CN106046160A - 治疗骨丢失相关疾病的 siglec 15 抗体 - Google Patents

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Abstract

本文描述了与Siglec‑15特异性结合的新型抗体和抗原结合片段。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段可阻断Siglec‑15的生物活性，并适用于治疗骨丢失的组合物，且更具体为适用于具有增高的Siglec‑15细胞表面表达的骨病，诸如其中存在破骨细胞的骨降解活性增高的病症。本发明还涉及表达抗体或抗原结合片段(诸如单克隆抗体、人源化抗体或嵌合抗体)的细胞。此外，还公开了利用所述抗体和片段检测和治疗骨丢失、骨相关疾病或癌症的方法。

Description

治疗骨丢失相关疾病的SIGLEC 15抗体
本申请是申请日为2010年10月6日、申请号为201080053103.4、发明名称为“治疗骨丢失相关疾病的SIGLEC 15抗体”的发明专利申请的分案申请。
【技术领域】
本发明涉及与Siglec-15特异性结合的单克隆抗体和其抗原结合片段，及其用于治疗某些疾病的用途，所述用途包括诊断、预防和治疗癌症或骨丢失，诸如与骨相关疾病有关的、或与破骨细胞分化或活性增高有关的严重的或过度的骨丢失。本发明还涉及这些抗体用于诊断、预防和治疗其中破骨细胞的活性增高的多种其它类型的疾病的用途。
【背景技术】
骨是动态的***，由支持骨的结构、机械和生化完整性和人体矿物质平衡所需的功能上不同的细胞群组成。所涉及的主要细胞类型包括负责骨形成并维持骨量(bonemass)的造骨细胞和负责骨再吸收的破骨细胞。造骨细胞和破骨细胞在称作骨重建的动态过程中起作用。这些细胞从其祖细胞的发育和增殖受骨微环境中产生的生长因子和细胞因子的网络以及***激素的控制。骨重建在个体一生中都进行着，并且是维持健康的骨组织和矿物质平衡所必需的。该过程在很大程度上保持着平衡，并受***激素、肽和下游信号转导通路蛋白、局部转录因子、细胞因子、生长因子和基质重建基因的复杂的相互影响的控制。
骨重建过程中出现的任何干扰或不平衡可产生骨骼疾病，其中最常见的骨骼病症以骨量的净减少为特征。该骨量减少的主要原因是破骨细胞数量和/或活性的增高。这种疾病最常见的和可能最熟知的是尤其在绝经期开始之后的妇女中发生的骨质疏松症。事实上，骨质疏松症在中老年和老年妇女中是骨折的最重要的根本原因。虽然***缺乏已被强烈牵扯为绝经后骨质疏松症的因素，但有长期存在的证据—重建是局部受控的过程，因为其发生在遍及骨骼中的不连续的小包(discrete packet)中，如40多年之前由Frost所首先描述的(Frost H.M.1964)。
因为骨重建发生在不连续的小包中，所以局部产生的激素和酶对于骨再吸收的开始和正常重建过程可能比***激素更重要。该局部控制受微环境中的的造骨细胞和破骨细胞所调节，其中造骨细胞和破骨细胞在所述微环境中起作用。例如，破骨细胞附着于骨基质并在其与骨表面之间形成独立的区室，所述骨表面由皱折缘周围的一圈肌动蛋白形成的封闭区所限定。多个小囊泡朝向骨基质转运酶并使部分消化的骨基质内化。封闭区内的微环境中富集溶酶体酶，且与机体的正常生理pH相比是高度酸性的。皱折缘膜还表达RANKL的受体RANK，和巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)受体(二者均负责破骨细胞分化)，以及能够快速使破骨细胞失活的降钙素受体(Baron,R.2003)。
在复杂的抑制和刺激方式中，生长激素、***-1、性类固醇、甲状腺激素、降钙素激素(诸如PTH和***素E2)、多种细胞因子(诸如白介素-1β、白介素-6和肿瘤坏死因子α)和1,25-二羟维生素D(钙三醇)在骨重建过程中共同协调作用(Jilka等1992；Poli等1994；Srivastava等1998；de Vemejoul 1996)。
因此，通过这些特化的细胞创建的独特的局部环境是由于在其它组织中不表达的独特的遗传序列的表达和/或在其它组织中表达的多核苷酸和多肽的剪接变体的表达所导致是合乎情理的。对破骨细胞活性特异的多核苷酸、多肽和其变体和衍生物的分离和鉴定将允许重建过程的更清楚的理解，并为与骨重建相关的疾病状态的治疗提供了组织特异性治疗靶标。
与骨重建相关联的许多疾病未被充分认识，通常是无法治疗或仅可以有限的程度治疗。例如，骨关节炎难以治疗，因为没有集中于减轻疼痛并防止受影响关节变形的疗法和治疗。通常使用非类固醇抗炎药物(NSAID)减轻疼痛。
另一个实例是骨质疏松症，其中在美国通过FDA批准使用的目前唯一药物是抗再吸收剂，其防止骨断裂。***替代疗法是抗再吸收剂的一个实例。另外包括阿伦膦酸盐(福善美(Fosamax)—一种二磷酸盐抗再吸收剂)、利塞膦酸盐(Actonel—一种二磷酸盐抗再吸收剂)、雷洛昔芬(Evista—选择性***受体调节剂(SERMS))、降钙素(Calcimar—一种激素)和甲状旁腺素/特立帕肽(teriparatide)(Forteo—人激素(甲状旁腺素)的一种合成形式，其协助调节钙代谢)。
诸如阿伦膦酸盐和利塞膦酸盐的二磷酸盐与骨的表面永久结合并干扰破骨细胞活性。这允许造骨细胞超越再吸收的速度。最常见的副作用是恶心、腹痛和腹泻。然而，阿伦膦酸盐被报道还导致食道的刺激和炎症，并且在一些情况下导致食道的溃疡。利塞膦酸盐在化学上不同于阿伦膦酸盐，且较小可能地导致食道刺激。然而，某些食物、钙、铁补充物、维生素和矿物质，或含钙、镁或铝的抗酸剂可降低利塞膦酸盐的吸收，从而导致效力的丧失。
雷洛昔芬和其它SERMS(诸如他莫昔芬(Tamoxifen))的最常见的副作用是热潮红。然而，已显示雷洛昔芬和其它激素替代疗法增加了血块的风险，包括深静脉血栓症和肺栓塞、心血管病和癌症。
降钙素在增加骨密度和强化骨方面不如***和其它抗再吸收剂一样有效。注射的或鼻腔喷雾的降钙素的常见副作用是恶心和发红。患者可形成鼻刺激、流鼻涕或流鼻血。可注射的降钙素可在注射部位导致局部皮肤发红、皮疹和发红。
表明涉及骨重建的若干疾患或疾病状态之间的关联的情况是使用首次通过FDA批准的依替膦酸盐(Didronel)治疗佩吉特氏病(Paget’s disease)。佩吉特氏病是以失调和加速的骨重建为特征的骨病，导致了骨衰弱和疼痛。依替膦酸盐已用于“未标志用途(off-label)”，且在一些研究中显示在患有确定的骨质疏松症的绝经后妇女中增加了骨密度。还已发现在需要长期类固醇药物(诸如强的松(Prednisone)或可的松(Cortisone))的患者中有效防止骨丢失。然而，高剂量或连续使用依替膦酸盐可导致称为骨软化症的另一骨病。如骨质疏松症一样，骨软化症可导致衰弱的骨，具有增高的骨折风险。由于骨软化症忧虑和仍缺少关于降低骨折速率的足够的研究，美国FDA未批准依替膦酸盐用于骨质疏松症的治疗。
已主要将骨质疏松症治疗集中于降低骨丢失速率的抗再吸收药物，但新出现的疗法显示了增加骨矿物质密度而非仅维持骨矿物质密度或减慢其恶化的前景。骨质疏松症早期阶段主要由新治疗种类中的药物候选物组成，尤其是组织蛋白酶K抑制剂、骨保护素和钙敏感受体拮抗剂(calcilytics)以及新型二磷酸盐。这些中的一些是这样的实例：其中基于骨生物学的更深的认识正在开发利用基因组学计划的新型药物，且长期而言其具有改变治疗骨疾患的面貌的可能性。
本发明描述了对Siglec-15特异的抗体用于诊断、预后和治疗(包括预防)癌症或骨丢失(例如，与骨相关疾病有关的、或与破骨细胞分化或活性的增高有关的严重的或过度的骨丢失)的用途。尤其是，本发明涉及抗Siglec-15抗体用于抑制破骨细胞的分化的用途。
唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素(Siglec)是免疫球蛋白(Ig)超家族的成员，其具有与唾液酸相互作用的能力(McMillan和Crocker,2008；Crocker等,2007)。存在一些Siglec家族成员，其均共有特定的结构特征，尤其是，表现出结合唾液酸的氨基末端V-setIg结构域和不同数目的C2-set Ig结构域。这些膜受体一般以高度特异的方式表达，且家族成员中的许多在造血细胞中表达(McMillan和Crocker,2008)。这些蛋白质被认为通过识别聚糖来促进细胞-细胞相互作用、调节信号转导和调控免疫功能(Crocker等,2007)。唾液酸是通常位于细胞表面的复杂糖复合物的端部的九碳糖。其可与多种蛋白质和脂质连接(McMillan和Crocker,2008)。
Siglec-15是最近被描述的与Siglec-14具有高度同源性的Siglec家族成员之一(Angata等,2007)。这些作者报道了其优先结合唾液酰Tn结构，且其与DAP12和DAP10相互作用。这些相互作用的功能意义是未知的，但提出Siglec-15可能具有激活功能(Angata等,2007)。虽然这些初步洞察了Siglec-15在哺乳动物中的可能作用，但当将序列鉴定为筛选的部分以发现破骨细胞分化的新型调节物时，促进了对蛋白质的生物学功能的理解的重要进展(Sooknanan等，2007)。在本专利申请中，揭示了在破骨细胞发生的小鼠模型中，通过RNA干扰对Siglec-15转录物的衰减导致了响应于RANKL治疗的前体的分化的显著降低。在人破骨细胞中公开了类似的结果。并且，本公开内容中呈现的研究还显示Siglec-15在细胞膜的定位对于其在破骨细胞分化中的作用是必需的。并且，最近的出版物显示表面糖复合物的末端的唾液酸的存在是适当的破骨细胞分化所需的，且对于破骨细胞前体细胞的融合可能是重要的(Takahata等,2007)。该最新观察创建了分化中的破骨细胞中唾液酸结合和Siglec-15的表达之间的直接功能关联，并有力表明了Siglec-15在破骨细胞前体的早期分化程序中具有作用。
因此，Siglec-15的表达谱，其在破骨细胞分化过程中的强可诱导性、其在膜表面的定位和其结构特征均有助于利用单克隆抗体在细胞表面靶向该蛋白质的可行性。靶向破骨细胞的基于单克隆抗体的疗法的唯一的另外实例是狄诺塞麦(denosumab)，对RANKL特异的人单克隆抗体(Ellis等2008)。本发明涉及抗Siglec-15抗体或抗原结合片段在骨丢失的检测或治疗中尤其在骨相关疾病的情况下或在增高的破骨细胞分化或活性的情况下作为破骨细胞分化的阻断剂的用途。本发明还涉及抗体或抗原结合片段在癌症的检测或治疗中的用途。
【附图简述】
图1显示了在来自6个不同供体的人分化中破骨细胞样本中Siglec-15mRNA的基于PCR的表达谱。还描绘了来自30个人正常组织的RNA样本中的表达谱。作为对照，将Siglec-15表达模式与熟知的破骨细胞标志物组织蛋白酶K(CATK)相比较，并包括管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)以用于每个样本中的RNA的量的对照。
图2显示了从癌细胞系的NCI-60组中分离的样本中的Siglec-15mRNA的表达。
图3呈现了含有作为Fc融合蛋白在293-6E细胞中表达的纯化的人重组Siglec-15的样本的考马斯染色的聚丙烯酰胺凝胶。该制备物被用以产生本专利中公开的单克隆抗体。
图4显示了选自来自含抗Siglec-15Fab的Omniclonal文库#25的96孔板的单独单克隆抗体的Fc-Siglec-15ELISA结果。通过粗体数字指示的孔含有示例性单克隆抗体25A1、25B4、25B8、25C1、25D8、25E5、25E6和25E9。还显示了在同样的板上单独使用Fc部分进行的ELISA以鉴定对Fc-Siglec-15融合蛋白的Fc部分特异的那些单克隆抗体。
图5呈现了示出将小鼠Fab转化到IgG2小鼠-人嵌合mAb中所涉及的步骤的方案。
图6显示了对于示例性抗体25B4、25B8、25C1、25D8、25E6和25E9，小鼠抗Siglec-15Fab的结合与对应的IgG2嵌合单克隆抗体的结合相比较的图。结果表明当转移至完全人IgG2支架时，保持了Fab可变区的相关结合。
图7显示了用递增浓度的抗Siglec-15IgG2嵌合单克隆抗体25B8、25E6和25E9治疗后对人破骨细胞的分化的抑制。治疗之后，关于TRAP表达对破骨细胞进行染色。
图8显示了用递增浓度的抗Siglec-15IgG2嵌合单克隆抗体25B8、25E6和25D8治疗后对小鼠破骨细胞的分化的抑制。治疗之后，关于TRAP表达对破骨细胞进行染色。
图9显示了在示例性抗体25C8的存在下人和小鼠Siglec-15的比较性结合。结果表明针对人Siglec-15生成的抗体的结合还与小鼠Siglec-15相互作用。
图10A、10B和10C是对于所选择的CDRL1、CDRL2和CDRL3序列(分别)利用ClustalW2程序获得的比对结果的总结；其中“*”意为在比对中该栏中的残基在所有序列中相同的，“:”意为已观察到的保守置换，和“.”意为所观察的半保守置换。利用ClustalW程序产生共有CDR(Larkin M.A.,等,(2007)ClustalW和ClustalX版本2.Bioinformatics 2007 23(21):2947-2948)。
图11A、11B和11C是对于所选择的CDRH1、CDRH2和CDRH3序列(分别)利用ClustalW2程序获得的比对结果的总结；其中“*”意为在比对中该栏中的残基在所有序列中相同的，“:”意为已观察到的保守置换，和“.”意为所观察的半保守置换。利用ClustalW程序产生共有CDR(Larkin M.A.,等,(2007)ClustalW和ClustalX版本2.Bioinformatics 2007 23(21):2947-2948)。
图12示出了对于Siglec-15特异的25E9候选抗体抑制破骨细胞的骨再吸收活性的能力。
图13A、13B、13C、13D和13E通过从过表达Siglec-15cDNA的细胞制备的裂解物的免疫印迹(13A)、从人破骨细胞中制备的裂解物的免疫印迹(13B)和从小鼠破骨细胞中制备的裂解物的免疫印迹(13C)，和从U87成胶质细胞瘤细胞中制备的裂解物的免疫印迹，和通过完整U87细胞的流式细胞术，证明Siglec-15抗体可检测蛋白。
图14A和14B显示了针对Siglec-15产生的抗体不与包括Siglec-2和CD33的其它有关Siglec结合。
图15显示了证明抗Siglec-15抗体可抑制Siglec-15和唾液酸之间的相互作用的ELISA。
【发明概述】
本发明涉及用于治疗(包括预防)、检测和诊断骨丢失或癌症的抗体和抗原结合片段以及试剂盒。所述抗体和抗原结合片段更具体地可用于检测已分化的破骨细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞和诊断骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。本发明的抗体或抗原结合片段还可用于治疗骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。
本发明的抗体或抗原结合片段可与Siglec-15(SEQ ID NO:2)的第20至259位氨基酸或与Siglec-15变体(例如，SEQ ID NO:4)的对应区结合。更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可与Siglec-15(SEQ ID NO:2)的第49至165位氨基酸或与Siglec-15变体(例如，SEQ ID NO:4)的对应区结合。
本发明更具体地涉及能够与能促使破骨细胞分化的多肽结合且能够抑制多肽的破骨细胞分化活性的分离的抗体或抗原结合片段。
本发明的抗体或抗原结合片段涵盖与SEQ ID NO:2的第20至259位氨基酸结合或与同SEQ ID NO:2的第20至259位氨基酸具有至少80％序列同一性的变体结合的那些。
更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可更具体地与SEQ ID NO:2的第49至165位氨基酸结合或与同SEQ ID NO:2的第49至165位氨基酸具有至少80％序列同一性的变体结合。
更具体地，本发明的抗体或抗原结合片段可更具体地与同SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的多肽结合。
根据本发明，抗体或抗原结合片段可因此干扰多肽促使破骨细胞分化或促使肿瘤生长的能力。
更具体地涵盖能够与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的胞外区结合的抗体或抗原结合片段。
本发明因此提供了能够与能促使破骨细胞分化的多肽结合并与SEQ ID NO:2或与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15(Siglec-15；SEQ ID NO:2)SEQ ID NO:2的第20至259位氨基酸具有至少80％序列同一性(或与SEQ ID NO:2的第49至165位氨基酸具有至少80％同一性)的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞分化、骨再吸收(降解)或能够阻断Siglec-15与唾液酸结合。
本发明的抗体或抗原结合片段可能够干扰(抑制)破骨细胞前体细胞分化为已分化的破骨细胞。
根据本发明，分离的抗体或抗原结合片段可以是例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
在一个示例性实施方案中，分离的抗体或抗原结合片段可以是包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
恒定区或其片段可来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一个更具体的实施方案中，恒定区可来自IgG2。
可以特别有用的抗原结合片段包括例如，FV(scFv)、Fab、Fab′或(Fab′)2。
抗体或抗原结合片段可在分离的哺乳动物细胞(非杂交瘤细胞)中产生或从分离的哺乳动物细胞产生，或在杂交瘤细胞中产生。分离的哺乳动物细胞的一个示例性实施方案是人细胞。
特别涵盖在分离的哺乳动物细胞(例如，人细胞)中产生单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。这样产生的嵌合抗体或人抗体可包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸，包括例如，来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的恒定区或其片段。在一个更具体的实施方案中，恒定区可来自IgG2。
在本发明的一方面，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑制)人破骨细胞前体细胞分化为分化的人破骨细胞。
在一个示例性实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可干扰(抑制)原代人破骨细胞前体细胞分化为分化的人破骨细胞。
具有所述活性的抗体或抗原结合片段可包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
在一个更具体的实施方案中，可能够具有所述活性的抗体或抗原结合片段包括例如，单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
在一个甚至更具体的实施方案中，可能够具有所述活性的抗体或抗原结合片段包括例如，可包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体、人抗体或其片段。
嵌合或人抗体的恒定区或其片段可来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。更具体地，恒定区可来自IgG2。
本发明的抗体和抗原结合片段还可用于一般靶向表达或过表达Siglec-15的细胞，所述细胞包括骨细胞和乳腺癌细胞、结肠癌细胞、肺癌细胞、***癌细胞和肾癌细胞以及黑素瘤细胞和中枢神经***的癌细胞。
更具体地，抗体和抗原结合片段可用于靶向经历分化的破骨细胞。
本发明在其一方面提供了可能够与SEQ ID NO:2特异性结合的分离的或基本上纯化的抗体或抗原结合片段。
更具体地且根据本发明的一个实施方案，抗体或抗原结合片段可与位于SEQ IDNO:2的第20位氨基酸和第259位氨基酸之间的结构域结合。
根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可能够与SEQ ID NO:2的第20位氨基酸和第259位氨基酸内包含的表位结合。
这样，本发明涵盖对SEQ ID NO:2具有特异性的诊断性和/或治疗性抗体或抗原结合片段。本发明还涵盖具有与本发明的抗体相同的表位特异性的抗体或抗原结合片段。通过确定是否其将与本文所描述的抗体结合的表位结合和/或通过用已知与表位结合的抗体或抗原结合片段进行竞争测定可鉴定候选抗体。
因此，本发明的另一方面提供了能够与本文所描述的抗体或抗原结合片段竞争的分离的抗体或抗原结合片段。
在另外的方面，本发明提供了利用本发明的抗体或抗原结合片段进行治疗的方法和检测的方法。
术语“抗体”是指完整的抗体、单克隆抗体或多克隆抗体。术语“抗体”还涵盖多特异性抗体，诸如双特异性抗体。人抗体通常由两条轻链和两条重链组成，每条链包含可变区和恒定区。轻链可变区包含3个CDR，本文认定为CDRL1、CDRL2和CDRL3，两侧为框架区。重链可变区包括3个CDR，本文认定为CDRH1、CDRH2和CDRH3，两侧为框架区。
如本文所用的术语“抗原结合片段”，是指保留与抗原(例如，SEQ ID NO:2或其变体)结合的能力的抗体的一个或多个片段。已显示抗体的抗原结合功能可由完整的抗体的片段来执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”中的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括两个在铰链区通过二硫桥连接的Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)，例如，VH CDR3。并且，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由独立的基因所编码，但可利用重组方法通过能使它们作为单一多肽链的合成连接子将它们结合，其中在所述单一多肽链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等.(1988)Science 242:423-426；和Huston等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883)。所述单链抗体也意在涵盖在术语抗体的“抗原结合片段”之中。并且，抗原结合片段包括结合结构域免疫球蛋白融合蛋白，其包含(i)结合结构域多肽(诸如重链可变区、轻链可变区或通过连接子肽与轻链可变区融合的重链可变区)，其与免疫球蛋白铰链区多肽融合，(ii)与铰链区融合的免疫球蛋白重链CH2恒定区，和(iii)与CH2恒定区融合的免疫球蛋白重链CH3恒定区。可通过将一个或多个半胱氨酸残基用丝氨酸残基取代来修饰铰链区以防止二聚化。US 2003/0118592和US 2003/0133939中也公开了所述结合结构域免疫球蛋白融合蛋白。利用本领域中的技术人员已知的常规技术获得这些抗体片段，并筛选所述片段的与完整的抗体相同的效用。
典型抗原结合位点包括由免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并表现出非常相似的结构。这些可变区通常包括相对同源的框架区(FR)，其与称作互补决定区(CDR)的3个高变区间隔。抗原结合片段的总结合活性通常受CDR序列的支配。FR通常在对于最优抗原结合的CDR的适当定位和三维排列中起作用。
本发明的抗体和/或抗原结合片段可源于例如，小鼠、大鼠或任何其它哺乳动物或源于诸如通过重组DNA技术的其它来源。
本发明的另外的范围、适用性和优点将从下文给出的非限制性详细描述中变得显而易见。然而，应理解地是，在表明本发明的示例性实施方案时，该详细描述参照附图仅以实例的方式给出。
【发明详述】
【破骨细胞和正常组织中Siglec-15的表达谱】
本发明涉及单克隆抗体靶向见于多种骨相关疾病中的破骨细胞的用途，其中在所述骨相关疾病中，观察到由于破骨细胞增高的活性导致严重骨丢失。为了将抗体定向到破骨细胞，必须进行在细胞的细胞表面表达的破骨细胞特异性抗原的鉴定。存在若干对于鉴定细胞特异性抗原可用的技术，并且用来在用RANKL处理的分化中的破骨细胞中鉴定Siglec-15的方法(称作基于消减转录的mRNA的扩增(STAR)的创新性探索平台)描述在公布的专利申请第PCT/CA2007/000210号中。
人破骨细胞STAR文库的分析产生了编码分泌蛋白和细胞表面蛋白的许多基因。这些其中之一称作AB-0326，含有编码328个氨基酸的多肽的开放阅读框，所述多肽对应于由具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列的987个碱基对的cDNA编码的SEQ ID NO:2。公众可获得的数据的研究显示AB-0326核苷酸序列与称作CD33抗原样3(CD33L3)的人基因的核苷酸序列相同。后来发现CD33L3是唾液酸结合蛋白的Siglec家族的成员，且基于与其它Siglec的同源性被重命名为Siglec-15(Crocker等,2007)。基于该信息，分离了小鼠直系同源基因并测序，发现其在氨基酸水平上与人序列约85％相同。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4分别显示了鼠类Siglec-15的cDNA和多肽的序列。生物信息学分析预测了I型膜锚定蛋白，其呈现了其对于胞外区室的功能性结构域。与其它Siglec序列一样，氨基末端信号肽(位于SEQ IDNO:2的第1位和第19位氨基酸之间)将该蛋白靶向细胞的膜，且通过位于羧基末端的单个跨膜螺旋(位于SEQ ID NO:2的第261位和第283位氨基酸之间)将最终加工过的蛋白质锚定于膜。V-set Ig结构域位于SEQ ID NO:2的第49位和第165位氨基酸之间，而C2-set Ig结构域位于SEQ ID NO:2的第178位和第244位氨基酸之间。
本发明涉及破骨细胞的分化过程中的Siglec-15的功能。先前的发现(Sooknanan等，2007)证实了响应于RANKL的编码人Siglec-15的转录物是显著上调的。该测定在RNA宏阵列(macroarray)上进行，其含有来自来自不同的人PBMNC供体的一些不同的人破骨细胞分化实验的点印的总RNA样本。并且，这些研究(Sooknanan等.2007)揭示Siglec-15转录物在30个人正常组织的大组中仅在一个正常组织中表达，表明了Siglec-15基因表达的非常高的破骨细胞特异性。利用更灵敏的方法诸如半定量RT-PCR，在许多破骨细胞样本中在RANKL处理一天之内刺激了Siglec-15mRNA的表达，表明该基因在细胞融合开始之前在破骨细胞前体细胞中早期表达。最后，通过半定量RT-PCR评估了Siglec-15的组织表达谱，并发现其仅在单一正常人组织中表达，因此验证了Sooknanan等的宏阵列结果。总之，如通过Siglec-15所例证的，这些表达结果强调了申请人的探索方法在其鉴定高度限制于分化中的破骨细胞的靶标的能力中的效力。
基于Siglec-15在破骨细胞的分化的早期的表达、其在正常组织中的有限表达和Siglec-15在破骨细胞的活性中的关键的生物学作用，选择Siglec-15作为治疗靶标以用于开发用来检测、预防和治疗骨相关疾病(诸如癌症诱导的骨丢失和骨质疏松症)的单克隆抗体。
因此，提供了多种抗Siglec-15抗体和其具有免疫功能的片段，诸如用于靶向Siglec-15的嵌合单克隆抗体和人源化单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。
【SEQ ID NO:2作为抗原和来源于SEQ ID NO:2的表位】
在国际申请第PCT/CA2007/000210号中，申请人意外地发现SEQ ID NO:2参与破骨细胞分化。因此该抗原可用来在体外或在体内靶向表达抗原的细胞，和用于开发用来在体外或在体内测量抗原的检测测定。
因此本发明提供了用于产生特异性抗体和/或对表达SEQ ID NO:2的细胞特异的抗原。该抗原或表位可包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的至少10个氨基酸(和高达总长度)的片段。
一个示例性的抗原是完全SEQ ID NO:2蛋白或与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的变体形式或包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的至少10个氨基酸的片段。
本文所描述的抗原或表位可与载体诸如匙孔血蓝蛋白(KHL)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或其它载体融合以产生抗体和抗原结合片段。
本发明还提供了在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中包含的表位以产生本文所描述的抗体和抗原结合片段。表位可包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的至少10个氨基酸的片段。
本发明还提供了用于产生针对SEQ ID NO:2或针对SEQ ID NO:2变体的抗体的组合物，该组合物可包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ I NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位和载体。
组合物的示例性实施方案是用于产生针对SEQ ID NO:2或针对SEQ ID NO:2变体的抗体的药物组合物。该药物组合物可包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位和药学上可接受的载体。
在又一个另外的方面，本发明提供了用于产生针对SEQ ID NO:2或针对SEQ IDNO:2变体的抗体的方法。该方法可包括施用多肽，所述多肽包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQ ID NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位。
在再一方面，本发明提供了在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中或在SEQID NO:2变体的对应部分中包含的SEQ ID NO:2的表位用于产生针对SEQ ID NO:2或针对SEQ ID NO:2变体的抗体的用途。
与SEQ ID NO:2具有80％同一性的SEQ ID NO:2变体的示例性实施方案包括例如但不限于，SEQ ID NO:4和以以下gene bank登录号或NCBI参照序列公布于数据库中的其它类似物：AAY40743.1、XP_512109.2、XP_001089000.1、XP_601064.4、NP_001094508.1、XP_855238.1、XP_574176.2和EAX01462.1。
【与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体结合的抗体和抗原结合片段】
关于其对于目标抗原的特异性首先从Fab文库中分离抗体。抗体的轻链可变域或重链可变域的氨基酸序列的比较所显示的最突出的特征使我们取得CDR中和可变区中的共有序列。SEQ ID NO:148-158和197-210中提供了CDR的共有序列。SEQ ID NO:191-196中提供了可变区的共有序列。
本文所描述的可变区可与期望的物种的恒定区融合从而允许通过期望的物种的效应细胞来识别抗体。恒定区可来源于，例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在框中克隆或合成恒定区与可变区在本领域技术人员的技术范围内，并且可例如通过重组DNA技术来进行。
在本发明的某些实施方案中，与SEQ ID NO:2结合的抗体可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。本发明的更具体的实施方案涉及IgG1亚型的抗体。抗体可以是IgG1亚型的人源化抗体，其在调节抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体介导的细胞毒性(CMC)中具有生物活性，或与免疫复合物有关。典型的ADCC包括自然杀伤(NK)细胞的激活并依赖于NK细胞的表面上的Fc受体对抗体覆盖的细胞的识别。Fc受体识别抗体的Fc结构域，诸如存在于IgG1上的，其与靶细胞的表面结合，所述靶细胞特别是表达抗原诸如SEQ ID NO:2的骨细胞。一旦与IgG的Fc受体结合后，NK细胞释放细胞因子和细胞毒性颗粒，其进入靶细胞并通过触发细胞凋亡来促使细胞死亡。
本发明描述了一系列与SEQ ID NO:2结合的抗体。在某些实施方案中，抗体可选自由以下组成的组：多克隆抗体、单克隆抗体(诸如嵌合抗体或人源化抗体)、抗体片段(诸如抗原结合片段)、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。
本发明因此在其另一方面提供了包含轻链可变域的分离的抗体或抗原结合片段，所述轻链可变域具有：
a.选自由以下组成的组的CDRL1序列：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:173、SEQ ID NO:179和SEQ ID NO:185；
b.选自由以下组成的组的CDRL2序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76.SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:112、SEQ IDNO:174、SEQ ID NO:180和SEQ ID NO:186和/或；
c.选自由以下组成的组的CDRL3序列：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:113、SEQ IDNO:175、SEQ ID NO:181和SEQ ID NO:187。
分离的抗体或抗原结合片段还可包括重链可变域，所述重链可变域具有：
a.选自由以下组成的组的CDRH1序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:176、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:188；
b.选自由以下组成的组的CDRH2序列：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:189和/或；
c.选自由以下组成的组的CDRH3序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:190。
在另一方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其可包含具有以下的轻链可变域：
a)CDRL1，所述CDRL1与选自由SEQ ID NO:148、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75和SEQID NO:105组成的组的CDRL1序列可具有至少80％同一性
b)CDRL2，所述CDRL2与选自由SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ ID NO:76、SEQID NO:82和SEQ ID NO:106组成的组的CDRL2序列可具有至少80％同一性，或；
c)CDRL3，所述CDRL3与选自由SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:77、SEQID NO:83、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:152组成的组的CDRL3序列可具有至少80％同一性。
在又一另外的方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含具有以下的重链可变域：
a)CDRH1，所述CDRH1与选自由SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:84、SEQID NO:96和SEQ ID NO:102组成的组的CDRH1序列可具有至少80％同一性；
b)CDRH2，所述CDRH2与选自由SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:109组成的组的CDRH2序列可具有至少80％同一性，或；
c)CDRH3，所述CDRH3与选自由SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:98、SEQID NO:104、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:116组成的组的CDRH3序列可具有至少80％同一性。
在一个示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含轻链可变区的任何单独的CDR或CDR1、CDR2和/或CDR3的组合。更具体地可选择CDR3。组合可包括例如，CDRL1和CDRL3；CDRL1和CDRL2；CDRL2和CDRL3和；CDRL2和CDRL3。
在另一个示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含重链可变区的任何单独的CDR或CDR1、CDR2和/或CDR3的组合。更具体地可选择CDR3。组合可包括例如，CDRH1和CDRH3；CDRH1和CDRH2；CDRH2和CDRH3和；CDRH1、CDRH2和CDRH3。
根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR。
还根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含一个CDRL1、一个CDRL2和一个CDRL3。
再根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含：
a.CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR，和；
b.CDRH1、一个CDRH2或一个CDRH3中的至少两个CDR。
更优选地，抗体或抗原结合片段可包含一个CDRL1、一个CDRL2和一个CDRL3。
更优选地，抗体或抗原结合片段还可包含一个CDRH1、一个CDRH2和一个CDRH3。
在另一方面，本发明提供了分离的抗体或抗原结合片段，其包含具有以下的重链可变域：
a.选自由以下组成的组的CDRH1序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:114、SEQ IDNO:176、SEQ ID NO:182和SEQ ID NO:188；
b.选自由以下组成的组的CDRH2序列：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:177、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:189和/或；
c.选自由以下组成的组的CDRH3序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116、SEQ IDNO:178、SEQ ID NO:184和SEQ ID NO:190。
根据本发明，抗体或抗原结合片段可包含一个CDRH1、一个CDRH2或一个CDRH3。
根据本发明，抗体或抗原结合片段还可包含一个CDRH1、一个CDRH2和一个CDRH3。
当仅轻链可变域或重链可变域其中之一可用时，可利用本领域中已知的方法通过筛选互补可变域的文库来重构抗体或抗原结合片段(Portolano等，The Journal ofImmunology(1993)150:880-887，Clarkson等，Nature(1991)352:624-628)。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在本文所描述的CDR的至少一个中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在CDR的至少两个中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在3个CDR中具有至少一个保守氨基酸置换的可变链。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在CDR的至少一个中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在CDR的至少两个中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。
本发明还涵盖多肽或抗体，所述多肽或抗体包含在3个CDR中具有至少两个保守氨基酸置换的可变链。
在另一方面，本发明涉及多肽、抗体或抗原结合片段，所述多肽、抗体或抗原结合片段(在单一多肽链上或在不同的多肽链上)包含本文所描述的抗体或抗原结合片段其中之一的轻链可变域的至少一个互补决定区和重链可变域的至少一个互补决定区。
本发明在其另一方面涉及可(在单一多肽链上或在不同的多肽链上)包含本文所描述的抗体或抗原结合片段的全部6个互补决定区(CDR)的抗体。
本发明的抗体或抗原结合片段还可包含位于CDR的氨基区和/或羧基区两侧的另外的氨基酸。那些另外的氨基酸可与本文所描述的对应的抗体的框架区相同或可包括例如，保守氨基酸置换。
根据本发明的一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL1序列，该CDRL1序列包括或由下式组成：
RSX1aX2aSLLHSNGX3aTYLY(SEQ ID NO:148)，
其中X1a可以是例如，中性亲水性氨基酸；
其中X2a可以是例如，赖氨酸或谷氨酸。
其中X3a可以是例如，疏水性氨基酸或天冬酰胺。
在一个更具体的实施方案中，X1a可以是例如，丝氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X2a可以是例如，赖氨酸。
更具体地，X3a可以是例如，异亮氨酸或缬氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X3a可以是异亮氨酸。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL1序列，该CDRL1序列包括或由下式组成：
RASXa10NIXb10Xc10YLA(SEQ ID NO:197)
其中Xa10可以是任何氨基酸或例如G或E；
Xb10可以是任何氨基酸或例如Y或H，和；
Xc10可以是任何氨基酸或例如S或N。
根据本发明的又一另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL1序列，该CDRL1序列包括或由下式组成：式RSSX1xSLLHSNGX2xTYLY(SEQ ID NO:201)的CDRL1，其中X1x和X2x如本文所定义。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL1序列，该CDRL1序列包括或由下式组成：式RSXa6KSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:202)的CDRL1，其中Xa6如本文所定义。
抗体或抗原结合片段还可包含例如CDRL1序列，所述CDRL1序列选自包括或由SEQID NO:75、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:105和表3或表5B中所列的其它CDRL1组成的那些序列。
根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL2序列，该CDRL2序列包括或由下式组成：
X1bMSNLAS(SEQ ID NO:149)，
其中X1b可以是例如，碱性氨基酸。
更具体地，X1b可以是例如，谷氨酰胺或天冬酰胺。
在一个更具体的实施方案中，X1b可以是谷氨酰胺。
根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL2序列，该CDRL2序列包括或由下式组成：
RX1cSNLX2cS(SEQ ID NO:150)，
其中X1c可以是例如，蛋氨酸或苏氨酸并且其中X2c可以是例如，疏水性氨基酸。
更具体地，X2c可以是例如，丙氨酸或缬氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X1c可以是例如，蛋氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X2c可以是例如，丙氨酸。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL2序列，该CDRL2序列包括或由下式组成：
NAKTLXa11Xb11(SEQ ID NO:198)
Xa11可以是任何氨基酸或例如P或A，和；
Xb11可以是任何氨基酸或例如酸性氨基酸诸如E或D。
抗体或抗原结合片段还可包含例如CDRL2序列，所述CDRL2序列选自包括或由SEQID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:106和表3或表5B中所列的其它CDRL2组成的那些序列。
根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成：
X1dQX2dLEX3dPX4dT(SEQ ID NO:151)
其中X1d可以是例如，疏水性氨基酸；
其中X2d可以是例如，碱性氨基酸；
其中X3d可以是例如，酪氨酸或亮氨酸，和；
其中X4d可以是例如，芳香族氨基酸。
更具体地，X1d可以是例如，蛋氨酸或丙氨酸。在一个更具体的实施方案中，X1d可以是例如，蛋氨酸。
更具体地，X2d可以是，例如组氨酸或天冬酰胺。在一个更具体的实施方案中，X2d可以是例如，组氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X3d可以是例如，酪氨酸。
更具体地，X4d可以是例如，酪氨酸或苯丙氨酸。在一个更具体的实施方案中，X4d可以是例如，酪氨酸。
根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成：
QQWSSNPX1eT(SEQ ID NO:152)
其中X1e是脯氨酸或亮氨酸。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成：
QHYGXa12PLT(SEQ ID NO:199)
Xa12可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V。
根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成：Xa8QXb8LEXc8PYT(SEQ ID NO:203)，其中Xa8、Xb8和Xc8如本文所定义。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRL3序列，该CDRL3序列包括或由下式组成：QHHYGXa4PLT(SEQ ID NO:204)，其中Xa4如本文所定义。
抗体或抗原结合片段还可包括例如CDRL3序列，所述CDRL3序列选自包括或由SEQID NO:77、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:152和表3和表5B中所列的其它CDRL3组成的那些序列。
根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH1序列，该CDRH1序列包括或由下式组成：
GYTFX1fX2fYX3fMX4f(SEQ ID NO:153)
其中X1f可以是例如，苏氨酸或天冬酰胺；
其中X2f可以是例如，苏氨酸、精氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；
其中X3f可以是例如，色氨酸或天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，和；
其中X4f可以是例如，酪氨酸、组氨酸或天冬氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X1f可以是例如，苏氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X2f可以是例如，丝氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X3f可以是例如，色氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X4f可以是例如，组氨酸。
根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH1序列，该CDRH1序列包括或由下式组成：
GYTFTDYX5fMH(SEQ ID NO:154)
其中X5f可以是例如，酸性氨基酸。
更具体地，X5f可以是例如，谷氨酸或天冬氨酸。在一个更具体的实施方案中，X5f可以是例如，天冬氨酸。
根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH1序列，该CDRH1序列包括或由下式组成：GYTFTX1lYWMH(SEQ ID NO:205)，其中X1l如本文所定义。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH1序列，该CDRH1序列包括或由下式组成：GYTFTDYX1sMH(SEQ ID NO:208)，其中X1s如本文所定义。
抗体或抗原结合片段还可包含例如CDRH1序列，所述CDRH1序列选自包括或由SEQID NO:84、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102和表3或表5A所列的其它CDRH1组成的那些序列。
根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：
LINPX1gNX2gRX3gN(SEQ ID NO:155)
其中X1g可以是例如，中性疏水性氨基酸；
其中X2g可以是例如，丙氨酸或甘氨酸，和；
其中X3g可以是例如，脯氨酸或苏氨酸。
更具体地，X1g可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X1g可以是例如，苏氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X2g可以是例如，甘氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X3g可以是例如，苏氨酸。
根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：
X1hIDPETGGTA(SEQ ID NO:156)
其中X1h可以是例如，丙氨酸或苏氨酸。
根据一个更具体的实施方案，X1h可以是，例如，苏氨酸。
根据又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：
EIX1iPX2iX3iSX4iX5iN(SEQ ID NO:157)
其中X1i可以是例如，天冬氨酸或天冬酰胺；
其中X2i可以是例如，天冬氨酸或丝氨酸；
其中X3i可以是例如，天冬氨酸或丝氨酸；
其中X4i可以是例如，酪氨酸或苏氨酸，和；
其中X5i可以是例如，苏氨酸或异亮氨酸。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：
AXa13YPGNGDSR(SEQ ID NO:200)
Xa13可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如I或V。
根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：X1tIDPETGGTA(SEQ ID NO:206)，其中X1t如本文所定义。
根据本发明的又一个另外的实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：LINPX1mNX2mRX3mN(SEQ ID NO:207)，其中X1m、X2m和X3m如本文所定义。
根据本发明的又一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH2序列，该CDRH2序列包括或由下式组成：X1tIDPETGGTA(SEQ ID NO:209)，其中X1t如本文所定义。
抗体或抗原结合片段还可包括例如CDRH2序列，所述CDRH2序列选自包括或由SEQID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:109和表3或表5A所列的其它CDRH2组成的那些序列。
根据另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH3序列，该CDRH3序列包括或由下式组成：
TX1jFYYX2jX3jX4jNYDVGFAY(SEQ ID NO:158)
其中X1j可以是例如，中性亲水性氨基酸；
其中X2j可以是例如，中性亲水性氨基酸；
其中X3j可以是例如，酪氨酸或组氨酸，和；
其中X4j可以是例如，酪氨酸或丝氨酸。
更具体地，X1j可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X1j可以是例如，丝氨酸。
更具体地，X2j可以是例如，丝氨酸或苏氨酸。在一个更具体的实施方案中，X2j可以是例如，苏氨酸。
在一个更具体的实施方案中，X3j可以是例如，酪氨酸。在一个更具体的实施方案中，X4j可以是例如，丝氨酸。
根据本发明的另一个实施方案，抗体或抗原结合片段可包含CDRH3序列，该CDRH3序列包括或由下式组成：TX1vFYYX2vX3vX4vNYDVGFAY(SEQ ID NO:210)，其中X1v、X2v、X3v和X4v如本文所定义。
抗体或抗原结合片段可包括例如CDRH3序列，所述CDRH3序列选自包括或由SEQ IDNO:74、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:116和表3或表5A所列的其它CDRH3组成的那些序列。
本文所描述的重链和/或轻链的框架区可来源于本文所示出的框架区中的一个或多个。因此抗体或抗原结合片段可包含本文所描述的CDR中的一个或多个(例如，选自特异性的CDR或选自共有CDR SEQ ID NO:148-158和197-210)和来源于本文所示出的轻链可变区或重链可变区的框架区。
在本发明的一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段)：
X1kX2kQX3kQQX4kX5kX6kEX7kVX8kPGASVKLSCKASGYTFTX1lYWMHWVKQRPGQGLEWIGLINPX1mNX2mRX3mNYNEX1nFX2nX3nKATLTVDKSSSTAYMX4nLSSLTSEDSAVYYCARGGDGDYFDYWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:191)
其中X1k可以是例如Q或E；
X2k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或I；
X3k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或L；
X4k可以是任何氨基酸或例如P或S；
X5k可以是任何氨基酸或例如R或G；
X6k可以是任何氨基酸或例如A或T；
X7k可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如L或I；
X8k可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如R或K；
X1l可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如例如S或T；
X1m可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如T或S；
X2m可以是任何氨基酸或例如G或A；
X3m可以是任何氨基酸或例如P或T；
X1n可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或R；
X2n可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如N或K；
X3n可以是任何氨基酸或例如N或中性亲水性氨基酸诸如S或T，和；
X4n可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如Q或H。
在本发明的另一个实施方案，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段)：
X1oVX2oLQQSGAELARPGASVKFSCKASGYTFTRNWIQWVKQRPGQGLEWIGAXa13YPGNGDSRYTQKFKGKATLTADKSSX1qTAYMQLX2qX3qLX4qSEDSAVYYCARLAGNYAYYFDYWGQGTALT VSS(SEQ ID NO:192)
其中X1o可以是例如Q或D；
X2o可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或Q；
Xa13可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如I或V；
X1q可以是任何氨基酸或例如S或N；
X2q可以是任何氨基酸或例如S或N；
X3q可以是任何氨基酸或例如G或S，和；
X4q可以是任何氨基酸或例如A或S。
在本发明的又一个另外的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的重链可变区(或片段)：
X1rX2rX3rLQQSGX4rELVRPGASVTLSCKASGYTFTDYX1sMHWVKQTPVHGLEWIGX1tIDPETGGTAYNQKFKGKATLTADX1uSSX2uTAYMELSSLTSEDSAVYYCTX1vFYYX2vX3vX4vNYDVGFAYWG QGTLVTVSA(SEQ ID NO:193)
其中X1r可以是例如E或Q；
X2r可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或I；
X3r可以是任何氨基酸或例如Y或Q；
X4r可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V；
X1s可以是任何氨基酸或酸性氨基酸诸如例如D或E；
X1t可以是任何氨基酸或例如A或T；
X1u可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如K或R；
X2u可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T；
X1v可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T；
X2v可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如T或S；
X3v可以是任何氨基酸或例如Y或H，和；
X4v可以是任何氨基酸或例如S或Y。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)：
DIVMTX1wAX2wFSNPVX3wLGTX4wASISCRSSX1xSLLHSNGX2xTYLYWYLQKPGQSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSX1ySGSGTX2yFTLRISRVEAEDVGVYYCXa8QXb8LEXc8PYTFGXa 9GTKLEIK(SEQ ID NO:194)
其中X1w可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如Q或H；
X2w可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或A；
X3w可以是任何氨基酸或例如T或I；
X4w可以是任何氨基酸或例如S或P；
X1x可以是任何氨基酸或例如E或K；
X2x可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或I；
X1y可以是任何氨基酸或例如S或G；
X2y可以是任何氨基酸或例如D或A；
Xa8可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如M或A；
Xb8可以是任何氨基酸或碱性氨基酸诸如例如N或H；
Xc8可以是任何氨基酸或例如Y或L，和；
Xa9可以是任何氨基酸或例如G或S。
在另一个实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)：
X1zIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASXa10NIXb10Xc10YLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLXa11Xb11GVXa3Xb3RFSGSGSGTQXc3SLKINXd3LQPEDFGSYXe3CQHHYGXa4PLTFGXa5GTKXb5ELK(SEQ ID NO:195)
其中X1z可以是任何氨基酸或例如D或N；
Xa10可以是任何氨基酸或例如E或G；
Xb10可以是任何氨基酸或例如Y或H；
Xc10可以是任何氨基酸或例如S或N；
Xa1111可以是任何氨基酸或例如P或A；
Xb11可以是任何氨基酸或酸性氨基酸诸如例如E或D；
Xa3可以是任何氨基酸或例如P或S；
Xb3可以是任何氨基酸或例如V或S；
Xc3可以是任何氨基酸或芳香族氨基酸诸如例如F或Y；
Xd3可以是任何氨基酸或例如N或S；
Xe3可以是任何氨基酸或例如H或Y；
Xa4可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如A或V；
Xa5可以是任何氨基酸或例如S或A，和；
Xb5可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如V或L。
在又一个另外的实施方案中，本发明的抗体或抗原结合片段可包含具有下式的轻链可变区(或片段)：
DIVMTQAAPSVPVTPGESVSISCRSXa6KSLLHSNGNTYLYWFLQRPGQSPQLLIYRMSNLASGVPDRFSGSGSGTAFTLRXa7SRVEAEDVGVYYCMQHLEYPFTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:196)
其中Xa6可以是任何氨基酸或中性亲水性氨基酸诸如例如S或T，和；
Xa7可以是任何氨基酸或疏水性氨基酸诸如例如I或L。
【与Siglec-15结合的抗体】
在本发明的某些实施方案中，与Siglec-15结合的抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型。在优选的实施方案中，抗体是IgG2亚型的抗体。在本实施方案中，抗体是IgG2亚型的人源化抗体，其在阻断破骨细胞表面上正常Siglec-15功能的生物活性中具有生物学活性。所述阻断，例如，可防止Siglec-15与其底物、其配体、其自身或相邻细胞上的其它蛋白质缔合。
本发明公开了一系列与Siglec-15结合的抗体。在某些实施方案中，抗体由单克隆抗体和其具有免疫学功能的片段组成，诸如嵌合和人源化单克隆抗体、抗体片段、单链抗体、结构域抗体和具有抗原结合区的多肽。
典型的抗原结合位点包括由免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的配对形成的可变区。抗体可变区的结构是非常一致的并表现出非常相似的结构。这些可变区通常包括相对同源的框架区(FR)，其与称作互补决定区(CDR)的3个高变区间隔。虽然抗原结合片段的总结合活性受CDR序列的支配，但FR在对于最优抗原结合的CDR的合适的定位和三维排列中起关键作用。
表1公开了与抗Siglec-15抗体的特定实例的完整的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链对应的核苷酸和氨基酸的序列。
表1-与Siglec-15结合的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整序列
抗体名称 链类型 核苷酸序列(SEQ ID NO:) 氨基酸序列(SEQ ID NO:)
25A1 轻链(L) 5 6
25A1 重链(H) 7 8
25B4 轻链 9 10
25B4 重链 11 12
25B8 轻链 13 14
25B8 重链 15 16
25C1 轻链 17 18
25C1 重链 19 20
25D8 轻链 21 22
25D8 重链 23 24
25E5 轻链 25 26
25E5 重链 27 28
25E6 轻链 29 30
25E6 重链 31 32
25E9 轻链 33 34
25E9 重链 35 36
与Siglec-15结合的抗体可包括表1所列的任何一个L链和任何一个H链免疫球蛋白。在某些实施方案中，抗体25A1的轻链可与25A1的重链或25B4的重链组合而形成具有Siglec-15结合活性的完整的抗体。在本发明的一个示例性实施方案中，可将25A1L链与25A1H链组合，可将25B4L链与25B4H链组合，可将25B8L链与25B8H链组合，可将25C1L链与25C1H链组合，可将2D8L链与25D8H链组合，可将25E5L链与25E5H链组合，可将25E6L链与25E6H链组合，或将25E9L链与25E9H链组合。此外，抗体或抗原结合片段的一些实例可由来自表1中所列的一系列抗体的两个L链和任两个H链的任何组合组成。
SEQ ID NO:5和7分别显示了抗体25A1的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:6和8分别显示了抗体25A1的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:8中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:6中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:6或其变体的两条相同的或基本上相同的25A1轻链，和含有SEQ ID NO:8或其变体的两条相同的或基本上相同的25A1重链。
SEQ ID NO:9和11分别显示了抗体25B4的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:10和12分别显示了抗体25B4的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:12中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:10中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:10或其变体的两条相同的或基本上相同的25B4轻链，和含有SEQ ID NO:12或其变体的两条相同的或基本上相同的25B4重链。
SEQ ID NO:13和15分别显示了抗体25B8的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:14和16分别显示了抗体25B8的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:16中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:14中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:14或其变体的两条相同的或基本上相同的25B8轻链，和含有SEQ ID NO:16或其变体的两条相同的或基本上相同的25B8重链。
SEQ ID NO:17和19分别显示了抗体25C1的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:18和20分别显示了抗体25C1的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:20中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:18中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:18或其变体的两条相同的或基本上相同的25C1轻链，和含有SEQ ID NO:20或其变体的两条相同的或基本上相同的25C1重链。
SEQ ID NO:21和23分别显示了抗体25D8的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:22和24分别显示了抗体25D8的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:24中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:22中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:22或其变体的两条相同的或基本上相同的25D8轻链，和含有SEQ ID NO:24或其变体的两条相同的或基本上相同的25D8重链。
SEQ ID NO:25和27分别显示了抗体25E5的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:26和28分别显示了抗体25E5的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:28中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:26中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:26或其变体的两条相同的或基本上相同的25E5轻链，和含有SEQ ID NO:28或其变体的两条相同的或基本上相同的25E5重链。
SEQ ID NO:29和31分别显示了抗体25E6的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:30和32分别显示了抗体25E6的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:32中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:30中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:30或其变体的两条相同的或基本上相同的25E6轻链，和含有SEQ ID NO:32或其变体的两条相同的或基本上相同的25E6重链。
SEQ ID NO:33和35分别显示了抗体25E9的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的完整的核苷酸序列，并且SEQ ID NO:34和36分别显示了抗体25E9的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链的对应的氨基酸序列。因此，在一个示例性实施方案中，与Siglec-15结合的抗体可包含与示于SEQ ID NO:36中的重链氨基酸序列组合的示于SEQ ID NO:34中的轻链氨基酸。在另一个实施方案中，抗体可包含含有SEQ ID NO:34或其变体的两条相同的或基本上相同的25E9轻链，和含有SEQ ID NO:36或其变体的两条相同的或基本上相同的25E9重链。
还提供了通过每个与表1中所列的氨基酸序列可独立地具有至少80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的免疫球蛋白轻链和/或免疫球蛋白重链的组合所形成的其它抗Siglec-15抗体或抗原结合片段的变体。在某些实施方案中，抗体变体可包含至少一条轻链和一条重链。在其它实例中，抗体变体可包含两条相同的或基本上相同的轻链和两条相同的或基本上相同的重链。根据本发明，变化的区可位于恒定区或位于可变区。还根据本发明，变化的区可位于框架区。
本发明还涵盖包含轻链和重链的抗体，所述轻链包含表1中所列的轻链序列的可变区或其变体中的一个，并且所述重链包含表1中所列的重链序列的可变区或其变体中的一个。轻链和重链可包含恒定区。本发明还涵盖表1的轻链和重链的组合。
本发明中还提供了含有轻链可变区和重链可变区的抗体或抗原结合片段。此外，某些实施方案包括这些轻链可变区和重链可变区的抗原结合片段、变体和衍生物。
本发明的又一个另外的实施方案包括能够与SEQ ID NO:2或其变体特异性结合的分离的抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
a.SEQ ID NO:38中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:40中限定的重链可变域；
b.SEQ ID NO:42中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:44中限定的重链可变域；
c.SEQ ID NO:46中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:48中限定的重链可变域；
d.SEQ ID NO:50中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:52中限定的重链可变域；
e.SEQ ID NO:54中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:56中限定的重链可变域；
f.SEQ ID NO:58中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:60中限定的重链可变域；
g.SEQ ID NO:62中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:64中限定的重链可变域；
h.SEQ ID NO:66中限定的轻链可变域和SEQ ID NO:68中限定的重链可变域；
本文中应理解地是，以上所提供的特定组合的轻链可变区可被替换为任何其它轻链可变区(尤其是表2中的那些)。同样地，以上所提供的特定组合的重链可变区可替换为任何其它重链可变区(尤其是表2中的那些)。
本发明还提供了含有轻链可变区和重链可变区的抗体，此外，某些实施方案包括这些轻链可变区和重链可变区的抗原结合片段、变体和衍生物。表2中公开了这些轻链可变区和重链可变区中存在的序列的实例。
表2-与Siglec-15结合的轻链可变区和重链可变区的序列
抗体名称 链类型 核苷酸序列(SEQ ID NO:) 氨基酸序列(SEQ ID NO:)
25A1 轻链(L) 37 38
25A1 重链(H) 39 40
25B4 轻链 41 42
25B4 重链 43 44
25B8 轻链 45 46
25B8 重链 47 48
25C1 轻链 49 50
25C1 重链 51 52
25D8 轻链 53 54
25D8 重链 55 56
25E5 轻链 57 58
25E5 重链 59 60
25E6 轻链 61 62
25E6 重链 63 64
25E9 轻链 65 66
25E9 重链 67 68
25B02 轻链 161 162
25B02 重链 163 164
25D11 轻链 165 166
25D11 重链 167 168
25E10 轻链 169 170
25E10 重链 171 172
因此，与Siglec-15结合的抗体和抗原结合片段可包含同一指定的抗体的一个轻链可变区和一个重链可变区，或任何组合。例如，在一个示例性实施方案中，抗Siglec-15抗体或片段可包含25A1轻链可变区(SEQ ID NO:38)和25A1重链可变区(SEQ ID NO:40)。在一个可选的实施方案中，抗Siglec-15抗体或片段可包含25A1轻链可变区(SEQ ID NO:38)和25B4重链可变区(SEQ ID NO:44)。在另一个实施方案中，抗Siglec-15抗体可包含两个相同的或基本上相同的轻链可变区和两个相同的或基本上相同的重链可变区。在又一个另外的实施方案中，抗Siglec-15抗体可包含两个不同的轻链可变区和两个不同的重链区。
还提供了通过每个与表2、表5A和5B中所列的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％同一性的轻链可变区和/或重链可变区的组合而形成的其它抗Siglec-15抗体的变体。本领域中的那些技术人员还将认识到抗Siglec-15抗体变体可包含表2所列的轻链可变区和/或重链可变区的氨基酸序列中的保守性氨基酸替换、氨基酸置换、缺失或增加。
表3-轻链CDR和重链CDR的序列
在本发明的某些实施方案中，抗Siglec-15抗体或抗原结合片段可包含表3中所显示的CDR序列或与表3中的CDR序列具有高度序列同一性。在一个示例性实施方案中，25A1抗Siglec-15抗体可包含含有分别由SEQ ID NO:68、69和70所编码的CDR1、2和3的轻链可变区，和/或含有分别由SEQ ID NO:71、72和73所编码的CDR1、2和3的重链可变区。在其它实施方案中，CDR3区可足以提供抗原结合。因此本发明涵盖包含CDRL3或CDRH3或CDRL3和CDRH3二者的多肽。
此外，抗Siglec-15抗体或抗原结合片段可包含表3中所列的CDR的任何组合。例如，抗体或抗原结合片段可包含轻链CDR3和重链CDR3。理解地是，抗Siglec-15抗体或抗原结合片段中所包含的CDR可以是与表3中所存在的CDR序列具有80％、85％、90％或95％序列同一性的变体CDR。本领域中的那些技术人员还将认识到变体可包含表3中所列的CDR序列中的保守性氨基酸替换、氨基酸置换、缺失或增加。
本发明的其它示例性实施方案包括能够与SEQ ID NO:2或其变体(与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸或与第49位至第165位氨基酸具有至少80％同一性的变体)特异性结合的分离的抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
a.表5B中所列的轻链可变域中的3个CDR和表5A中所列的重链可变域的3个CDR；
b.SEQ ID NO:194中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:191中所限定的重链可变域的3个CDR；
c.SEQ ID NO:195中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:192中所限定的重链可变域的3个CDR；
d.SEQ ID NO:196中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:193中所限定的重链可变域的3个CDR；
e.SEQ ID NO:38中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:40中所限定的重链可变域的3个CDR；
f.SEQ ID NO:42中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:44中所限定的重链可变域的3个CDR；
g.SEQ ID NO:46中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:48中所限定的重链可变域的3个CDR；
h.SEQ ID NO:50中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:52中所限定的重链可变域的3个CDR
i.SEQ ID NO:54中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:56中所限定的重链可变域的3个CDR；
j.SEQ ID NO:58中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:60中所限定的重链可变域的3个CDR；
k.SEQ ID NO:62中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:64中所限定的重链可变域的3个CDR；
l.SEQ ID NO:66中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:68中所限定的重链可变域的3个CDR；
m.SEQ ID NO:162中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:164中所限定的重链可变域的3个CDR,
n.SEQ ID NO:166中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:168中所限定的重链可变域的3个CDR；
o.SEQ ID NO:170中所限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:172中所限定的重链可变域的3个CDR。
在另一方面，本发明涉及能够与Siglec-15或其变体(与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸或第49位至第165位氨基酸具有至少80％同一性的变体)特异性结合的分离的抗体或抗原结合片段，所述抗体包含：
a)与表5B中所列的序列具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与表5A中所列的序列具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
b)与SEQ ID NO:194具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:191具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
c)与SEQ ID NO:195具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:192具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
d)与SEQ ID NO:196具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:193具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
e)与SEQ ID NO:38具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:40具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域，
f)与SEQ ID NO:42具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:44具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
g)与SEQ ID NO:46具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:48具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
h)与SEQ ID NO:50具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:52具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
i)与SEQ ID NO:54具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:56具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
j)与SEQ ID NO:58具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:60具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
k)与SEQ ID NO:62具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:64具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域，
l)与SEQ ID NO:66具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:68具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域，
m)与SEQ ID NO:162具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:164具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域，
n)与SEQ ID NO:166具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:168具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域；
o)与SEQ ID NO:170具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:172具有至少70％(75％、80％、85％、90％、95％、100％)序列同一性的重链可变域。
同样，以上所提供的特定组合的轻链可变区可替换为本文所描述的任何其它轻链可变区。同样地，以上所提供的特定组合的重链可变区可替换为本文所描述的任何其它重链可变区。
【变体抗体和抗原结合片段】
本发明还涵盖本文所描述的抗体或抗原结合片段的变体。所包括的变体抗体或抗原结合片段是在氨基酸序列中具有变化的那些。例如，所包括的变体抗体或抗原结合片段是具有至少一个变体CDR(2个、3个、4个、5个、6个和多达12个变体CDR)、变体轻链可变域、变体重链可变域、变体轻链和/或变体重链的那些。本发明中所包括的变体抗体或抗原结合片段是，例如，与原始抗体或抗原结合片段相比较具有相似的或提高的结合亲和力的那些。
如本文所用的术语“变体”适用于本文所描述的任何序列，且包括例如，变体CDR(CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3)、变体轻链可变域、变体重链可变域、变体轻链、变体重链、变体抗体、变体抗原结合片段和SEQ ID NO:2变体。
本发明还涵盖的变体抗体或抗原结合片段是可能包含***、缺失或氨基酸置换(保守性的或非保守性的)的那些。这些变体可在其氨基酸序列中去除至少一个氨基酸残基并在该位置***了不同的残基。
置换诱变最感兴趣的位点包括高变区(CDR)，但也考虑框架区或甚至恒定区中的改变。可通过将来自以下所列的组(组1至6)之一的(CDR、可变链、抗体等的)氨基酸替换为相同的组的另一个氨基酸来进行保守性置换。
一般，CDR中的突变比框架区中的突变对抗体或抗原结合片段的抗原结合活性具有更大影响。本发明所涵盖的变体抗体或抗原结合片段是与本文所呈现的那些具有基本上相同的(包括相似的、相同的或稍微较少的)抗原结合能力或比本文所呈现的那些具有更好的抗原结合能力的那些。
保守性置换的其它示例性实施方案以标题“优选的置换”示出在表1A中。如果该置换产生了不想要的性质，则可将表1A中命名为“示例性置换”的、或如下文中关于氨基酸种类所进一步描述的更多的替换引入并筛选产物。
本领域中已知的可通过置换诱变来产生变体且该变体保留了本发明的多肽的生物学活性。这些变体可在其氨基酸序列中去除了至少一个氨基酸残基并在该位置***了不同的残基。例如，置换诱变的一个目标位点可包括其中获自不同的物种的特定的残基为相同的位点。被确定为“保守性置换”的置换的例子示于表1A中。如果该置换导致了不需要的改变，则将表1A中命名为“示例性置换”的或如本文关于氨基酸种类所进一步描述的其它类型的置换引入并筛选产物。
通过选择置换来实现功能或免疫学同一性中的大量改变，所述置换对于其维持以下的作用显著不同：(a)置换区中多肽骨架的结构，例如，作为折叠或螺旋构象。(b)靶位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。基于常见的侧链性质将天然存在的残基分成以下的组：
(组1)疏水性的：正亮氨酸、蛋氨酸(Met)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、异亮氨酸(Ile)
(组2)中性亲水性的：半胱氨酸(Cys)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)
(组3)酸性的：天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)
(组4)碱性的：天冬酰胺(Asn)、谷氨酰胺(Gln)、组氨酸(His)、赖氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)
(组5)影响侧链定向的残基：甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)；和
(组6)芳香族的：色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)
非保守性置换将这些种类之一中的一员替换为另一员。
表1A氨基酸置换
原始残基 示例性置换 保守性置换
Ala(A) Val、Leu、Ile Val
Arg(R) Lys、Gln、Asn Lys
Asn(N) Gln、His、Lys、Arg、Asp Gln
Asp(D) Glu、Asn Glu
Cys(C) Ser、Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp、Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn、Gln、Lys、Arg、 Arg
Ile(I) Leu、Val、Met、Ala、Phe、正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸、Ile、Val、Met、Ala、Phe Ile
Lys(K) Arg、Gln、Asn Arg
Met(M) Leu、Phe、Ile Leu
Phe(F) Leu、Val、Ile、Ala、Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Ser Ser
Trp(W) Tyr、Phe Tyr
Tyr(Y) Trp、Phe、Thr、Ser Phe
Val(V) Ile、Leu、Met、Phe、Ala、正亮氨酸 Leu
变体抗体或抗原结合片段的氨基酸序列中的变化可包括氨基酸增加、缺失、***、置换等，一个或多个氨基酸的骨架或侧链中的一个或多个改变、或基团或另一分子增加到一个或多个氨基酸(侧链或骨架)。
变体抗体或抗原结合片段与原始抗体或抗原结合片段氨基酸序列相比较在其氨基酸序列上可具有高度序列相似性和/或序列同一性。两个序列之间的相似性的程度基于同一性(相同的氨基酸)的百分比和保守性置换的百分比。
一般，本文利用Blast2序列程序(Tatiana A.Tatusova,Thomas L.Madden(1999),"Blast 2sequences-a new tool for comparing protein and nucleotidesequences(Blast 2序列—用于比较蛋白序列和核苷酸序列的一种新型工具)",FEMSMicrobiol Lett.174:247-250)，利用缺省设置，即，blastp程序，BLOSUM62矩阵(开放空位(open gap)11和延伸空位罚值(extention gap penalty)1；gapx dropoff 50，期望值(expect)10.0，字长(word size)3)和激活的过滤器已确定了可变链之间的相似性和同一性的程度。
因此同一性百分比将表示与原始肽相比相同的且可占据相同或相似位置的氨基酸。
相似性百分比将表示与原始肽相比相同的氨基酸并且在相同或相似位置处被保守性氨基酸置换所替换的氨基酸。
因此本发明的变体(即，类似物)(包括VL变体、VH变体、CDR变体、抗体变体、多肽变体等)包括与原始序列或原始序列的部分可具有至少70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的那些。
根据本发明，SEQ ID NO:2变体包括具有与SEQ ID NO:2的第49位-第165位氨基酸或与第20位-第259位氨基酸具有至少80％同一性的区的多肽。SEQ ID NO:2的变体还包括与SEQ ID NO:2具有至少80％序列同一性的多肽。
变体的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少81％序列同一性和与原始序列或原始序列的部分具有81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
变体的其它示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少82％序列同一性并与原始序列或原始序列的部分具有82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
变体的其它示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少85％序列同一性并与原始序列或原始序列的部分具有85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
变体的其它示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少90％序列同一性并与原始序列或原始序列的部分具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
变体的另外的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少95％序列同一性并与原始序列或原始序列的部分具有95％、96％、97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
变体的又一些另外的示例性实施方案是与本文所描述的序列具有至少97％序列同一性并与原始序列或原始序列的部分具有97％、98％、99％或100％序列相似性的那些。
为了简明的目的，申请人在本文提供了表1B，其示出了本发明所涵盖的单独的变体的示例性实施方案，并包括具体的％序列同一性和％序列相似性。每个“X”应解释为限定了给定的变体。
如本文所用，术语“相同的”意为序列与另一序列共有100％序列同一性。
如本文所用，术语“基本上相同的”意为序列与另一序列或另一序列的部分共有70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性。
本发明涵盖与本文所描述的序列具有至少80％同一性的CDR、轻链可变域、重链可变域、轻链、重链、抗体和/或抗原结合片段。
本发明的抗体或抗原结合片段的示例性实施方案是包含轻链可变域的那些，所述轻链可变域包括选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:38至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:42至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:46至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:50至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:54至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:58至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:62至少70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:66 70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQID NO:162 70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列、与SEQ ID NO:166 70％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列和与SEQ ID NO:17070％(包括80％、85％、90％、95％和100％相同的)相同的序列。
这些轻链可变域可包含与SEQ ID NO:69至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ IDNO:70至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:71至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:69可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:69可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:70至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:70可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:71可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:71可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:75至少80％相同的CDRL1序列、与SEQID NO:76至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:77至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:75可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:75可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:76可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:76可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包括与SEQ IDNO:77可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:77可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:81至少80％相同的CDRL1序列、与SEQID NO:82至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:83至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:81可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:81可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:82可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:82可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:83可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:83可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:87至少80％相同的CDRL1序列、与SEQID NO:88至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:89至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:87可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:87可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:88可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:88可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:89可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:89可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:93至少80％相同的CDRL1序列、与SEQID NO:94至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:95至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:93可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:93可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:94可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:94可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:95可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:95可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:99至少80％相同的CDRL1序列、与SEQID NO:100至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:101至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:99可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:99可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:100可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:100可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:101可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:101可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:105至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ ID NO:106至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:107至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:105可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:105可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:106可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:106可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:107可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:107可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:111至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ ID NO:112至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:113至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:111可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:111可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:112可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:112可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:113可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:113可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:173至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ ID NO:174至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:175至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:173可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:173可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:174可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:174可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:175可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:175可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:179至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ ID NO:180至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:181至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:179可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:179可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:180可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:180可至少100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:181可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:181可100％相同的CDRL3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:185至少80％相同的CDRL1序列、与SEQ ID NO:186至少80％相同的CDRL2序列和与SEQ ID NO:187至少80％相同的CDRL3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:185可至少90％相同的CDRL1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:185可100％相同的CDRL1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:186可至少90％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:186可100％相同的CDRL2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:187可至少90％相同的CDRL3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包括与SEQ IDNO:187可至少100％相同的CDRL3序列。在一个示例性实施方案中，抗体或抗原结合片段可包含重链可变域，所述重链可变域包括选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:40至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:44至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:48至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:52至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:56至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:60至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:64至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:68至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:164至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列、与SEQ ID NO:168至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列和与SEQ ID NO:172至少70％相同的(包括80％、85％、90％、95％、100％相同的)序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:72至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:73至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:74至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:72可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:72可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:73可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:73可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:74可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:74可100％相同的CDRH3序列。
以上所列的重链可变域可包含与SEQ ID NO:78至少80％相同的CDRH1序列、与SEQID NO:79至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:80至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:78可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:78可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:79可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:79可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:80可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:80可100％相同的CDRH3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:84至少80％相同的CDRH1序列、与SEQID NO:85至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:86至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:84可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:84可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:85可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:85可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:86可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:86可100％相同的CDRH3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:90至少80％相同的CDRH1序列、与SEQID NO:91至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:92至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:90可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:90可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:91可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:91可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:92可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:92可100％相同的CDRH3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:96至少80％相同的CDRH1序列、与SEQID NO:97至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:98至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:96可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:96可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:97可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:97可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:98可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:98可100％相同的CDRH3序列。
以上所列的轻链可变域可包含与SEQ ID NO:102至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ ID NO:103至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:104至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:102可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:102可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:103可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:103可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:104可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:104可100％相同的CDRH3序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:108至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:109至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:110至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:108可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:108可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:109可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:109可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包包含与SEQ ID NO:110可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:110可100％相同的CDRH3序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:114至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:115至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:116至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:114可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:114可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:115可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:115可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:116可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:116可100％相同的CDRH3序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:176至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:177至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:178至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:176可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:176可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:177可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:177可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:178可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:178可100％相同的CDRH3序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:182至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:183至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:184至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:182可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:182可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:183可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:183可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:184可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的又一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:184可100％相同的CDRH3序列。
这些重链可变域可包含与SEQ ID NO:188至少80％相同的CDRH1序列、与SEQ IDNO:189至少80％相同的CDRH2序列和与SEQ ID NO:190至少80％相同的CDRH3序列。
在本发明的一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:188可至少90％相同的CDRH1序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:188可100％相同的CDRH1序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:189可至少90％相同的CDRH2序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:189可100％相同的CDRH2序列。
在本发明的又一个另外的示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ ID NO:190可至少90％相同的CDRH3序列。
在本发明的另一个示例性实施方案中，本文所提供的任何抗体可包含与SEQ IDNO:190可100％相同的CDRH3序列。
【细胞中抗体的产生】
本文所公开的抗体可通过本领域中的技术人员熟悉的多种方法来制备，比如杂交瘤方法或通过重组DNA方法。
在本发明的一个示例性实施方案中，抗体可通过常规杂交瘤技术来产生，其中用抗原使小鼠免疫、分离脾细胞并将其与缺乏HGPRT表达的骨髓瘤细胞融合，并通过含次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸腺嘧啶(HAT)的培养基选择杂交细胞。
在本发明的又一个示例性实施方案中，抗体可通过重组DNA方法来产生。
为表达抗体，可将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列***到表达载体中，所述表达载体即，含有用于特定的宿主中所***的编码序列的转录和翻译控制的元件的载体。这些元件可包括调控序列，比如增强子、组成型和诱导型启动子和5′和3′非翻译区。可使用本领域中的技术人员熟知的方法来构建这类表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。
本领域中的技术人员已知的多种表达载体/宿主细胞***可用于表达来源于能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列的多肽或RNA。这些包括但不限于，微生物，诸如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用杆状病毒载体感染的昆虫细胞***；用病毒或细菌表达载体转化的植物细胞***；或动物细胞***。为在哺乳动物***中进行重组蛋白的长期产生，细胞系中稳定的表达可能是有效的。例如，利用可含有复制的病毒起始点和/或内源性表达元件和在相同上或不同载体上的可选择的或可见的标记基因的表达载体可将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列转化到细胞系中。本发明不限于所用的载体或宿主细胞。在本发明的某些实施方案中，可将每个能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列连接到独立的表达载体中并独立地表达每个链。在另一个实施方案中，可将能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的轻链和重链连接到单一表达载体中并同时表达。
可选地，分别利用体外转录***或联合的体外转录/翻译***可从包含能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列的载体中表达RNA和/或多肽。
一般，可通过本领域中技术人员已知的多种方法来鉴定含有能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列和/或表达由能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个或其部分的核苷酸序列所编码的多肽的宿主细胞。这些方法包括但不限于，DNA/DNA杂交或DNA/RNA杂交、PCR扩增和包括基于膜、溶液或芯片的技术的蛋白质生物测定或免疫测定技术以用于检测和/或定量核酸或氨基酸序列。利用特定的多克隆抗体或单克隆抗体检测和测量多肽的表达的免疫学方法是本领域中已知的。这样的技术的实例包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。本领域中的技术人员可容易地使这些方法适合于本发明。
因此可在用于转录对应的RNA(mRNA、siRNA、shRNA等)和/或从细胞培养物表达多肽的条件下培养包含能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列的宿主细胞。通过细胞产生的多肽可以是分泌的或可以是根据所使用的序列和/或载体在细胞内保留的。在一个示例性实施方案中，可将含有能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列的表达载体设计为含有指导多肽通过原核或真核细胞膜进行分泌的信号序列。
由于遗传密码的固有简并性，可产生并使用编码相同的、基本上相同的或功能上等同的氨基酸序列的其它DNA序列，例如，以表达通过能够编码本文所描述的免疫球蛋白轻链和免疫球蛋白重链中任何一个的核苷酸序列所编码的多肽。可利用本领域中一般已知的方法对本发明的核苷酸序列进行工程化以改变核苷酸序列以用于多种目的，所述目的包括但不限于，克隆、加工的改变和/或基因产物的表达。通过随机断裂的DNA改组和基因片段和合成的寡核苷酸的PCR再组装可用于对核苷酸序列进行工程化。例如，寡核苷酸介导的定点诱变可用于引入突变，所述突变创建新限制性位点、改变糖基化方式、改变密码子偏好、产生剪接变体等。
另外，可选择宿主细胞株的调节所***的序列的表达或以需要的方式加工所表达的多肽的能力。这种多肽的修饰包括但不限于，乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂质化和酰化。在一个示例性实施方案中，含有特定的糖基化结构或型式的抗体可能是需要的。还可使用切割多肽的“前原(prepro)”形式的翻译后加工来指定蛋白质靶向、折叠和/或活性。具有用于翻译后活性的特定的细胞机器和特征性机制的不同的宿主细胞(例如，CHO、HeLa、MDCK、HEK293和W138)可从商业上和从美国菌种保藏中心(ATCC)获得，并可对其选择以确保对所表达的多肽的正确修饰和加工。
因为杂交瘤细胞是杂交的小鼠细胞，其严格地用于产生鼠类抗体。清楚地是，所述鼠类抗体的糖基侧链可能显著不同于在人细胞中观察到的糖基化形式。人细胞和杂交瘤之间磷酸化型式的差异也对抗体的活性具有影响。并且，对人施用鼠类抗体常常诱导抗抗体免疫反应，其可能中和鼠类抗体可能具有的任何生物活性。
为使人免疫***对鼠类抗体的识别最小化，或为提高抗体在人中的生物活性，有利地将鼠类抗体转化为部分(例如，嵌合的)或完全人源化抗体。因此可将(部分或完全)人源化抗体的轻链和重链的重组形式引入到除杂交瘤细胞外的哺乳动物表达***(比如293细胞、CHO或其它)中。哺乳动物表达***可获得的优点为所得的糖基化型式更接近抗体的天然存在的人形式的糖基化型式。
例如，在溶解性IgG1抗体的情况下，免疫球蛋白链的合适的糖基化是效应器功能所需的。IgG1单克隆抗体的这些生物学功能包括抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和补体依赖性细胞毒性(CDC)，二者均将受在哺乳动物细胞中的表达过程中迁移至氨基酸的糖基侧链的类型的极大影响。
此外，与杂交瘤相比较，优化的哺乳动物细胞表达***将通常显著地分泌更大量的抗体。因此，采用人细胞进行制备具有实际的和可能的经济学原因。
本领域中的技术人员将容易地理解，可将天然的、经改变的或重组的核酸序列连接到异源序列，从而导致在前述任何宿主***中含异源多肽部分的融合多肽的翻译。利用商业上可获得的亲和基质，所述异源多肽部分可促进融合多肽的纯化。所述部分包括但不限于，谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白、钙调蛋白结合肽、6-His(His)、FLAG、c-myc、血凝素(HA)和抗体表位诸如单克隆抗体表位。
在又一个另外的方面，本发明涉及多核苷酸，所述多核苷酸可包括编码融合蛋白的核苷酸序列。所述融合蛋白可包括与本文所描述的多肽(例如，完整的轻链、完整的重链、可变区、CDR等)融合的融合配偶体(例如，HA、Fc等)。
本领域中的技术人员还将容易地认识到，利用本领域中熟知的化学方法或酶促方法可全部地或部分地合成核酸和多肽序列。例如，利用多种固相技术可进行肽合成，和诸如ABI 431A肽合成仪(PE Biosystems)的机器可用来使合成自动化。如果需要的话，在合成过程中可改变氨基酸序列和/或将氨基酸序列与来自其它蛋白质的序列相组合以产生变体蛋白质。
【抗体偶联物】
虽然对于检测或治疗目的并不总是需要，可将本发明的抗体或抗原结合片段与可检测部分(即，用于检测或诊断目的)或与治疗性部分(以用于治疗目的)偶联。
对于检测目的，未偶联的抗体(一抗)可用于与抗原结合，并可添加携带可检测部分并能够与一抗结合的二抗。然而，如以上所示，可将抗SIGLEC 15抗体与可检测标签偶联，且从而二抗可以是非必要的。
“可检测部分”是通过分光镜法、光化学方法、生物化学方法、免疫化学方法、化学方法和/或其它物理方法可检测的部分。利用本领域中熟知的方法可将可检测部分与本发明的抗体和抗原结合片段直接地和/或间接地耦合(例如通过连接，比如但不限于，DOTA或NHS连接)。可使用多种可检测部分，选择取决于所需要的敏感度、偶联的容易度、稳定性要求和可获得的仪器装置。适当的可检测部分包括但不限于，荧光标记、放射性标记(例如不限于，125I、In111、Tc99、I131和包括用于PET扫描器等的正电子发射同位素)、核磁共振活性标记、发光标记、化学发光标记、生色团标记、酶标记(例如且不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、量子点和/或纳米颗粒。可检测部分可导致和/或产生可检测信号，从而允许检测到来自可检测部分的信号。
在本发明的另一个示例性实施方案中，可将抗体或其抗原结合片段与治疗性部分(例如，药物、细胞毒性部分)相耦合(修饰)。
在一些实例中，对于治疗性目的，未偶联的抗体可自身能够隔绝抗原，可阻滞抗原和抗原结合配偶体之间的重要的相互作用，可募集效应器细胞等。然而，如上所示，可将抗体与治疗性部分偶联。
在一个示例性实施方案中，抗体和抗原结合片段可包括化学治疗剂或细胞毒性剂。例如，可将抗体和抗原结合片段与化学治疗剂或细胞毒性剂偶联。所述化学治疗剂或细胞毒性剂包括但不限于，钇-90、钪-47、铼-186、碘-131、碘-125和由本领域中的技术人员所认识的许多其它的(例如，镥(例如，Lu177)、铋(例如，Bi213)、铜(例如，Cu67))。在其它的实例中，化学治疗剂或细胞毒性剂除本领域中的技术人员已知的其它之外可包括，5-氟尿嘧啶、阿霉素、依立替康(irinotecan)、紫杉烷类、假单胞菌内毒素、蓖麻毒素和其它毒素。
可选地，为进行本发明和本领域中已知的方法，本发明的抗体或抗原结合片段可用于与能够特异性地结合本发明的抗体或抗原结合片段且可携带需要的可检测部分、诊断性部分或治疗性部分的第二分子(例如，二抗等)相组合。
【抗体的药物组合物和其用途】
本发明还涵盖抗体的(偶联的或未偶联的)药物组合物。药物组合物可包含抗体或抗原结合片段，且还可含有药学上可接受的载体。
本发明的其它方面涉及组合物，该组合物可包含本文所描述的抗体或抗原结合片段和载体。
本发明的另外的其它方面涉及本文所描述的分离的抗体或抗原结合片段用于治疗或诊断骨病或癌症的用途。
除活性成分之外，药物组合物可含有药学上可接受的载体和有助于将活性化合物加工成可在药学上使用的制备物的其它赋形剂和助剂，所述药学上可接受的载体包括水、PBS、盐溶液、明胶、油类、醇类。在其它的实例中，所述制备物可以是无菌的。
如本文所用，“药物组合物”通常包含治疗有效量的试剂连同药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。如本文所用，“治疗有效量”指对于给定的病状和施用方案提供治疗效果的量。所述组合物是液体或冻干的或其它的干燥的制剂，且包括不同的缓冲液内容物(例如，Tris-HCl、醋酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度的稀释物、添加剂诸如铝或明胶以防止表面的吸收、去污剂(例如，吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐类)。增溶剂(例如，甘油、聚乙二醇)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如，局部抗菌剂、苯甲醇、对羟苯甲酸酯)、膨胀物质或紧张性改良剂(例如，乳糖、甘露醇)、聚合物诸如聚乙二醇与蛋白质的共价结合、与金属离子的复合、或将材料掺入到聚合化合物诸如聚乳酸、水凝胶等的颗粒制备物之中或之上，或掺入到脂质体、微乳剂、微胶粒、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球之上。所述组合物将影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。控制释放的组合物或持续释放的组合物包括亲脂性贮藏物质(例如，脂肪酸、蜡、油类)中的制剂。本发明还涵盖覆盖有聚合物(例如，泊洛沙姆或poloxamines)的颗粒组合物。本发明的组合物的其它实施方案掺入了颗粒形式保护性包衣、蛋白酶抑制剂或渗透增强剂以用于多种施用途径，包括胃肠外途径、肺部途径、鼻途径、口服途径、***途径、直肠途径。在一个实施方案中，药物组合物是经胃肠外、癌近旁(paracancerally)、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、颅内和瘤内施用的。
此外，如本文所用的“药学上可接受的载体”或“药学上的载体”是本领域中已知的，且包括但不限于，0.01-0.1M或0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。此外，所述药学上可接受的载体可以是含水溶液或无水溶液、悬浮液和乳液。无水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油诸如橄榄油和可注射的有机酯诸如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/含水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外载体包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer’sdextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸盐林格氏溶液(lactated Ringer’s)或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养物补充剂、电解质补充剂诸如基于林格氏葡萄糖的那些等。还可存在防腐剂和其它添加剂，比如例如，抗菌剂、抗氧化剂、整理剂、惰性气体等。
对于任何化合物，可首先在细胞培养测定中或在动物模型诸如小鼠、大鼠、兔、狗或猪中评估治疗有效量。还可使用动物模型来确定浓度范围和施用途径。然后可使用该信息来确定用于在人中施用的有用的剂量和途径。这些技术是本领域中的技术人员熟知的，且治疗有效剂量指减轻症状或病症的活性成分的量。在细胞培养物中或利用实验动物通过标准制药程序可确定治疗效力和毒性，比如通过计算和对比ED50(在50％的群体中治疗有效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)统计数值。以上所描述的任何治疗性组合物可应用于需要所述治疗的任何受治疗者，包括但不限于，哺乳动物诸如狗、猫、牛、马、兔、猴和人。
本发明中使用的药物组合物可通过任何数量的途径来施用，所述途径包括但不限于，口服方式、静脉内方式、肌内方式、动脉内方式、髓内方式、鞘内方式、心室内方式、透皮方式、皮下方式、腹膜内方式、鼻内方式、肠内方式、局部方式、舌下方式或直肠方式。
用于本公开内容的目的的术语“治疗”指治疗性治疗和预防性或防护性措施，其中目的是防止或减慢(减少)目标病理性病症或疾患。需要治疗的那些个体包括已患有疾患的那些个体以及易于患有疾患的那些个体或其中的疾患待防止的那些个体。
抗体或抗原结合片段可在多种骨丢失或癌症的治疗中具有治疗性用途。在一个示例性实施方案中，抗体或片段可在与骨病相关的骨丢失中具有治疗性用途，所述骨病诸如其中破骨细胞的骨降解活性增高的病症。在某些实例中，抗体或抗原结合片段可与表达SEQID NO:2的细胞相互作用并通过介导ADCC来诱导免疫反应。在其它实例中，抗体和片段可阻断SEQ ID NO:2与其蛋白质配偶体的相互作用。
抗Siglec-15抗体或抗原结合片段可在多种骨相关疾病的情况中的骨丢失的治疗中具有治疗性用途，所述骨相关疾病包括但不限于，骨质疏松症、骨质减少、骨软化、甲状旁腺机能亢进、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、性腺机能减退、甲状腺毒症、***性肥大细胞增多症、成人低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征(cushing’s disease/syndrome)、特纳综合征(Turner syndrome)、戈谢病(Gaucherdisease)、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、马凡综合征(Marfan'ssyndrome)、Menkes综合征、范可尼综合征(Fanconi's syndrome)、多发性骨髓瘤、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、佝偻病(包括维生素D依赖型、I型和II型和X连锁遗传性低磷酸盐佝偻症)、不完全性骨纤维生成、骨硬化疾患诸如致密性成骨不全症和由巨噬细胞介导的炎性过程导致的损伤。在优选的实施方案中，抗体和片段在其中严重骨丢失占优势的病症尤其是转移到骨的转移性癌症中具有治疗性用途。在某些实例中，抗Siglec-15抗体和片段可与细胞诸如表达Siglec-15的破骨细胞相互作用。在其它实例中，抗Siglec-15抗体和片段可阻断Siglec-15与其蛋白配偶体的相互作用。
抗Siglec-15抗体和其抗原结合片段可在由多种骨再造疾患导致的或与多种骨再造疾患相关的癌症或骨丢失的治疗中具有治疗性用途。尤其是，抗Siglec-15抗体和其中具有免疫学功能的片段在其中破骨细胞是机能亢进的并促使骨表面的降解的病症中具有治疗性应用。在某些实例中，抗Siglec-15抗体和其抗原结合片段可与施用于同一病症的其它治疗同时组合施用。这样，抗体可与本领域中的技术人员已知的抗再吸收剂(例如，二碳磷酸盐)一起施用。此外，抗体可与抗有丝***剂(例如，紫杉烷类)、铂基剂(例如，顺铂)、DNA损伤剂(例如，多柔比星)和本领域中的技术人员已知的其它细胞毒性治疗一起施用。在其它实例中，抗Siglec-15抗体和其中具有免疫学功能的片段可与其它治疗性抗体一起施用。这些包括，但不限于，靶向RANKL、EGFR、CD-20和Her2的抗体。
在某些实例中，抗体和其中的抗原结合片段可与施用于同一病症的其它治疗同时组合施用。这样，抗体可与抗有丝***剂(例如，紫杉烷类)、铂基剂(例如，顺铂)、DNA损伤剂(例如，多柔比星)和本领域中的技术人员已知的其它抗癌治疗一起施用。在其它实例中，抗体和其中的抗原结合片段可与其它治疗性抗体一起使用。这些包括但不限于，靶向EGFR、CD-20和Her2的抗体。
在另一方面本发明涉及用于抑制SEQ ID NO:2表达细胞或SEQ ID NO:2变体表达细胞的生长的方法，所述方法可包括将细胞与有效量的本文所描述的抗体或抗原结合片段相接触。
本发明还涵盖哺乳动物中治疗癌症或骨丢失或抑制SEQ ID NO:2表达细胞或SEQID NO:2变体表达细胞的生长的方法，所述方法可包括将本文所描述的抗体或抗原结合片段施用于需要的哺乳动物。
本发明还提供了用于抑制癌细胞的生长的方法，所述癌细胞选自由以下组成的组：卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞。所述方法可包括向癌细胞提供能够削弱与SEQ ID NO:2至少80％相同的或具有与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸或与第49位至第165位氨基酸至少80％相同的区的多肽的表达的核酸。所述癌细胞可表达与SEQ ID NO:2至少80％相同的或具有与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸或与第49位至第165位氨基酸至少80％相同的区的多肽。
根据本发明，核酸可以是例如，siRNA或反义核酸。
本发明还涵盖在哺乳动物中检测癌症或骨丢失或检测SEQ ID NO:2表达细胞或SEQ ID NO:2变体表达细胞的方法，所述方法可包括将本文所描述的抗体或抗原结合片段施用于需要的哺乳动物。
在其另一方面本发明涉及用于检测SEQ ID NO:2表达细胞或SEQ ID NO:2变体表达细胞的方法，所述方法可包括使细胞与本文所描述的抗体或抗原结合片段相接触并检测由所述抗体和SEQ ID NO:2表达细胞或SEQ ID NO:2变体表达细胞形成的复合物。
本发明的另一方面涉及用于检测SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸或与第49位至第165位氨基酸具有至少80％序列同一性的变体的方法，所述方法可包括使表达SEQ ID NO:2或变体的细胞或包含或怀疑包含SEQ ID NO:2或变体的样本(活检样本、血清、血浆、尿等)与本文所描述的抗体或抗原结合片段相接触并测量结合。
抗体与抗原的结合将导致抗原的预期分子量增高。因此抗体或抗原结合片段与抗原的特异性结合后发生物理改变。
该改变可利用以下来检测，例如，电泳之后进行蛋白质印记和凝胶或印迹的染色、质谱法、与计算机连接的HPLC或其它。能够计算分子量的迁移的仪器是本领域中已知的，且包括例如，PhosphorimagerTM。
当抗体包含例如可检测标记时，抗原-抗体复合物可通过标记所发射的荧光、标记的放射性发射、标记对其底物的酶活性或其它来检测。
抗体或抗原结合片段和抗原之间的结合的检测和/或测量可通过本领域中的多种方法来进行。抗体或抗原结合片段和抗原之间的结合可利用能够检测可检测标记所发射的信号(放射性发射、荧光、颜色改变等)的仪器来监测。所述仪器提供指示结合发生的数据，并还可提供关于与抗原结合的抗体的量的指示。仪器(通常与计算机相连接)还能够计算背景信号(例如，在无抗原-抗体结合时获得的信号)或背景噪声与特异性的抗体-抗原结合后获得的信号之间的差异。因此该仪器可向使用者提供关于是否已检测出抗原的指示或结论。
样本可来自哺乳动物(例如，人)，所述哺乳动物可患有癌症或骨病或可能怀疑患有癌症或骨病或可能经历骨病或可能怀疑经历骨病。样本可以是从哺乳动物或细胞培养上清液中获得的组织样本。
根据本发明，样本可以是获自哺乳动物的血清样本，血浆样本、血液样本或腹水。本文所描述的抗体或抗原结合片段可有利地检测SEQ ID NO:2。
方法可包括定量由与SEQ ID NO:2或与SEQ ID NO:2变体结合的抗体或抗原结合片段形成的复合物。
本发明的抗体或抗原结合片段可更加具体地用于检测、诊断或治疗骨病或癌症。
本发明的另外的方面涉及试剂盒，所述试剂盒可包括包含一种或多种本文所描述的抗体或抗原结合片段的一种或多种容器。
【核酸、载体和细胞】
通常在允许从载体中表达的轻链和重链的表达的细胞中制备抗体，所述载体包括编码轻链和重链的核酸序列。
因此本发明涵盖能够编码本文所描述的CDR(包括CDR变体)、轻链可变域(包括轻链可变域变体)、重链可变域(包括重链可变域变体)、轻链(包括轻链变体)、重链(包括重链变体)中的任何一者的核酸。
本发明的核酸的示例性实施方案包括编码轻链可变域的核酸，所述轻链可变域包含：
a.选自由以下组成的组的CDRL1序列：SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111；
b.选自由以下组成的组的CDRL2序列：SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:112，和/或；
c.选自由以下组成的组的CDRL3序列：SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113。
根据本发明，核酸可编码轻链可变域，所述轻链可变域可包含CDRL1、CDRL2或CDRL3中的至少两个CDR。
还根据本发明，核酸可编码轻链可变域，所述轻链可变域可包含一个CDRL1、一个CDRL2和一个CDRL3。
本发明还涉及编码重链可变域的核酸，所述重链可变域包含：
a.选自由以下组成的组的CDRH1序列：SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114；
b.选自由以下组成的组的CDRH2序列：SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:109和SEQ ID NO:115，和/或；
c.选自由以下组成的组的CDRH3序列：SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:116。
在另一方面，本发明提供了编码轻链可变域的核酸，所述轻链可变域包含：
a)选自由以下组成的组的CDRL1序列：SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:102；
b)选自由以下组成的组的CDRL2序列：SEQ ID NO:149、SEQ ID NO:150、SEQ IDNO:76、SEQ ID NO:82和SEQ ID NO:106，或；
c)选自由以下组成的组的CDRL3序列：SEQ ID NO:151、SEQ ID NO:152、SEQ IDNO:77、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:152。
在又一方面，本发明提供了编码重链可变域的核酸，所述重链可变域可包含：
a)选自由以下组成的组的CDRH1序列：SEQ ID NO:153、SEQ ID NO:154、SEQ IDNO:84、SEQ ID NO:96和SEQ ID NO:102；
b)选自由以下组成的组的CDRH2序列：SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ IDNO:157、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103和SEQID NO:109，或；
c)选自由以下组成的组的CDRH3序列：SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:110和SEQ ID NO:116。
根据本发明，核酸可编码重链可变域，所述重链可变域可包含CDRH1、CDRH2或CDRH3中的至少两个CDR。
根据本发明，核酸可编码重链可变域，所述重链可变域可包含一个CDRH1、一个CDRH2和一个CDRH3。
本发明还涵盖编码抗体变体的核酸，所述抗体变体具有至少一个保守性氨基酸置换。
根据本发明，核酸可编码包含至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，核酸可编码在CDR的至少两个中包含至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，核酸可编码在3个CDR中包含至少一个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，核酸可编码在CDR的至少一个中包含至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，核酸可编码在CDR的至少两个中包含至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
根据本发明，核酸可编码在3个CDR中包含至少两个保守性氨基酸置换的CDR。
本发明的其它方面涉及编码轻链可变域的核酸，所述轻链可变域与选自由以下组成的组的的序列具有至少70％(包括至少80％)序列同一性：SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:61和SEQ ID NO:65。
本发明的另外的其它方面涉及编码重链可变域的核酸，所述重链可变域与选自由以下组成的组的序列具有至少70％(包括至少80％)序列同一性：SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:63和SEQID NO:67。
在又一方面，本发明涉及包含本文所描述的核酸的载体。
根据本发明，载体可以是表达载体。
在特定的宿主中含有用于所***的编码序列的转录和翻译控制的元件的载体是本领域中已知的。这些元件可包括调控序列，比如增强子、组成型和诱导型启动子和5′和3′非翻译区。本领域中的技术人员熟知的方法可用于构建所述表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。
在另一方面，本发明涉及分离的细胞，所述分离的细胞可包括本文所描述的核酸。
分离的细胞可包含在不同的载体上或在同一载体上编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。该分离的细胞还可包含在不同的载体上或在同一载体上编码轻链的核酸和编码重链的核酸。
根据本发明，细胞可能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本发明提供了细胞，所述细胞可包含和/或可表达本文所描述的抗体。
根据本发明，细胞可包含编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
细胞可能够表达、组装和/或分泌抗体或抗原结合片段。
呈现了以下的实例以进一步概述本发明的细节。
【筛选测定的示例性实施方案】
在另一方面，本发明提供了鉴定能够抑制卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞的生长的化合物的方法。该方法可包括向包含与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸具有至少80％相同的区的多肽或表达所述多肽的细胞提供候选化合物并测量多肽的活性或表达。多肽的降低的活性或表达可确定地鉴定适宜的抑制性化合物。
根据本发明，候选化合物可与多肽特异性地结合。
根据本发明，候选化合物可以是例如，抗体或抗原结合片段。
根据本发明，候选化合物可以是例如，siRNA或反义核酸。
可进行其它类型的测定而不脱离本发明的范围。
【实施例】
【实施例1】
该实施例描述了Siglec-15基因在破骨细胞和人组织RNA样本中的表达的型式。
所鉴定的最有前景的基因之一称为AB-0326，其编码细胞表面I型膜蛋白，Siglec-15。该候选物首次从人破骨细胞文库中分离，且通过RT-PCR还证实了与前体细胞相比较在原代小鼠破骨细胞中以及小鼠RAW 264.7细胞中相似的RANKL依赖性上调(Sooknanan等.2007)。评估了Siglec-15的组织表达谱以确定表达的特异性，其为施加于被选择用于验证的所有靶标的标准。从6个人供体获得外周血单核细胞(PBMNC)，并将其在破骨细胞分化培养基(MCS-F和RANKL)中培养至少14天。从前体细胞(无RANKL处理(图1，顶图，-))中或在中间的时间间隔时(图1，顶图，)分离总RNA。利用Thermoscript逆转录酶(Thermoscriptreverse transcriptase)(Invitrogen,Burlington,ON)根据生产商的说明将1微克的每个RNA样本转化为单链的cDNA，稀释200倍，并用于事先优化的PCR反应以特异性地扩增Siglec-15转录物的片段。用于PCR反应的寡核苷酸的序列示于SEQ ID NO:117和118中。如图1顶图，分化中的破骨细胞中所示，与分化中的破骨细胞相比较，Siglec-15转录物在前体细胞中以低得多的水平表达。另外，随分化的进行Siglec-15转录物增高。通过比较，已知的破骨细胞标志物基因，组织蛋白酶K(图1，分化中的破骨细胞中的CATK)在破骨细胞分化过程中也是上调的。SEQ ID NO:119和120中显示了用于扩增CATK信息的寡核苷酸。作为对照，利用特异性地扩增管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH，参见图1的下图，分化中的破骨细胞)的引物在同样的样本上进行PCR反应。用于PCR反应的GAPDH-特异性引物的序列示于SEQ ID NO:121和122。该后者反应证明了每个样本中存在等量的起始RNA。来自人正常组织的总RNA购自商业供货商(Clontech,Mountain View,CA)。如图1中所示(上图，正常组织)，在单一组织(肺，泳道9)中较弱地检测了Siglec-15，且在所有其它组织样本中完全不存在。这强调了申请人的探索方法在其鉴定高度限制于分化中的破骨细胞的靶标的能力上的效力。图1中的泳道编号对应于以下的组织：泳道对应于以下组织：泳道1，肾上腺；2，乳腺；3，空肠；4，气管；5，肝；6，胎盘；7，主动脉；8，脑；9，肺；10，肾上腺皮质；11，食道；12，结肠；13，卵巢；14，肾脏；15，***；16，胸腺；17，骨骼肌；18，腔静脉；19，胃；20，小肠；21，心脏；22，输卵管；23，脾；24，膀胱；25，子宫颈；26，胰腺；27，回肠；28，十二指肠；29，甲状腺；30，睾丸；泳道10和11之间和泳道20和21之间的空白泳道代表阴性对照(无cDNA)。我们的结果显示了Siglec-15在分化中的破骨细胞中是上调的，在几乎全部正常人组织中不存在，并表明抗Siglec-15的抗体将显著较少地与非靶标组织相互作用。
进行了另外的表达谱研究以在癌症适应症中确定Siglec-15的表达。本领域中的技术人员将认识到，如果发现Siglec-15基因在这些类型的适应症中表达，本发明中描述的抗体可能在癌症中具有应用，。为证实如此，使基于PCR的方法适于确定从9种类型的癌症中分离的癌症细胞系中的Siglec-15转录物的表达型式。细胞系所代表的癌症类型为白血病、中枢神经***的癌症、乳腺癌、结肠癌、肺癌、黑素瘤、卵巢癌、***癌和肾癌(参见表4)。这些RNA样本获自NCI/NIH的Developmental Therapeutics Program。如以上所描述的，利用从获自NCI的总RNA样本扩增的相同的RAMP RNA样本，将500ng的RNA转化为单链cDNA。稀释cDNA反应物以将反应物的1/200用于每个PCR实验。在来自MJ Research的DNA EngineTetrad中利用来自Qiagen(Mississauga,ON)的热起始Taq聚合酶(Hot-Start TaqPolymerase)在96孔板中进行PCR。将一半的反应混合物加载到1.2％的琼脂糖/溴化乙锭凝胶中并利用UV光察看扩增子。为验证每个反应使用了等量的RNA，用GAPDH表达监测RNA的水平。
表4-来自NCI-60组的癌细胞系的列表
如图2中所示，发现Siglec-15在某些癌症类型中表达，尤其是卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症和***癌。事实上，除白血病之外，在由这些样本代表的几乎所有癌症适应症中检测了Siglec-15。该结果表明抗Siglec-15的抗体可能在癌症疾病中具有用途。
实施例2中描述的抗体(参见以下)还可用于通过免疫印迹在细胞裂解物中检测Siglec-15。将人Siglec-15cDNA的完整的开放阅读框克隆到CMV启动子(pCDNA-Siglec-15)下游的哺乳动物表达载体中。将该构建体或不编码Siglec-15的对照空载体转染到表达低内源性水平的Siglec-15蛋白的A375黑素瘤细胞中。通过用G418选择分离一组稳定的转染子。通过用单克隆抗体E6进行免疫印迹分析来自Siglec-15转染的(+)和对照(-)A375细胞的细胞裂解物。如图13A中所示，抗体在Siglec-15转染的细胞中检测到35kDa的单一条带，但未在对照细胞中检测到。这严密地匹配基于一级氨基酸序列(http://www.bioinformatics.org/sms/prot_mw.html)预测的Siglec-15的分子量(35.62kDa)。利用抗-β-肌动蛋白抗体通过免疫印迹还分析了裂解物以证明每个泳道中加载了相似总量的裂解物。通过免疫印迹，该结果表明，抗体E6以高度特异性的方式识别来自用克隆的Siglec-15cDNA转染的细胞的裂解物中过表达的Siglec-15。
为证实分化的人PBMNC中增高的Siglec-15mRNA水平对应于Siglec-15蛋白质水平的增高，从利用单独的MCSF处理的人PBMNC(未分化的，C)或利用MCSF和RANKL处理的人PBMNC(分化的，Δ)中制备裂解物(图13B)。还从未处理的RAW 264.7细胞(未分化的，C)或用RANKL处理的RAW 264.7细胞(分化的，Δ)中制备裂解物(图13C)。先前显示了通过RANKL诱导破骨细胞分化后RAW264.7细胞上调Siglec-15mRNA水平(Sooknanan,2007)。利用抗体E9通过免疫印迹对这些裂解物的分析表明，如通过RT-PCR研究所预测，在分化为破骨细胞后，PBMNC细胞和RAW 264.7细胞二者中的Siglec-15蛋白水平具有显著的增高(图13B和13C)。
来自NCI60组的mRNA的RT-PCR分析(图2)显示，显著高的比例的CNS来源的癌细胞系表达Siglec-15，而最近的微阵列研究发现了一小组癌细胞系，包括U87成胶质细胞瘤系，其非NCI60组的部分，其表达非常高水平的Siglec-15mRNA(Shankavaram,2007)。因此，我们测试了在U87细胞中是否能检测到内源性的Siglec-15蛋白质的表达。事实上，通过对U87细胞裂解物的免疫印迹检测到了Siglec-15大小的蛋白。为证实该蛋白的身份，用一组靶向Siglec-15的小干扰RNA(siRNA)(SIGLEC15siGENOME SMARTpool,Dharmacon)转染U87细胞或用对照的非靶向的siRNA组(-，图13D)转染U87细胞，并使其生长72小时，然后进行细胞裂解。与其作为Siglec-15的身份一致的是，用靶向的siRNA处理导致了与非靶向的对照相比较该蛋白质的降低表达(图13D)。为检查Siglec-15是否发现于癌细胞的细胞表面，我们通过流式细胞术分析了siRNA-处理的U87细胞。将活细胞置于冰上并在使抗体与细胞外抗原而非细胞内抗原结合的条件下用Siglec-15抗体E9(参见实施例2)或同种型对照抗体进行染色。利用靶向siRNA的处理导致了抗体E9的降低结合而对对照抗体的结合没有影响(图13E)。总之，这些结果证明Siglec-15可能在癌细胞中表达，并且抗体在细胞表面的结合是可行的。
【实施例2】
该实施例提供了关于与Siglec-15结合的单克隆抗体家族的细节。
为产生单克隆抗体，利用大规模瞬时转染技术(Durocher等.,2002；Durocher,2004)在293E细胞中产生重组的人Siglec-15。利用并入BamHI限制位点的正向引物(SEQ IDNO:124)和并入NotI限制位点的反向引物(SEQ ID NO:125)通过PCR扩增编码SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸的cDNA(参见SEQ ID NO:123)。利用BamHI和NotI消化所得的PCR产物，并将片段连接到用相同的限制酶相似地消化的表达载体pYD5中(SEQ ID NO:126)以构建称作pYD5-0326的载体。pYD5表达质粒包含人Fc结构域的编码序列，其允许融合蛋白的形成，且包含编码IgG1信号肽的序列以允许融合蛋白分泌到培养基中。对于每毫升细胞，将称作pYD5-032620-259的1微克表达载体转染到在悬浮液中生长至1.5-2.0×106细胞/ml的密度的2936E细胞中。所使用的转染试剂是聚乙烯亚胺(PEI)(线性，分子量25,000，目录号#23966Polysciences,Inc.,Warrington,PA)，其以DNA:PEI为1:3的比率含在其中。使细胞继续生长5天，然后收获培养基以进行重组Fc-032620-259融合蛋白的纯化。按照生产商的说明利用蛋白-A琼脂糖(Sigma-Aldrich Canada Ltd.,Oakville,ON)纯化蛋白质。图3中显示了代表性的聚丙烯酰胺凝胶，其显示了纯化的Fc-032620-259的样本(指示为Fc-Siglec-1520-259)。
利用Biosite噬菌体展示技术产生结合Siglec-15的抗体。该技术的详细描述和用于产生这些抗体的方法可见于美国专利第6,057,098号。简言之，该技术利用了展示抗原结合片段(Fab)的噬菌体文库的严格淘选。几轮淘选之后，获得了称作Omniclonal的文库，其富集了包含以高度亲和力和特异性与Siglec-15结合的轻链可变区和重链可变区的重组Fab。从大肠杆菌中制备了来自该文库(更精确地命名为Omniclonal AL0025Z1)的96个单独的重组单克隆Fab并测试其关于Siglec-15结合。
为测量每个单独的单克隆抗体的相对结合，利用大规模瞬时转染技术(Durocher等.,2002；Durocher,2004)在293E细胞中产生了重组的人Fc-Siglec-1520-259。单克隆制备物的96孔母板(master plate)在每个孔中含有不同浓度的纯化的抗Siglec-15Fab。通过将Fab稀释至10μg/ml的终浓度而制备第二贮存母板，从其中进行用于ELISA测量的所有的后续稀释。为进行Fc-Siglec-15与单克隆制备物的结合，用NHS-生物素(Pierce,Rockford,IL)对Fc-Siglec-1520-259进行生物素化，并以10ng/孔覆盖在链酶亲和素96孔平板中。向每孔中添加1纳克的每个Fab单克隆制备物并在室温下孵育30分钟。在TMB液体底物(Sigma-Aldrich Canada Ltd.,Oakville,ON)存在下用HRP偶联的小鼠抗κ轻链抗体检测所结合的抗体并在酶标仪(microtiter plate reader)中在450nm下进行读数。如图4A中所示，在该测定中总共53个(突出显示的深灰色)单克隆抗体展示了显著的结合(>0.2任意OD450单位)。特意地将抗体稀释至1ng/孔以突出那些抗体以最高亲和力与Siglec-15的结合。因为利用Fc融合蛋白产生了抗体，还仅利用生物素化的Fc结构域在ELISA中测试了单克隆抗体。如图4B中所示，17个抗体与Fc-Siglec-1520-259的Fc部分相互作用(突出显示的浅灰色)。粗体呈现的值(参见图4)代表示例性抗体25A1、25B4、25B8、25C1、25D8、25E5、25E6和25E9。这些数据还揭示了不同的孔的抗体的结合不同，这表明其对于Siglec-15的不同的亲和力。
申请人注意到本发明的抗体或抗原结合片段可有效地与抗原结合，事实上，发现1ng的抗体能够与小于500ng的SEQ ID NO:2结合。
通过测试这些抗体与Siglec家族的其它两个成员CD33和Siglec-2的结合来评估这些抗体对于Siglec-15的特异性。CD33(GeneBankTM登录号NM_001772.3)是CD33相关Siglec家族的原型：在人蛋白中，这些Siglec与Siglec-15共有最高的氨基酸序列相似性(它们两个各自的N末端Ig样结构域之间约29％序列同一性)。Siglec-2(GeneBankTM登录号NM_001771.3)与Siglec-15较少相似(23％序列同一性)，但与大多数其它Siglec不相似，其对于与α2-6连接的唾液酸偶联物的结合具有明显的偏好(Angata 2007,Blixt 2003)。从人PBMNC cDNA文库中将包含Siglec-2和CD33的V-set合和N末端C2-set Ig样结构域的序列(对应于用作用于抗体产生的抗原的Siglec-15的区)克隆到pYD5载体中。通过用抗-Fc抗体进行免疫印迹对来自用这些构建体转染的293-6E细胞的上清液、以及来自非转染的293-6E细胞的上清液或来自用pYD5-Siglec-15或pYD5空载体转染的那些细胞的上清液进行分析以评估表达水平(图14A)。这些构建体的转染导致了预期大小的Fc标签蛋白的表达(图14A)。通过真空斑点印迹将这些上清液的等份吸附到PVDF上(Bio-点印装置(Bio-dotapparatus),Bio-Rad)，并评估了代表性的Siglec-15单克隆抗体的结合(因为许多抗体仅与天然的、未变性形式的Siglec-15反应，所以未使用蛋白质印迹)。作为对照，抗-Fc抗体和抗-Siglec-15omniclonal抗体与全部4种Fc标记的蛋白质反应(图14B)。相比之下，单克隆抗体D8和E9显示了没有与单独的Fc、Siglec-2或CD33的可检测的结合，表明了它们对于Siglec-15是高度特异性的。
【实施例3】
该实施例公开了用于将Fab转化为完全的IgG2嵌合单克隆抗体的方法。图5中呈现了方法的方案。
为进行体外研究和体内研究以证实抗原的生物学功能，将Fab中包含的轻链可变区和重链可变区转移到完全抗体的支架，以产生小鼠-人嵌合IgG2。构建了免疫球蛋白轻链和重链的表达载体以便使i)用哺乳动物信号肽替换Fab表达载体上游的原始细菌信号肽序列和ii)用人恒定区替换小鼠抗体中的轻链恒定区和重链恒定区。完成该转移的方法使用了本领域中的技术人员熟悉的标准分子生物学技术。本文描述了该方法的简要概述(参见图5)。
轻链表达载体—将设计用于293E瞬时转染***中的称作pTTVH8G(Durocher等,2002)的现有的哺乳动物表达质粒进行修改以适合小鼠轻链可变区。所得的小鼠-人嵌合轻链含有小鼠可变区，其后为人κ恒定域。通过PCR利用引物OGS1773和OGS1774(分别为SEQ IDNO:127和128)扩增编码人κ恒定域的cDNA序列。SEQ ID NO:129和130分别显示了人κ恒定区的核苷酸序列和对应的氨基酸序列。将所得的321个碱基对的PCR产物连接到紧接人VEGF A(NM_003376)的信号肽序列的下游的pTTVH8G中。该克隆步骤还定位了允许编码小鼠轻链可变区的cDNA的精确定位的独特的限制性核酸内切酶位点。称作pTTVK1的最终表达质粒的序列显示于SEQ ID NO:131中。基于表2中公开的序列，设计了对于抗体25A1、25B4、25B8、25C1、25D8、25E5、25E6和25E9(分别为SEQ ID NO:37、41、45、49、53、57、61和65)特异的PCR引物并在其5′-端掺入了与VEGF A信号肽的最后20个碱基对相同的序列。这些引物的序列分别显示于：对于25A1的SEQ ID NO:132；对于25B4、25B8、25C1、25D8和25E9的SEQ ID NO:133；对于25E5的SEQ ID NO:134和对于25E6的SEQ ID NO:135。使用了相同的反向引物以扩增全部4个轻链可变区，因为引物3′-末端是相同的。该引物(SEQ ID NO:136)在其3′-末端掺入了与人κ恒定域的前20个碱基对相同的序列。利用T4DNA聚合酶的3′-5′核酸外切酶活性处理PCR片段和消化的pTTVK1，得到了互补末端，通过复性将其连接。将复性反应物转化到感受态的大肠杆菌中并通过测序验证表达质粒以确保将小鼠轻链可变区适当地***到pTTVK1表达载体中。本领域中的技术人员将容易地认识到，用于构建轻链表达质粒的方法适用于原始Fab文库中所包含的全部抗-Siglec-15抗体。
重链表达载体—以与以上所描述的用于产生轻链免疫球蛋白的pTTVK1相似的方式设计产生重链免疫球蛋白的表达载体。在嵌合抗-Siglec-15抗体的情况下，需要IgG2同种型，其为用于稳定的阻断抗体的优选的类型。为此目的，扩增人IgG2免疫球蛋白的恒定区(CH1、CH2和CH3)并将其连接到预先存在的IgG1表达载体中，并且本文描述了详细的方法。通过连接编码人CH1恒定区的cDNA序列来改变含有人IgGK信号肽序列以及IgG1的人Fc结构域的CH2区和CH3区的质粒pYD11(Durocher等.,2002)。使用设计以含有独特的限制性核酸内切酶位点的PCR引物OGS1769和OGS1770(SEQ ID NO:137和138)来扩增含有示于SEQ IDNO:139和140的核苷酸序列和对应的氨基酸序列的人IgG1CH1区。将紧接IgGK信号肽序列的下游的人CH1的309个碱基对的片段连接后，用限制酶ApaI和NsiI消化所得的质粒。这些酶准确地在相同的位置消化恒定IgG1和IgG2cDNA，这允许在表达载体中IgG1恒定序列被人IgG2序列所替换。编码人IgG2恒定域的cDNA获自商业上可获得的来源(Open Biosystems,Huntsville,AL)。用于表达IgG2免疫球蛋白重链的最终质粒命名为pYD19，且该序列示于SEQ ID NO:141中。当将所选择的重链可变区连接到该载体中时，所得的质粒编码具有人恒定区的完全IgG2重链免疫球蛋白。基于表2中公开的序列，设计了对于抗体25A1、25B4、25B8、25C1、25D8、25E5、25E6和25E9(分别为SEQ ID NO:39、43、47、51、55、59、63和67)的重链可变区特异的PCR引物，并在其5′端掺入了与IgGK信号肽的后20个碱基对相同的序列。这些引物的序列分别示于如下中：对于25A1的SEQ ID NOS:142；对于24B4和25D8的SEQ IDNO:143；对于25B8、25C1和25E9的SEQ ID NO:144；对于25E5的SEQ ID NO:145；和对于25E6的SEQ ID NO:146。使用相同的反向引物来扩增全部4个重链可变区，因为3′-末端是相同的。该引物(SEQ ID NO:147)在其3′-端掺入了与人CH1恒定域的前20个碱基对相同的序列。将PCR片段和所消化的pYD19用T4DNA聚合酶的3′-5′核酸外切酶活性来处理，得到了互补端，通过复性将互补端连接。将复性反应物转化到感受态大肠杆菌中并通过测序验证表达质粒以确保小鼠重链可变区合适地***到pYD19表达载体中。本领域中的技术人员将容易认识到，用于构建重链表达质粒的方法适用于原始Fab文库中所含的所有抗-Siglec-15抗体。
人IgG2在293E细胞中的表达—利用瞬时转染***(Durocher等,2002)在293E细胞中表达编码免疫球蛋白轻链和重链的如上制备的表达载体。通过在两条免疫球蛋白链的氨基末端掺入的信号肽，从细胞的无血清培养基中收获了成熟的IgG2。本文描述了用于共转染轻链表达载体和重链表达载体的方法。对于每毫升细胞，将1微克的轻链表达质粒和重链表达质粒的组合转染到在悬浮液中生长至1.5-2.0×106细胞/ml的密度的293E细胞中。将轻链质粒与重链质粒的比率优化以在组织培养基中获得最大的抗体产量，并且发现该比率为9:1(L:H)。使用的转染试剂是聚乙烯亚胺(PEI)(线性，分子量25,000，目录号#23966Polysciences,Inc.,Warrington,PA)，其以DNA:PEI为1:3的比率含在其中。使细胞继续生长5天，然后收获培养基以进行IgG2嵌合单克隆抗体的纯化。按照生产商的说明利用蛋白-A琼脂糖(Sigma-Aldrich Canada Ltd.,Oakville,ON)纯化蛋白。
为了更准确地确定所选择的单克隆抗体的相对亲和力，将渐增浓度的Fab与生物素化的Fc-Siglec-1520-259一起孵育。将10纳克的生物素化的Fc-Siglec-1520-259覆盖在链酶亲和素微量滴定板上，并如图6中所示添加渐增量的Fab或嵌合IgG2单克隆抗体25B4、25B8、25C1、25D8、25E6和25E9。如图6中所描绘的，25B4、25B8、25C1、25D8、25E6和25E9嵌合IgG2单克隆抗体的结合与Fab非常相似。该结果显示了来自小鼠Fab的可变域转位到人IgG2骨架中没有显著影响轻链可变区和重链可变区赋予Siglec-15结合的能力。
【实施例4】
该实施例描述了抗Siglec-15抗体用于抑制破骨细胞的分化的用途。
将人PBMNC(AIiCells,Emoryville,CA)置于适当的培养基中，在5％CO2气体中在37℃下持续24小时。将细胞以100,000细胞/ml的细胞密度接种到96-孔平板中，并在35ng/ml M-CSF和30ng/ml RANKL存在下用渐增浓度(0.01μg/ml-100μg/ml)的抗Siglec-15IgG2嵌合单克隆抗体进行处理。未分化的前体细胞仅用M-CSF进行处理，对照细胞用非Siglec-15结合IgG2进行了处理。将细胞固定，关于TRAP进行染色，并对多核细胞进行计数和拍照(放大倍数40×)。如图7中所描绘的，靶向Siglec-15的mAb能够以剂量依赖方式有效地抑制人破骨细胞的分化。测试了每个示例性Siglec-15抗体，且最具活性的单克隆抗体是25B8、25E6和25E9，观察到对破骨细胞分化的不同程度的抑制。用对照嵌合IgG2处理的细胞未被抑制(参见图8中的右下图，对照IgG2)。该结果与Sooknanan公开的实验(Sooknanan等,2007)完全一致，所述实验显示了RNA干扰对Siglec-15表达的敲低导致了对人破骨细胞分化的抑制。
分化的破骨细胞的生物学功能是再吸收骨且因此破骨细胞的活性也应该被靶向Siglec-15的抗体所抑制。为进行检验，将人PBMNC接种到合成的磷酸钙底物盘(BDBioCoatTM OsteologicTM MultiTest Slides)上并在如上所描述的相似条件下进行培养。在对照同种型IgG或25D8或25E9抗Siglec-15抗体的存在下，用M-CSF和RANKL处理前体细胞。抗体浓度为1μg/ml或10μg/ml。一旦对照未处理的孔中呈现了完全成熟的破骨细胞后，将细胞刮离盘并利用使钙矿物质呈现棕色的标准von Kossa着色剂对剩余的骨底物进行染色。如图12中所示，含有未分化的破骨细胞的孔(左上图，M-CSF)显示了底物无降解迹象，所述降解迹象表现为表面上的白色斑点(降解凹点)。如预期地，用RANKL处理的细胞具有显著的降解的迹象，且表面含有许多凹点(左下图，M-CSF+RANKL)。相似地，用对照IgG处理的破骨细胞也可降解骨底物，这证明这些对照抗体未非特异性地抑制破骨细胞活性。当用抗Siglec-15抗体处理分化中的破骨细胞时，在该测定中25E9候选物有效地抑制骨降解(图12，右图)。相反地，在该测定中25D8抗体没有抑制降解(参见图12的中间-右图)。总之，这些结果(图7和图12)证明抗Siglec-15的抗体抑制破骨细胞分化和骨降解活性。
在一个平行的实验中，以相似的方式处理小鼠PBMNC。如图8中所描绘的，抗Siglec1-15嵌合抗体能够抑制小鼠破骨细胞的分化，如通过命名为25B8、25E6和25D8的嵌合mAb所例证的。该结果证实了针对Siglec-15的人同源物生成的单克隆抗体对于小鼠Siglec-15蛋白也是交叉反应性的。这通过利用ELISA实验证实。利用包含显示于SEQ IDNO:159和160的序列的寡核苷酸扩增了对应于第21位至第256位氨基酸的小鼠Siglec-15cDNA的片段。如关于人Siglec-15片段所描述的将该PCR片段连接到pYD5表达载体中，以在293-6E细胞中进行表达。利用蛋白-A亲和色谱法纯化重组的Fc-小鼠Siglec-15。
将命名为25C8的示例性的抗Siglec-15单克隆Fab与Fc-人(h)Siglec-1520-259或Fc-小鼠(m)Siglec-1521-256一起孵育。结果(参见图9)表明针对人Siglec-15生成的抗体的结合活性还与Siglec-15的小鼠同源物交叉反应。
以上描述的结果清楚地证明了Siglec-15在破骨细胞生成中的重要性。破骨细胞前体细胞中Siglec-15表达的削减产生了其形成多核成熟破骨细胞的能力被高度削弱的细胞。因此，用抑制物尤其是治疗性单克隆抗体靶向Siglec-15，将证明是非常具选择性的途径以靶向在急性转移性骨癌或慢性骨质疏松症过程中直接负责骨降解的那些细胞。
【实施例5】
该实施例涉及抗Siglec-15抗体阻断Siglec-15与唾液酸(SA)偶联物的结合的能力。
唾液酸化的糖蛋白的形成是适当的破骨细胞生成所需的(Takahata等,2007)。Siglec-15结合唾液酸，且该结合依赖于氨基酸残基R143(Angata 2007)。Siglec-15抗体抑制破骨细胞形成的一个机制可能涉及由与包括R143的表位的相互作用导致的对其靶标的唾液酸结合功能的干扰。为检查该可能性，我们进行了基于ELISA的测定以测试Siglec-15抗体阻断重组Fc-Siglec-15与Neu5Aca2-6-GalNAc-PAA-生物素(Glycotech,Rockville,MD)的结合的能力，Neu5Aca2-6-GalNAc-PAA-Biotin是Siglec-15的优选的含唾液酸结合配偶体(Angata 2007)。将Fc-Siglec-15固定在蛋白-A覆盖的微量滴定板上，且然后涂布不同的Siglec-15抗体。在孵育并去除未结合的抗体之后，添加Neu5Aca2-6-GalNAc-PAA-生物素。只要抗体没有阻断唾液酸结合位点，该生物素化的探针应该与Siglec-15形成复合物。通过标准方法利用链酶亲和素-HRP检测到了生物素化探针的存在。如图15中所示，抗Siglec-15omiclonal抗体和25D8抗体与非靶向的对照抗体相比较抑制了唾液酸结合。抗体E6也具有明显的，但不太显著的作用。抗体E9几乎无作用，表明其表位没有与唾液酸结合位点重叠。对照抗体的添加(图15，参见ctl IgG2)没有阻止唾液酸部分与Siglec-15的结合。该方法高度依赖于Siglec-15的存在，因为当仅Fc覆盖在平板中时未检测到结合且当略去SA时也没有任何结合(图15，参见无SA，Fc+SA，和仅Fc)。总之，这些结果证明可能由R143附近的相互作用导致，Siglec-15单克隆抗体可不同程度地干扰Siglec-15的唾液酸结合功能。该性质对于其对破骨细胞生成的作用可能是重要的。
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【序列表】
【SEQ ID NO:1】
atggaaaagtccatctggctgctggcctgcttggcgtgggttctcccgacaggctcatttgtgagaactaaaatagatactacggagaacttgctcaacacagaggtgcacagctcgccagcgcagcgctggtccatgcaggtgccacccgaggtgagcgcggaggcaggcgacgcggcagtgctgccctgcaccttcacgcacccgcaccgccactacgacgggccgctgacggccatctggcgcgcgggcgagccctatgcgggcccgcaggtgttccgctgcgctgcggcgcggggcagcgagctctgccagacggcgctgagcctgcacggccgcttccggctgctgggcaacccgcgccgcaacgacctctcgctgcgcgtcgagcgcctcgccctggctgacgaccgccgctacttctgccgcgtcgagttcgccggcgacgtccatgaccgctacgagagccgccacggcgtccggctgcacgtgacagccgcgccgcggatcgtcaacatctcggtgctgcccagtccggctcacgccttccgcgcgctctgcactgccgaaggggagccgccgcccgccctcgcctggtccggcccggccctgggcaacagcttggcagccgtgcggagcccgcgtgagggtcacggccacctagtgaccgccgaactgcccgcactgacccatgacggccgctacacgtgtacggccgccaacagcctgggccgctccgaggccagcgtctacctgttccgcttccatggcgccagcggggcctcgacggtcgccctcctgctcggcgctctcggcttcaaggcgctgctgctgctcggggtcctggccgcccgcgctgcccgccgccgcccagagcatctggacaccccggacaccccaccacggtcccaggcccaggagtccaattatgaaaatttgagccagatgaacccccggagcccaccagccaccatgtgctcaccgtga
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ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC
【SEQ ID NO:141】
CTTGAGCCGGCGGATGGTCGAGGTGAGGTGTGGCAGGCTTGAGATCCAGCTGTTGGGGTGAGTACTCCCTCTCAAAAGCGGGCATTACTTCTGCGCTAAGATTGTCAGTTTCCAAAAACGAGGAGGATTTGATATTCACCTGGCCCGATCTGGCCATACACTTGAGTGACAATGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGGTCCAAGTTTGCCGCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGCGGAGACGGAGCTTACGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAACTTCGGCACCCAGACCTACACCTGCAACGTAGATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGACAGTTGAGCGCAAATGTTGTGTCGAGTGCCCACCGTGCCCAGCACCACCTGTGGCAGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCACGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTTCCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTTGTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACACCTCCCATGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGCCCCGCCGCCGGACGAACTAAACCTGACTACGGCATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGATGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCACGATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTAATTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCATTGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCCTCACTCTCTTCCGCATCGCTGTCTGCGAGGGCCAGCTGTTGGGCTCGCGGTTGAGGACAAACTCTTCGCGGTCTTTCCAGTACTCTTGGATCGGAAACCCGTCGGCCTCCGAACGGTACTCCGCCACCGAGGGACCTGAGCGAGTCCGCATCGACCGGATCGGAAAACCTCTCGAGAAAGGCGTCTAACCAGTCACAGTCGCAAGGTAGGCTGAGCACCGTGGCGGGCGGCAGCGGGTGGCGGTCGGGGTTGTTTCTGGCGGAGGTGCTGCTGATGATGTAATTAAAGTAGGCGGT
【SEQ ID NO:142】
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCGAGGTCCAGCTGCAACAATCTGG
【SEQ ID NO:143】
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGGTCCAAGTGCAGCAGCCTGG
【SEQ ID NO:144】
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCGAGATCCAGCTGCAGCAGTCTGG
【SEQ ID NO:145】
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCGAAGTGAAGCTTGAGGAGTCTGG
【SEQ ID NO:146】
GGGTTCCAGGTTCCACTGGCCAGGTCCAACTGCAGCAGCCTGG
【SEQ ID NO:147】
GGGGCCAGGGGAAAGACAGATGGGCCCTTCGTTGAGGC
【SEQ ID NO:148】
RSX1aX2aSLLHSNGX3aTYLY
X1a是中性亲水性氨基酸
X3a是疏水性氨基酸或天冬酰胺
X2a是赖氨酸或谷氨酸
SEQ ID NO:149
X1bMSNLAS
其中X1b是碱性氨基酸
【SEQ ID NO:150】
RX1cSNLX2cS
其中X1c是蛋氨酸或苏氨酸
其中X2c是疏水性氨基酸
【SEQ ID NO:151】
X1dQX2dLEX3dPX4dT
其中X1d是疏水性氨基酸；
其中X2d是碱性氨基酸；
其中X3d是酪氨酸或亮氨酸，和；
其中X4d是芳香族氨基酸。
【SEQ ID NO:152】
QQWSSNPX1eT
其中X1e是脯氨酸或亮氨酸。
【SEQ ID NO:153】
GYTFX1fX2fYX3fMX
其中X1f是苏氨酸或天冬酰胺；
其中X2f苏氨酸、精氨酸、丝氨酸或天冬氨酸；
其中X3f是色氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸或谷氨酸，和；
其中X4f是酪氨酸、组氨酸或天冬氨酸。
【SEQ ID NO:154】
GYTFTDYX5fMH
其中X5f是酸性氨基酸。
【SEQ ID NO:155】
LINPX1gNX2gRX3gN
其中X1g是中性亲水性氨基酸；
其中X2g是丙氨酸或甘氨酸，和；
其中X3g是脯氨酸或苏氨酸。
【SEQ ID NO:156】
X1hIDPETGGTA
其中X1h是丙氨酸或苏氨酸。
【SEQ ID NO:157】
EIX1iPX2iX3iSX4iX5iN
其中X1i是天冬氨酸或天冬酰胺；
其中X2i是天冬氨酸或丝氨酸；
其中X3i是天冬氨酸或丝氨酸；
其中X4i是酪氨酸或苏氨酸，和；
其中X5i是苏氨酸或异亮氨酸。
【SEQ ID NO:158】
TX1jFYYX2jX3jX4jNYDVGFAY
其中X1j是中性亲水性氨基酸；
其中X2j是中性亲水性氨基酸；
其中X3j是酪氨酸或组氨酸，和；
其中X4j是酪氨酸或丝氨酸。
【SEQ ID NO:159】
GTAAGCGAATTCATGGTGAAAACTAGAAGAGACGC
【SEQ ID NO:160】
GTAAGCAAGCTTTTAGCCGTGGAAGCGGAACAGG
【SEQ ID NO:161】(25B02可变轻链DNA)
AACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGAGAATATTTACAGTTATTTAGCATGGTATCAACAGAAGCAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTACCAGAAGGTGTGTCAGTAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAACCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATCACTGTCAACATCATTATGGTGTTCCTCTTACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGTTGAAA
【SEQ ID NO:162】(25B02可变轻链氨基酸)
NIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASENIYSYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLPEGVSVRFSGSGSGTQFSLKINNLQPEDFGSYHCQHHYGVPLTFGSGTKLELK
【SEQ ID NO:163】(25B02可变重链DNA)
CAGGTGAAGCTTCAGCAGTCCGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAGGAACTGGATACAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAAATGGTGATAGTAGGTATACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCGAACACAGCCTACATGCAACTCAGCGGTTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATTGGCTGGTAACTACGCTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA
【SEQ ID NO:164】(25B02可变重链氨基酸)
QVKLQQSGAELARPGASVKFSCKASGYTFTRNWIQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNGDSRYTQKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSGLASEDSAVYYCARLAGNYAYYFDYWGQGTALTVSS
【SEQ ID NO:165】(25D11可变轻链DNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAACAGAAGCAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCTTACCAGAAGGTGTGTCAGTAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACACAGTTTTCTCTGAAGATCAACAACCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATCACTGTCAACATCATTATGGTGTTCCTCTTACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGTTGAAA
【SEQ ID NO:166】(25D11可变轻链氨基酸)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLPEGVSVRFSGSGSGTQFSLKINNLQPEDFGSYHCQHHYGVPLTFGSGTKLELK
【SEQ ID NO:167】(25D11可变重链DNA)
CAGGTGAAGCTTCAGCAGTCCGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACTAGGAACTGGATACAGTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTATTTATCCTGGAAATGGTGATAGTAGGTATACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCGAACACAGCCTACATGCAACTCAGCGGTTTGGCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATTGGCTGGTAACTACGCTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA
【SEQ ID NO:168】(25D11可变重链氨基酸)
QVKLQQSGAELARPGASVKFSCKASGYTFTRNWIQWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNGDSRYTQKFKGKATLTADKSSNTAYMQLSGLASEDSAVYYCARLAGNYAYYFDYWGQGTALTVSS
【SEQ ID NO:169】(25E10可变轻链DNA)
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCAGCCTCCCTATCTGCATCTGTGGGAGAAACTGTCACCATCACATGTCGAGCAAGTGGGAATATTCACAATTATTTAGCATGGTATCAGCAGAAACAGGGAAAATCTCCTCAGCTCCTGGTCTATAATGCAAAAACCCTAGCAGATGGTGTGCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGAACACAATATTCTCTCAAGATCAACAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGGGAGTTATTACTGTCAACATCATTACGGTGCTCCTCTTACGTTCGGTGCTGGGACCAAGGTGGAGCTGAAA
【SEQ ID NO:170】(25E10可变轻链氨基酸)
DIQMTQSPASLSASVGETVTITCRASGNIHNYLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLADGVPSRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSYYCQHHYGAPLTFGAGTKVELK
【SEQ ID NO:171】(25E10可变重链DNA)
GATGTGCAGCTGCAACAATCTGGGGCTGAGCTGGCAAGACCTGGGGCTTCAGTGAAGTTTTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACTAGGAACTGGATACAGTGGGTTAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGGGCTGTTTATCCTGGAAATGGTGATAGTAGGTATACTCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACATTGACTGCAGATAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAACAGTTTGTCATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGCGCAAGATTGGCTGGTAACTACGCTTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCGCTCTCACAGTCTCCTCA
【SEQ ID NO:172】(25E10可变重链氨基酸)
DVQLQQSGAELARPGASVKFSCKASGYTFTRNWIQWVKQRPGQGLEWIGAVYPGNGDSRYTQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLNSLSSEDSAVYYCARLAGNYAYYFDYWGQGTALTVSS
【SEQ ID NO:173】
RASENIYSYLA
【SEQ ID NO:174】
NAKTLPE
【SEQ ID NO:175】
QHHYGVPLT
【SEQ ID NO:176】
GYTFTRNWIQ
【SEQ ID NO:177】
AIYPGNGDSR
【SEQ ID NO:178】
ARLAGNYAYYFDY
【SEQ ID NO:179】
RASGNIHNYLA
【SEQ ID NO:180】
NAKTLPE
【SEQ ID NO:181】
QHHYGVPLT
【SEQ ID NO:182】
GYTFTRNWIQ
【SEQ ID NO:183】
AIYPGNGDSR
【SEQ ID NO:184】
ARLAGNYAYYFDY
【SEQ ID NO:185】
RASGNIHNYLA
【SEQ ID NO:186】
NAKTLAD
【SEQ ID NO:187】
QHHYGAPLT
【SEQ ID NO:188】
GYTFTRNWIQ
【SEQ ID NO:189】
AVYPGNGDSR
【SEQ ID NO:190】
ARLAGNYAYYFDY
表5A：抗siglec-15重链可变序列
表5B：抗siglec-15轻链可变序列
本发明的一些实施方案如下：
1.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与能促进破骨细胞分化的多肽结合并具有与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15(Siglec-15；SEQID NO:2)的第20位至第259位氨基酸至少80％相同的序列，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞分化、骨再吸收或能够阻断Siglec-15与唾液酸结合。
2.如实施方案1所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞前体细胞分化成分化的破骨细胞。
3.如实施方案2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
4.如实施方案3所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其从分离的哺乳动物细胞产生。
5.如实施方案4所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的哺乳动物细胞是人细胞。
6.如实施方案5所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
7.如实施方案6所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
8.如实施方案7所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
9.如实施方案8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
10.如实施方案3所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
11.如实施方案10所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
12.如实施方案11所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
13.如实施方案2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是FV(scFv)、Fab、Fab′或(Fab′)2。
14.如实施方案2所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述破骨细胞前体细胞是人破骨细胞前体细胞。
15.如实施方案8所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述人破骨细胞前体细胞是原代人破骨细胞前体细胞。
16.如实施方案9所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
17.如实施方案16所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述分离的抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人抗体或其片段。
18.如实施方案17所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其为包含人抗体的恒定区或其片段的氨基酸的嵌合抗体或人抗体。
19.如实施方案18所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区或其片段来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。
20.如实施方案19所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述恒定区来自IgG2。
21.如实施方案1至20中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于与非变性的Siglec-15结合。
22.如实施方案21所述的抗体或抗原结合片段，特征在于其与Siglec-15而非Siglec-2或CD33特异性结合。
23.如实施方案1至22中任一项所述的抗体或抗原结合片段，特征在于1ng的抗体能够与少于500ng的SEQ ID NO:2结合。
24.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与SEQID NO:2或与同SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸具有至少80％序列同一性的变体特异性结合，且能够在卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞中检测所述SEQ ID NO:2或变体。
25.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与SEQID NO:2或与同SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸具有至少80％序列同一性的变体特异性结合，且能够抑制卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞的生长。
26.如实施方案1至25中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含轻链可变域，所述轻链可变域包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:38至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:42至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:46至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:50至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:54至少70％相同的序列、与SEQID NO:58至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:62至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:66至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:162至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:166至少70％相同的序列和与SEQ ID NO:170至少70％相同的序列。
27.如实施方案1至26所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含重链可变域，所述重链可变域包含选自由以下组成的组的序列：与SEQ ID NO:40至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:44至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:48至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:52至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:56至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:60至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:64至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:68至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:164至少70％相同的序列、与SEQ ID NO:168至少70％相同的序列和与SEQ ID NO:172至少70％相同的序列。
28.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与Siglec-15或与其变体特异性结合，所述抗体包含：
a)SEQ ID NO:38中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:40中限定的重链可变域的3个CDR，
b)SEQ ID NO:42中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:44中限定的重链可变域的3个CDR；
c)SEQ ID NO:46中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:48中限定的重链可变域的3个CDR；
d)SEQ ID NO:50中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:52中限定的重链可变域的3个CDR；
e)SEQ ID NO:54中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:56中限定的重链可变域的3个CDR；
f)SEQ ID NO:58中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:60中限定的重链可变域的3个CDR；
g)SEQ ID NO:62中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:64中限定的重链可变域的3个CDR，
h)SEQ ID NO:66中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:68中限定的重链可变域的3个CDR，
i)SEQ ID NO:162中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:164中限定的重链可变域的3个CDR，
j)SEQ ID NO:166中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:168中限定的重链可变域的3个CDR，和；
k)SEQ ID NO:170中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:172中限定的重链可变域的3个CDR。
29.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与Siglec-15或与其变体特异性结合，所述抗体包含：
a)与SEQ ID NO:194具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:191具有至少70％序列同一性的重链可变域；
b)与SEQ ID NO:195具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:192具有至少70％序列同一性的重链可变域；
c)与SEQ ID NO:196具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:193具有至少70％序列同一性的重链可变域；
d)与SEQ ID NO:38具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:40具有至少70％序列同一性的重链可变域；
e)与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:44具有至少70％序列同一性的重链可变域；
f)与SEQ ID NO:46具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:48具有至少70％序列同一性的重链可变域；
g)与SEQ ID NO:50具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:52具有至少70％序列同一性的重链可变域；
h)与SEQ ID NO:54具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:56具有至少70％序列同一性的重链可变域；
i)与SEQ ID NO:58具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:60具有至少70％序列同一性的重链可变域；
j)与SEQ ID NO:62具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:64具有至少70％序列同一性的重链可变域，
k)与SEQ ID NO:66具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:68具有至少70％序列同一性的重链可变域，
l)与SEQ ID NO:162具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:164具有至少70％序列同一性的重链可变域，
m)与SEQ ID NO:166具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:168具有至少70％序列同一性的重链可变域，和；
n)与SEQ ID NO:170具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:172具有至少70％序列同一性的重链可变域。
30.如实施方案29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含：
a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQ ID NO:194具有至少70％序列同一性且具有如SEQ ID NO:148或SEQ ID NO:201中限定的CDRL1、如SEQ ID NO:149中限定的CDRL2和如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:203中限定的CDRL3和；
b)重链可变域，所述重链可变域与SEQ ID NO:191具有至少70％序列同一性且具有如SEQ ID NO:153或SEQ ID NO:205中限定的CDRH1、如SEQ ID NO:155或SEQ ID NO:207中限定的CDRH2和具有序列ARGGDGDYFDY的CDRH3。
31.如实施方案30所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL1选自由RSSKSLLHSNGITYLY、RSSKSLLHSNGVTYLY或RSSESLLHSNGITYLY组成的组。
32.如实施方案29或30所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2是QMSNLAS。
33.如实施方案29至32中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3选自由AQNLELPYT、MQHLEYPYT或AQNLEYPYT组成的组。
34.如实施方案29至33中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH1选自由GYTFTSYWMH和GYTFTTYWMH组成的组。
35.如实施方案29至34中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由LINPTNGRTN、LINPSNARTN和LINPSNGRPN组成的组。
36.如实施方案29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含：
a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQ ID NO:195具有至少70％序列同一性且具有如SEQ ID NO:197中限定的CDRL1、如SEQ ID NO:198中限定的CDRL2和如SEQ ID NO:204中限定的CDRL3和；
b)重链可变域，所述重链可变域与SEQ ID NO:192具有至少70％序列同一性且具有具有序列GYTFTRNWIQ的CDRH1、如SEQ ID NO:200中限定的CDRH2和具有序列ARLAGNYAYYFDY的CDRH3。
37.如实施方案36所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL1选自由RASGNIHNYLA和RASENIYSYLA组成的组。
38.如实施方案36或37所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2选自由NAKTLPE和NAKTLAD组成的组。
39.如实施方案36至38中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3选自由QHHYGVPLT和QHHYGAPLT组成的组。
40.如实施方案36至39中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由AIYPGNGDSR和AVYPGNGDSR组成的组。
41.如实施方案29所述的分离的抗体或抗原结合片段，特征在于其包含：
a)轻链可变域，所述轻链可变域与SEQ ID NO:196具有至少70％序列同一性且具有如SEQ ID NO:202中限定的CDRL1、如SEQ ID NO:150中限定的CDRL2和如SEQ ID NO:151或SEQ ID NO:203中限定的CDRL3，和；
b)重链可变域，所述重链可变域与SEQ ID NO:193具有至少70％序列同一性且具有如SEQ ID NO:154或SEQ ID NO:208中限定的CDRH1、如SEQ ID NO:156或SEQ ID NO:209中限定的CDRH2和如SEQ ID NO:158或SEQ ID NO:210中限定的CDRH3。
42.如实施方案41中所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL1选自由RSSKSLLHSNGNTYLY和RSTKSLLHSNGNTYLY组成的组。
43.如实施方案41或42所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL2是RMSNLAS。
44.如实施方案41至43中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRL3是MQHLEYPFT。
45.如实施方案41至44中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH1选自由GYTFTDYDMH和GYTFTDYEMH组成的组。
46.如实施方案41至45中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH2选自由TIDPETGGTA和AIDPETGGTA组成的组。
47.如实施方案41至46中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述CDRH3选自由TSFYYTYSNYDVGFAY、TSFYYTYYNYDVGFAY和TTFYYSHYNYDVGFAY组成的组。
48.一种分离的抗体或抗原结合片段，所述分离的抗体或抗原结合片段能够与如实施方案1至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争。
49.如实施方案1至48中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体包含恒定区或其片段。
50.如实施方案1至48中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其为scFv、Fab、Fab′或(Fab′)2。
51.如实施方案1至49中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是单克隆抗体。
52.如实施方案1至49中任一项所述的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体是多克隆抗体。
53.如实施方案1至52中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体与可检测部分或细胞毒性部分偶联。
54.一种核酸，所述核酸编码如实施方案26至47中任一项所述的抗体或抗原结合片段的轻链可变域和/或重链可变域。
55.一种载体，所述载体包含如实施方案54所述的核酸。
56.如实施方案55所述的载体，其中所述载体是表达载体。
57.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含如实施方案54所述的核酸。
58.如实施方案57所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
59.如实施方案58所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
60.一种分离的细胞，所述分离的细胞包含或表达如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
61.如实施方案60所述的分离的细胞，其中所述细胞包含编码轻链可变域的核酸和编码重链可变域的核酸。
62.如实施方案61所述的分离的细胞，其中所述细胞能够表达、组装和/或分泌抗体或其抗原结合片段。
63.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种和药学上可接受的载体。
64.一种组合物，所述组合物包含如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种和载体。
65.如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于治疗骨丢失的用途。
66.如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段用于治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的用途。
67.如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于诊断骨丢失或骨病的用途。
68.如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种用于诊断卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的用途。
69.一种治疗骨丢失的方法，所述方法包括将如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
70.一种治疗卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的方法，所述方法包括将如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
71.一种检测骨丢失或骨病的方法，所述方法包括将如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种施用于有需要的哺乳动物。
72.一种检测卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的方法，所述方法包括将如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段施用于有需要的哺乳动物。
73.一种检测SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的方法，所述SEQ ID NO:2变体与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸具有至少80％序列同一性，所述方法包括使表达SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的细胞或包含或怀疑包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2变体的样本与如实施方案1至53中任一项所述的抗体或抗原结合片段中的至少一种接触并测量结合。
74.如实施方案73所述的方法，其中所述样本来自哺乳动物。
75.如实施方案74所述的方法，其中所述哺乳动物患有或怀疑患有骨丢失。
76.如实施方案74所述的方法，其中所述哺乳动物患有或怀疑患有卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌。
77.如实施方案73至76中任一项所述的方法，其中所述样本是获自所述哺乳动物的血清样本、血浆样本或血液样本。
78.如实施方案73至76中任一项所述的方法，其中所述样本是获自所述哺乳动物的组织样本。
79.如实施方案73所述的方法，其中所述样本是细胞培养上清液。
80.如实施方案78至79中任一项所述的方法，所述方法包括定量与SEQ ID NO:2或与所述SEQ ID NO:2变体结合的抗体的量。
81.一种试剂盒，所述试剂盒包含如实施方案1至53中任一项所述的抗体。
82.SEQ ID NO:2或其至少10个氨基酸的片段用于产生用来诊断或治疗骨丢失、卵巢癌、肾癌、中枢神经***的癌症、***癌、黑素瘤、乳腺癌、肺癌或结肠癌的抗体的用途。
83.根据实施方案82所述的用途，其中所述片段包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中。
84.一种产生抗体或抗原结合片段的方法，所述抗体或抗原结合片段能够抑制破骨细胞前体细胞的分化(成为分化的破骨细胞)或能够抑制破骨细胞的再吸收活性，所述方法包括将SEQ ID NO:2、与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的变体或其至少10个氨基酸的片段施用于哺乳动物。
85.如实施方案84所述的方法，所述方法还包括分离或纯化所述抗体或抗原结合片段。
86.根据实施方案85所述的方法，其中所述片段包含在SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸中。
87.一种鉴定能够抑制卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞和结肠癌细胞的生长的化合物的方法，所述方法包括向包含与SEQ ID NO:2的第20位至第259位氨基酸至少80％相同的区的多肽或表达所述多肽的细胞提供候选化合物并测量所述多肽的所述活性或表达，根据所述多肽的降低的活性或表达确实地鉴定适宜的抑制性化合物。
88.如实施方案87所述的方法，其中所述候选化合物与所述多肽特异性地结合。
89.如实施方案88所述的方法，其中所述候选化合物是抗体或抗原结合片段。
90.如实施方案89所述的方法，其中所述候选化合物是siRNA或反义核酸。
91.一种抑制癌细胞的生长的方法，所述癌细胞选自由以下组成的组：卵巢癌细胞、肾癌细胞、中枢神经***的癌细胞、***癌细胞、黑素瘤细胞、乳腺癌细胞、肺癌细胞或结肠癌细胞，所述方法包括向所述癌细胞提供能够削弱与SEQ ID NO:2至少80％相同的多肽的表达的核酸，其中所述癌细胞表达与SEQ ID NO:2至少80％相同的所述多肽。
92.如实施方案90所述的方法，其中所述核酸是siRNA或反义核酸。

Claims (29)

1.能够与唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15(Siglec-15)特异性结合的分离的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含：
a)SEQ ID NO:38中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:40中限定的重链可变域的3个CDR；
b)SEQ ID NO:42中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:44中限定的重链可变域的3个CDR；
c)SEQ ID NO:46中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:48中限定的重链可变域的3个CDR；
d)SEQ ID NO:50中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:52中限定的重链可变域的3个CDR；
e)SEQ ID NO:54中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:56中限定的重链可变域的3个CDR；
f)SEQ ID NO:58中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:60中限定的重链可变域的3个CDR；
g)SEQ ID NO:62中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:64中限定的重链可变域的3个CDR；
h)SEQ ID NO:66中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:68中限定的重链可变域的3个CDR；
i)SEQ ID NO:162中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:164中限定的重链可变域的3个CDR；
j)SEQ ID NO:166中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:168中限定的重链可变域的3个CDR；
k)SEQ ID NO:170中限定的轻链可变域的3个CDR和SEQ ID NO:172中限定的重链可变域的3个CDR；
l)与SEQ ID NO:194具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:191具有至少70％序列同一性的重链可变域；
m)与SEQ ID NO:195具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:192具有至少70％序列同一性的重链可变域；
n)与SEQ ID NO:196具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:193具有至少70％序列同一性的重链可变域；
o)与SEQ ID NO:38具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:40具有至少70％序列同一性的重链可变域；
p)与SEQ ID NO:42具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:44具有至少70％序列同一性的重链可变域；
q)与SEQ ID NO:46具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:48具有至少70％序列同一性的重链可变域；
r)与SEQ ID NO:50具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:52具有至少70％序列同一性的重链可变域；
s)与SEQ ID NO:54具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:56具有至少70％序列同一性的重链可变域；
t)与SEQ ID NO:58具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:60具有至少70％序列同一性的重链可变域；
u)与SEQ ID NO:62具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:64具有至少70％序列同一性的重链可变域；
v)与SEQ ID NO:66具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:68具有至少70％序列同一性的重链可变域；
w)与SEQ ID NO:162具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:164具有至少70％序列同一性的重链可变域；
x)与SEQ ID NO:166具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:168具有至少70％序列同一性的重链可变域；或
y)与SEQ ID NO:170具有至少70％序列同一性的轻链可变域和与SEQ ID NO:172具有至少70％序列同一性的重链可变域。
2.权利要求1的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段包含：
a)包含具有SEQ ID NO:81中所示的氨基酸序列的CDRL1、具有SEQ ID NO:82中所示的氨基酸序列的CDRL2和具有SEQ ID NO:83中所示的氨基酸序列的CDRL3的轻链可变域，和
b)包含具有SEQ ID NO:84中所示的氨基酸序列的CDRH1、具有SEQ ID NO:85中所示的氨基酸序列的CDRH2和具有SEQ ID NO:86中所示的氨基酸序列的CDRH3的重链可变域。
3.权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
4.权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自：scFv、Fab、Fab′或(Fab′)2。
5.权利要求1或2的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含人抗体的恒定区。
6.权利要求1至5中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述恒定区来自人IgG1免疫球蛋白或来自人IgG2免疫球蛋白。
7.权利要求1至6中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段与治疗性部分或可检测部分偶联。
8.权利要求1至7中任一项的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：具有SEQ ID NO:46中所示的氨基酸序列的轻链可变区，和具有SEQ ID NO:48中所示的氨基酸序列的重链可变区。
9.药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段。
10.权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于抑制破骨细胞分化、骨再吸收或骨丢失的药物中的用途。
11.权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗或预防骨再吸收或骨丢失的药物中的用途。
12.权利要求10或11中所定义的用途，其中所述骨再吸收或骨丢失与选自下列的疾病相关：癌症、骨质减少、骨软化、甲状旁腺机能亢进、甲状腺机能减退、甲状腺机能亢进、性腺机能减退、甲状腺毒症、***性肥大细胞增多症、成人低磷酸酯酶症、肾上腺皮质功能亢进、成骨不全、佩吉特氏病、库兴氏病/综合征、特纳综合征、戈谢病、埃勒斯-当洛斯综合征、马凡综合征、Menkes综合征、范可尼综合征、高钙血症、低钙血症、关节炎、牙周病、佝偻病、不完全性骨纤维生成、骨硬化疾患、致密性成骨不全症和由巨噬细胞介导的炎性过程导致的损伤。
13.权利要求12中所定义的用途，其中所述骨再吸收或骨丢失与多发性骨髓瘤相关。
14.权利要求12中所定义的用途，其中所述骨再吸收或骨丢失与骨质疏松症相关。
15.权利要求12中所定义的用途，其中所述骨丢失为癌症诱导的骨丢失。
16.权利要求15中所定义的用途，其中所述癌症诱导的骨丢失与多发性骨髓瘤相关。
17.权利要求10至16中任一项中所定义的用途，其中所述抗体与抗癌药物相组合地进行使用。
18.权利要求17中所定义的用途，其中所述抗癌药物为细胞毒性剂、抗有丝***药物、铂基剂或DNA损伤剂或者适合于癌症治疗的治疗性抗体。
19.试剂盒，其包含权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段。
20.权利要求19的试剂盒，其进一步包含抗癌药物或抗再吸收药物。
21.权利要求20的试剂盒，其中所述抗癌药物为细胞毒性剂、抗有丝***药物、铂基剂或DNA损伤剂或者适合于癌症治疗的治疗性抗体。
22.核酸，其编码权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段。
23.载体，其包含权利要求22的核酸。
24.分离的细胞，其包含权利要求22的核酸或权利要求23的载体，或者表达权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段。
25.权利要求24的分离的细胞，其中所述细胞表达并且组装或分泌抗体或其抗原结合片段。
26.权利要求1至8中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素15，所述检测对于表达Siglec-15的细胞或者包含或怀疑包含Siglec-15的样本来进行。
27.权利要求26的用途，其中所述样本来自哺乳动物或者为细胞培养上清液。
28.权利要求27的用途，其中所述哺乳动物患有或怀疑患有骨丢失。
29.权利要求26的用途，其中所述样本是获自哺乳动物的血清样本、血浆样本、血液样本或组织样本。
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