KR20170140318A - 진행성 골화성 섬유이형성증의 치료 - Google Patents

진행성 골화성 섬유이형성증의 치료 Download PDF

Info

Publication number
KR20170140318A
KR20170140318A KR1020177033896A KR20177033896A KR20170140318A KR 20170140318 A KR20170140318 A KR 20170140318A KR 1020177033896 A KR1020177033896 A KR 1020177033896A KR 20177033896 A KR20177033896 A KR 20177033896A KR 20170140318 A KR20170140318 A KR 20170140318A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
acvr1
antibodies
human
fop
Prior art date
Application number
KR1020177033896A
Other languages
English (en)
Inventor
사라 제이. 핫셀
아리스 엔. 이코노미디스
빈센트 제이. 아이던
Original Assignee
리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 filed Critical 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드
Publication of KR20170140318A publication Critical patent/KR20170140318A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/138—Aryloxyalkylamines, e.g. propranolol, tamoxifen, phenoxybenzamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Abstract

진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)의 치료 방법이 제공되며, 상기 방법에서는 FOP에 걸린 피검자에게 유효한 투약체계의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체가 투여된다.

Description

진행성 골화성 섬유이형성증의 치료
관련 출원의 상호 참조
본 출원은, 개시 내용이 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 2015년 4월 29일에 출원된 미국 가출원 제62/154,617호 및 2015년 4월 30일에 출원된 제62/155,427호에 대하여 35 USC 119(e) 하에서 이득을 주장한다.
진행성 골화성 섬유이형성증(Fibrodysplasia Ossificans Progressiva) (FOP)은, 골격근 및 관련 결합 조직의 조기 발병형(early onset), 일과성(episodic) 및 진행성 골화를 특징으로 하는 보통염색체 우성 장애(autosomal dominant disorder)이다. FOP는, 대다수가 206번 아르기닌을 히스티딘으로 변경 (R206H)시킴에 의한, ACVR1 (ALK2)의 세포내 도메인의 돌연변이에 의해 유발된다 (문헌[Pignolo, R.J. et al. 2011, Orphanet J. Rare Dis.6:80]). ACVR1은 골형성 단백질(bone morphogenic protein) (BMP)에 대한 I형 수용체이다. 그 중에서도 R206H 돌연변이는, 활성화에 대한 수용체의 감수성을 증가시키고 이것이 사일런싱(silencing)에 대해 더 저항성이 되게 하는 것으로 믿어진다. FOP에 대한 유효한 의학 요법은 알려져 있지 않다.
본 발명은 진행성 골화성 섬유이형성증 (FOP)에 걸린 피검자에게 유효한 투약체계의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체를 투여하는 것을 포함하는, FOP의 치료 방법을 제공한다. 일부 방법에서, 항체는 키메라(chimeric), 베니어드(veneered), 인간화(humanized) 또는 인간 항체이다. 일부 방법에서, 항체는 무손상(intact) 항체이다. 일부 방법에서, 항체는 인간 카파 IgG1 항체이다. 일부 방법에서, 액티빈 B, BMP9 및 BMP10 중 둘 이상에 대한 항체들의 병용물이 투여된다. 일부 방법에서, 항체는 ACVR1, ACVR2A, 또는 ACVR2B 세포외 도메인-Fc 융합 단백질 또는 액티빈 A에 대한 항체와의 병용 요법으로 투여된다.
본 발명은 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체의 용도를 추가로 제공한다. 선택적으로, 항체는 키메라, 베니어드, 인간화 또는 인간 항체이다. 선택적으로, 항체는 무손상 항체이다. 선택적으로, 항체는 인간 카파 IgG1 항체이다. 선택적으로, 액티빈 B, BMP9 및 BMP10 중 둘 이상에 대한 항체들의 병용물이 투여된다. 선택적으로, 항체는 ACVR1, ACVR2A, 또는 ACVR2B 세포외 도메인-Fc 융합 단백질 또는 액티빈 A에 대한 항체와의 병용 요법으로 투여된다.
도 1의 A 내지 D는 비동종 리간드 액티빈 B 및 동종 BMP 리간드에 의한 ACVR1 R206H의 활성화를 나타낸 개략도를 도시한다. 도 1의 A는 I형 수용체 ACVR1B/1C를 통한 액티빈 B 신호전달 및 Smad2/3 인산화, 및 BMP와의 II형 수용체 (ACVR2A, ACVR2B, 및 BMPR2)의 공유를 도시한다. 도 1의 B는, ACVR1이 II형 수용체와 함께 BMP를 인식하고 Smad1/5/8의 인산화를 자극하는 것을 도시한다. 도 1의 C에서, ACVR1은 II형 수용체와 함께 액티빈 B와 결합하지만, 생성된 복합체는 Smad1/5/8의 인산화를 자극하지 않고; 대신에, 액티빈 B는 ACVR1을 통한 표준(canonical) BMP-매개 신호전달의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 도 1의 D에서, ACVR1의 R206H 변이체는, BMP와 흡사하게, 액티빈 B에 반응하여 Smad1/5/8 인산화를 유도하여, ACVR2
Figure pct00001
ACVR1
Figure pct00002
액티빈 복합체를 '데드 엔드(dead end)' 복합체로부터 신호전달 복합체로 효과적으로 전환시킨다.
도 2는 액티빈 A가 ACVR1을 통한 BMP6 신호전달을 억제하는 것을 도시한다.
도 3의 A 내지 C는 (A) 흉골, (B) 꼬리쪽 척추골 및 (C) 고관절에서의 처리의 부재 하에 있는 Acvr1 [R206H]FlEx /+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2 /+ 마우스에서의 이소성(heterotopic) 골형성을 도시한다. 도 3의 D는, 전위성(ectopic) 골성장이 타목시펜 주사 후 2주 내지 4주째에 형성되고 현존하는 골격의 원위에서 발생될 수 있음을 도시한다. 도 3의 E는 대퇴골부터 골반까지에 걸쳐서 보여주는 등쪽에서 바라본(dorsal view) 전위성 골병변의 생체외(ex- vivo) μCT 이미지를 도시한다. 도 3의 F는 전위성 골을 통과하는 횡단면도를 도시하는데, 이는 새로 형성된 골이 피질(cortical) 및 해면(trabecular) 유사 구조 둘 모두를 가짐을 보여준다. 도 3의 G는 전위성 골병변의 H&E 염색된 조직 절편이 피질골(c) 및 해면골(t) 유사 구조 및 골수(bm)임을 입증함을 도시한다.
정의
항체 또는 ECD-Fc 융합 단백질과 같은 치료제는 전형적으로 단리된 형태(isolated form)로 제공된다. 이것은 작용제가 전형적으로 적어도 50% w/w에 이의 생성 또는 정제로부터 발생하는 간섭 단백질 및 다른 오염물질이 없음을 의미하지만, 작용제가 이의 사용을 용이하도록 의도되는 과량의 약제학적으로 허용되는 담체(들) 또는 다른 비히클과 배합될 가능성을 배제하지는 않는다는 것을 의미한다. 때때로 작용제는 적어도 60, 70, 80, 90, 95 또는 99% w/w에 생성 또는 정제로부터의 간섭 단백질 및 오염물질이 없다.
아미노산 치환을 보존적 또는 비보존적으로 분류하기 위해, 아미노산은 하기와 같이 그룹화된다: 그룹 I (소수성 측쇄): met, ala, val, leu, ile; 그룹 II (중성 친수성 측쇄): cys, ser, thr; 그룹 III (산성 측쇄): asp, glu; 그룹 IV (염기성 측쇄): asn, gln, his, lys, arg; 그룹 V (사슬 배향(chain orientation)에 영향을 주는 잔기): gly, pro; 및 그룹 VI (방향족 측쇄): trp, tyr, phe. 보존적 치환은 동일한 클래스(class)의 아미노산들 사이의 치환을 포함한다. 비보존적 치환은 이들 클래스 중 한 클래스의 구성원을 다른 클래스의 구성원으로 교환하는 것이 된다.
서열 동일성 백분율은 가변 영역에 대한 카밧(Kabat) 번호표기 규칙(numbering convention) 또는 불변 영역에 대한 EU 번호표기에 의해 최대로 정렬된 항체 서열을 이용하여 결정된다. 다른 단백질에 대해, 서열 동일성은, 알고리즘, 예를 들어 Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0 (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., 미국 위스콘신주 매드슨 소재)의 BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA를 사용하거나, 디폴트 갭 파라미터(default gap parameter)를 사용하거나, 검사(inspection), 및 최상의 정렬에 의해, 서열을 정렬함으로써 결정될 수 있다. 정렬 후, 대상 항체 영역 (예를 들어, 중쇄 또는 경쇄의 전체 성숙 가변 영역)이 기준 항체의 동일한 영역과 비교되고 있는 경우, 대상 항체 영역과 기준 항체 영역 사이의 서열 동일성 백분율은, 대상 및 기준 항체 영역 둘 모두에서 동일한 아미노산에 의해 점유되는 위치들의 개수를, 갭(gap)은 계산되지 않은 두 영역의 정렬된 위치들의 전체 개수로 나누고, 100을 곱하여 백분율로 환산한 것이다.
하나 이상의 열거된 요소를 "포함하는" 조성물 또는 방법은 구체적으로 열거되지 않은 다른 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체를 포함하는 조성물은 항체를 단독으로 또는 다른 성분과 배합하여 함유할 수 있다.
인간화 항체는, 비인간(non-human) "도너(donor)" 항체로부터의 CDR이 인간 "억셉터(acceptor)" 항체 서열 내로 이식된, 유전자 조작된(genetically engineered) 항체이다 (예를 들어, Queen의 미국 특허 제5,530,101호 및 제5,585,089호; Winter의 미국 특허 제5,225,539호; Carter의 미국 특허 제6,407,213호; Adair의 미국 특허 제5,859,205호 및 제6,881,557호; Foote의 미국 특허 제6,881,557호 참조). 억셉터 항체 서열은, 예를 들어 성숙 인간 항체 서열, 이러한 서열들의 복합물(composite), 인간 항체 서열의 컨센서스(consensus) 서열, 또는 생식계열(germline) 영역 서열일 수 있다. 따라서, 인간화 항체는, 완전히 또는 실질적으로 도너 항체로부터의 일부 또는 모든 CDR 및, 존재하는 경우, 완전히 또는 실질적으로 인간 항체 서열로부터의 가변 영역 프레임워크(framework) 서열 및 불변 영역을 지닌 항체이다. 유사하게, 인간화 중쇄는, 완전히 또는 실질적으로 도너 항체 중쇄로부터 적어도 1개, 2개 및 통상 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 중쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 중쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 중쇄 불변 영역을 지닌다. 유사하게, 인간화 경쇄는, 완전히 또는 실질적으로 도너 항체 경쇄로부터 적어도 1개, 2개 및 통상 모든 3개의 CDR, 및 존재하는 경우, 실질적으로 인간 경쇄 가변 영역 프레임워크 및 불변 영역 서열로부터의 경쇄 가변 영역 프레임워크 서열 및 경쇄 불변 영역을 지닌다. 나노바디(nanobody) 및 dAb 이외에, 인간화 항체가 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄를 포함한다. 각각의 CDR들 사이에, 상응하는 잔기 (카밧에 의해 정의된 바와 같음)의 적어도 85%, 90%, 95% 또는 100%가 동일한 경우, 인간화 항체의 CDR은 실질적으로 비인간 항체의 상응하는 CDR로부터의 것이다. 카밧에 의해 정의된 상응하는 잔기의 적어도 85, 90, 95 또는 100%가 동일한 경우, 항체 사슬의 가변 영역 프레임워크 서열 또는 항체 사슬의 불변 영역은 실질적으로 각각 인간 가변 영역 프레임워크 서열 또는 인간 불변 영역으로부터의 것이다.
인간화 항체가 마우스 항체로부터의 모든 6개의 CDR (바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같음)을 종종 포함한다고 하더라도, 그것은 모두보다 더 적은 CDR (예를 들어, 마우스 항체로부터의 적어도 3개, 4개, 또는 5개의 CDR)로 또한 만들어질 수 있다 (예를 들어, 문헌[Pascalis et al., J. Immunol. 169:3076, 2002]; 문헌[Vajdos et al., Journal of Molecular Biology, 320: 415-428, 2002]; 문헌[Iwahashi et al., Mol. Immunol. 36:1079-1091, 1999]; 문헌[Tamura et al., Journal of Immunology, 164:1432-1441, 2000]).
키메라 항체는, 비인간 항체 (예를 들어, 마우스)의 경쇄 및 중쇄의 성숙 가변 영역이 인간 경쇄 및 중쇄 불변 영역과 조합된 항체이다. 이러한 항체는 마우스 항체의 결합 특이성을 실질적으로 또는 완전히 보유하고, 약 3분의 2가 인간 서열이다.
베니어드 항체는, 비인간 항체의 CDR의 일부 및 통상 전부 및 비인간 가변 영역 프레임워크 잔기의 일부를 보유하지만 B- 또는 T-세포 에피토프에 기여할 수 있는 다른 가변 영역 프레임워크 잔기, 예를 들어 노출된 잔기 (문헌[Padlan, Mol. Immunol. 28:489, 1991])가 인간 항체 서열의 상응하는 위치로부터의 잔기로 대체된, 인간화 항체의 일 유형이다. 결과는, CDR이 완전히 또는 실질적으로 비인간 항체로부터의 것이고 비인간 항체의 가변 영역 프레임워크가 치환에 의해 더 인간과 유사하게 된, 항체이다.
인간 항체는 인간으로부터 단리되거나 그렇지 않으면 인간 면역글로불린 유전자의 발현으로부터 생성될 수 있다 (예를 들어, 유전자도입(transgenic) 마우스에서, 시험관내에서 또는 파지 디스플레이(phage display)에 의해). 인간 항체를 생성시키는 방법은 문헌[Oestberg et al., Cys muoma 2:361-367 (1983)]); Oestberg의 미국 특허 제4,634,664호; 및 Engleman 등의 미국 특허 제4,634,666호의 트리오마(trioma) 방법, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 유전자도입 마우스의 용도(예를 들어, 참조)를 포함한다. 단클론성(monoclonal) 항체는 인간 면역계 유전자를 함유하는 유전자도입 마우스, 예를 들어 Regeneron Pharmaceuticals, Inc.로부터의 VelocImmune® 마우스 (문헌[Murphy, PNAS 111 no. 14, 5153-5158 (2014)], 문헌[Xenomouse, Jakobovits, Nature Biotechnology 25, 1134-1143 (2007)]) 또는 Medarex, Inc.로부터의 HuMAb 마우스 (문헌[Lonberg, Handbook Exp. Pharmacol. 181, 69-97 (2008)]; Lonberg 등의 국제 특허 출원 공개 WO93/12227호 (1993년); 미국 특허 제5,877,397호, 미국 특허 제5,874,299호, 미국 특허 제5,814,318호, 미국 특허 제5,789,650호, 미국 특허 제5,770,429호, 미국 특허 제5,661,016호, 미국 특허 제5,633,425호, 미국 특허 제5,625,126호, 미국 특허 제5,569,825호, 미국 특허 제5,545,806호, 문헌[Nature 148, 1547-1553 (1994)], 문헌[Nature Biotechnology 14, 826 (1996)], Kucherlapati의 국제 특허 출원 공개 WO 91/10741호 (1991년))에 의해 또한 생성될 수 있다. 인간 항체는 파지 디스플레이 방법에 의해 또한 생성될 수 있다 (예를 들어, Dower 등의 국제 특허 출원 공개 WO 91/17271호 및 McCafferty 등의 국제 특허 출원 공개 WO 92/01047호, 미국 특허 제5,877,218호, 미국 특허 제5,871,907호, 미국 특허 제5,858,657호, 미국 특허 제5,837,242호, 미국 특허 제5,733,743호 및 미국 특허 제5,565,332호 참조).
길항제가 이것의 유래가 된 모항체(parental antibody)의 특성을 보유한다고 하는 경우, 보유는 완전하거나 부분적일 수 있다. 활성의 완전한 보유는, 길항제의 활성이 이것의 유래가 된 분자의 그것과 실험 오차 내에서 동일하거나 그보다 높다는 것을 의미한다. 활성의 부분적 보유는, 음성 대조군의 백그라운드 수준보다 유의하게 높은 (즉, 실험 오차를 넘는) 활성, 바람직하게는 이것의 유래가 된 분자의 상응하는 활성의 적어도 50%를 의미한다.
하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 항원의 모든 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소 또는 제거시키는 경우, 두 항체는 동일한 에피토프를 지닌다. 하나의 항체의 결합을 감소 또는 제거시키는 일부의 아미노산 돌연변이가 다른 것의 결합을 감소 또는 제거시키는 경우, 두 항체는 중첩(overlapping) 에피토프를 지닌다.
항체들 사이의 경쟁은, 시험 중인 항체가 공통 항원(common antigen)에 대한 기준 항체의 특이적 결합을 억제하는 검정(assay)에 의해 결정된다 (예를 들어, 문헌[Junghans et al., Cancer Res. 50:1495, 1990] 참조). 경쟁 결합 검정에서 측정되는 바와 같이 과량의 시험 항체 (예를 들어, 적어도 2x, 5x, 10x, 20x 또는 100x)가 기준 항체의 결합을 적어도 50%, 그러나 바람직하게는 75%, 90% 또는 99% 억제하는 경우, 시험 항체는 기준 항체와 경쟁한다. 경쟁 검정에 의해 확인된 항체 (경쟁성(competing) 항체)는, 기준 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체, 및 입체 장애가 일어날 정도로 기준 항체에 의해 결합되는 에피토프에 충분히 근접해 있는 인접 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다.
I. 개요
본 발명은 진행성 골화성 섬유이형성증 (FOP)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법에서는 유효한 투약체계의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체가 이 질환을 갖는 피검자에게 투여된다. 본 발명은 다른 것들 중에서도 이들 리간드 각각이 ACVR1H206 돌연변이를 갖는 세포에서 FOP의 이소성 골화를 유도할 수 있다는 결과에 부분적으로 기초한다. 액티빈 B는 야생형 ACVR1의 리간드가 아니기 때문에, 액티빈 B에 의한 활성화는 특히 의외이다.
본 발명의 실시가 기전(mechanism)의 이해에 의존하지는 않지만, 액티빈 B에 의한, ACVR1은 아닌 ACVR1H206의 활성화에 대한 가능한 설명이 도 1의 A 내지 D에 개략적으로 도시되어 있다. 도 1의 A는 I형 수용체 ACVR1B/1C를 통한 액티빈 B 신호전달 및 Smad2/3 인산화, 및 BMP와의 II형 수용체 (ACVR2A, ACVR2B, 및 BMPR2)의 공유를 도시한다. 도 1의 B는, ACVR1이 II형 수용체와 함께 BMP를 인식하고 Smad1/5/8의 인산화를 자극하는 것을 도시한다. 도 1의 C에서, ACVR1은 II형 수용체와 함께 액티빈 B와 결합하지만, 생성된 복합체는 Smad1/5/8의 인산화를 자극하지 않고; 대신에, 액티빈 B는 ACVR1을 통한 표준 BMP-매개 신호전달의 경쟁적 억제제로서 작용한다. 도 1의 D에서, ACVR1의 R206H 변이체는, BMP와 흡사하게, 액티빈 B에 반응하여 Smad1/5/8 인산화를 유도하여, ACVR2
Figure pct00003
ACVR1
Figure pct00004
액티빈 복합체를 '데드 엔드' 복합체로부터 신호전달 복합체로 효과적으로 전환시킨다. R206H 변이체는 또한 표준 BMP, 예컨대 BMP9 및 BMP10에 반응할 수 있다. ACVR2
Figure pct00005
ACVR1
Figure pct00006
액티빈 B 복합체는 ACVR1-ACVR1[R206H]의 이종이량체를 함유하는 것으로 본 명세서에 제시되어 있다. 그러나, 이것은 필수 배열은 아니다: ACVR1[R206H]의 동종이량체가 또한 신호를 전달할 수 있다.
II. ACVR1 , ACVR2A , ACVR2B , 액티빈 A, 액티빈 B, BMP9 및 BMP10
리간드의 형질전환 성장 인자(transforming growth factor) β (TGFβ) 수퍼패밀리(superfamily)는, 예를 들어 골형성 단백질 (BMP) 및 성장 및 분화 인자(growth and differentiation factor) (GDF)를 포함한다. 이러한 리간드에 대한 수용체는 I형 및 II형 막관통(transmembrane) 세린/트레오닌 키나제 수용체로 구성된 이종복합체성(heteromeric) 수용체 복합체이다. I형 수용체의 예는 액티빈 수용체 IA형 (ACTRIA, ACVR1, 또는 ALK2), BMP 수용체 IA형 및 BMP 수용체 IB형을 포함한다. II형 수용체의 예는 액티빈 수용체 IIA형 및 IIB형 (ACTRIIA 또는 ACVR2A 및 ACTRIIB 또는 ACVR2B) 및 BMP 수용체 II형을 포함한다. TGFβ 수퍼패밀리의 리간드들은 다양한 I형 및 II형 수용체에 대해 각각 다른 친화도를 지닌다.
I형 및 II형 수용체 둘 모두는 세포외 리간드 결합 도메인 (ECD) 및 세포내 세린/트레오닌 키나제 도메인을 지닌다. 또한, I형 수용체는 키나제 도메인에 선행하는 글라이신/세린-풍부 영역 (GS-박스(GS-box)) 및 키나제 도메인 내의 L45 루프를 지닌다. 둘 모두의 수용체는 함께 작용하여 리간드가 하류 신호전달(signaling) 경로, 예를 들어 Smad 및 비-Smad 신호전달 경로를 활성화하게 한다. 활성화는 리간드 결합, 리간드-수용체 올리고머화(oligomerization) 및 II형 수용체 키나제에 의한 I형 수용체의 GS 박스의 인산전달(transphosphorylation)을 포함한다. II형 수용체 키나제는 항시적으로 활성(constitutively active)이고, 리간드 결합 및 I형 수용체의 활성화에서 역할을 한다.
액티빈 수용체 I형으로도 공지된 ACVR1, ACVR1A, ACVRLK2, 또는 ALK2는 리간드의 TGFβ 수퍼패밀리에 대한 I형 수용체이다. ACVR1은 세린/트레오닌 키나제 활성을 지니고, Smad 단백질을 인산화시키며, 하류 신호전달 경로를 활성화시킨다. ACVR1은 골격근 및 연골을 포함하는 신체의 많은 조직에서 발견되고, 뼈 및 근육의 성장 및 발달을 조절하는 것을 돕는다. 본 명세서의 다른 부분에 기재되어 있는 바와 같이, ACVR1 유전자에서의 소정 돌연변이는 FOP를 초래한다. ACVR1 활성의 예는 리간드에 결합하는 능력, II형 수용체와 복합체를 형성하는 능력, 또는 하류 신호전달 경로, 예를 들어 Smad 경로를 활성화시키는 능력을 포함한다.
액티빈 수용체 II형으로도 공지된 ACVR2는 리간드의 TGFβ 수퍼패밀리에 대한 II형 수용체이다. 적어도 2개의 ACVR2 수용체, 예를 들어 액티빈 수용체 IIA형 (ACVR2A 또는 ACTRIIA) 및 액티빈 수용체 IIB형 (ACVR2B 또는 ACTRIIB)이 존재한다. ACVR2에 대한 언급은 ACVR2A 및 ACVR2B 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함한다. ACVR2A 및 ACVR2B는 골격근, 위, 심장, 자궁내막, 고환, 전립선, 난소, 및 신경 조직을 포함하는 다수의 조직에서 발현될 수 있다.
리간드 결합 시에, ACVR2 수용체는 I형 수용체, 예를 들어 ACVR1과 복합체를 형성하고 I형 수용체의 GS 박스를 인산화시킴으로써, I형 수용체의 키나제 활성을 향상시킨다. ACVR2A 및 ACVR2B 활성의 예는 리간드에 결합하는 능력, I형 수용체와 복합체를 형성하는 능력, 또는 I형 수용체를 인산화시키는 능력을 포함한다.
인간 ACVR2의 예시적 형태는 Swiss Prot 수탁 번호(accession number) P27037을 지닌다. 잔기 1 내지 19는 신호 펩티드이고, 잔기 20 내지 135는 세포외 도메인이고, 잔기 59 내지 116은 액티빈 I형 및 II형 수용체 도메인이고, 잔기 136 내지 161은 막관통 도메인이고, 잔기 162 내지 513은 세포질 도메인이다. 인간 ACVR2B의 예시적 형태는 Swiss Prot 번호 Q13705로 배정되어 있다. 잔기 1 내지 18은 신호 서열이고, 잔기 19 내지 137은 세포외 도메인이고, 잔기 27 내지 117은 액티빈 I형 및 II형 수용체 도메인이고, 잔기 138 내지 158은 막관통 도메인이고, 잔기 159 내지 512는 세포질 도메인이다. 인간 ACVR1의 예시적 형태는 Swiss Prot 수탁 번호 Q04771을 지닌다. 잔기 1 내지 20은 신호 서열이고, 잔기 21 내지 123은 세포외 도메인이고, 잔기 33 내지 104는 액티빈 I형 및 II형 수용체 도메인이고, 잔기 124 내지 146은 막관통 도메인이고, 잔기 147 내지 509는 세포질 도메인이다. ACVR1, ACVR2A 및 ACVR2B 중 어느 것에 대한 언급은 이러한 예시적 형태, 이의 공지된 아이소폼(isoform) 및 다형(polymorphism), 예를 들어 Swiss Prot 데이터베이스에 열거된 것들, 다른 종으로부터의 동계(cognate) 형태, 및 예시된 형태와 적어도 90, 95, 96, 97, 98 또는 99% 서열 동일성을 지닌 다른 변이체(variant)를 포함한다.
상기 정의된 예시적 서열 이외의 ACVR2A, ACVR2B 및 ACVR1의 형태의 잔기는, 상응하는 예시적 서열과의 최대 정렬에 의해 번호가 표기되어, 정렬된 잔기가 동일한 번호를 할당받도록 한다.
인간의 경우 액티빈 A는 동종이량체성(homodimeric) 또는 이종이량체성(heterodimeric) 단백질로서 존재할 수 있다. 동종이량체성 단백질은 동종이량체성 베타 A 서브유닛(subunit) 쌍을 함유한다. 이종이량체성 단백질은 베타 A 서브유닛 및 베타 B, 베타 C 또는 베타 E 서브유닛 (즉, 베타 A 베타 B, 베타 A 베타 C, 또는 베타 A 베타 E)을 함유한다. 서브유닛은 신호 펩티드, 프로펩티드(propeptide) 및 성숙 폴리펩티드를 포함하는 전구체 폴리펩티드로서 각각 발현된다. 인간 베타 A 서브유닛 전구체의 예시적 형태는 Swiss Prot P08476으로 명명되는 426개 아미노산 길이의 폴리펩티드이며, 이것의 잔기 1 내지 20은 신호 펩티드이고, 잔기 21 내지 310은 프로펩티드이고, 잔기 311 내지 426은 성숙 폴리펩티드이다. 베타 B 서브유닛 전구체 폴리펩티드의 예시적 형태는 Swiss Prot P09529로 명명되고, 이것의 잔기 1 내지 28은 신호 펩티드이고, 잔기 29 내지 292는 프로펩티드이고, 잔기 293 내지 407은 성숙 폴리펩티드이다. 베타 C 서브유닛의 예시적 형태는 Swiss Prot P55103으로 명명되고, 이것의 잔기 1 내지 18은 신호 펩티드이고, 잔기 19 내지 236은 프로펩티드이고, 잔기 237 내지 352는 성숙 폴리펩티드이다. 베타 E 서브유닛 전구체의 예시적 형태는 Swiss Prot P58166으로 명명되고, 이것의 잔기 1 내지 19는 신호 펩티드이고, 잔기 20 내지 236은 프로펩티드이고, 잔기 237 내지 350은 성숙 폴리펩티드이다. 이러한 서열의 몇몇 변이체가 Swiss Prot 데이터베이스에 기재된 바와 같이 공지되어 있다. 액티빈 A에 대한 언급은, 베타 A 동종이량체, 베타 A 베타 B, 베타 A 베타 C 및 베타 A 베타 E 이종이량체 형태, 뿐만 아니라 이들의 서브유닛, 뿐만 아니라 제공된 예시적 Swiss Prot 서열 또는 이러한 서열의 다른 자연 발생적 인간 형태에 의해 정의된 프로펩티드 및/또는 신호 펩티드에 서브유닛이 결합되어 있는 이들의 전구체 중 어느 것을 포함한다. 액티빈 A는 ACVR2A 또는 ACVR2B에 결합하는 것을 통해 신호를 전달하지만, ACVR1에 대한 리간드인 것으로 공지되어 있지 않다.
액티빈 B는 베타 B 서브유닛의 동종이량체로서 존재한다. 액티빈 B는 ACVR2A 및 ACVR2B에 결합하는 것을 통해 신호를 전달하지만, ACVR1의 리간드인 것으로 공지되어 있지 않다. 액티빈 B에 대한 언급은 동종이량체, 또는 베타 B 서브유닛 폴리펩티드를 지칭하는데, 이것은 전장(full length) 베타 B 폴리펩티드, 또는 제공된 예시적인 Swiss Prot 서열 또는 이러한 서열의 다른 자연 발생적 인간 형태에 의해 정의된 펩티드 및 프로펩티드가 부재하는, 이의 성숙 폴리펩티드 부분일 수 있다.
인간 BMP9의 예시적인 형태가 Swiss Prot Q9UK05로 지정되어 있다. 이 단백질은 429개의 아미노산을 가지며, 이것의 잔기 1 내지 22는 신호 펩티드이고, 잔기 23 내지 319는 프로펩티드이고, 잔기 320 내지 429는 성숙 폴리펩티드이다. BMP9는 이황화물-결합 동종이량체로서 자연적으로 존재한다. 이것은 ACVR1과 상호작용하는 것으로 여겨진다. BMP9에 대한 언급은 동종이량체 또는 이의 서브유닛을 지칭하는데, 이것은 전장 BMP9 폴리펩티드, 또는 제공된 예시적인 Swiss Prot 서열 또는 이러한 서열의 다른 자연 발생적 인간 형태에 의해 정의된 신호 펩티드 및 프로펩티드가 부재하는, 이의 성숙 폴리펩티드 부분일 수 있다.
인간 BMP10의 예시적 형태는 Swiss Prot O95393으로 지정되어 있고, 이것의 잔기 1 내지 21은 신호 펩티드이고, 잔기 22 내지 316은 프로펩티드이고, 잔기 317 내지 424는 성숙 펩티드이다. BMP10은 이황화물 결합 동종이량체로서 존재한다. 이것은 ACVR1과 상호작용하는 것으로 여겨진다. BMP10에 대한 언급은 동종이량체 또는 이의 서브유닛을 지칭하는데, 이것은 전장 BMP10 폴리펩티드, 또는 제공된 예시적인 Swiss Prot 서열 또는 이러한 서열의 다른 자연 발생적 인간 형태에 의해 정의된 신호 펩티드 및 프로펩티드가 부재하는, 이의 성숙 폴리펩티드 부분일 수 있다.
III. 액티빈 B, BMP9 및 BMP10에 대한 항체
액티빈 B, BMP9 및 BMP10 각각은 동종이량체로서 자연적으로 발견된다. 이들 표적 중 하나에 대한 항체는, 동종이량체를 형성하는 단량체 서브유닛에 결합하지 않고서 동종이량체에 특이적으로 결합할 수 있거나(즉, 쌍을 이룬 서브유닛들 둘 모두가 에피토프에 기여함), 동종이량체 및 단량체 서브유닛 둘 모두에 특이적으로 결합할 수 있거나, 동종이량체에 결합하지 않고서 단량체 서브유닛에 특이적으로 결합할 수 있다(서브유닛 내의 에피토프가 다른 서브유닛과 회합될 때 그것이 은폐됨). 액티빈 B에 대한 일부 항체는 또한 액티빈 AB(베타 B 서브유닛 내의 에피토프)에 특이적으로 결합하며, 한편 다른 항체들은 액티빈 AB에 결합하지 않고서 액티빈 B에 특이적으로 결합한다(두 베타 B 서브유닛 모두가 에피토프에 기여함). 액티빈 B에 대한 일부 항체는 인히빈 B에 특이적으로 결합하며, 한편 다른 것들은 그렇지 않다. BMP9 또는 BMP10에 대한 일부 항체는 BMP10에 특이적으로 결합하지 않고서 BMP9에 특이적으로 결합하거나 또는 그 반대이다. 일부 항체는 BMP9 및 BMP10 둘 모두에 특이적으로 결합한다. 달리 특정되지 않는 한, 항체는 그의 표적의 인간 형태에 특이적으로 결합한다. 항체는 그의 표적의 비인간 동종 형태에 결합할 수 있거나 또한 그에 결합하지 않을 수 있다. 각각 마우스 세포인 비인간 세포들에서의 시험을 위하여, 항체는 시험하는 종에서 그의 인간 표적 및 그 표적의 동종 형태와 교차 반응하는 것이 바람직하다.
바람직한 항체는 실시예 1에 기재된 검정에서 ACVR1H206을 통한 그의 표적 리간드의 신호전달을 억제한다. 일부 항체는 4 nM 미만, 때때로 400 pM 미만 또는 40 pM 미만의 IC50으로 그들의 표적 리간드의 신호 전달을 억제한다. 일부의 항체는 4 nM 내지 10 pM 또는 3.5 nM 내지 35 pM 범위의 IC50으로 신호 전달을 억제한다. 바람직한 항체는 실시예 2에 기재된 바와 같은 동물 모델에서 FOP의 이소성 골화 증상을 억제한다.
BMP9에 대한 몇몇 단클론성 항체는 구매가능하거나 과학 문헌 또는 특허 문헌에 기재되어 있다. 이들은 R & D Systems, Inc.로부터 입수가능한 미국 특허 출원 공개 제20140227254호의 MAB3209, Novus Biologicals, LLC로부터의 4D2, 및 미국 특허 출원 공개 제20140056902호에 기재된 바와 같은 항체 6D10-1-1, 10D5-2-3 및 3B7-3-3을 포함한다.
BMP10에 대한 구매가능한 단클론성 항체는 MAC106Hu22 (USCN Life Science Inc.) MM0113-5L26 Ab CAM PLC, 및 MAB 2926 (R & D Systems, Inc.)를 포함한다.
구매가능하거나 특허 문헌에 기재된 액티빈 B에 대한 단클론성 항체는 Sigma Aldridge 또는 R & S Biosystems, Inc.로부터의 클론 146807, GeneTex, Inc.로부터의 9M29 및 미국 특허 출원 공개 제20090317921호의 46A/F를 포함한다.
이러한 항체들 중 어느 것의 인간화, 키메라 및 베니어드 형태가, 결합을 위해 이와 경쟁하거나 동일한 에피토프를 공유하는 항체인 경우, 포함된다. 상기 언급된 항체들 중 어느 것의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 cDNA의 돌연변이유발(mutagenesis)에 의해 다른 항체가 얻어질 수 있다. 성숙 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열에 있어서 상기 언급된 항체들 중 어느 것과 적어도 90%, 95% 또는 99% 동일하며 이의 기능적 특성을 유지하고, 및/또는 적은 수의 기능적으로 중요하지 않은 아미노산 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 결실 또는 삽입에 의해 각각의 항체와 달라지는, 단클론성 항체가 또한 본 발명에 포함된다. 예시된 항체들 중 어느 것의 상응하는 CDR과 90%, 95%, 99% 또는 100% 동일한 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 바람직하게는 6개 모두의 CDR(들)을 지닌 단클론성 항체가 또한 포함된다. CDR은 바람직하게는 카밧에 의해 정의된 바와 같지만, 임의의 통상적인 대안적 정의, 예를 들어 초티아(Chothia), 복합 카밧-초티아(composite Kabat-Chothia), 접촉 정의(contact definition) 또는 AbM 정의에 의해 정의될 수 있다 (world wide web bioinf.org.uk/abs 참조).
항체 또는 융합 단백질의 이의 표적 항원에 대한 특이적 결합은 적어도 106, 107, 108, 109, 또는 1010 M-1의 친화도를 의미한다. 특이적 결합은 적어도 하나의 비관련된 표적에 대해 일어나는 비특이적 결합보다 검출가능할 정도로 크기가 높고 그와 구별될 수 있다.
항체에 대한 언급은 두 쌍의 중쇄 및 경쇄를 지닌 무손상 항체, 및 항원과 결합할 수 있는 항체 단편 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv, 단일 사슬 항체, 다이아바디(diabody), 항체 키메라, 하이브리드 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 등), 및 전술한 것을 포함하는 재조합 펩티드를 포함한다. 항체 단편은 무손상 항체의 항원-결합 부분을 포함하는 단편을 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fab, F(ab')2, 및 Fv 단편; 다이아바디; 선형 항체 (문헌[Zapata et al. (1995) Protein Eng. 10:1057-1062]); 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.
항체는 단클론성 또는 다클론성(polyclonal)일 수 있다. 단클론성 항체는 실질적으로 균일한 항체의 집단으로부터 얻어지는 항체인데, 즉, 집단을 구성하는 개개의 항체는 미량(minor amount)으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 단클론성 항체는 단일 항원 부위에 대해 유도되는바 종종 고도로 특이적이다. 또한, 다양한 결정기(determinant) (에피토프)에 대해 유도된 다양한 항체를 전형적으로 포함하는 통상적인 (다클론성) 항체 조제물과 대조적으로, 각각의 단클론성 항체는 전형적으로 항원 상의 단일 결정기에 대해 전형적으로 유도된다. 수식어 "단클론성"은 실질적으로 균일한 항체 집단, 예를 들어 B-세포의 클론 집단(clonal population)에 의해 생성되는 것들로부터 얻어지는 것으로서의 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생성을 필요로 하지 않는다.
단클론성 항체는 문헌[Kohler et al. (1975) Nature 256:495]에 최초로 기재된 하이브리도마(hybridoma) 방법 또는 이의 변형에 의해 제조될 수 있다. 전형적으로, 동물, 예를 들어 마우스가, 항원 (예를 들어, 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10 동종이량체 또는 이의 서브유닛 또는 이의 일부)을 함유하는 용액으로 면역화된다.
면역화는, 식염수 중에, 바람직하게는 애쥬번트(adjuvant), 예를 들어 프로인트 완전 애쥬번트(Freund's complete adjuvant) 중에 항원-함유 용액을 혼합 또는 유화시키고, 혼합물 또는 에멀젼을 비경구 주사함으로써 수행될 수 있다. 동물의 면역화 후, 비장 (및 선택적으로 몇몇 큰 림프절)을 적출하고, 단일 세포로 분리한다. 관심 항원으로 코팅된 플레이트 또는 웰(well)에 세포 현탁액을 적용함으로써 비장 세포가 스크리닝될 수 있다. 항원에 대해 특이적인 막 결합된 면역글로불린을 발현하는 B-세포가 플레이트에 결합하고 씻겨 나가지 않는다. 이어서, 생성된 B-세포, 또는 모든 분리된 비장 세포가, 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 형성하도록 유도되고, 선택 배지(selective medium)에서 배양된다. 생성된 세포는 연속 희석에 의해 플레이팅되고, 관심 항원과 특이적으로 결합하는 (그리고 비관련 항원에 결합하지 않는) 항체의 생성에 대해 검정된다. 이어서, 선택된 단클론성 항체 (mAb)-분비 하이브리도마가 시험관내에서(in vitro) (예를 들어, 조직 배양 병 또는 중공 섬유 반응기 내에서), 또는 생체내에서(in vivo) (마우스 내의 복수(ascites)로서) 배양된다.
대안적으로, 단클론성 항체는 재조합 DNA 방법에 의해 제조될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조). 단클론성 항체는, 예를 들어 문헌[Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]; 문헌[Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-597]; 및 미국 특허 제5,514,548호에 기재된 기법을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 또한 단리될 수 있다.
본 단클론성 항체는 다양한 항체 동종형(isotype)들 중 임의의 것, 즉 IgG, IgM, IgE, IgD, 또는 IgA 부류일 수 있다. 동종형 IgG의 단클론성 항체가 바람직하다. 동종형은 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4, 특히 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 중 임의의 것일 수 있다. 이펙터(effector) 기능이 요구되는 경우에는 인간 IgG1이 그리고 이것이 요구되지 않는 경우에는 IgG2 또는 IgG4가 종종 바람직하지만, 대안적으로, 이펙터 기능이 필요하지 않다면, 인간 IgG1이 약화된 이펙터 기능으로 돌연변이될 수 있다.
경쇄 및/또는 중쇄의 아미노 또는 카르복시 말단에 있는 1개 또는 수개의 아미노산, 예를 들어 중쇄의 C-말단 라이신이, 분자의 일부 또는 전부에서 누락 또는 유도체화될 수 있다. 이펙터 기능, 예를 들어 보체-매개된 세포독성 또는 ADCC를 감소 또는 증가시키기 위해 (예를 들어, Winter 등의 미국 특허 제5,624,821호; Tso 등의 미국 특허 제5,834,597호; 및 문헌[Lazar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4005, 2006] 참조), 또는 인간에서 반감기를 연장시키기 위해 (예를 들어, 문헌[Hinton et al., J. Biol. Chem. 279:6213, 2004 참조]), 불변 영역에서 치환이 이루어질 수 있다. 예시적 치환은, 항체의 반감기를 증가시키기 위한 250번 위치의 Gln 및/또는 428번 위치의 Leu를 포함한다 (EU 번호표기). 234번, 235번, 236번 및/또는 237번 위치 중 어느 것에서의 치환은 Fcγ 수용체, 특히 FcγRI 수용체에 대한 친화도를 감소시킨다 (예를 들어, 미국 특허 제6,624,821호 참조). 선택적으로, 인간 IgG2에서 234번, 236번 및/또는 237번 위치는 알라닌으로 그리고 235번 위치는 글루타민으로 치환된다 (예를 들어, 미국 특허 제5,624,821호 참조). 이펙터 기능은 232번 내지 236번 위치에서 EFLG가 PVA로 치환됨으로써 또한 감소될 수 있다 (국제 특허 출원 공개 WO14/121087호 참조). 선택적으로, 내인성 면역글로불린과 외인성 면역글로불린 사이의 교환을 감소시키기 위해, 특히 인간 IgG4에서, 428번 위치의 S가 P로 대체될 수 있다. 다른 변이가, 번역후 변형(post-translational modification), 예를 들어 N-X-S/T 모티프(motif)에서의 N-연결된 글라이코실화의 부위를 부가하거나 제거할 수 있다. 이중특이적 항체의 생성을 위해 다양한 중쇄들 사이의 이종이량체의 형성을 촉진하도록, 변이는 노브(knob) (즉, 하나 이상의 아미노산의 더 큰 아미노산으로의 대체) 또는 홀(hole) (즉, 하나 이상의 아미노산의 더 작은 아미노산으로의 대체)의 도입을 또한 포함할 수 있다. 노브 및 홀 쌍을 형성하기 위한 예시적 치환은 각각 T336Y 및 Y407T 이다 (문헌[Ridgeway et al., Protein Engineering vol.9 no.7 pp.617-621, 1996]). 변이는, EU 번호표기 시스템에서 단백질 A 상호작용을 감소시키는 돌연변이 (예를 들어, H435R 및 Y436F)를 또한 포함할 수 있다. 하나의 중쇄는 그러한 변이를 지니고 다른 중쇄는 그렇지 않은 이중특이적 항체가, 단백질-A 친화성 크로마토그래피에 의해 이의 모항체로부터 분리될 수 있다.
IV. 진행성 골화성 섬유이형성증 (FOP)
FOP는 이소성 골화가 골격외(extraskeletal) 부위, 예를 들어 결합 조직에서 조직학적으로 및 생체역학적으로 '정상인(normal)' 뼈를 형성하는 희귀 유전성 장애이다. 이러한 장애는, 일과성이지만, 누적되어, 그 결과 중증도가 증가하는 영구적 불능(disability)으로 이어진다.
FOP의 전세계적 유병률은 대략 1/2,000,000이다. FOP에 대한 민족(ethnic), 인종(racial), 성별, 또는 지리적 선호는 없다. 이것은 극도로 불능인 상태가 되게 하는(extremely disabling) 질병일 뿐만 아니라 상당히 단축된 수명의 질환이다.
FOP의 특징은, 예를 들어 엄지 발가락의 선천성 기형, 염증을 동반하는 머리, 목, 및/또는 등에서의 고통스러운 연조직 종창(swelling)을 특징으로 하는 재연(flare-up) 및 연골내(endochondral) 골화를 통한 진행성 이소성 골형성을 포함한다.
FOP는 엄지 발가락의 기형의 존재에 근거하여 임상적으로 의심될 수 있다. 진단 검사, 예를 들어 x-레이 또는 뼈 스캔(bone scan)은 엄지 발가락 비정상을 입증할 수 있고, 이소성 골화의 존재를 확인할 수 있다. FOP 진단은 유전자 검사에 의해, 예를 들어 ACVR1 유전자에서 617번 G에서 A로의 (R206H) 돌연변이를 검출함으로써 또한 확인될 수 있다.
FOP가 이소성 골화의 다른 질환을 포함하는 몇몇 다른 장애로 오진되는 것이 통상적이다. FOP는 차별적 진단에 의해, 예를 들어 단독형(isolated) 선천성 기형, 림프부종, 연조직 육종, 데스모이드 종양(desmoid tumor), 공격성 청소년 섬유종증(aggressive juvenile fibromatosis), 청소년 건막류(juvenile bunion), 단독형 단지증(brachydactyly), 진행성 골 이형성증(progressive osseous heteroplasia) 및 이소성 골화를 포함하는 장애와 구별되어야 한다. 엄지 발가락 선천성 기형의 존재 및 고통스러운 연조직 재연을 이용하여 FOP를 다른 장애와 구별할 수 있다.
FOP에 걸린 환자는 엄지 발가락의 선천성 기형을 지니지만, 그 외에는 출생시 정상인 것으로 보인다. FOP와 관련된 재연은 생애의 처음 십년 도중에 시작한다. 재연은, 예를 들어 연조직 손상, 낙상(fall), 피로, 바이러스 감염 또는 근내 주사에 의해 촉발될 수 있다. 재연의 결과는 연조직, 예를 들어 인대, 골격근 또는 힘줄의 이소성 뼈로의 변환이다.
이전에 FOP에 대한 치료적 처치는 존재하지 않았다. FOP는 예방적 조치, 예를 들어 손상을 최소화하기 위한 안전 및 전략 개선, 근내 주사 회피 및 치과 진료 시 주의에 의해 관리되었다. 재연의 처음 24시간 이내에 시작된 고용량(high dose) 코르티코스테로이드 치료는 재연과 관련된 염증 및 부종을 감소시키는 것을 도울 수 있다. 이소성 뼈를 제거하는 수술 전략은 권장되지 않는데, 이는 이것이 역효과를 가져오며 새로운 외상 유도된 이소성 골화를 초래하기 때문이다.
FOP는, GS 도메인과 억제 분자인 FKBP12의 상호작용을 불안정하게 하는 것으로 보이는, ACVR1 (ALK2로도 공지되어 있음)의 돌연변이에 의해 초래된다 (문헌[Groppe, J., et al. 2011, Cells Tissues Organs, 194:291-295]). FKBP12는 ACVR1의 음성 조절자(negative modulator)이고, 수용체를 비활성 입체형태로 안정화시키는 기능을 한다 (문헌[Huse, M., et al. 1999, Cell, 96:425-436]). 문헌[Kaplan, F.S., et al. 2012, Disease Models & Mechanisms, 5:756-762]을 참조한다. FOP와 관련된 ACVR1의 돌연변이의 예는 세포내 도메인에서의 206번 아르기닌의 히스티딘으로의 (R206H) 돌연변이이다.
FOP가 발생될 위험이 있는 피검자는, ACVR1 R206H 돌연변이 또는 FOP와 관련된 다른 돌연변이를 지닌 임의의 피검자, 엄지 발가락의 기형을 지닌 채 출생한 피검자, 또는 당 분야에서 인정되는 기준에 의해 FOP의 진단을 내리기에 충분한 FOP의 증상을 아직 나타내지 않은 FOP의 가족력이 있는 피검자를 포함한다.
V. 치료 방법
본 발명은 FOP에 걸린 피검자에게 유효한 투약체계의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체를 투여하는 것을 포함하는, FOP의 치료 방법을 제공한다.
"피검자"는, FOP의 치료가 요망되는, 임의의 동물 (즉, 포유동물), 예를 들어 인간, 영장류, 설치류, 예를 들어 마우스 및 래트, 농업용 및 가축화된 동물, 예를 들어 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 양 등이다. 본 발명의 방법들 중 어느 것에 있어서, 피검자는 포유동물, 바람직하게는 인간일 수 있다.
액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체의 유효한 투약체계는, FOP의 적어도 하나의 징후 또는 증상에서 긍정적 반응을 가져오는, 길항제의 용량, 빈도 및 투여 경로의 조합을 의미한다. 긍정적 반응은 FOP의 적어도 하나의 징후 또는 증상을 감소, 제거, 개선, 이의 악화를 억제, 또는 지연시키는 것을 포함할 수 있다. 긍정적 반응의 대상일 수 있는 FOP의 징후 또는 증상은, 예를 들어 전위성 또는 이소성 골형성, FOP 재연, 또는 재연과 관련된 통증 및 종창을 포함한다. 투약체계는 치료 전과 후에 징후 및 증상을 비교함으로써 단일 환자에서 평가될 수 있다. 투약체계는 적어도 하나의 징후 또는 증상이 치료 후에 긍정적 반응을 나타내는 경우 유효한 것으로 간주된다. 본 발명의 길항제 또는 길항제들로 치료된 피검자 집단의 징후 및 증상을, 치료를 받지 않은 대조 피검자 집단과 비교함으로써, 투약체계가 대안적으로 또는 추가적으로 평가될 수 있다. 이러한 비교를 위한 피검자는 임상 실험 (예를 들어, I상, II상, IIa상, IIb상, 또는 III상) 중인 동물 모델, 또는 인간 피검자일 수 있다. 적어도 하나의 징후 또는 증상에서 집단들 사이에 통계적으로 유의한 긍정적 반응이 존재하는 경우 투약체계는 유효한 것으로 간주된다.
FOP를 치료하기 위한 일부의 방법에 있어서, 피검자는 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체로 치료될 수 있는 다른 질환에 걸려 있지 않고, 이의 위험이 없다. 예를 들어, 피검자는 II형 당뇨병, 근이영양증, 근위축성 측삭 경화증 (ALS) 또는 골다공증 중 어느 것 또는 전부가 없을 수 있다.
A. 투여 방법
액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체는 단백질 또는 소분자로서 통상 직접적으로 투여되지만, 단백질인 경우에는 이러한 단백질을 인코딩하는 핵산으로서 또한 투여될 수 있다. 이러한 길항제는 다양한 방법, 예를 들어 세포 형질감염, 유전자 요법, 전달 비히클 또는 약제학적으로 허용되는 담체에 의한 직접 투여에 의해 투여될 수 있다.
본 명세서에 제공된, 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체를 투여하기 위해 다양한 전달 시스템, 예를 들어 리포솜 내, 미세입자(microparticle) 내, 마이크로캡슐(microcapsule) 내 캡슐화, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 엔도사이토시스(receptor-mediated endocytosis) (예를 들어, 문헌[Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 작제 등이 사용될 수 있다.
투여 방법은 장내(enteral) 또는 비경구 투여일 수 있으며, 피내, 근내, 복막내, 정맥내, 피하, 폐, 비강내, 안내, 경막외(epidural) 또는 경구 경로를 포함한다. 화합물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입(infusion) 또는 일시 주사(bolus injection)에 의해, 상피 또는 점막피부 내층(mucocutaneous lining) (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적 또는 국소적일 수 있다. 또한, 뇌실내(intraventricular) 및 수강내(intrathecal) 주사를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의해 본 발명의 약제학적 조성물을 중추 신경계 내로 도입시키는 것이 바람직할 수 있는데, 뇌실내 주사는, 예를 들어 옴카나(Omcana) 저장소(reservoir)와 같은 저장소에 결합된, 뇌실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 폐 투여가, 예를 들어, 흡입기(inhaler) 또는 분무기(nebulizer), 및 에어로졸화제와의 제형의 사용에 의해, 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여될 수 있으며, 이는 예를 들어 수술 중 국소 주입, 국소 적용에 의해, 예를 들어 주사에 의해, 카테터에 의해, 또는 삽입물(implant)에 의해 달성될 수 있고, 상기 삽입물은 막, 예를 들어 시알라스틱 막(sialastic membrane), 섬유, 또는 시판용 피부 대체물(substitute)을 포함하는 다공성, 비다공성, 또는 젤라틴성 물질(gelatinous material)로 이루어진다.
약제학적 조성물은 또한 소포(vesicle), 특히 리포솜으로 전달될 수 있다 (문헌[Langer (1990) Science 249:1527-1533] 참조). 약제학적 조성물은 또한 제어 방출 시스템, 펌프 (상기 문헌[Langer (1990)] 참조) 형태일 수 있거나, 중합체 재료를 수반할 수 있다 (문헌[Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71:105] 참조).
B. 병용 요법
액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체는 단제요법으로서, 또는 병용 요법으로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10 중 2개 또는 3개 전부에 대한 항체가 병용 요법으로 투여될 수 있다. 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10 중 어느 하나 또는 전부에 대한 항체가 또한 ACVR1 길항제, ACVR2A 길항제 또는 ACVR2B 길항제, 또는 액티빈 A에 대한 항체 중 어느 하나 또는 전부와 병용하여 투여될 수 있으며, 이는 2015년 4월 1일에 출원된 미국 특허 출원 제62/141,775호에 추가로 기재된 바와 같다. 바람직한 ACVR1, ACVR2A 및 ACVR2B 길항제는 Fc 도메인에 연결된 세포외 도메인을 포함하는 Fc 융합 단백질이다. ACVR1의 다른 바람직한 길항제는 문헌[Mohedas et al., (2013) ACS Chem. Biol. 8:1291-1302]에 기재된 소분자 억제제 LDN-212854이다. 액티빈 A에 대한 바람직한 항체는 미국 특허 출원 공개 제2015037339 A1호에서의 그리고 미국 특허 제8,309,082호에 기재된 바와 같은 H4H10446P 및 H4H10430P를 포함한다. 병용 요법에서의 다수의 작용제들은 동시에, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
C. 약제학적 조성물
본 발명은 또한 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. '약제학적으로 허용되는'은 연방 정부 또는 주정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 승인가능하거나, 미국 약전(US Pharmacopeia) 또는 동물, 더욱 특히 인간에 사용하기 위해 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재된 것임을 의미한다. 담체는 치료제와 함께 투여되는, 희석제, 애쥬번트, 부형제 또는 비히클이다. 이러한 약제학적 담체는 무균 액체, 예를 들어 물 및 오일일 수 있으며, 이에는 석유(petroleum), 동물, 식물 또는 합성 기원의 것들, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유(mineral oil), 참기름 등이 포함된다. 적합한 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 초크(chalk), 실리카 겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석(talc), 염화나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 조성물은, 요망되는 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 또한 함유할 수 있다. 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 종종 멸균성이고 실질적으로 등장성(오스몰랄 농도 약 250 내지 350 mOsm/㎏ 물)이며, GMP 조건 하에서 제조된다. 약제학적 조성물은 단위 투여형 (즉, 단회 투여를 위한 투여량)으로 제공될 수 있다.
이러한 조성물은 용액, 현탁액, 에멀젼, 정제, 환제(pill), 캡슐, 분말, 지속방출성 제형(sustained-release formulation), 동결건조물 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은, 전통적 결합제 및 담체, 예를 들어 트라이글리세라이드와 함께, 좌제(suppository)로서 제형화될 수 있다. 경구용 제형은 표준 담체, 예를 들어 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 사카린나트륨, 셀룰로스, 탄산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예는 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences" by E.W. Martin]에 기재되어 있다.
조성물은 인간에 대한 정맥내 또는 피하 투여에 적합하도록 제형화될 수 있다. 필요한 경우, 조성물은 주사 부위에서의 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제, 예를 들어 리도카인을 또한 포함할 수 있다. 조성물이 주입에 의해 투여되는 경우, 이것은 약제학적 등급의 무균수 또는 무균 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 조성물이 주사에 의해 투여되는 경우, 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰풀(ampoule)이 제공될 수 있다.
본 명세서에 제공된, 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체는 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 유리 아미노 기와 함께 형성된 것들, 예를 들어 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등으로부터 유도된 것들, 및 유리 카르복실 기와 함께 형성된 것들, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 수산화제2철(ferric hydroxide), 아이소프로필아민, 트라이에틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도된 것들을 포함한다.
FOP의 치료에 유효한 특정 경로에 의해 투여되는, 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체의 양 및 빈도 (예를 들어, 유효한 투약체계)는 본 명세서에 근거하여 표준 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 또한, 최적 투여량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 시험관내 검정 또는 동물 모델이 사용될 수 있다. 제형에 사용하고자 하는 정확한 용량은, 투여 경로, 및 질환의 중증도에 또한 좌우되며, 의사의 판단 및 각각의 피검자의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 투여를 위한 적합한 투여량 범위는 대체로 체중 ㎏ 당 활성 화합물 약 20 내지 50000 마이크로그램이다.
상기 또는 하기 인용된 모든 특허 출원, 웹사이트, 다른 간행물, 수탁 번호 등은 각각의 개별 항목이 구체적으로 및 개별적으로 그렇게 참고로 포함되도록 지시되어 있는 것처럼 그와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다. 서열의 다양한 버전이 다양한 시점에서 수탁 번호와 관련되는 경우, 본 출원의 유효 출원일에서 수탁 번호와 관련된 버전이 의도된다. 유효 출원일은 실제 출원일 또는 적용가능한 경우 수탁 번호를 언급하는 우선 출원의 출원일 중 더 빠른 것을 의미한다. 마찬가지로 다양한 버전의 간행물, 웹사이트 등이 다양한 시점에서 공개된 경우, 달리 지시되지 않는 한 본 출원의 유효 출원일에서 가장 최근에 공개된 버전이 의도된다. 본 발명의 임의의 특징부, 단계, 요소, 실시 형태, 또는 태양은 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 임의의 다른 것과 조합하여 사용될 수 있다.
실시예
실시예 1: 이 실시예는 AVCR1 [ R206H ] 돌연변이를 갖는 세포에서 이소성 골화를 유도하는 리간드를 확인한다.
재료 및 방법
마우스 오스테오칼신(Osteocalcin) 유전자로부터의 168 bp 최소 프로모터 및 GC-풍부 BMP 반응 요소(BMP Responsive Element) (BRE; 5'-GCCGCCGCagc-3')의 10개의 탠덤 반복을 포함하는 변형된 pFA 벡터 (Stratagene)로 HEK293 세포를 형질감염시켰다. BRE를 사용하여 반딧불이 루시퍼라제 발현을 구동시켰다. Lipofectamine 2000 (Invitrogen) 형질감염에 이어서 500 ug/ml의 G418에 의한 선택을 행함으로써, 상응하는 안정한 세포주를 생성하였다. 달리 기재되지 않는 한, 10% (v/v) 소태아 혈청, 50 단위/ml 페니실린/스트렙토마이신 및 2 mM L-글루타민을 함유하는 DMEM 중에서 세포를 배양하였다. 인간 ACVR1에 대한 cDNA를 pCMV 발현 벡터 내로 클로닝하였다 (pCMV.ACVR1). ACVR1[R206H] 변이체를 pCMV.ACVR1 내로 도입하고, 서열분석에 의해 확인하였다. ACVR1 야생형 및 R206H 과발현 HEK293/BRE-Luc 안정한 세포주를 생성하기 위하여, TransIT-LT1 형질감염 시약 (Mirus)을 제조자의 설명서에 따라 사용하여 HEK293/BRE-Luc 세포를 pCMV.ACVR1 또는 pCMV.ACVR1[R206H]로 형질감염시켰다. 100 ug/ml의 하이그로마이신 B를 사용하여 선택함으로써 안정한 세포주를 생성하였다. 거의 동일한 수준의 ACVR1 및 ACVR1[R206H]를 발현하는 안정하게 형질감염된 세포들의 풀(pool)을 항-ACVR1 항체에 의한 표면 염색 후에 형광 활성화 세포 분류(fluorescence-activated cell sorting) (FACS)에 의해 생성하였다 (하기 참조). 생성된 풀을 신호전달 검정에 사용하였다.
ACVR1 -발현 세포를 선택하기 위한 FACS -분류
생세포 염색을 위하여, 15 × 106개 세포를 TrypLE Express Enzyme (Life Technology)으로 처리하였다. 수집된 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 세척하고, 4℃에서 1시간 동안 5 ㎍/ml의 단클론성 마우스 항-인간 ACVR1 항체 (R&D Systems MAB637)로 염색하였다. 이어서, 세포를 2% FBS를 함유하는 PBS로 1회 세척하고, 염소 항-마우스 IgG Alexa Flour 647 (Invitrogen)을 검출에 사용하였다. 2% FBS를 함유하는 PBS 중에서 2회 세척 후에, 세포를 70 μm 세포 여과기로 여과하였다. DAPI-양성 생세포를 hACVR1의 표면 발현에 대해 분류하였다. 풀들을 MoFlo XDP (Beckman Coulter)로 수집하였다. 추가 라운드의 표면 염색에 의한 FACS-기반 세포 분류 후에 ACVR1의 발현을 확인하였다.
HEK293 / Bre -Luc 리포터 세포주에서의 신호전달 검정
HEK293/BRE-Luc 리포터 세포주를 96웰 플레이트(Thermo Scientific) 내에서 10,000개 세포/0.33 ㎠로 플레이팅하고, 37°C에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 기재된 바와 같이 처리하였다. 경쟁 검정의 경우, rh액티빈 A 및 rhBMP6 (R&D Systems)를 세포에 첨가하기 전에 지시된 농도로 예비혼합하였다. 액티빈 A 항체를 포함한 실험의 경우, 리포터 세포를 상기에서와 같이 플레이팅하고, 액티빈 A 항체를 세포에 첨가하기 전에 재조합 액티빈과 함께 30분 동안 미리 인큐베이션하였다. 모든 리포터 검정의 경우, Bright-Glo 루시퍼라제 검정 시스템(Luciferase Assay System) (Promega)에 의한 처리 후 16시간째에 루시퍼라제 발현을 측정하였다.
결과:
거의 동일한 수준의 ACVR1 또는 ACVR1[R206H]를 안정하게 발현하는 HEK293/BRE-Luc 리포터 세포주들을 BMP 및 TGFβ 패밀리에 속하는 리간드들의 패널에 대한 그들의 반응에 대해 시험하였다. ACVR1[R206H]는 그의 표준 리간드들의 전부는 아닌 일부에 대해 반응하여 증가된 신호전달을 나타내었다. 구체적으로는, BMP2, BMP4, BMP7, BMP9, 및 BMP10에 대한 반응은 향상되었으며, 한편 BMP2/7, BMP4/7, BMP5, 및 BMP6에 대한 반응은 변함이 없었다 (표 1). 이들 실험은 또한 ACVR1[R206H]의 예기치 않은 특성을 밝혀내었는데; ACVR1[R206H]가, 야생형 ACVR1이 측정가능한 반응을 나타내지 않는 '비표준' 리간드들의 세트인 액티빈 A, AB, AC, 액티빈 B, 및 아마도 BMP15에 반응하게 되었음이 밝혀졌다.
[표 1]
Figure pct00007
관찰된 결과가 과발현의 인위적 결과일 가능성을 배제하기 위하여, ACVR1[R206H]의 변경된 신호전달 특성이 녹인(knock-in) Acvr1 [R206H]FlEx /+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2/+ ES 세포에서 재현될지의 여부를 조사하였다. 이들 시험 과정 동안, Cre에 의한 활성화 전에, Acvr1 [R206H]FlEx 대립유전자가, 전사체들의 약 절반에서 엑손 5가 누락된 하이포모픽(hypomorphic) 상태임을 알아내었다. 따라서, 기능적인 관점에서, Acvr1 [R206H]FlEx/+ 세포는 Acvr1 null/+ 와 거의 동등하다. 그럼에도 불구하고, HEK293 세포에서 획득된 데이터와 일치하게, Acvr1 [R206H]FlEx /+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2/+ ES 세포 및 그들의 'Cre-활성화된' 상대물, Acvr1 [ R206H ]/+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2/+ ES 세포 사이의 비교는 후자가 액티빈 A에 반응하게 된 것을 보여주었다. 이러한 변경된 반응성은 또한 Acvr1 [ R206H ]/null ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2 /+ ES 세포에서도 관찰되는데, 이는 Acvr1[R206H]의 하나의 대립유전자가 변경된 신호전달에 있어서 충분하고, 야생형 대립유전자의 존재는 이러한 비정상적인 반응을 유의하게 변형시키지는 않지만, 그것은 신호를 증가시키는 데 기여할 수 있음을 나타낸다. 액티빈 A
Figure pct00008
Acvr1[R206H]를 통한 신호전달의 활성화는 Smad1/5/8을 이용하였고, Smad2/3으로의 신호전달의 전환을 수반하지 않았다. 더욱이, 이들 세포에서의 Acvr1[R206H] 변이체의 존재는 액티빈 A의 표준 수용체 및 Smad2/3을 통한 액티빈 A 신호전달을 유의하게 변경시키는 것으로 보이지 않는다.
이들 데이터는, I형 BMP 수용체의 세포내 도메인에서의 아미노산 변화는 정성적인 방식으로 그러한 수용체의 반응성을 변화시켜, 그것이 비표준 리간드들에 의한 활성화에 대해 허용가능하게 할 수 있음을 나타낸다. 어떻게 이것이 일어나는지에 대한 한 가지 가능한 설명은 ACVR1[R206H]이 FKBP12에 대해 디스플레이되는 감소된 친화성을 들 수 있다 (문헌[Groppe et al., Clin Orthop Relat Res 462, 87 (Sep, 2007)] 및 문헌[Cells, Tissues, Organs 194, 291 (2011)]) 따라서, FKBP12 결합이 FK506에 의해 감소된다면, 야생형 ACVR1이 액티빈-반응성 수용체로 전환될 수 있는지의 여부를 시험하였다. FK506의 유일한 효과는 표준 리간드들로부터의 신호전달을 향상시키는 것임이 밝혀졌다 - 그것은 야생형 ACVR1이 액티빈 A에 반응할 수 없게 한다.
또한, 비표준 리간드들에 대한 반응성이 ACVR1[R206H]가 그들과 결합하는 능력을 획득한 것에 의해 단순히 설명될 수 있는지의 여부를 조사하였다. LacZ 상보성에 의한 I형 BMP 수용체와 II형 BMP 수용체 사이의 회합이 보고된 인공 융합 수용체들을 이용하는 검정 (미국 캘리포니아주 프리몬트 소재의 DiscovRx)에서 이것을 시험하였다. ACVR1은 이러한 비표준 리간드들의 존재 하에서 ACVR2A를 갖는 이종이량체를 형성하는 것을 보여준다. 이들 데이터는 ACVR1[R206H]의 변경된 반응성이 이 수용체에 의해 새로 획득된 결합 특성에 기인될 수 없음을 나타낸다. 더욱이, 액티빈들이 ACVR1 및 ACVR2와 비신호전달 복합체를 형성하는 능력은 액티빈들이 ACVR1을 통한 표준 BMP 신호전달의 경쟁적 억제제로서 작용할 수 있다는 증거를 제공한다. 실제로, 액티빈 A는 야생형 ACVR1을 과발현하는 HEK293/BRE-Luc 리포터 세포를 이용하는 경쟁 검정에서 BMP6-유도 신호전달을 억제한다 (도 2). 종합해 보면, 이들 결과는 야생형 ACVR1에 비하여 ACVR1[R206H]의 가장 현저하고 특유한 차별화된 성질은 비표준 리간드들로부터의 신호를 전달하는 ACVR1[R206H]의 능력임을 나타낸다. 또한, 이들은 비표준 리간드들이 때때로 표준 ACVR1-매개 신호전달의 경쟁적 억제제로서 기능할 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 2: FOP의 마우스 모델에서 전위성 골형성을 억제하기 위한 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체의 용도.
Acvr1[R206H]을 인코딩하는 조건적 대립유전자(conditional allele)를 함유하는 유전자도입 녹-인(knock-in) 마우스가 개발되어 왔다. 이러한 Acvr1 [R206H]COIN/+ 마우스는, 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된, 미국 특허 출원 제14/207,320호 및 PCT/US2014/026582호에 기재되어 있다. 이러한 대립유전자는, Cre 재조합효소에 의한 활성화 후에만 R206H 변이체를 발현시킨다. 이것은, 다양한 유형의 Cre 드라이버 라인(driver line)을 사용함으로써 특정 조직에서 그리고 특정 시간에 Acvr1[R206H] 발현의 Cre-의존성 활성화를 가능하게 한다. 이러한 방식으로, 생성된 마우스는, Acvr1[R206H]의 비조절된 녹-인 대립유전자의 경우 관찰되었던 출생전후 치사(perinatal lethality)를 또한 우회한다. 어린 또는 성체 마우스에서 Acvr1[R206H] 발현의 활성화는 전위성 골형성을 야기한다. 예를 들어, Acvr1 [R206H]COIN/+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+ 마우스 (여기서, CreERt2는, Gt(ROSA26)Sor 유전자좌(locus) 내로 도입된, 타목시펜-조절가능한 재조합효소이며 (문헌[Feil et al. (1997) Biochem Biophys Res Commun. 237(3):752-7] 참조), 그리하여 이것은 항시적으로 및 전역적으로 발현됨)는 타목시펜에 노출된 후 FOP를 발생시킨다. 요약하면, 타목시펜이 없는 경우, CreERt2는 비활성인 상태이다. 타목시펜은 Cre의 발현을 활성화시키고, 이어서 Cre는 Acvr1 [R206H]COIN/+ 에 대해 작용하여 이를 Acvr1 [R206H]/+ 로 전환시킴으로써, ACVR1[R206H]인 FOP 환자의 유전자형을 반영하도록 마우스의 유전자형을 전환시킨다. Acvr1[R206H] 대립유전자는 Acvr1[R206H]을 발현시키며, 그것은 Acvr1 [ R206H ] /+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERt2 /+ 마우스에서 FOP의 발생을 유발하기에 적합하다. 이는 통상적인 Acvr1[R206H] 녹-인 마우스인 Acvr1tm1Emsh (http://www.informatics.jax.org/allele/key/828153)의 경우 겪게 되는 배아 치사(embryonic lethality)를 우회한다.
Acvr1 [R206H]COIN/+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERt2/+ 마우스에게 타목시펜을 1 mg/마우스의 용량으로 8일 동안 복막내 투여한다. 마우스를 6주 동안 주 2회 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체 10 mg/㎏ 또는 비관련 대조 항체 10 mg/㎏으로 처리한다. 타목시펜 투여의 개시 후 기선(baseline), 2주, 4주 및 6주째에 생체내 μCT를 사용하여 마우스를 모니터링한다.
도 3의 A 내지 G는 타목시펜 투여 후 6주의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체에 의한 처리의 부재 하에 있는 Acvr1 [R206H]FlEx /+ ; Gt(ROSA26)Sor CreERT2 /+ 마우스에서의 이소성 골형성을 도시한다. 전위성 골성장이, 현존하는 골격에 인접하여 (A) 흉골, (B) 꼬리쪽 척추골 및 (C) 고관절에서를 포함한 다수의 상이한 부위들에서 확인되었다. (D) 전위성 골성장이 타목시펜 주사 후 2주 내지 4주째에 형성되고, 현존하는 골격의 원위에서 발생될 수 있다. 이러한 전위성 골병변은 현존하는 골격과 융합될 수 있다. (E) 대퇴골부터 골반까지에 걸쳐서 보여주는 등쪽에서 바라본 전위성 골병변의 생체외 μCT 이미지. (F) 전위성 골을 통과하는 횡단면도는 새로 형성된 골이 피질 및 해면 유사 구조 둘 모두를 가짐을 보여준다. 전위성 골과 내인성 골격의 교차 영역(화살표)에서는, 피질골의 리모델링에 대한 증거는 있지만, 골수 공유에 대한 증거는 없다. (G) 전위성 골병변의 H&E 염색된 조직 절편이 피질골(c) 및 해면골(t) 유사 구조 및 골수(bm)임을 입증한다.
6주 후에, 처리군보다 대조군에서 더 많은 마우스가 적어도 하나의 위치에서 전위성 골을 발생시킨다.

Claims (6)

  1. 진행성 골화성 섬유이형성증(FOP)을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 액티빈 B, BMP9 또는 BMP10에 대한 항체의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가 키메라(chimeric), 베니어드(veneered), 인간화(humanized) 또는 인간 항체인, 용도.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체가 무손상(intact) 항체인, 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 카파 IgG1 항체인, 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 액티빈 B, BMP9 및 BMP10 중 둘 이상에 대한 항체들의 병용물이 투여되는, 용도.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 ACVR1, ACVR2A, 또는 ACVR2B 세포외 도메인-Fc 융합 단백질 또는 액티빈 A에 대한 항체와의 병용 요법으로 투여되는, 용도.
KR1020177033896A 2015-04-29 2016-04-27 진행성 골화성 섬유이형성증의 치료 KR20170140318A (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562154617P 2015-04-29 2015-04-29
US62/154,617 2015-04-29
US201562155427P 2015-04-30 2015-04-30
US62/155,427 2015-04-30
PCT/US2016/029585 WO2016176341A1 (en) 2015-04-29 2016-04-27 Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20170140318A true KR20170140318A (ko) 2017-12-20

Family

ID=55911125

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177033896A KR20170140318A (ko) 2015-04-29 2016-04-27 진행성 골화성 섬유이형성증의 치료

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20160319009A1 (ko)
EP (1) EP3288976B1 (ko)
JP (1) JP2018518461A (ko)
KR (1) KR20170140318A (ko)
AU (1) AU2016255768B2 (ko)
CA (1) CA2984249A1 (ko)
HK (1) HK1251898A1 (ko)
TW (1) TW201713361A (ko)
WO (1) WO2016176341A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20160075772A1 (en) 2014-09-12 2016-03-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Treatment of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva
EP3837550A1 (en) * 2018-08-17 2021-06-23 Roche Diagnostics GmbH Circulating bmp10 (bone morphogenic protein 10) in the assessment of atrial fibrillation

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH652145A5 (de) 1982-01-22 1985-10-31 Sandoz Ag Verfahren zur in vitro-herstellung von hybridomen welche humane monoklonale antikoerper erzeugen.
US4634666A (en) 1984-01-06 1987-01-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Human-murine hybridoma fusion partner
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
DE69120146T2 (de) 1990-01-12 1996-12-12 Cell Genesys Inc Erzeugung xenogener antikörper
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
ES2246502T3 (es) 1990-08-29 2006-02-16 Genpharm International, Inc. Animales no humanos transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
DE69230142T2 (de) 1991-05-15 2000-03-09 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
US5858657A (en) 1992-05-15 1999-01-12 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
ES2206447T3 (es) 1991-06-14 2004-05-16 Genentech, Inc. Anticuerpo humanizado para heregulina.
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
JP3720353B2 (ja) 1992-12-04 2005-11-24 メディカル リサーチ カウンシル 多価および多重特異性の結合タンパク質、それらの製造および使用
DE614989T1 (de) 1993-02-17 1995-09-28 Morphosys Proteinoptimierung Verfahren für in vivo Selektion von Ligandenbindende Proteine.
US5914349A (en) 1994-01-10 1999-06-22 Teva Pharmaceutical Industries, Ltd. Compositions containing and methods of using 1-aminoindan and derivatives thereof and process for preparing optically active 1-aminoindan derivatives
US5834597A (en) 1996-05-20 1998-11-10 Protein Design Labs, Inc. Mutated nonactivating IgG2 domains and anti CD3 antibodies incorporating the same
CN100405399C (zh) 1999-02-05 2008-07-23 三星电子株式会社 图像纹理恢复方法及其装置
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
CL2007002567A1 (es) 2006-09-08 2008-02-01 Amgen Inc Proteinas aisladas de enlace a activina a humana.
US8642031B2 (en) 2006-11-02 2014-02-04 Acceleron Pharma, Inc. Antagonists of BMP9, BMP10, ALK1 and other ALK1 ligands, and uses thereof
US8383351B2 (en) 2008-06-11 2013-02-26 Oxford Brookes University Antibody to inhibin/ activin β-B subunit
WO2011158924A1 (ja) * 2010-06-18 2011-12-22 独立行政法人国立精神・神経医療研究センター 優性アレル発現抑制剤
WO2013063536A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Acceleron Pharma, Inc. Actriib binding agents and uses thereof
KR102143476B1 (ko) 2012-07-02 2020-08-12 쿄와 기린 가부시키가이샤 항ｂｍｐ９ 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제
JPWO2014051109A1 (ja) * 2012-09-28 2016-08-25 協和発酵キリン株式会社 抗ヒトｂｍｐ９抗体および該抗体を有効成分とする異所性骨化疾患の治療剤
TWI682941B (zh) 2013-02-01 2020-01-21 美商再生元醫藥公司 含嵌合恆定區之抗體
TW201920262A (zh) 2013-07-30 2019-06-01 美商再生元醫藥公司 抗活化素ａ之抗體及其用途
JP6601687B2 (ja) * 2014-03-31 2019-11-06 大日本住友製薬株式会社 進行性骨化性線維異形成症の予防剤及び治療剤

Also Published As

Publication number Publication date
AU2016255768A1 (en) 2017-11-16
JP2018518461A (ja) 2018-07-12
EP3288976B1 (en) 2020-04-08
CA2984249A1 (en) 2016-11-03
US20190153085A1 (en) 2019-05-23
EP3288976A1 (en) 2018-03-07
AU2016255768B2 (en) 2022-03-10
TW201713361A (zh) 2017-04-16
US20210061898A1 (en) 2021-03-04
HK1251898A1 (zh) 2019-04-26
US20160319009A1 (en) 2016-11-03
WO2016176341A1 (en) 2016-11-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11407822B2 (en) Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
KR101699432B1 (ko) 섬유아세포성장인자수용체 ２에 대한 모노클로날 항체
JP5171948B2 (ja) Ｍｄｌ−１の使用
MX2012013369A (es) Anticuerpos hacia gdf8 humano.
WO2013188448A2 (en) Dual receptor antagonistic antigen-binding proteins and uses thereof
US20210061898A1 (en) Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
JP2023519100A (ja) 抗ａｃｖｒ１抗体およびその使用
US20210253685A1 (en) Treatment of fibrodysplasia ossificans progressiva
EA039118B1 (ru) Способ лечения прогрессирующей оссифицирующей фибродисплазии
BR112017004812B1 (pt) Uso de um anticorpo contra ativina a para preparação de um medicamento para tratamento de fibrodisplasia ossificante progressiva

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application