CN115791717A - 基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂及其应用，涉及生物医学诊断技术领域，该检测试剂包括高价金属离子，高价金属离子被还原性盐还原为低价金属离子，基于QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号采用二元可视化方式定量还原性盐。本发明基于还原性盐的强还原性，可将高价金属离子迅速还原为低价金属离子，并结合钙黄绿素和QDs对高价金属离子/低价金属离子的竞争性识别现象，成功构建了均相双荧光和二元可视化分析***，用于诊断含有还原性盐的相关病症，其具有操作简单、快速、高灵敏、低成本、不需使用仪器、能实现可视化分析和POCT的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学诊断技术领域，尤其是涉及一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂及其应用。
背景技术
尿石症是最为常见的疾病之一，症状遍及肾盂、输尿管、膀胱和尿道。其中，肾结石由于发病率高(约5％-10％)、5年内复发率高、费用昂贵，一直以来受到广泛关注。高草酸尿石症是最常见的结石类型(约85％)，由不溶性草酸钙组成，会增加患慢性肾病或肾功能衰竭的风险。因此，检测草酸盐的含量对于早期诊断和监测结石的形成非常重要。
现有的草酸钙尿石症诊断方法主要有临床的影像学检查(如：超声、CT等)、色谱仪器，以及基于比色法、荧光法、电化学法、高效液相色谱法、离子色谱法等草酸盐的定量检测方法。
就现有的技术而言：①临床影像学检查无法区分结石的种类，如草酸盐、尿酸、磷酸盐等结石类型，且价格昂贵；②基于色谱等草酸盐的分析方法需要相对昂贵的仪器、专业人员或繁琐的操作步骤；③难以实现高灵敏的即时检验(point-of-care testing，POCT)，以及可视化读取：④成本较高，难以在基层医院推广以及用于患者自我监测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，以解决现有技术中采用临床影像学检查、基于色谱等草酸盐的分析方法等存在的缺陷。
本发明的目的之二在于提供一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂的应用。
为了实现上述目的之一，本发明提供了一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，所述试剂包括高价金属离子，所述高价金属离子被还原性盐还原为低价金属离子，所述高价金属离子和其对应的所述低价金属离子选择性调控QDs和钙黄绿素的荧光信号，所述高价金属离子和其对应的所述低价金属离子有效改变QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号采用二元可视化方式定量所述还原性盐。
根据一种可选实施方式，所述低价金属离子对QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号的淬灭程度大于所述高价金属离子。
根据一种可选实施方式，所述二元可视化包括颜色可视化和距离可视化。
根据一种可选实施方式，所述颜色可视化为钙黄绿素和QDs在紫外光下照射下分别呈现绿色和红色。
根据一种可选实施方式，所述距离可视化为采用喷墨打印技术制备双色试纸条，通过读取试纸条上移动距离实现可视化读取。
根据一种可选实施方式，所述还原性盐为草酸盐或者具有强还原性的病原标志物。
根据一种可选实施方式，所述高价金属离子为Cu2+，所述低价金属离子为Cu+。
根据一种可选实施方式，所述高价金属离子为Fe3+，所述低价金属离子为Fe2+。
根据一种可选实施方式，所述QDs和所述钙黄绿素共同存在时的激发波长为486nm。
为了实现上述目的之一，本发明提供了一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂的应用，所述应用包括将上述任一所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂应用于尿石症中草酸盐的检测。
本发明提供的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂及其应用，具有以下技术效果：
该种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，该检测试剂包括高价金属离子，还原性盐将高价金属离子还原为低价金属离子，高价金属离子和其对应的低价金属离子选择性调控QDs和钙黄绿素的荧光信号，高价金属离子和其对应的低价金属离子有效改变QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号采用二元可视化方式定量还原性盐，本发明基于还原性盐的强还原性，可将高价金属离子迅速还原为低价金属离子，并结合钙黄绿素和QDs对高价金属离子/低价金属离子的竞争性识别现象，成功构建了均相双荧光和二元可视化分析***，用于诊断含有还原性盐的相关病症，其具有操作简单、快速、高灵敏、低成本、不需使用仪器、能实现可视化分析和POCT的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是基于竞争选择性识别和二元可视化的草酸盐分析策略原理图；
图2是钙黄绿素和QDs的Cu2+/Cu+竞争性识别现象验证图；
图3是草酸盐分析条件优化；
图4是草酸盐分析性能。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下面本发明以还原性盐为草酸盐，高价金属离子为Cu2+，低价金属离子为Cu+，对本发明的技术方案进行详细的说明。
本发明的原理分析如下：
如图1所示，为本发明描述的基于竞争选择性识别和二元可视化的草酸盐分析策略原理，草酸作为一种常见于草酸钙尿石症患者尿液中的诊断标志物，具有强还原性，能够在短时间内迅速将Cu2+还原为Cu+。在草酸盐存在的情况下，Cu2+被还原为Cu+，分别与钙黄绿素和QDs发生快速配位和阳离子交换反应，钙黄绿素和QDs的荧光被猝灭。相比之下，当不存在草酸盐时，虽然Cu2+与钙黄绿素和QDs发生反应，但Cu2+的荧光猝灭效果远不及Cu+。因此，可以通过测量钙黄绿素和QDs荧光信号的下降值来快速量化草酸盐。
此外，鉴于本发明所采用的两个信号报告器：钙黄绿素和QDs的高发光特性，可使用喷墨打印技术制备便携式试纸条，用来获得可视化读数。当试纸条浸入反应溶液中时，溶液由于毛细作用拉过试纸条表面，并与表面的钙黄绿素或QDs发生反应。反应体系中草酸盐浓度的增加使得生成的Cu+浓度升高，对钙黄绿素和QDs的荧光猝灭作用增强，从而使试纸条上的猝灭距离增长。因此可以通过观察溶液颜色的变化和测量试纸条上荧光猝灭的距离来检测草酸盐的含量。
下面结合实施例对本发明的技术方案进行具体验证。
1.QDs的合成
CdTe QDs是根据一锅法合成的：
首先，制备含有CdCl2(0.5mmol)和柠檬酸三钠(0.2g)的50mL溶液；
然后，立即将52μL MPA添加到上述溶液中，并使用NaOH将溶液pH调节至10.5；
随后，将Na2TeO3(0.1mmol)和KBH4(50mg)添加到制备的溶液中并回流1h以获得CdTe量子点；
最后，通过用正丙醇沉淀并离心(11000rpm)获得高纯度的CdTe QDs。使用前将纯化的红色CdTe QDs分散在高纯水中。
2.草酸盐分析步骤：
2.1草酸盐的均相双荧光信号分析步骤
首先，将50μL 10mM 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)缓冲液(100mM NaNO3，pH 7.3)、7μL CuCl2溶液(50μM)与不同浓度的草酸盐(40μL)混合，混合溶液在室温(RT)下孵育1.5min以进行还原反应；
之后，在上述溶液中加入4.8μL钙黄绿素(10μM)和3μL CdTe QDs(5倍稀释溶液)，室温反应1.5min，完成配位反应和阳离子交换反应；
最后，在486nm激发波长下检测钙黄绿素和QDs的荧光信号。
2.2距离读取试纸条分析步骤
使用普通打印机在色谱纸(Whatman)上分别打印QDs和钙黄绿素的试纸条，并将试纸条裁剪成7.5cm×0.3mm的规格。
使用QDs试纸条时，将80μL 10mM MOPS缓冲液(100mM NaNO3，pH7.3)、8μL CuCl2溶液(50μM)与不同浓度的草酸盐(40μL)混合，并在室温下孵育1.5min。将QDs试纸条轻轻***反应液中，等待1.5min。取出试纸条，干燥后紫外灯下肉眼观察。
使用钙黄绿素试纸条时，将80μL 10mM MOPS缓冲液(100mM NaNO3，pH 7.3)、4μLCuCl2溶液(80μM)和不同浓度的草酸盐(40μL)在室温下孵育2min。将钙黄绿素试纸条轻轻***溶液中，反应1min。取出试纸条，干燥后紫外灯下肉眼观察。
3.钙黄绿素和QDs对Cu2+和Cu+的竞争性识别现象的验证
在进行草酸盐分析之前，对钙黄绿素和QDs对Cu2+/Cu+竞争性识别现象进行了验证，如图2所示。
如图2A、2B和2C所示，透射电镜(TEM)图像表明，合成得到的QDs分散均匀，呈现类球状，粒径约为4nm；在一定浓度的Cu2+存在时，QDs的粒径增加；而当Cu+存在时，QDs的聚集程度进一步增加。
如图2D和图2E所示，QDs和钙黄绿素的特征紫外吸收峰分别在630nm和480nm处。
如图2F和图2G所示，一价或二价铜离子对钙黄绿素和QDs的荧光显示出明显不同程度的猝灭效果，即Cu+优于Cu2+。
此外，如图2F、2G以及内插图所示，该现象还可以通过离心管的颜色变化和读取试纸条猝灭距离进行视觉识别。Cu2+和Cu+浓度越高，溶液颜色越暗，试纸条上的猝灭距离越长，并且可以观察到Cu+对钙黄绿素和QDs的响应相较于Cu2+更加灵敏。
4.草酸盐分析可行性验证
首先对双荧光信号的激发波长进行了筛选。如图2H所示，在486nm的激发波长下，钙黄绿素和QDs均显示出较好的荧光信号值，因此，选择486nm作为激发波长。
如图2I和图2J所示，使用具有还原性的抗坏血酸(AA)验证了分析***的原理，随着AA浓度的增加，两个荧光信号值逐渐降低。
如图2K的c-f和i-l所示，在双信号分析***中，钙黄绿素和QDs的信号值随着草酸盐浓度的增加而定量减弱(0.1-1000nM)。
上述结果表明，该双信号分析***可以实现纳摩尔浓度草酸盐的定量检测，并且可以同时实现肉眼视觉结果的读取。
5.草酸盐分析条件优化
在验证了实验可行性后，对实验中涉及的实验条件进行了考察。
如图3A所示，随着Cu2+和草酸盐反应时间的增加，钙黄绿素和QDs的荧光值逐渐降低，90s后反应完成。
如图3B和图3C所示，随着Cu2+体积的增加，含草酸盐溶液(高浓度草酸盐+Cu2++钙黄绿素+QDs)与空白溶液(低浓度草酸盐+Cu2++钙黄绿素+QDs)的荧光信号差异先增大后减小。当Cu2+的体积为7μL时，达到最大差异值。结果表明，当Cu2+的含量为7μL 50μM时，Cu2+最大程度地被草酸盐还原为Cu+。
如图3D和图3E所示，当钙黄绿素和QDs的体积分别为4.8μL和3μL时，空白溶液和草酸盐溶液之间的荧光信号值差异最大。
此外，如图3F所示，草酸盐和Cu2+的还原产物Cu+对钙黄绿素和QDs具有快速淬灭作用，可在90s内完成。
6.草酸盐分析性能考察
现有技术中使用量子点(QDs)作为信号报告分子，用于草酸钙尿石症的检测。草酸盐将Cu2+还原为Cu+，Cu2+/Cu+可以被碲化镉量子点(CdTe QDs)选择性识别，最后使用荧光仪对量子点的荧光信号进行检测，可以在6min内实现草酸盐的定量。然而，该策略只能达到nM-μM的灵敏度，并且开发的使用试管颜色可视化的阅读模式具有主观性，不利于色盲/色弱患者的使用。
如图4所示，本发明对多模式下草酸盐的分析灵敏度进行了考察。
如图4A所示，当使用钙黄绿素作为信号报告分子时，钙黄绿素的荧光信号与10nM-10mM浓度范围内的草酸盐呈线性关系，检测限为4nM(基于三倍信噪比)。
如图4B所示，当QDs用作信号报告分子时，可检测草酸盐浓度范围为10nM-1mM，检测限为3nM。
如图4C和图4D所示，使用钙黄绿素和QDs进行双荧光信号分析，观察到钙黄绿素和QDs的荧光信号随着草酸盐浓度在10pM-10nM范围内的增加而定量下降，它们的检测限分别为3pM和4pM。
结果表明，双荧光信号分析***具有优越的灵敏度，比单信号模式高出3个数量级，这可能是由于钙黄绿素和QDs竞争性识别Cu+，降低了其歧化反应速率，从而提高了反应效率。之后，我们进一步开发了紫外灯下离心管颜色和试纸条距离的视觉读出模式，使该分析***能适用于POCT。
如图4E、4F和4G所示，当草酸盐浓度增加时，离心管颜色变暗，试纸条猝灭距离变长。值得注意的是，在单信号模式下，可以肉眼区分低至100nM浓度的草酸盐。
然而，如图4H和4I所示，在双信号模式下可以看到低至100pM草酸盐的颜色变化，且颜色对比更加明显。通过试纸条的距离读数，我们获得了更直观、灵敏的视觉结果，并且钙黄绿素和QDs的试纸条猝灭距离与草酸盐浓度之间存在良好的线性关系。
因此，双信号和二元可视化分析策略具有快速、简单、灵敏度高、低成本、不依赖仪器并且可以实现多模式下裸眼读数等优越性能。除此之外，该分析***具有良好的目标选择性。如图4J所示，高浓度(100nM)的离子和小分子等干扰物质对荧光信号没有明显影响，而低浓度草酸盐(1和10nM)则明显降低了荧光信号。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述试剂包括高价金属离子，所述高价金属离子被还原性盐还原为低价金属离子，所述高价金属离子和其对应的所述低价金属离子选择性调控QDs和钙黄绿素的荧光信号，所述高价金属离子和其对应的所述低价金属离子有效改变QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号，并基于QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号采用二元可视化方式定量所述还原性盐。
2.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述低价金属离子对QDs的荧光信号和钙黄绿素的荧光信号的淬灭程度大于所述高价金属离子。
3.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述二元可视化包括颜色可视化和距离可视化。
4.根据权利要求3所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述颜色可视化为钙黄绿素和QDs在紫外光照射下分别呈现绿色和红色。
5.根据权利要求3所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述距离可视化为采用喷墨打印技术制备双色试纸条，通过读取试纸条上移动距离实现可视化读取。
6.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述还原性盐为草酸盐或者具有强还原性的病原标志物。
7.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述高价金属离子为Cu2+，所述低价金属离子为Cu+。
8.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述高价金属离子为Fe3+，所述低价金属离子为Fe2+。
9.根据权利要求1所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂，其特征在于，所述QDs和所述钙黄绿素共同存在时的激发波长为486nm。
10.一种基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-9任一所述的基于竞争选择性识别和二元可视化检测还原性盐的检测试剂应用于尿石症中草酸盐的检测。
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