明の範囲には、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む試薬の使用も含まれる。図１に、本実施形態の試薬１１の一例を示した。
[尿試料分析用試薬キット]
　本実施形態の尿試料分析用試薬キット(以下、単に「試薬キット」ともいう)は、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための試薬キットである。この試薬キットは、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬と、分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬とを含む。
　試薬キットに含まれる第１試薬及び第２試薬については、本実施形態の尿試料分析方法に用いた第１試薬及び第２試薬について述べたことと同じである。
　本実施形態においては、第１試薬と第２試薬とを別々の容器に収容し、これらを備えた２試薬型の試薬キットとすることが好ましい。図２に、容器に収容された第１試薬２２及び容器に収容された第２試薬３３を含む本実施形態の試薬キットの一例を示した。
　本発明の範囲には、尿試料中の有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための、DiOC2(3)、DiOC3(3)、DiOC4(3)及びDiOC5(3)から選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬と、分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬とを含む試薬キットの使用も含まれる。
　以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
　実施例１では、円柱を染色可能であって、且つ円柱と粘液糸とを染色の差により判別可能な色素を探索した。なお、円柱と粘液糸との判別は、試料を蛍光顕微鏡下で観察することにより行った。また、フローサイトメータによる測定も行った。
(１)尿試料
　尿試料として、円柱及び粘液糸を含む尿を用いた。
(２)試薬
・染色用試薬
　染色用試薬として、表１に示される各色素を含む染色液１～２９を調製した。なお、これらの染色液はいずれも、色素を１mg/mLの濃度となるようにエチレングリコール(ナカライテスク株式会社)に溶解して調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
・希釈用試薬
　希釈用試薬として、HEPES-OH(100 mM、pH7)(株式会社同仁化学研究所)を用いた。なお、溶媒には、逆浸透膜で濾過した水を用いた。
(３)蛍光顕微鏡による観察及び結果
　尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、各染色液(20μL)とを混合し、40℃にて１分間反応させ測定試料を調製した。そして、得られた測定試料中の円柱及び粘液糸を蛍光顕微鏡BX51(オリンパス株式会社製)により観察した。観察の結果、上記の29種の色素のうち、円柱を染色可能であって、且つ円柱と粘液糸とを染色の差により判別可能な色素は、DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3)及びDioC7(3)の６種のみであった。これらの色素を用いた場合、粘液糸よりも円柱が良好に染色され、その結果、円柱と粘液糸との判別が可能であった。
(４)フローサイトメータによる測定及び結果
　蛍光顕微鏡による観察結果を受けて、染色液１～６のそれぞれで染色した試料について、フローサイトメータによっても円柱と粘液糸とを弁別可能であるかを検討した。試料の測定は、フローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、各染色液(20μL)とを混合し、40℃にて60秒間反応させて測定試料を調製した。そして、測定試料に光を照射して、前方散乱光強度、側方散乱光強度、蛍光強度及び蛍光の積分値を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。蛍光強度及び蛍光の積分値から、円柱の粘液糸に対する蛍光強度比及び蛍光総和比を算出した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表２より、染色液１～６のいずれを用いた場合でも、蛍光強度比及び蛍光総和比はどちらも1.2以上であった。特に、染色液１～４を用いた場合に、蛍光強度比及び蛍光総和比が高いことが分かった。この結果より、DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)及びDioC5(3)は、フローサイトメータによる円柱と粘液糸との弁別に適していることが示された。
実施例２
　実施例２では、DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)、DioC5(3)、DioC6(3)及びDioC7(3)による赤血球への影響(溶血)を検討した。なお、赤血球への影響は、測定試料中の赤血球数に基づいて評価した。
(１)赤血球試料
　健常ボランティアから採取したヒト血液を生理食塩水(大塚製薬工場)で1000倍に希釈して、赤血球試料を調製した。
(２)試薬
　染色用試薬として、実施例１と同じ染色液１～６を用いた。希釈用試薬として、実施例１と同じ緩衝液を用いた。
(３)測定及び結果
　試料の測定はフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。なお、測定試料は実施例１と同様にして調製した。そして、測定試料に光を照射して、蛍光強度及び前方散乱光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。そして、これらの測定値に基づいて、測定試料中の赤血球数をカウントした。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表３から明らかなように、染色液５及び６を用いた場合では、染色液１～４を用いた場合に比べて、測定試料中の赤血球の数が顕著に減少していた。これは、染色用試薬中のDioC6(3)及びDioC7(3)の影響により赤血球が溶血したことを示す。したがって、DioC6(3)及びDioC7(3)を尿試料の染色に用いた場合、該試料中の赤血球を正確に計数することは難しい。これに対して、DioC2(3)、DioC3(3)、DioC4(3)及びDioC5(3)は、DioC6(3)及びDioC7(3)に比べて、赤血球に及ぼす影響が極めて小さく、尿試料中の赤血球の測定に適していることがわかる。
実施例３
　実施例３では、フローサイトメータを用いる本実施形態の尿試料分析方法の臨床性能を、目視検査の結果と比較して評価した。
(１)尿試料
　尿試料として、顕微鏡観察により円柱が出現していないと判断された陰性尿検体(42検体)を用いた。
(２)試薬
・染色用試薬
　染色用試薬として、実施例１と同じ染色液２(DioC3(3)含有)を用いた。
・希釈用試薬
　希釈用試薬として、下記の組成の希釈液１及び２を調製した。なお、希釈液１及び２には、逆浸透膜で濾過した水を溶媒として用いた。
　希釈液１：HEPES-OH(100 mM、pH7)及びEDTA-2K(25 mM)(中部キレスト株式会社)
　希釈液２：HEPES-OH(100 mM、pH7)、EDTA-2K(25 mM)及びDTAB(10 ppm)(東京化成工業株式会社)
(３)測定及び結果
　試料の測定はフローサイトメータUF-1000i(シスメックス株式会社製)を用いて行った。このフローサイトメータによる測定の具体的な工程は、次のとおりである。まず、尿試料(200μL)と、希釈用試薬(580μL)と、各染色液(20μL)とを混合し、40℃にて10秒間反応させて測定試料を調製した。そして、得られた測定試料に光を照射して、前方散乱光強度、側方散乱光強度及び蛍光強度を取得した。なお、フローサイトメータの光源として、励起波長488 nmの半導体レーザを用いた。これらの測定値に基づいて測定試料中の円柱の数を算出し、フローサイトメータ(FCM)により陰性と判断された検体数を求めた。また、目視(顕微鏡観察)による陰性検体数をリファレンスとして、FCMによる円柱の分析の特異度を求めた。結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　表４より、DioC3(3)を含む染色用試薬と、希釈液とを用いて尿試料を処理し、得られた測定試料をFCMで測定することにより、70％以上の特異度で尿試料を分析できることが示された。また、分散剤としてカチオン性界面活性剤のDTABを含む希釈液で尿試料を処理することにより、特異度が向上した。これは、DTABの作用により、円柱に類似した夾雑物が低減されたことによると考えられる。
　本出願は、２０１４年２月２８日に出願された日本国特許出願特願２０１４－３９２８１号に関し、これらの特許請求の範囲、明細書、図面及び要約書の全ては本明細書中に参照として組み込まれる。
１１　　尿試料分析用試薬
２２　　第１試薬
３３　　第２試薬

Claims (14)

  1. 　尿試料と、3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3-ジプロピルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3'-ジブチルオキサシアニンアイオダイド及び3,3-ジペンチルオキサカルボシアニンアイオダイドから選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬とを混合して測定試料を調製する工程と、
    　調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程と
    を含む、尿試料分析方法。
  2. 　調製工程において、分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬をさらに混合する請求項１に記載の尿試料分析方法。
  3. 　界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤から選択される少なくとも１つである請求項２に記載の尿試料分析方法。
  4. 　界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドである請求項２に記載の尿試料分析方法。
  5. 　第２試薬が、キレート剤をさらに含む請求項２に記載の尿試料分析方法。
  6. 　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸塩(EDTA塩)である請求項５に記載の尿試料分析方法。
  7. 　調製工程で得られた測定試料に含まれる尿中有形成分に光を照射して光学的情報を取得する工程をさらに含み、
    　検出工程が、取得した光学的情報に基づいて、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出する工程である請求項１に記載の尿試料分析方法。
  8. 　光学的情報が、散乱光情報および蛍光情報である請求項７に記載の尿試料分析方法。
  9. 　3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3-ジプロピルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3'-ジブチルオキサシアニンアイオダイド及び3,3-ジペンチルオキサカルボシアニンアイオダイドから選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬。
  10. 　3,3'-ジエチルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3-ジプロピルオキサカルボシアニンアイオダイド、3,3'-ジブチルオキサシアニンアイオダイド及び3,3-ジペンチルオキサカルボシアニンアイオダイドから選択される少なくとも１つの蛍光色素を含む第１試薬と、
    　分散剤としての界面活性剤を含む第２試薬と
    を含む、尿中有形成分として少なくとも円柱及び赤血球を検出するための尿試料分析用試薬キット。
  11. 　界面活性剤が、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤及びノニオン性界面活性剤から選択される少なくとも１つである請求項１０に記載の尿試料分析用試薬キット。
  12. 　界面活性剤が、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミドである請求項１０に記載の尿試料分析用試薬キット。
  13. 　第２試薬が、キレート剤をさらに含む請求項１０に記載の尿試料分析用試薬キット。
  14. 　キレート剤が、エチレンジアミン四酢酸塩(EDTA塩)である請求項１３に記載の尿試料分析用試薬キット。
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