CN105980409A - 靶向her2的双特异性抗原结合构建体 - Google Patents

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Abstract

本文提供了特异性结合HER2的双互补位抗原结合构建体。所述双互补位抗原结合构建体包含与HER2的ECD2结合的一个抗原结合部分、与HER2的ECD4结合的第二抗原结合部分和Fc。所述抗原结合部分中的至少一个为scFv。所述双互补位抗原结合构建体可用于癌症的治疗。

Description

靶向HER2的双特异性抗原结合构建体
相关申请案的交叉引用
本申请要求2013年11月27日提交的美国临时申请第61/910,026号；2014年5月20日提交的美国临时申请第62/000,908号；和2014年6月6日提交的美国临时申请第62/009,125号的权益，所述临时申请全部据此通过引用整体并入。
序列表
本申请含将经由EFS-Web提交并且据此通过引用整体并入的序列表。20XX年XX月创建的所述ASCII拷贝命名为XXXXXUS_sequencelisting.txt，并且大小为X,XXX,XXX字节。
发明背景
大多数当前上市的抗体治疗剂是针对由两个抗原结合结构域赋予的高亲和力结合和亲合力而优化和选择的二价单特异性抗体。由诱变引起的FcgR结合的无岩藻糖基化或增强已经用于经由抗体Fc依赖性细胞毒性作用机制使抗体更有效。无岩藻糖基化抗体或FcgR结合增强的抗体仍在临床试验中遭受不完整的疗效并且对于这些抗体中的任一种而言尚待获得上市药物状态。与毒素偶联的典型二价抗体(抗体药物偶联物)更有效但是更广泛的临床实用性受剂量限制性毒性的限制。
理想地，治疗性抗体会具有某些微小特征，包括靶特异性、生物稳定性、生物利用度和施用给受试患者后的生物分布，及足够的靶标结合亲和力和高靶标占有率以使抗体依赖性治疗效果达到最大限度。通常治疗性抗体为单特异性的。然而单特异性靶向不针对在信号传导和发病机制中可能有关的其它靶表位，允许药物抗性和逃避机制。当前的一些治疗范例需要使用靶向同一靶抗原的两个不同表位的两种治疗性单特异性抗体的组合。一个实例为使用曲妥珠单抗(Trastuzumab)和帕妥珠单抗(Pertuzumab)的组合，两者靶向一些癌细胞表面上的HER2受体蛋白，但是患者仍有疾病进展，而具有较低HER2受体水平(通过Hercept试验HER2<3+)的其它患者显示无治疗益处。在GenMab的WO 2012/143523和Genentech的WO 2009/154651中公开了靶向HER2的治疗性抗体。在WO 2009/068625和WO2009/068631中也描述了抗体。
2011年11月4日提交的共有专利申请PCT/CA2011/001238、2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780、2013年5月10日提交的PCT/CA2013/00471和2013年5月8日提交的PCT/CA2013/050358描述了治疗性抗体。每一个共有专利申请均据此通过引用整体并入用于所有目的。
发明概述
本文描述了结合HER2的二价抗原结合构建体。所述抗原结合构建体包含单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体和单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2ECD4(胞外结构域4)抗原的第二抗原结合多肽构建体，第一和第二接头多肽，其中所述第一接头多肽与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接，并且所述第二接头多肽与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接；其中所述接头多肽能够相互形成共价键，其中ECD2结合多肽构建体或ECD4结合多肽构建体中的至少一个为scFv。在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为scFv，并且ECD2结合多肽构建体为Fab。在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为Fab而ECD4结合多肽构建体为scFv。在一些实施方案中，ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为scFv。在一些实施方案中，所述抗原结合构建体具有包含CH3序列的二聚Fc。在一些实施方案中，Fc是在CH3序列中具有一个或多个修饰的异二聚体，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体的形成。在一些实施方案中，异二聚体CH3序列的解链温度(Tm)为68℃或更高。还描述了编码抗原结合构建体的核酸，及载体和细胞。还描述了使用本文描述的抗原结合构建体治疗病症，如癌症的方法。
本文还提供了经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含在VL区中具有突变Y96A且在VH区具有突变T30A/A49G/L70F(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体为单价的，并且对HER2ECD2具有比帕妥珠单抗高7至9倍的亲和力。在某些实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体具有Fab/Fab、Fab/scFv或scFv/scFv形式。
附图简述
图1A描绘呈Fab-Fab形式的双互补位抗体的结构。图1B至1E描绘呈scFv-Fab形式的双互补位抗体的可能型式的结构。在图1B中，抗原结合结构域1为scFv，与A链融合，而抗原结合结构域2为Fab，与B链融合。在图1C中，抗原结合结构域1为Fab，与A链融合，而抗原结合结构域2为scFv，与B链融合。在图1D中，抗原结合结构域2为Fab，与A链融合，而抗原结合结构域1为scFv，与B链融合。在图1E中，抗原结合结构域2为scFv，与A链融合，而抗原结合结构域1为Fab，与B链融合。在图1F中，两个抗原结合结构域均为scFv。
图2描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的表达和纯化的表征。图2A和2B描绘蛋白A纯化抗体的SEC色谱，及对v5019的10L表达和纯化的非还原SDS-PAGE分析。图2C描绘对v10000的25L表达和纯化的SDS-PAGE分析。
图3描绘对通过蛋白A和SEC纯化的示例性抗HER2双互补位抗体的UPLC-SEC分析的结果。图3A示出了v5019的结果，其中上图示出了纯化的结果而下图示出了y轴刻度扩大的相同结果。在UPLC-SEC结果下面提供了获得的数据总结。图3B示出了v10000的结果。
图4描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的异二聚体纯度的LCMS分析。图4A描绘来自于对v5019的合并SEC成分的LC-MS分析的结果。图4B描绘来自于对v10000的合并蛋白A成分的LC-MS分析的结果。
图5描绘对示例性抗HER2双互补位抗体的25L规模制备物的分析。图5A描绘在MabSelectTM和HiTrapTM SP FF纯化后示例性抗HER2双互补位抗体的SDS-PAGE图谱。图5B描绘纯化抗体的LCMS分析。
图6，如通过FACS所测量，将示例性双互补位抗HER2抗体与展示出不同HER2受体密度的HER2+全细胞结合的能力与对照抗体比较。图6A和图6E描绘与SKOV3细胞的结合；图6B描绘与JIMT1细胞的结合；图6C和图6F描绘与MCF7细胞的结合；图6D描绘与MDA-MB-231细胞的结合；并且图6G描绘与WI-38细胞的结合。
图7描绘示例性抗HER2双互补位抗体抑制HER2+细胞生长的能力。图7A和图7D示出了SKOV3细胞中的生长抑制；图7B示出了BT-474细胞中的生长抑制；图7C示出了SKBR3细胞中的生长抑制，并且图7E示出了JIMT-1细胞中的生长抑制。
图8描绘关于示例性抗HER2双互补位抗体的互补位的SPR结合数据。图8A说明单价抗Her2抗体(v1040；表示示例性抗Her2双互补位抗体的CH-B上的抗原结合结构域)与固定Her2ECD或二聚Her2-Fc结合的KD值(nM)。图8B说明单价抗Her2抗体(v4182；表示示例性抗Her2双互补位抗体的CH-A上的抗原结合结构域)与固定Her2ECD或二聚Her2-Fc结合的KD值(nM)。
图9描绘示例性抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中内化的能力。图9A描绘在BT-474细胞中的内化，而图9b描绘在JIMT-1细胞中的内化。
图10描绘示例性抗HER2双互补位抗体的表面结合和内化。图10A(v5019)描绘在BT-474细胞中的结果；图10B(v5019)和图10F(v5019和v10000)描绘在JIMT1细胞中的结果；图10C(v5019)和图10E(v5019和v10000)描绘在SKOV3细胞中的结果，并且图10D(v5019)描绘在MCF7细胞中的结果。
图11描绘示例性抗HER2双互补位抗体在SKOV3细胞中介导ADCC的能力。在图11A中，使用5:1的效应子:靶细胞比率进行测定；在图11B中，使用3:1的效应子:靶细胞比率进行测定；并且在图11C中，使用1:1的效应子:靶细胞比率进行测定。
图12描绘单价抗HER2(v630和v4182)和示例性双互补位抗Her2抗体(v5019)与重组人HER2的亲和力和结合动力学的表征。图12A示出了ka(1/Ms)的测量。图12B示出了kd(1/s)的测量。图12C示出了KD(M)的测量。
图13描绘示例性双互补位抗HER2抗体与重组人HER2在一系列抗体捕获水平的亲和力和结合特征。图13A描绘对于示例性双互补位抗Her2抗体(v5019)而言在一系列抗体捕获水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量。图13B描绘对于单价抗Her2抗体(v4182)而言在一系列抗体捕获水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量。图13C描绘对于单价抗Her2抗体(v630)而言在一系列抗体捕获水平测定的对HER2ECD的kd(1/s)的测量。
图14示出了单特异性抗ECD4HER2抗体(左)和Fab-scFv双互补位抗ECD2xECD4HER2抗体(右)的结合机制的比较。单特异性抗ECD4HER2抗体能够使一个抗体分子与两个HER2分子结合；而双互补位抗ECD2x ECD4HER2抗体能够使一个抗体与两个HER2分子结合，以及2个抗体与一个HER2分子结合及其组合，导致HER2受体交联及晶格形成，接着是如箭头所指示的下游生物效应如内化和/或生长抑制。IEC表示“免疫效应细胞”。HER2的四个胞外结构域编号为1、2、3或4，其中1＝ECD1、2＝ECD2、3＝ECD3及4＝ECD4。
图15描绘在BT-474细胞中示例性抗HER2双互补位抗体对AKT磷酸化的影响。
图16描绘示例性抗HER2双互补位抗体对心肌细胞活力的影响。图16A描绘v5019及相应的ADC v6363对心肌细胞活力的影响；图16B描绘v5019、v7091和v10000及相应的ADCv6363、7148、10553对心肌细胞活力的影响，并且图16C描绘v5019、v7091和v10000及相应的ADC v6363、7148、10553对经多柔比星(doxorubicin)预处理的心肌细胞活力的影响。
图17描绘示例性抗HER2双互补位抗体药物偶联物抑制HER2+细胞生长的能力。图17A示出了ADC v6363抑制JIMT1细胞生长的能力。图17B示出了ADC v6363抑制SKOV3细胞生长的能力。图17C示出了ADC v6363抑制MCF7细胞生长的能力。图17D示出了ADC v6363抑制MDA-MB-231细胞生长的能力。图17E示出了ADC v6363、v10553和v1748抑制SKOV3细胞生长的能力。图17F示出了ADC v6363、v10553和v1748抑制JIMT-1细胞生长的能力。图17G示出了ADC v6363、v10553和v1748抑制NCI-N87细胞生长的能力。
图18描绘双互补位抗HER2抗体在人卵巢癌系异种移植模型(SKOV3)中的作用。图18A示出了抗体对平均肿瘤体积的影响。图18B示出了抗体对动物存活百分比的影响。
图19描绘在双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)人卵巢癌系异种移植模型(SKOV3)中的作用。图19A示出了抗体对平均肿瘤体积的影响。图19B示出了抗体对动物存活百分比的影响。
图20描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种移植模型(HBCx-13b)中对平均肿瘤体积的影响。
图21描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种移植模型(T226)中对平均肿瘤体积的影响。
图22描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人乳腺原代细胞异种移植模型(HBCx-5)中对平均肿瘤体积的影响。
图23描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人细胞系异种移植模型(SKOV3)中对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响。
图24描绘双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人原代细胞异种移植模型(HBCx-13b)中对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响。
图25描绘示例性抗HER2双互补位抗体的热稳定性。图25A描绘v5019的热稳定性。图25B描绘v10000的热稳定性。图25C描绘v7091的热稳定性。
图26描绘示例性抗HER2双互补位抗体药物偶联物的热稳定性。图26A描绘v6363的热稳定性。图26B描绘v10553的热稳定性。图26C描绘v7148的热稳定性。
图27描绘抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中介导ADCC的能力。图27C中所示的图例适用于图27A和图27B。图27A描绘在SKBR3细胞中的这种能力；图27B描绘在JIMT-1细胞中的这种能力；图27C描绘在MDA-MB-231细胞中的这种能力；并且图27D描绘在WI-38细胞中的这种能力。
图28描绘无岩藻糖基化对抗HER2双互补位抗体介导ADCC的能力的影响。图28B中所示的图例也适用于图28A。图28A比较了在SKOV3细胞中无岩藻糖基化型式的v5019介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC的能力。图28B比较了在MDA-MB-231细胞中无岩藻糖基化型式的v5019介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC的能力。图28C比较了在ZR-75-1细胞中无岩藻糖基化型式的v10000介导ADCC的能力与赫塞汀TM介导ADCC的能力。
图29描绘在生长刺激性配体存在或缺乏时v5019抑制BT-474细胞生长的能力。
图30描绘在人乳腺癌异种移植模型(HBCx13B)中无岩藻糖基化型式的v5019(v7187)对肿瘤体积的影响。
图31描绘抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC与HER2+肿瘤细胞结合的能力。图31A将在SKOV3细胞中v6363与T-DM1类似物(v6246)的结合进行比较。图31B将在JIMT-1细胞中v6363与T-DM1类似物(v6246)的结合进行比较。图31C将在SKOV3细胞中几种示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC的结合与对照进行比较。图31D将在JIMT-1细胞中几种示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC的结合与对照进行比较。
图32描绘在HER2 3+(ER-PR阴性)患者来源的异种移植模型(HBCx13b)中示例性抗HER2双互补位-ADC的剂量依赖性肿瘤生长抑制。图32A示出了v6363对肿瘤体积的影响，而图32B示出了对存活百分比的影响。
图33描绘在曲妥珠单抗抗性PDX HBCx-13b异种移植模型中与护理标准组合(Standard of Care Combinations)相比双互补位抗HER2-ADC v6363的作用。图33A描绘处理对肿瘤体积的影响，而图33B描绘处理对存活率的影响。
图34描绘在HER2+曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞来源的肿瘤异种移植模型(JIMT-1)中双互补位抗HER2-ADC的功效。
图35描绘在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿瘤异种移植模型(SKOV3)中示例性抗HER2双互补位抗体在体内的功效。图35A描绘处理对肿瘤体积的影响，而图35B描绘处理对存活率的影响。
图36描绘在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿瘤异种移植模型(SKOV3)中示例性抗HER2双互补位抗体在体内的剂量依赖性功效。
图37描绘抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC抑制以3+、2+或1+水平表达HER2和EGFR和/或HER3的细胞系的生长的能力。图37A描绘v10000抑制所选细胞系生长的能力。图37B描绘v10553抑制所选细胞系生长的能力。
图38描绘v10000和v10553在一组细胞系中抑制生长的能力的总结。带有连字符号的值(例如1/2)指示如文献中报道的有差异的erbb受体水平；Erbb IHC值内部获得或来自于文献。未报道值时受体量未知和/或未报道。*IHC水平估计值基于erBb2基因表达数据(Crown BioSciences)。下面描述了编号的参考文献。
图39描绘v10000在HER2+细胞中介导ADCC的能力。图39A描绘在FaDu细胞中的结果。图39B描绘在A549细胞中的结果。图39C描绘在BxPC3细胞中的结果。图39D描绘在MiaPaca2细胞中的结果。
图40描绘抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中介导ADCC的能力。图40A描绘在A549细胞中的结果。图40B描绘在NCI-N87细胞中的结果。图40C描绘在HCT-116细胞中的结果。
图41描绘抗HER2双互补位抗体形式对结合HER2+细胞的影响。图41A描绘形式对与BT-474细胞结合的影响。图41B描绘形式对与JIMT-1细胞结合的影响。图41C描绘形式对与MCF7细胞结合的影响。图41D描绘形式对与MDA-MB-231细胞结合的影响。
图42描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体在HER2+细胞中内化的影响。图42A描绘对在BT-474细胞中内化的影响。图42B描绘对在JIMT-1细胞中内化的影响。图42C描绘对在MCF7细胞中内化的影响。
图43描绘抗HER2双互补位抗体形式对在HER2+细胞中介导ADCC的能力的影响。图43A描绘在JIMT-1细胞中的影响。图43B描绘在MCF7细胞中的影响。图43C描绘在HER2 0/1+MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞中的影响。
图44描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体在BT-474细胞中在生长刺激性配体存在或缺乏时抑制HER2+肿瘤细胞生长的能力的影响。
图45描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体抑制SKBR3细胞生长的能力的影响。
图46描绘抗HER2双互补位抗体形式对抗体抑制HER2+肿瘤细胞生长的能力的影响。图46A描绘在SKOV3细胞中的生长抑制。图46B描绘在JIMT-1细胞中的生长抑制。图46C描绘在MCF7细胞中的生长抑制。
图47描绘对通过SPR测量的不同形式的抗HER2双互补位抗体的结合特征的比较。图47A描绘用v6903和v7091在不同抗体捕获水平下对kd(1/s)的散点图和线性回归分析。图47B描绘用v6903和v7091在不同抗体捕获水平下对KD(M)的散点图和线性回归分析。
图38中找到的参考文献如下：1.Labouret et al.2012,Neoplasia 14:121-130；2.Ghasemi et al.2014,Oncogenesis doi:10.1038/oncsis.2014.31；3.Gaborit etal.2011J Bio Chem,286:1133-11345；4.Kimura et al.2006,Clin Cancer Res；12:4925-4932；5.Komoto et al.2009,Cane Sci；101:468-473；6.Cretellaet al.2014,MolecularCancer 13:143-155；7.Bunn et al.2001,Clin Cancer Res；7:3239-3250；8.LewisPhillips et al.2013,Clin Cancer Res,20:456-468；9.McDonagh et al.2012,11:582-593；10.Coldren et al.2006,Mol Cancer Res:521-528；11.Cavazzoni et al.2012MolCancer,11:91-115；12.Li et al.2014,Mol Cancer Res,doi:10.1158/1541-7786.MCR-13-0396；13.Chmielewski et al.2004,Immunology,173:7647-7653；14.Kuwada etal.2004,Int J Cancer,109:291-301；15.Fujimoto-Ouchi et al.2007,Clin ChemotherPharmacol,59:795-805；16.Chavez-Bianco et al.2004,BMC Cancer,4:59；17.Campiglioet al.2004,J Cellular Physiology.198:259-268；18.Lehmann et al.2011,J ClinInvestigation,121:2750-2767；19.Collins et al.2011,Annals Oncology,23:1788-1795；20.Takai et al.2005,Cancer,104:2701-2708；21.Rusnack et al.2007,CellProlif,40:580-594；22.Ma et al.2013,PLOS ONE,8:e73261-e73261；23.Meira etal.2009,British J Cancer,101:782-791；24.Hayashi MP28-14poster；25.Wang etal.2005J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci.25:326-8；26.Makhjaet al.2010.JCline Oncolo 28:1215-1223.
具体实施方式
本文描述了一种抗原结合构建体，其包含单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体和单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2ECD4(胞外结构域4)抗原的第二抗原结合多肽构建体，其中ECD2结合多肽构建体或ECD4结合多肽构建体中的至少一个为scFv。在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为scFv，而ECD4结合多肽构建体为Fab。在某些实施方案中，ECD2结合多肽构建体为Fab而ECD4结合多肽构建体为scFv。在一些实施方案中，ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为scFv。在一些实施方案中，所述抗原结合构建体具有包含CH3序列的二聚Fc。在一些实施方案中，Fc是在CH3序列中具有一个或多个修饰的异二聚体，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体的形成。在一些实施方案中，异二聚体CH3序列的解链温度(Tm)为68℃或更高。
所述抗原结合构建体在体外表现出抗肿瘤活性，如(i)在表皮生长因子或调蛋白(heregulin)的刺激存在或缺乏时抑制癌细胞生长的能力，(ii)在癌细胞中内化的能力及(iii)介导抗体指导的效应细胞杀伤(ADCC)的能力。用裸抗原结合构建体(即未与药物或毒素偶联)和用与美登素(maytansine)偶联的抗原结合构建体，并且在不同的HER2表达水平下(1+、2+和3+)均获得这些体外活性。
本文显示抗原结合构建体的形式(scFv/scFv、scFv/Fab或Fab/Fab)在决定其功能图特性方面很重要。在某些实施方案中，抗HER2结合构建体与其中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为Fab的参考双互补位抗原结合构建体相比表现出被HER2表达肿瘤细胞内化的能力增强。其中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽两者均为scFv的一个实施方案在比具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体更高的程度上被表达1+、2+或3+水平的HER2的肿瘤细胞内化，具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体又比具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体更有效被内化。易于内化的实施方案是抗体-药物偶联物的优良候选物，其需要被肿瘤细胞内化才能实现杀伤。
在某些实施方案中，所述抗原结合构建体与具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体相比在表达低水平HER2的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面表现出效力增强。在一个实施方案中，具有Fab/scFv形式的抗原结合构建体在表达低水平HER2(HER2 0-1+或1+)的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面比具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体更有效，具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体又比具有scFv/scFv形式的抗原结合构建体更有效。
在一些实施方案中，抗HER2抗原结合构建体经糖基化。
在一些实施方案中，抗HER2结合构建体无岩藻糖基化。在一些实施方案中，抗HER2结合构建体与药物偶合。在一些实施方案中，抗HER2结合构建体通过SMCC接头与美登素(DM1)偶合。
本文还描述了通过向受试者施用抗HER2抗原结合构建体而治疗患有HER2+肿瘤的受试者的方法。在一些实施方案中，肿瘤上HER2表达的水平为2+或更低。在一些实施方案中，所述抗原结合构建体与美登素偶联。在某些实施方案中，所述肿瘤为胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮肤癌。在一些实施方案中，所述肿瘤是(i)HER2 3+***受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PR-)、曲妥珠单抗抗性、化疗抗性浸润性乳腺导管癌，(ii)HER2 3+ER-、PR-、曲妥珠单抗抗性炎性乳腺癌，(iii)HER2 3+、ER-、PR-浸润性导管癌或(iv)HER2 2+HER2基因扩增的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌。
本文还提供了通过施用所述抗原结合构建体抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞的方法。
本文还提供了经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含在VL区中的突变Y96A和在VH区的突变T30A/A49G/L70F(根据Kabat编号)。在一个实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体为单价的，并且对HER2ECD2具有比帕妥珠单抗高7至9倍的亲和力。在某些实施方案中，经修饰的帕妥珠单抗构建体具有Fab/Fab、Fab/scFv或scFv/scFv形式。
双特异性抗原结合构建体
本文提供了结合HER2的双特异性抗原结合构建体。双特异性抗原结合构建体包括两个抗原结合多肽构建体，各自特异性地结合HER2的不同表位。在一些实施方案中，抗原结合构建体衍生自已知的抗体或抗原结合构建体。如下面更加详细的描述，抗原结合多肽构建体可以是，但不限于，蛋白质构建体如Fab(抗原结合片段)、scFv(单链Fv)和sdab(单结构域抗体)。通常所述抗原结合构建体包括Fc。
术语“抗原结合构建体”是指能够与抗原结合的任何试剂，如多肽或多肽复合物。在一些方面抗原结合构建体是与目标抗原特异性结合的多肽。抗原结合构建体可以是单体、二聚体、多聚体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物；抗体、抗体片段或其抗原结合片段；scFv等。抗原结合构建体可以是单特异性、双特异性或多特异性的多肽构建体。在一些方面，抗原结合构建体可包括，例如，与一个或多个Fc连接的一个或多个抗原结合组分(例如，Fab或scFv)。在下面描述并且在实施例中提供了抗原结合构建体的其它实例。
术语“双特异性”旨在包括具有两个抗原结合部分(例如抗原结合多肽构建体)，各自具有独特结合特异性的任何试剂，例如抗原结合构建体。例如，第一抗原结合部分与第一抗原上的表位结合，而第二抗原结合部分与第二抗原上的表位结合。如本文中所用的术语“双互补位”是指双特异性抗体，其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分与同一抗原上的不同表位结合。双互补位双特异性抗体可与同一抗原分子上的两个表位结合，或者可与两个不同抗原分子上的表位结合。
单特异性抗原结合构建体是指具有一种结合特异性的抗原结合构建体。换言之，两个抗原结合部分均与同一抗原上的相同表位结合。单特异性抗原结合构建体的实例包括例如与HER2结合的曲妥珠单抗、帕妥珠单抗。
抗原结合构建体可以是抗体或其抗原结合部分。如本文中所用，“抗体”或“免疫球蛋白”是指大体上由一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因编码的特异性结合并识别分析物(例如，抗原)的多肽或其片段。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几类可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGi、IgG2、IgG3、IgG4、IgAi和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链构成，每一对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端结构域限定约100至110个或更多个氨基酸的主要负责抗原识别的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链结构域。IgG1重链从N到C端分别由VH、CH1、CH2和CH3结构域组成。轻链从N到C端由VL和CL结构域组成。IgG1重链包含介于CH1和CH2结构域之间的铰链。在某些实施方案中，免疫球蛋白构建体包含来自于IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的与治疗性多肽连接的至少一个免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中，在本文提供的抗原结合构建体中找到的免疫球蛋白结构域来自于或衍生自基于免疫球蛋白的构建体如双链抗体或纳米抗体。在某些实施方案中，本文描述的免疫球蛋白构建体包含来自于重链抗体如骆驼抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中，本文提供的免疫球蛋白构建体包含来自于哺乳动物抗体如牛抗体、人抗体、骆驼抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
如本文中所用，术语“高变区”或“HVR”是指在序列上高度可变和/或形成结构限定的环(“高变环”)的抗体可变结构域的每个区域。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自于高变环和/或来自于互补决定区(CDR)的氨基酸残基，后者具有最高的序列变异性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语在提及形成抗原结合区的可变区部分时在本文中可交换使用。这个特定区域已经被Kabat等，U.S.Dept.of Health and Human Services,Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1983)和Chothia等，J Mol Biol 196:901-917(1987)描述，其中定义包括相互比较时氨基酸残基的重叠或子集。然而，应用任一种定义指抗体或其变体的CDR都旨在落入本文定义和使用的术语范围之内。涵盖以上引用的每个参考文献定义的CDR的适当氨基酸残基下面在表1中作为比较而列出。涵盖特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而改变。考虑到抗体的可变区氨基酸序列，本领域的技术人员可按常规确定哪些残基组成特定CDR。
如本文中所用，术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中，其中一个抗原结合多肽构建体为单链Fab分子，即其中Fab轻链和Fab重链通过肽接头连接形成单一肽链的Fab分子。在此类具体实施方案中，在单链Fab分子中Fab轻链的C端与Fab重链的N端连接。在某些其它实施方案中，其中一个抗原结合多肽构建体为单链Fv分子(scFv)。如本文更加详细的描述，scFv具有通过多肽链从其C端与重链可变结构域(VH)的N末端连接的轻链可变结构域(VL)。可选地scFv由多肽链组成，其中VH的C末端通过多肽链与VL的N末端连接。
抗原结合多肽构建体
双特异性抗原结合构建体包含两个抗原结合多肽构建体，其各自与HER2的特定结构域或表位结合。在一个实施方案中，每个抗原结合多肽构建体均与HER2的胞外结构域，例如ECD2或ECD4结合。抗原结合多肽构建体可根据应用为(例如)Fab或scFv。
双特异性抗原结合构建体的形式决定双特异性抗原结合构建体的功能特征。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体具有scFv-Fab形式(即一个抗原结合多肽构建体为scFv而另一个抗原结合多肽构建体为Fab，也称为Fab-scFv形式)。在另一实施方案中，双特异性抗原结合构建体具有scFv-scFv形式(即两个抗原结合多肽构建体均为scFv)。
“Fab片段”(也称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)连同分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定环(CDR，也称为高变区)。Fab'片段与Fab片段不同之处在于在重链CH1结构域的羧基端添加几个残基，包括来自于抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含介于VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成抗原结合所需的结构。对scFv的综述，参见Pluckthun，The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag,New York，第269-315页(1994)。在WO93/16185、美国专利第5,571,894号和美国专利第5,587,458号中描述了HER2抗体scFv片段。
“单结构域抗体”或“sdAb”形式是独立免疫球蛋白结构域。Sdab相当稳定且易于作为具有抗体Fc链的融合伴侣表达(Harmsen MM,De Haard HJ(2007)."Properties,production,and applications of camelid single-domain antibody fragments".Appl.Microbiol Biotechnol.77(1):13-22)。
抗原结合构建体的形式和功能
本文提供了具有两个抗原结合多肽构建体的双互补位HER2抗原结合构建体，其中第一个与HER2ECD2特异性结合，而第二个与HER2ECD4特异性结合。抗原结合构建体的形式是这样的是，使得第一或第二抗原结合多肽中的至少一个为scFv。抗原结合构建体的形式可为scFv-scFv或Fab-scFv或scFv-Fab(分别为第一抗原结合多肽构建体-第二抗原结合多肽)。
在某些实施方案中，抗原结合构建体在体外表现出抗肿瘤活性，如(i)在表皮生长因子或调蛋白的刺激存在或缺乏时抑制癌细胞生长的能力，(ii)在癌细胞中内化的能力(通过与HER2抗原结合并使其内化)及(iii)介导抗体指导的效应细胞杀伤(ADCC)的能力。用裸抗原结合构建体和用与美登素偶联的抗原结合构建体，并且在不同的HER2表达水平下(1+、2+和3+)均获得这些体外活性。
本文的实例显示抗原结合构建体的形式(scFv/scFv、scFv/Fab或Fab/Fab)在决定其功能特性上很重要。在某些实施方案中，抗HER2结合构建体与其中ECD2结合多肽构建体和ECD4结合多肽构建体两者均为Fab的参考抗原结合构建体相比表现出被HER2表达肿瘤细胞内化的能力增强。预计可通过增强一种或两种抗原结合多肽构建体对ECD2或ECD4的亲和力而进一步提高抗HER2抗原结合构建体的内化程度。其中ECD2结合多肽和ECD4结合多肽两者均为scFv的一个实施方案是在比具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体更高的程度上被表达1+、2+或3+水平的HER2的肿瘤细胞内化，具有Fab/scFv形式的等效亲和力的构建体又比具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体内化更有效。易于内化的实施方案是抗体-药物偶联物的优良候选物，其需要被肿瘤细胞内化才能实现杀伤。相反，在某些实施方案中，不易内化的抗原结合构建体与具有Fab/Fab形式的等效亲和力的构建体相比在表达低水平HER2的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面表现出效力增强。在一个实施方案中，具有Fab/scFv形式的抗原结合构建体在表达低水平HER2(HER2 0-1+或1+)的肿瘤细胞的ADCC杀伤方面比具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体更有效，具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体又比具有scFv/scFv形式的抗原结合构建体更有效。一些实施方案的ADCC效力增强可能是由于1)其亲和性地结合具有低HER2受体密度且随后使HER2受体在靶细胞表面聚集并介导下游细胞介导的杀伤的能力增强；和/或2)其留在细胞表面的能力增强(而不引起内化)；因此它们更适用于细胞介导的效应子杀伤。
HER2
本文描述的抗原结合构建体具有与HER2的ECD2和ECD4结合的抗原结合多肽构建体。
措辞“ErbB2”和“HER2”在本文中可交换使用并且是指，例如在Semba等，PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等Nature319:230-234(1986)中描述的人HER2蛋白(基因库登录号X03363)。术语“erbB2”和“neu”是指编码人ErbB2蛋白的基因。p185或p185neu是指neu基因的蛋白质产物。
HER2为HER受体。“HER受体”是属于人表皮生长因子受体(HER)家族的受体蛋白酪氨酸激酶并且包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含可结合HER配体的胞外结构域；亲脂性跨膜结构域；保守性胞内酪氨酸激酶结构域；和带有几个可以磷酸化的酪氨酸残基的羧基端信号传导结构域。所谓“HER配体”意指结合和/或活化HER受体的多肽。
HER2的胞外(外)结构域包括四个结构域，结构域I(ECD1，约1-195的氨基酸残基)、结构域II(ECD2，约196-319的氨基酸残基)、结构域III(ECD3，约320-488的氨基酸残基)和结构域IV(ECD4，约489-630的氨基酸残基)(残基编号，无信号肽)。参见Garrett等Mol.Cell.11:495-505(2003)，Cho等Nature 421:756-760(2003)，Franklin等Cancer Cell5:317-328(2004)，Tse等Cancer Treat Rev.2012年4月；38(2):133-42(2012)，或Plowman等Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。
HER2的序列如下；ECD边界为结构域I：1-165；结构域II：166-322；结构域III：323-488；结构域IV：489-607。
“表位2C4”是HER2的胞外结构域中与抗体2C4结合的区域。表位2C4包含来自于HER2胞外结构域中结构域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的接合处与HER2胞外结构域结合。Franklin等Cancer Cell 5:317-328(2004)。为了筛选与2C4表位结合的抗体，可以进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，Harlow和David Lane编辑(1988)中描述的常规交叉阻断测定。可选地，可以使用本领域已知的方法进行表位作图以估计抗体是否与HER2的2C4表位结合和/或可以研究抗体-HER2结构(Franklin等Cancer Cell 5:317-328(2004))以了解HER2的哪个结构域被抗体结合。
“表位4D5”是HER2胞外结构域中与抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的区域。该表位靠近HER2的跨膜结构域，并且在HER2的结构域IV内。为筛选与4D5表位结合的抗体，可以进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory，编辑Harlow和David Lane(1988)中描述的常规交叉阻断测定。可选地，可以进行表位作图以估计抗体是否与HER2的4D5表位(例如，从大约残基529到大约残基625(包括端点)的区域内的任一个或多个残基，参见美国专利公布第2006/0018899号的图1)结合。
“特异性地结合”、“特异性结合”或“选择性结合”意为结合对于抗原而言是选择性的并且可以与不需要或非特异性的相互作用区别开。抗原结合构建体与特定抗原决定簇结合的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术测量，例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等，Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley，Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中，正如(例如)通过SPR所测量那样，抗原结合部分与无关蛋白结合的程度低于抗原结合构建体与抗原结合的约10％。在某些实施方案中，与抗原结合的抗原结合构建体，或包含抗原结合部分的抗原结合分子，解离常数(KD)<1μM、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如10-8M或更低，例如从10-8M至10"13M，例如从10"9M至10"13M)。
“调蛋白”(HRG)在本文中使用时是指如美国专利第5,641,869号或Marchionni等，Nature,362:312-318(1993)中公开的调蛋白基因产物编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等，Science,256:1205-1210(1992)；和美国专利第5,641,869号)；neu分化因子(NDF)(Peles等Cell 69:205-216(1992))；乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等Cell 72:801-815(1993))；胶质生长因子(GGF)(Marchionni等，Nature,362:312-318(1993))；感觉和运动神经元来源性因子(SMDF)(Ho等J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995))；γ-调蛋白(Schaefer等Oncogene 15:1385-1394(1997))。该术语包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列变体，如其EGF样结构域片段(例如HRGβ1177-244)。
“HER活化”或“HER2活化”是指任何一种或多种HER受体或HER2受体的活化或磷酸化。通常，HER活化引起信号转导(例如通过HER受体或底物多肽中的HER受体磷酸化酪氨酸残基的胞内激酶结构域引起的信号转导)。HER活化可通过HER配体与包含目标HER受体的HER二聚体的结合而介导。HER配体与HER二聚体的结合可以活化二聚体中的一个或多个HER受体的激酶结构域并从而引起一个或多个HER受体中的酪氨酸残基磷酸化和/或附加底物多肽，如Akt或MAPK胞内激酶中的酪氨酸残基的磷酸化。
衍生的抗原结合多肽构建体
抗原结合多肽构建体可衍生自已知的抗HER2抗体或抗HER2结合结构域，而与结构域的类型无关。结构域类型的实例包括Fab片段、scFv和sdAb。此外，如果已知的抗HER2抗体或结合结构域的抗原结合部分为Fab，则Fab可以转换为scFv。同样，如果已知的抗HER2抗体或结合结构域的抗原结合部分为scFv，则scFv可以转换为Fab。在抗原结合结构域类型之间转换的方法在本领域已知(参见例如Zhou等(2012)Mol Cancer Ther 11:1167-1476描述的将scFv转换为Fab形式的示例方法。本文描述的方法通过引用并入。)。
本文描述的抗原结合构建体可衍生自与ECD2或ECD4结合的已知抗HER2抗体。如本文其它地方所述，与ECD2或ECD4结合的抗体在本领域已知并且包括例如，2C4或帕妥珠单抗(结合ECD2)、4D5或曲妥珠单抗(结合ECD4)。在本领域中，例如在WO 2011/147982(GenmabA/S)中还已描述了与HER2的ECD2或ECD4结合的其它抗体。
在一些实施方案中，抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体衍生自将抗体4D5或曲妥珠单抗与HER2的ECD4的结合阻断50％或更高的抗体。在一些实施方案中，抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体衍生自将抗体2C4或帕妥珠单抗与HER2的ECD2的结合阻断50％或更高的抗体。在一些实施方案中，抗原结合构建体衍生自将抗体2C4或帕妥珠单抗与HER2的ECD2的结合阻断30％或更高的抗体。
在一个实施方案中，抗原结合多肽构建体衍生自曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的Fab片段。在一个实施方案中，抗原结合多肽衍生自scFv。
在某些实施方案中抗原结合多肽衍生自这些抗体的人源化或嵌合型式。
非人(例如啮齿动物)抗体的“人源化”形式是含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合抗体。对于大部分而言，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自于受者高变区的残基被来自于具有所需特异性、亲和力和容量的非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔子或非人灵长类动物的高变区的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的骨架区(FR)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体可包含在受者抗体中或在供者抗体中并未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个且通常两个可变结构域的绝大部分，其中全部或绝大部分的高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环并且全部或绝大部分的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常为人免疫球蛋白的至少一部分。更多详情，参见Jones等，Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等，Nature 332:323-329(1988)；和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
人源化HER2抗体包括如通过引用明确并入本文的美国专利第5,821,337号的表3中描述的huMAb4D5-l、huMAb4D5-2、huMAb4D5-3、huMAb4D5-4、huMAb4D5-5、huMAb4D5-6、huMAb4D5-7和huMAb4D5-8或曲妥珠单抗美国专利公布第2006/0018899号中描述的人源化520C9(WO93/21319)和20'人源化2C4抗体。
亲和力成熟
在一些实施方案中，使用亲和力成熟由已知的HER2结合抗体衍生抗原结合构建体。
在期望增加抗原结合多肽对其同源抗原的亲和力的情况下，可使用本领域已知的方法增加抗原结合多肽对其抗原的亲和力。在以下参考文献中描述了此类方法的实例：Birtalan等(2008)JMB 377,1518-1528；Gerstner等(2002)JMB 321,851-862；Kelley等(1993)Biochem 32(27),6828-6835；Li等(2010)JBC 285(6),3865-3871，及Vajdos等(2002)JMB 320,415-428。
如下描述了用于HER2抗原结合结构域的亲和力成熟的一种示例性方法。曲妥珠单抗/HER2(PDB代码1N8Z)复合物和帕妥珠单抗/HER2复合物(PDB代码1S78)的结构用于建模。可采用分子动力学(MD)评价WT复合物在水环境中的内在动态性质。平均场和死端排除法连同柔性骨架可用于优化和制备待筛选突变体的模型结构。包装后将为许多特征评分，包括接触密度、碰撞得分(clash score)、疏水性和静电。一般化Born方法将允许对溶剂环境效应的精确建模并计算蛋白质中特定位置突变而改变残基类型之后的自由能差。接触密度和碰撞得分将提供对互补性的量度，这是蛋白质有效包装的关键方面。筛选程序采用以知识为基础的潜力以及依赖成对残基相互作用能的偶合分析方案和熵计算。在下表中总结了已知增强HER2结合的文献突变及其组合。
表A4.对于曲妥珠单抗-HER2体系而言已知增加与HER2的结合的曲妥珠单抗突变。
表A5.对于帕妥珠单抗-HER2体系而言已知增加与HER2的结合的帕妥珠单抗突变。
抗原结合构建体的Fc。
在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体包含Fc，例如二聚Fc。
本文中术语“Fc结构域”或“Fc区”用于定义含恒定区的至少一个部分的免疫球蛋白重链的C端区域。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***，也称为EU指数，如Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD,1991所述。如本文中所用二聚Fc的“Fc多肽”是指形成二聚Fc结构域的两个多肽之一，即包含免疫球蛋白重链的C端恒定区，能够稳定自我缔合的多肽。例如，二聚IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。
Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。CH3结构域包含两个CH3序列，一个来自于二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。CH2结构域包含两个CH2序列，一个来自于二聚Fc的两个Fc多肽中的每一个。
在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面，Fc经或不经一个或多个接头与第一抗原结合构建体和/或第二抗原结合构建体偶合。在一些方面，Fc为人Fc。在一些方面，Fc为人IgG或IgG1Fc。在一些方面，Fc为异二聚体Fc。在一些方面，Fc包含至少一个或两个CH2序列。
在一些方面，Fc包含在至少一个CH3序列中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc包含在至少一个CH2序列中的一个或多个修饰。在一些方面，Fc为单个多肽。在一些方面，Fc为多个多肽，例如两个多肽。
在一些方面，Fc是2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780中描述的Fc，每个专利申请的全部内容据此通过引用整体并入用于所有目的。
经修饰的CH3结构域
在一些方面，本文描述的抗原结合构建体包含异二聚体Fc，其包含已经不对称性修饰的经修饰的CH3结构域。异二聚体Fc可包含两个重链恒定结构域多肽：第一Fc多肽和第二Fc多肽，其可交换使用，只要Fc包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。通常，第一Fc多肽包含第一CH3序列而第二Fc多肽包含第二CH3序列。
包含以不对称方式引入的一个或多个氨基酸修饰的两个CH3序列，当两个CH3序列二聚化时，通常产生异二聚体Fc，而不是同二聚体。如本文中所用，“不对称氨基酸修饰”是指其中第一CH3序列上特定位置的氨基酸不同于第二CH3序列上相同位置的氨基酸，并且第一和第二CH3序列优先配对形成异二聚体，而不是同二聚体的任何修饰。这种异二聚化可能是每个序列上各相同氨基酸位置的两个氨基酸中仅一个修饰；或在第一和第二CH3序列中每一个上各相同位置处每个序列上的两个氨基酸均修饰的结果。异二聚体Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或一个以上不对称氨基酸修饰。
表A提供了人IgG1Fc序列的氨基酸序列，对应于全长人IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人IgG1重链的氨基酸341-447。
通常Fc可包括能够二聚化的两个连续重链序列(A和B)。在一些方面，Fc的一个或两个序列包括在以下位置的一个或多个突变或修饰：L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390，使用EU编号。在一些方面，Fc包括表X所示的突变序列。在一些方面，Fc包括变体1A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体2A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体3A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体4A-B的突变。在一些方面，Fc包括变体5A-B的突变。
表A：IgG1Fc序列
关于全长人IgG1重链的氨基酸231至447，第一和第二CH3序列可包含如本文描述的氨基酸突变。在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T394处具有氨基酸修饰。在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列具有选自L351Y、F405A和Y407V的一个或多个氨基酸修饰，而第二CH3序列具有选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的一个或多个氨基酸修饰。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，并且第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处的氨基酸修饰，而另一CH3序列还包含在位置K360处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，第一或第二CH3序列之一还包含在位置Q347处的氨基酸修饰，而另一个CH3序列还包含在位置K360处的氨基酸修饰，并且所述CH3序列中的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰并且所述第一和第二CH3序列之一还包含D399R或D399K的氨基酸修饰而另一个CH3序列还包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一种或多种。在另一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，所述第一和第二CH3序列之一还包含D399R或D399K的氨基酸修饰而另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一种或多种，并且所述CH3序列中的一个或两个还包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含经修饰的CH3结构域，其第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰，而第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰，其中所述CH3序列中的一个或两个还包含T350V的氨基酸修饰。
在一个实施方案中，异二聚体Fc包含包括以下氨基酸修饰的经修饰的CH3结构域，其中“A”表示对第一CH3序列的氨基酸修饰，而“B”表示对第二CH3序列的氨基酸修饰：A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392M_T394W，A：L351Y_F405A_Y407V，B：T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392L_T394W，A：T350V_L351Y_F405A_Y407V，B：T350V_T366L_K392M_T394W，A：T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V，和/或B：T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
所述一个或多个不对称氨基酸修饰可促进异二聚体Fc的形成，其中异二聚体CH3结构域具有与野生型同二聚体CH3结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中异二聚体Fc结构域具有与野生型同二聚体Fc结构域相当的稳定性。在一个实施方案中，所述一个或多个不对称氨基酸修饰促进异二聚体Fc结构域的形成，其中异二聚体Fc结构域具有在差示扫描量热法研究中经由解链温度(Tm)所观察到的稳定性，并且其中解链温度在对于相应对称野生型同二聚体Fc结构域所观察到的解链温度的4℃以内。在一些方面，Fc包含在至少一个CH3序列中促进具有与野生型同二聚体Fc结构域的相当稳定性的异二聚体Fc形成的一个或多个修饰。
在一个实施方案中，可通过测量CH3结构域的解链温度，例如通过差示扫描量热法(DSC)评估CH3结构域的稳定性。因此，在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约68℃或更高。在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约70℃或更高。在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约72℃或更高。在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约73℃或更高。在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约75℃或更高。在另一个实施方案中，CH3结构域的解链温度为约78℃或更高。在一些方面，二聚化CH3序列的解链温度(Tm)为约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高。
在一些实施方案中，在表达产物中包含经修饰的CH3序列的异二聚体Fc与同二聚体Fc相比可以至少约75％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约80％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约85％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约90％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约95％的纯度形成。在另一个实施方案中，异二聚体Fc可以高于约97％的纯度形成。在一些方面，Fc是在表达时以高于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。在一些方面，Fc是在经由单细胞表达时以高于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体。
在国际专利公布第WO 96/027011号(knobs into holes)中，在Gunasekaran等(Gunasekaran K.等(2010)J Biol Chem.285,19637-46,electrostatic design toachieve selective heterodimerization)中，在Davis等(Davis,JH.等(2010)Prot EngDes Sel；23(4):195-202,strand exchange engineered domain(SEED)technology)中，及在Labrijn等[Efficient generation of stable bispecific IgG1by controlled Fab-arm exchange.Labrijn AF、Meesters JI、de Goeij BE、van den Bremer ET、Neijssen J、van Kampen MD、Strumane K、Verploegen S、Kundu A、Gramer MJ、van Berkel PH、van deWinkel JG、Schuurman J、Parren PW.Proc Natl Acad Sci USA.2013年3月26日；110(13):5145-50中描述了另外的修饰单体Fc多肽以促进异二聚体Fc形成的方法。
CH2结构域
在一些实施方案中，抗原结合构建体的Fc包含CH2结构域。Fc的CH2结构域的一个实例为表A所示序列的氨基酸231-340。几种效应子功能由与抗体的Fc结合的Fc受体(FcR)介导。
术语“Fc受体”和“FcR”用于描述与抗体的Fc区结合的受体。例如，FcR可以是天然序列人FcR。通常，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)并且包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位基因变体和可变剪切形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(抑制受体)，其具有主要在其细胞质结构域上不同的相似氨基酸序列。其它同种型的免疫球蛋白也可被某些FcR结合(参见，例如，Janeway等，ImmunoBiology:the immune system in health and disease，(Elsevier Science Ltd.,NY)(第4版，1999))。活化受体FcγRIIA在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其细胞质结构域中含有免疫受体酪氨酸基抑制基序(ITIM)(在Annu Rev.Immunol.15:203-234(1997)中有评论)。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)；Capel等，Immunomethods 4:25-34(1994)；和de Haas等，J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)中评论了FcR。其它FcR，包括将来鉴定的FcR，均被本文的术语“FcR”所涵盖。该术语还包括新生儿受体，FcRn，其负责母体IgG向胎儿的转移(Guyer等，J.Immunol.117:587(1976)；和Kim等，J.Immunol.24:249(1994))。
CH2结构域中的修饰可影响FcR与Fc的结合。Fc区中的许多氨基酸修饰在本领域中已知选择性地改变Fc对不同Fcγ受体的亲和力。在一些方面，Fc包含促进Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰。
下面列出了改变Fcr与Fc的结合的示例性突变：
S298A/E333A/K334A、S298A/E333A/K334A/K326A(Lu Y、Vernes JM、Chiang N等JImmunol Methods.2011Feb 28；365(1-2):132-41)；
F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L、F243L/R292P/Y300L/L235V/P396L(Stavenhagen JB、Gorlatov S、Tuaillon N等Cancer Res.2007年9月15日；67(18):8882-90；Nordstrom JL、Gorlatov S、Zhang W等Breast Cancer Res.2011年11月30日；13(6):R123)；
F243L(Stewart R、Thom G、Levens M等Protein Eng Des Sel.2011年9月；24(9):671-8.)、S298A/E333A/K334A(Shields RL、Namenuk AK、Hong K等J Biol Chem.2001年3月2日；276(9):6591-604)；
S239D/I332E/A330L,S239D/I332E(Lazar GA、Dang W、Karki S等Proc Natl AcadSci USA.2006年3月14日；103(11):4005-10)；
S239D/S267E、S267E/L328F(Chu SY、Vostiar I、Karki S等Mol Immunol.2008年9月；45(15):3926-33)；
S239D/D265S/S298A/I332E、S239E/S298A/K326A/A327H、G237F/S298A/A330L/I332E、S239D/I332E/S298A、S239D/K326E/A330L/I332E/S298A、G236A/S239D/D270L/I332E、S239E/S267E/H268D、L234F/S267E/N325L、G237F/V266L/S267D和通过引用并入本文的WO2011/120134和WO2011/120135中所列的其它突变。Therapeutic AntibodyEngineering(William R.Strohl和Lila M.Strohl，2012年10月在Biomedicine No 11，ISBN 1 907568 37 9中的Woodhead Pu blishing系列)在第283页列出了突变。
在一些实施方案中本文描述的抗原结合构建体包含结合抗原的抗原结合多肽构建体；和二聚Fc，其具有优良生物物理性质如稳定性并且相对于不包括相同二聚Fc的抗原结合构建体易于生产。在一些实施方案中CH2结构域包含一个或多个不对称氨基酸修饰。在国际专利申请第PCT/CA2014/050507号中描述了示例性不对称突变。
改善效应子功能的附加修饰。
在一些实施方案中本文描述的抗原结合构建体包括改善其介导效应子功能的能力的修饰。此类修饰在本领域已知并且包括无岩藻糖基化或Fc针对活化受体的亲和力的工程化，对于ADCC而言主要是FCGR3a，且对于CDC而言是针对C1q。下表B总结了文献中对于效应子功能工程化而报道的各种设计。
生成在Fc糖基化位点上(Asn 297EU编号)具有很少或没有岩藻糖的抗原结合构建体，而不改变氨基酸序列的方法在本领域已知。技术(ProBioGen AG)是基于引入使岩藻糖生物合成的细胞途径偏向用于抗原结合构建体生成的细胞的酶的基因。这样通过生成抗原结合构建体的细胞防止向N-连接的抗体碳水化合物部分添加糖“岩藻糖”。(vonHorsten等(2010)Glycobiology.2010年12月；20(12):1607-18。获得岩藻糖基化水平降低的抗原结合构建体的另一种方法可以在美国专利8,409,572中找到，其教示选择用于抗原结合构建体生成的细胞系的抗原结合构建体上产生更低岩藻糖基化水平的能力。抗原结合构建体可完全无岩藻糖基化(意味着其不含可检测的岩藻糖)或其可部分无岩藻糖基化，意味着分离的抗体含有对于由哺乳动物表达***生成的类似抗体通常所检测到的岩藻糖量的不到95％、不到85％、不到75％、不到65％、不到55％、不到45％、不到35％、不到25％、不到15％或不到5％。
因此，在一个实施方案中，本文描述的构建体可包括二聚Fc，其包含如表B中指出的赋予改善的效应子功能的一个或多个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，构建体可无岩藻糖基化以改善效应子功能。
表B：CH2结构域和效应子功能工程化。
减少FcγR和/或补体结合和/或效应子功能的Fc修饰在本领域已知。近期出版物描述了已用于工程化效应子活性降低或沉默的抗体的策略(参见Strohl,WR(2009)，CurrOpin Biotech 20:685-691，和Strohl,WR和Strohl LM,在Therapeutic AntibodyEngineering中的“Antibody Fc engineering for optimal antibody performance”，Cambridge:Woodhead Publishing(2012)，第225-249页)。这些策略包括通过糖基化的修饰、使用IgG2/IgG4骨架或在Fc的铰链或CH2区引入突变而降低效应子功能。例如，美国专利公布第2011/0212087号(Strohl)、国际专利公布第WO 2006/105338号(Xencor)、美国专利公布第2012/0225058号(Xencor)、美国专利公布第2012/0251531号(Genentech)和Strop等((2012)J.Mol.Biol.420:204-219)描述了减少FcγR或补体与Fc结合的特异性修饰。
减少FcγR或补体与Fc结合的已知氨基酸修饰的具体、非限制性实例包括下表中标识的那些：
表C：减少FcγR或补体与Fc结合的修饰
公司 突变
GSK N297A
Ortho Biotech L234A/L235A
Protein Design labs IGG2 V234A/G237A
Wellcome Labs IGG4 L235A/G237A/E318A
GSK IGG4 S228P/L236E
Alexion IGG2/IGG4组合
Merck IGG2H268Q/V309L/A330S/A331S
Bristol-Myers C220S/C226S/C229S/P238S
Seattle Genetics C226S/C229S/E3233P/L235V/L235A
Amgen 大肠杆菌(E.coli)生成，非糖基化
Medimune L234F/L235E/P331S
Trubion 铰链突变体，可能是C226S/P230S
在一个实施方案中，Fc包含上表所标识的至少一个氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含L234、L235或D265中至少一个的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含在L234、L235和D265处的氨基酸修饰。在另一个实施方案中，Fc包含氨基酸修饰L234A、L235A和D265S。
接头和接头多肽
抗原结合构建体的每一个抗原结合多肽构建体与接头多肽可操作地连接，其中所述接头多肽能够相互形成共价键。包含第一和第二抗原结合多肽构建体及接头多肽的抗原结合构建体的空间构象与通过木瓜蛋白酶消化生成的F(ab’)2片段的互补位的相对空间构象类似，虽然在本文描述的双特异性抗原结合构建体的情况下，两个抗原结合多肽构建体呈Fab-scFv或scFv-scFv形式。
因此，选择接头多肽使其保持F(ab’)片段的互补位的相对空间构象，并且能够形成与IgG核心铰链中的二硫键等效的共价键。合适的接头多肽包括IgG铰链区，例如来自于IgG1、IgG2或IgG4的铰链区。也可以使用这些示例性接头的经修饰型式。例如，在本领域中已知提高IgG4铰链稳定性的修饰(参见例如，Labrijn等(2009)Nature Biotechnology 27,767-771)。
在一个实施方案中，接头多肽与此处描述的骨架，例如Fc可操作地连接。在一些方面，Fc经一个或多个接头与所述一个或多个抗原结合多肽构建体偶合。在一些方面，Fc通过接头与每个抗原结合多肽的重链偶合。
在其它实施方案中，接头多肽与除Fc以外的骨架可操作地连接。许多替代性蛋白质或分子结构域在本领域已知并且可用于形成两个不同抗原结合多肽的选择性配对。实例为亮氨酸拉链结构域如一起选择性配对的Fos和Jun[S A Kostelny、M S Cole和J YTso.Formation of a bispecific antibody by the use of leucine zippers.JImmunol 1992148:1547-53；Bemd J.Wranik、Erin L.Christensen、Gabriele Schaefer、Janet K.Jackman、Andrew C.Vendel和Dan Eaton.LUZ-Y,a Novel Platform for theMammalian Cell Production of Full-length IgG-bispecificAntibodiesJ.Biol.Chem.2012 287:43331-43339]。可选地，也可以采用其它选择性配对分子对如芽胞杆菌RNA酶抑制剂(barnase barstar)对[Deyev,S.M.、Waibel,R.、Lebedenko,E.N.、Schubiger,A.P.和Plückthun,A.(2003).Design of multivalent complexes usingthe barnase*barstar module.Nat Biotechnol 21,1486-1492]、DNA链对[ZahidaN.Chaudri、Michael Bartlet-Jones、George Panayotou、Thomas Klonisch、IvanM.Roitt、Torben Lund、Peter J.Delves，Dual specificity antibodies using adouble-stranded oligonucleotide bridge，FEBS Letters，第450卷，1-2期，1999年4月30日，第23-26页]、脱落荧光蛋白对[Ulrich Brinkmann,Alexander Haas.Fluorescentantibody fusion protein,its production and use，WO 2011135040A1]。
解离常数(K D )和最大结合量(Bmax)
在一些实施方案中，通过功能特征，包括但不限于解离常数和最大结合量描述抗原结合构建体。
如本文中所用的术语“解离常数(KD)”意在指特定配体-蛋白质相互作用的平衡解离常数。如本文中所用，配体-蛋白质相互作用是指，但不限于蛋白质-蛋白质相互作用或抗体-抗原相互作用。KD量度两种蛋白质(例如AB)可逆地解离成较小组分(A+B)的倾向，并且定义为解离速率(也称为“分离速率(koff)”)与缔合速率(或“结合速率(kon)”)之比。因此，KD等于koff/kon并且表示为摩尔浓度(M)。由此断定KD越小，结合亲和力越强。因此，1mM的KD指示与1nM的KD相比较弱的结合亲和力。可使用本领域完善的方法测定抗原结合构建体的KD值。一种测定抗原结合构建体KD的方法是通过使用表面等离子体共振(SPR)，通常使用生物传感***如***。等温滴定量热法(ITC)是另一种可以用于测定的方法。
可通过各种技术测定抗原结合构建体的结合特征。其中一种是通过流式细胞术(FACS，荧光活化细胞分选)测量与表达抗原的靶细胞的结合。通常，在此类实验中，使表达目标抗原的靶细胞与抗原结合构建体在不同浓度下温育，洗涤，与用于检测抗原结合构建体的辅助试剂温育，洗涤并且在流式细胞仪中分析以测量表示细胞上检测信号的强度的中位荧光强度(MFI)，检测信号的强度又和与细胞结合的抗原结合构建体的数量有关。然后将抗原结合构建体浓度与MFI数据拟合到饱和结合方程式中以得到两个关键结合参数，Bmax和表观KD。
表观KD或表观平衡解离常数，表示观察到半最大细胞结合量时的抗原结合构建体浓度。显然，KD值越小，达到最大细胞结合量所需的抗原结合构建体浓度越小并且因此抗原结合构建体的亲和力越高。表观KD取决于细胞结合实验的条件，如在细胞上表达的不同受体水平和温育条件，并且因此表观KD通常不同于由无细胞分子实验如SPR和ITC测定的KD值。然而，在不同方法之间通常存在良好的一致性。
术语“Bmax”或最大结合量，是指在抗原结合构建体的饱和浓度下细胞上的最高抗原结合构建体结合水平。该参数为了相对比较可以按任意单位MFI报道，或借助于标准曲线转化成对应于和细胞结合的抗原结合构建体的数量的绝对值。在一些实施方案中，抗原结合构建体展示出为参考抗原结合构建体的Bmax的1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2.0倍的Bmax。
对于本文描述的抗原结合构建体而言，Bmax与FSA最明确的分离发生在饱和浓度下和其中Bmax不能再随FSA增加时。在非饱和浓度下显著性较低。在一个实施方案中与参考抗原结合构建体相比所述抗原结合构建体的Bmax和KD的增加不依赖靶细胞上的靶抗原表达水平。
在一些实施方案中本文描述了分离的抗原结合构建体，其中所述抗原结合构建体与相应参考抗原结合构建体相比在对于表达所述抗原的靶细胞的Bmax(最大结合量)方面展示出增加。在一些实施方案中所述Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约125％。在某些实施方案中，Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约150％。在一些实施方案中，Bmax的增加是相应参考抗原结合构建体的Bmax的至少约200％。在一些实施方案中，Bmax的增加高于相应参考抗原结合构建体的Bmax的约110％。
增强的效应子功能
在一个实施方案中，本文描述的双特异性抗原结合构建体与每种相应的单特异性二价抗原结合构建体相比(即，和与ECD2结合的单特异性二价抗原结合构建体或与ECD4结合的单特异性二价抗原结合构建体相比)和/或与两种单特异性二价抗原结合构建体的组合相比展示出增强的效应子功能。抗体“效应子功能”是指可归因于抗体Fc结构域(天然序列Fc结构域或氨基酸序列变体Fc结构域)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
ADCC
因此，在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在表达1+水平的HER2的细胞中展示出比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结合构建体更高的效力。
在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在ADCC测定中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体更高的最大限度细胞裂解作用。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物，或曲妥珠单抗或帕妥珠单抗类似物组合的参考抗原结合构建体更高的最大限度细胞裂解作用。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在表达1+或更高水平的HER2的细胞中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体更高的最大限度细胞裂解作用。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在ADCC测定中在HER22+/3+细胞中展示出比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体更高的效力。
内化
本文描述的双特异性抗原结合构建体通过与受体HER2结合内化于HER2+细胞中。因此，本文描述的双特异性抗原结合构建体能够诱导在HER2+细胞中的受体内化。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在表达3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结合构建体更强的HER2内化。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈Fab-scFv形式并且在表达2+或3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结合构建体更强的HER2内化。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体呈scFv-scFv形式并且在表达1+、2+或3+水平的HER2的细胞中诱导比呈Fab-Fab形式的形式参考抗原结合构建体更强的HER2内化。
细胞毒性
双特异性抗原结合构建体可如本文其它地方所述制备成ADC并且对细胞有毒性。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体ADC在细胞毒性或细胞存活测定中在HER2+乳腺癌细胞中比为曲妥珠单抗或其类似物的参考抗原结合构建体，或在HER2 1+、2+、2+/3+或3+细胞中比为T-DM1和帕妥珠单抗的组合的参考抗原结合构建体展示出更高的效力。
对FcγR增加的结合能力
在一些实施方案中，双特异性抗原结合构建体对一种或多种FcγR表现出更高的结合能力(Rmax)。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在对一种或多种FcγR的Rmax上表现出高于为v506或v6246，具有同二聚体Fc的参考抗原结合构建体约1.3至2倍之间的增加。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在对CD16FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体约1.3至1.8倍之间的增加。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在对CD32FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体约1.3至1.8倍之间的增加。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体在对CD64FcγR的Rmax上表现出高于参考二价抗原结合构建体约1.3至1.8倍之间的增加。
对FcγR增强的亲和力
本文提供的双特异性抗原结合构建体与参考抗原结合构建体如曲妥珠单抗相比对FcγR具有增强的亲和力。由结合引起的Fc浓度增加与增强的ADCC和/或其它免疫效应子杀伤机制一致。
在一些实施方案中，双特异性抗原结合构建体对一种或多种FcγR表现出增强的亲和力。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体包含与HER2结合的抗原结合多肽时，双特异性抗原结合构建体对至少一种FcγR表现出增强的亲和力。与该实施方案一致，双特异性抗原结合构建体对CD32表现出增强的亲和力。
FcRn结合和PK参数
在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体能够结合FcRn。正如本领域中已知，与FcRn的结合使内吞抗体从内体循环回到血流中(Raghavan等，1996，Annu Rev CellDev Biol 12:181-220；Ghetie等，2000，Annu Rev Immunol 18:739-766)。这个过程，加上由于全长分子的大尺寸引起的妨碍肾过滤，产生范围为1至3周的有利抗体血清半衰期。Fc与FcRn的结合在抗体运输方面也起关键作用。
药代动力学参数
在某些实施方案中，本文提供的双特异性抗原结合构建体表现出与市场上可买到的治疗性抗体相当的药代动力学(PK)性质。在一个实施方案中，就血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL而言，本文描述的双特异性抗原结合构建体表现出与已知治疗性抗体类似的PK性质。在一个实施方案中，双特异性抗原结合构建体表现出比得上或高于所述单特异性二价抗原结合构建体的体内稳定性。此类体内稳定性参数包括血清浓度、t1/2、β半衰期和/或CL。
双特异性抗原结合构建体的测试。FcγR、FcRn和C1q结合
双特异性抗原结合构建体的效应子功能可如下测试。可进行体外和/或体内细胞毒性测定以评估ADCP、CDC和/或ADCC活性。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定以测量FcγR结合。介导ADCC的原代细胞，NK细胞，仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。在Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9:457-92(1991)第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。在美国专利第5,500,362或5,821,337号中描述了评估目标分子的ADCC活性的体外测定的实例。用于此类测定的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选地或另外，可以在体内，例如在诸如Clynes等PNAS(USA)95:652-656(1998)公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。也可进行C1q结合测定以确定双特异性抗原结合构建体是否能够结合C1q并因此激活CDC。为评估补体活化，可进行CDC测定，例如，如Gazzano-Santoro等，J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。也可以使用本领域公知的方法进行抗体的FcRn结合(如通过SPR)和体内PK测定。
抗原结合构建体的测试：HER2结合
在体外测试本文描述的抗原结合构建体或药物组合物，然后在人中使用之前，在体内测试其所需的治疗或预防活性。例如，证明化合物或药物组合物的治疗或预防实用性的体外测定包括化合物对细胞系或患者组织样品的影响。化合物或组合物对细胞系和/或组织样品的影响可以利用本领域技术人员已知的技术测定，包括但不限于玫瑰花形成测定(rosette formation assay)和细胞裂解测定。根据本发明，可用于确定是否指示施用特异性抗原结合构建体的体外测定包括体外细胞培养测定，或其中患者组织样品在培养中生长，暴露于或以其它方式施用抗原结合构建体的体外测定，并且观察到此类抗原结合构建体对组织样品的影响。
可使用表达HER2的细胞，例如乳腺癌细胞系测定候选抗原结合构建体。下面表D描述了在几种代表性癌细胞系中HER2的表达水平。
表D-在目标细胞系中HER2的相对表达水平
McDonagh等Mol Cancer Ther.2012年3月；11(3):582-93；Subik等(2010)BreastCancer:Basic Clinical Research:4；35-41；Carter等PNAS，1994:89；4285-4289；Yarden2000，HER2:Basic Research,Prognosis and Therapy；Hendricks等Mol Cancer Ther2013；12:1816-28。
正如本领域已知，可采用许多测定以便鉴定适合用于本文描述的方法的抗原结合构建体。这些测定可在表达HER2的癌细胞中进行。表A5中鉴定了合适的癌细胞的实例。如下描述了可进行的测定的实例。
例如，为鉴定结合HER2的生长抑制性候选抗原结合构建体，可筛选抑制表达HER2的癌细胞的生长的抗体。在一个实施方案中，所选候选抗原结合构建体与对照抗原结合构建体相比能够抑制细胞培养中的癌细胞的生长约20-100％并且优选约50-100％。
为选择诱导细胞死亡的候选抗原结合构建体，可相对于对照评估由例如PI(磷脂酰肌醇)、锥虫蓝或7AAD摄取量指示的膜完整性丧失。
为了选择诱导凋亡的候选抗原结合构建体，可采用膜联蛋白(annexin)结合测定。除膜联蛋白结合测定外，也可使用DNA染色测定。
在一个实施方案中，如同在免疫共沉淀实验中所测定的那样，目标候选抗原结合构建体可比单克隆抗体4D5大体上更有效地，并且优选比单克隆抗体7F3大体上更有效地阻断在MCF7和SK-BR-3细胞中ErbB2与ErbB3的调蛋白依赖性缔合。
为筛选与被目标抗体结合的ErbB2上的表位结合的抗原结合构建体，可进行诸如Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory，Harlow和DavidLane编辑(1988)中描述的常规交叉阻断测定。可选地或另外，可通过本领域已知的方法进行表位作图。
可通过其中受验抗原结合构建体抑制或阻断参考抗原结合构建体与共同抗原的特异性结合的测定来确定抗原结合构建体之间的竞争(参见，例如，Junghans等，CancerRes.50:1495,1990；Fendly等Cancer Research 50:1550-1558；US 6,949,245)。如在竞争结合测定中所测量的，如果过量的测试抗原结合构建体(例如，至少2倍、5倍、10倍、20倍或100倍)抑制或阻断参考抗原结合构建体的结合例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％，则测试抗原结合构建体与参考抗原结合构建体竞争。通过竞争测定鉴定的抗原结合构建体(竞争性抗原结合构建体)包括与和参考抗原结合构建体相同的表位结合的抗原结合构建体及与足够靠近被参考抗原结合构建体结合的表位的相邻表位结合而发生位阻的抗原结合构建体。例如，可以鉴定与本文描述的第一抗原结合构建体竞争与HER2结合的第二竞争性抗原结合构建体。在某些情况下，在竞争结合测定中所测量的，第二构建体可阻断或抑制第一构建体的结合，例如至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在某些情况下，第二构建体可置换第一构建体高于50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方案中，测定本文描述的抗原结合构建体在体内，例如在动物模型中的功能。在一些实施方案中，动物模型是表E中描述的动物模型。在一些实施方案中，所述抗原结合构建体与参考抗原结合构建体相比在动物模型中表现出治疗功效方面的增强。
表E：用于测试HER2结合抗原结合构建体的动物模型
参考抗原结合构建体
在一些实施方案中，将本文描述的双特异性抗原结合构建体的功能特征与参考抗原结合构建体的功能特征做比较。参考抗原结合构建体的特性取决于测量的功能特征或产生的区别。例如，在比较示例性双特异性抗原结合构建体的功能特征时，参考抗原结合构建体可为曲妥珠单抗类似物，例如v506，或可为抗体如曲妥珠单抗和帕妥珠单抗的组合(v4184)。在比较双特异性抗原结合构建体的形式的实施方案中，参考抗原结合构建体为，例如双互补位抗HER2抗体，其中两个抗原结合部分均呈Fab-Fab形式(形式参考抗原结合构建体)。后一种构建体的实例包括v6902和v6903。
抗原结合构建体和抗体药物偶联物(ADC)
在某些实施方案中抗原结合构建体与药物，例如毒素、化疗剂、免疫调节剂或放射性同位素偶联。在本领域中已知几种制备ADC(抗体药物偶联物或抗原结合构建体药物偶联物)的方法并且例如在美国专利8,624,003(一锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中有描述。
在一些实施方案中，所述药物选自美登素、澳瑞他汀(auristatin)、卡奇霉素(calicheamicin)或其衍生物。在其它实施方案中，所述药物是选自DM1和DM4的美登素。下面描述了更多实例。
在一些实施方案中，所述药物经SMCC接头(DM1)或SPDB接头(DM4)与分离的抗原结合构建体偶联。下面描述了另外的实例。药物:抗原结合蛋白比率(DAR)可为1.0至6.0或3.0至5.0或3.5-4.2。
在一些实施方案中，抗原结合构建体与细胞毒性剂偶联。如本文中所用的术语“细胞毒性剂”是指抑制或妨碍细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu177)、化疗剂及毒素如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段和/或变体。下面描述了更多实例。
药物
在ADC的各个实施方案中使用的药物或有效负载的非限制性实例包括DM1(美登素，N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-或N2'-脱乙酰基-N2'-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素)、mc-MMAD(6-马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀-D或N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-2-甲氧基-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-[[(1S)-2-苯基-1-(2-噻唑基)乙基]氨基]丙基]-1-吡咯烷基]-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-(9C1)-L-缬氨酰胺)、mc-MMAF(马来酰亚胺己酰基-单甲基澳瑞他汀F或N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧代-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-N-甲基-L-缬氨酰-L-缬氨酰-(3R,4S,5S)-3-甲氧基-5-甲基-4-(甲氨基)庚酰-(αR,βR,2S)-[β-甲氧基-α-甲基-2-吡咯烷丙酰基-L-苯丙氨酸)和mc-Val-Cit-PABA-MMAE(6-马来酰亚胺己酰基-ValcCit-(对氨基苄氧基羰基)-单甲基澳瑞他汀E或N-[[[4-[[N-[6-(2,5-二氢-2,5-二氧-1H-吡咯-1-基)-1-氧代己基]-L-缬氨酰-N5-(氨基羰基)-L-鸟氨酰]氨基]苯基]甲氧基]羰基]-N-甲基-L-缬氨酰-N-[(1S,2R)-4-[(2S)-2-[(1R,2R)-3-[[(1R,2S)-2-羟基-1-甲基-2-苯乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]-1-吡咯烷基]-2-甲氧基-1-[(1S)-1-甲基丙基]-4-氧代丁基]-N-甲基-L-缬氨酰胺)。DM1是微管蛋白抑制剂美登素的衍生物，而MMAD、MMAE和MMAF是澳瑞他汀衍生物。
美登木素(Maytansinoid)药物部分
如上所示，在一些实施方案中所述药物为美登素。示例性美登木素包括DM1、DM3(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-巯基-1-氧代戊基)美登素)和DM4(N2'-脱乙酰基-N2'-(4-甲基-4-巯基-l-氧代戊基)甲基美登素)(参见US20090202536)。
已知美登素化合物上的许多位置根据连接的类型可用作连接位置。例如，为了形成酯键，具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置全部适合。
对于本文描述的ADC考虑到了美登木素(maytansinoid)药物部分的所有立体异构体，即在D手性碳上的R和S构型的任何组合。
澳瑞他汀
在一些实施方案中，所述药物为澳瑞他汀，如澳瑞他汀E(在本领域中也称为尾海兔素-10(dolastatin-10)的衍生物)或其衍生物。澳瑞他汀可以是，例如，澳瑞他汀E和酮酸之间形成的酯。例如，澳瑞他汀E可与对乙酰苯甲酸或苯甲酰戊酸反应分别生成AEB和AEVB。其它典型澳瑞他汀包括AFP、MMAF和MMAE。在美国专利第6,884,869、7,098,308、7,256,257、7,423,116、7,498,298和7,745,394中公开了示例性澳瑞他汀的合成和结构，所述每个专利通过引用整体并入本文并用于所有目的。
化疗剂
在一些实施方案中，抗原结合构建体与化疗剂偶联。实例包括但不限于顺铂(Cisplantin)和拉帕替尼(Lapatinib)。“化疗剂”是用于癌症治疗的化学化合物。
化疗剂的实例包括烷化剂如噻替派(thiotepa)和环磷酰胺(CYTOXANTM)；磺酸烷基酯类如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridine)如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙烯亚胺类和甲基蜜胺类(methylamelamines),包括六甲蜜胺、三亚乙基蜜胺、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲基蜜胺；氮芥类，如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷酰胺、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、氧化氮芥盐酸盐(mechlorethamine oxidehydrochloride)、美法仑(melphalan)、新恩比兴(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；硝基脲类(nitrosureas)，如卡莫司汀(carmustine)、氯脲霉素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、卡奇霉素、卡拉比星(carabicin)、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycin)、麦考酚酸、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑霉素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺素药，如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(elfornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK7；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2'＝-三氯三乙胺；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴溱(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷类，例如紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology,Princeton,N.J.)和多西他赛(Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂(carboplatin)；长春花碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱(vincristine)；长春瑞滨(vinorelbine)；诺维苯(navelbine)；能灭瘤(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔红霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓朴异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；维甲酸；埃斯培拉霉素(esperamicin)；卡培他滨(capecitabine)；及以上任何烷化剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。在本定义中还包括起调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗***药，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、盐酸雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素药，如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；及以上任何试剂的药学上可接受的盐、酸或衍生物。
偶联接头
在一些实施方案中，所述药物通过接头与抗原结合构建体，例如抗体连接。接头与抗体的连接可按多种方式实现，例如通过表面赖氨酸、与氧化碳水化合物的还原偶合及通过还原链间二硫键释放的半胱氨酸残基。在本领域中已知多种ADC连接***，包括腙键、二硫键和肽基键。
合适的接头包括，例如，可裂解和不可裂解的接头。可裂解接头通常对在细胞内条件下的裂解敏感。合适的可裂解接头包括，例如，可被细胞内蛋白酶，如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶裂解的肽接头。在示例性实施方案中，接头可为二肽接头，如缬氨酸-瓜氨酸(val-cit)、苯丙氨酸-赖氨酸(phe-lys)接头，或马来酰亚胺己酸-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苄氧羰基(mc-Val-Cit-PABA)接头。另一种接头是4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸磺基琥珀酰亚胺酯(SMCC)。磺基-smcc偶联经由与巯基(硫醇，-SH)反应的马来酰亚胺基团发生，而其磺基-NHS酯对伯胺有反应性(正如在赖氨酸和蛋白质或肽N-端发现的那样)。再一种接头是马来酰亚胺己酰基(MC)。其它合适的接头包括在特定pH或pH范围可水解的接头，如腙接头。另外合适的接头包括二硫化物接头。所述接头可与抗体共价结合达到使得抗体必须在细胞内降解才能释放药物的程度，例如MC接头等。
ADC的制备
ADC可通过几种途径，采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂制备，包括：(1)抗体的亲核基团或亲电子基团与二价接头试剂反应，经由共价键形成抗体-接头中间产物Ab-L，接着是与活化药物部分D的反应；和(2)药物部分的亲核基团或亲电子基团与接头试剂反应，经由共价键形成药物-接头中间产物D-L，接着是与抗体的亲核基团或亲电子基团的反应。偶联方法(1)和(2)可与多种抗体、药物部分和接头一起用于制备此处描述的抗体-药物偶联物。
在本领域中已知制备ADC的方法的几个具体实例并且在美国专利8,624,003(一锅法)、8,163,888(一步法)和5,208,020(两步法)中有描述。
抗原结合构建体的制备方法
本文描述的抗原结合构建体可使用，例如美国专利第4,816,567号中描述的重组方法和组合物生成。
在一个实施方案中，提供了编码本文描述的抗原结合构建体的分离核酸。此类核酸可编码组成抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和/或组成抗原结合构建体的VH的氨基酸序列(例如，抗原结合构建体的轻链和/或重链)。在另一个实施方案中，提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如，表达载体)。在一个实施方案中，在多顺反子载体中提供核酸。在另一个实施方案中，提供了包含此类核酸的宿主细胞。在一个此类实施方案中，宿主细胞包含(例如，已经被以下载体转化)：(1)包含编码组成抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和组成抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码组成抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码组成抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中，宿主细胞为真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗原结合构建体的方法，其中所述方法包括在适于表达抗原结合构建体的条件下培养如以上所提供的包含编码抗原结合构建体的核酸的宿主细胞，并且任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收抗原结合构建体。
为了抗原结合构建体的重组生产，分离(例如)如上所述的编码抗原结合构建体的核酸并***一个或多个载体中以供进一步在宿主细胞中克隆和/或表达。此类核酸可容易地分离并使用常规程序测序(例如，通过使用能够与编码抗原结合构建体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。
术语“大体上纯的”是指本文描述的构建体，或其变体可大体上或基本上没有如同在其自然发生环境中所发现的那样通常伴随蛋白质或与蛋白质相互作用的组分，即在某些实施方案中大体上没有细胞物质的天然细胞，或在重组产生的异源多聚体情况下的宿主细胞包括具有少于约30％、少于约25％、少于约20％、少于约15％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当异源多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中蛋白质按细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或更少存在。当异源多聚体或其变体由宿主细胞重组产生时，在某些实施方案中蛋白质按细胞干重的约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更低存在于培养基中。在某些实施方案中，正如通过适当方法如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳所测定那样，通过本文描述的方法生成的“大体上纯的”异源多聚体具有至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特别地，至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更具体地，至少约90％的纯度水平，至少约95％的纯度水平，至少约99％或更高的纯度水平。
适于克隆或表达编码抗原结合构建体的载体的宿主细胞包括本文描述的原核或真核细胞。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包括外源性多核苷酸的细胞，与用于***的方法无关，例如，直接摄取、转导、f-交配或本领域中已知产生重组宿主细胞的其它方法。外源性多核苷酸可保持为非整合载体，例如，质粒，或可选地，可整合到宿主基因组中。
如本文中所用，术语“真核生物”是指属于真核种系发生域的生物体，如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子目、原生生物等。
如本文中所用，术语“原核生物”是指原核生物体。例如，非真核生物可属于真细菌类(Eubacteria)(包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)种系发生域或古生菌类(Archaea)(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacteriumthermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(如沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌NRC-1)、闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcusfuriosus)、超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热古菌(Aeuropyrum pemix)等)种系发生域。
例如，尤其是当不需要糖基化和Fc效应子功能时，可在细菌中产生抗原结合构建体。对于抗原结合构建体片段和多肽在细菌中的表达，参见，例如美国专利第5,648,237、5,789,199和5,840,523号。(还参见Charlton，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,编辑，Humana Press,Totowa,N.J.,2003)，第245-254页，其描述了抗体片段在大肠杆菌(E.coli)中的表达。表达后，可从细菌细胞浆的可溶性成分中分离出抗原结合构建体并且可进一步纯化。
除原核生物外，真核微生物如丝状真菌或酵母是适合的编码抗原结合构建体的载体的克隆或表达宿主，包括糖基化途径已经“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的抗原结合构建体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross，Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)，和Li等，Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适合的表达糖基化抗原结合构建体的宿主细胞也衍生自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可连同昆虫细胞一起，特别用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞转染的许多杆状病毒菌株。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见，例如，美国专利第5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429号(描述了用于在转基因植物中产生抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如，适应于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能有用。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例为SV40转化的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(例如，在Graham等，J.Gen Virol.36:59(1977)中描述的293或293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠塞尔托利细胞(例如，在Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980)中描述的TM4细胞)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人***细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞(例如，在Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述)；MRC 5细胞；和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；和骨髓瘤细胞系如Y0、NS0和Sp2/0。适于抗原结合构建体产生的某些哺乳动物细胞系的综述，参见，例如，Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo,编辑，Humana Press,Totowa,N.J.)，第255-268页(2003)。
在一个实施方案中，本文描述的抗原结合构建体在稳定哺乳动物细胞中，通过包括以下步骤的方法测试：按预定比率，用编码抗原结合构建体的核酸转染至少一个稳定哺乳动物细胞；并且在所述至少一种哺乳动物细胞中表达核酸。在一些实施方案中，在瞬时转染实验中测定核酸的预定比率以确定在表达产物中产生最高百分比的抗原结合构建体的输入核酸的相对比率。
在一些实施方案中是在如本文描述的稳定哺乳动物细胞中测试抗原结合构建体的方法，其中所述至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含与单体重链或轻链多肽或其它抗体相比较大百分比的所需糖基化抗原结合构建体。
在一些实施方案中是在本文描述的稳定哺乳动物细胞中产生糖基化抗原结合构建体的方法，所述方法包括鉴定并纯化所需糖基化抗原结合构建体。在一些实施方案中，所述鉴定是通过液相色谱法和质谱法中的一种或两种进行。
若需要，可以在表达之后纯化或分离抗原结合构建体。可按本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化蛋白质。标准的纯化方法包括色谱技术，包括离子交换、疏水相互作用、亲和力、分级或凝胶过滤及反相色谱法，在大气压力或高压下使用诸如FPLC和HPLC等***进行。纯化方法还包括电泳、免疫学、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术，连同蛋白质浓缩，也有用。正如本领域所公知，多种天然蛋白质结合Fc和抗体，并且这些蛋白质可用于本发明中用于纯化抗原结合构建体。例如，细菌蛋白质A和G与Fc区结合。同样，细菌蛋白质L与一些抗体的Fab区结合。常常可以通过特定融合伴侣使纯化成为可能。例如，如果采用GST融合，则可以使用谷胱甘肽树脂纯化抗体，如果采用His-标签，则可以使用Ni+2亲和色谱法纯化抗体，或者如果使用flag-标签，则可以使用固定抗flag抗体纯化抗体。合适的纯化技术的通用指南，参见，例如通过引用整体并入的Protein Purification:Principlesand Practice第3版，Scopes,Springer-Verlag,NY,1994，其通过引用整体并入。必要的纯化程度将根据抗原结合构建体的用途而改变。在一些实施方案中，不必纯化。
在某些实施方案中，使用阴离子交换色谱法纯化抗原结合构建体，包括但不限于在Q-琼脂糖、DEAE琼脂糖、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、ToyopearlDEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上的色谱法。
在具体实施方案中使用阳离子交换色谱法纯化本文描述的蛋白质，包括但不限于SP-琼脂糖、CM琼脂糖、poros HS、poros CM、Toyopearl SP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱及其等效方案和同等方案。
另外，可使用本领域已知的技术化学合成本文描述的抗原结合构建体(例如，参见Creighton，1983，Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y和Hunkapiller等，Nature,310:105-111(1984))。例如，可通过使用肽合成仪合成对应于多肽片段的多肽。此外，若需要，可向多肽序列引入非经典氨基酸或氨基酸化学类似物作为取代或添加。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、g-Abu、e-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、□-丙氨酸、氟代-氨基酸、设计师氨基酸如□-甲基氨基酸、C□-甲基氨基酸、N□-甲基氨基酸及通常的氨基酸类似物。此外，氨基酸可为D(右旋性)或L(左旋性)。
翻译后修饰：
在某些实施方案中本文描述的抗原结合构建体在翻译期间或之后经差异化修饰。
术语“修饰”，如本文中所用，是指对指定多肽所做的任何变化，如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的变化、共翻译修饰或翻译后修饰的变化。形式“(修饰)”的术语意指所讨论的多肽经任选地修饰，即，讨论的多肽可经修饰或未修饰。
术语“翻译后修饰”是指在天然或非天然氨基酸已经并入多肽链之后对此类氨基酸发生的任何修饰。仅举例而言，该术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(如在无细胞翻译***中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
在一些实施方案中，修饰是以下的至少一种：糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封端基团的衍生化、溶蛋白性裂解及与抗体分子或抗原结合构建体或其它细胞配体的连接。在一些实施方案中，通过已知技术化学修饰抗原结合构建体，包括但不限于用溴化氰、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4进行特异性化学裂解；乙酰化、甲酰化、氧化、还原及在衣霉素存在下的代谢合成。
本文描述的抗原结合构建体另外的翻译后修饰包括，例如，N-连接或O-连接碳水化合物链、N-端或C-端的加工)、化学部分与氨基酸骨架的连接、N-连接或O-连接碳水化合物链的化学修饰及由于原核宿主细胞表达引起的N-端蛋氨酸残基的添加或缺失。本文描述的抗原结合构建体经可检测标记，如酶、荧光、同位素或亲和力标记修饰以允许检测和分离蛋白质。在某些实施方案中，合适的酶标记的实例包括辣根过氧物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪氨荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺(luminol)；生物发光物质的实例包括荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；并且合适的放射性物质的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体实施方案中，本文描述的抗原结合构建体连接到与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体通过自然过程，如翻译后加工，或通过本领域熟知的化学修饰技术修饰。在某些实施方案中，在指定多肽的几个位点可存在相同或不同程度的同类修饰。在某些实施方案中，来自于本文描述的抗原结合构建体的多肽例如由于泛素化分支，并且在一些实施方案中为环状，有或无分支。环状、分支及分支环状多肽是翻译后自然过程的结果或通过合成方法制成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸盐的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚点形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋、硒酰化(selenoylation)、硫酸盐化、转运RNA介导的向蛋白质添加氨基酸如精氨酰化和泛素化。(参见，例如，PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton,W.H.Freeman and Company,New York(1993)；POST-TRANSLATIONALCOVALENT MODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson编辑，Academic Press,New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182:626-646(1990)；Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
在某些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体与固体支撑体连接，固体支撑体对于被本文描述的蛋白质结合、与本文描述的蛋白质结合或缔合的多肽的免疫测定或纯化特别有用。此类固体支撑体包括但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙(nylon)、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
药物组合物
本文还提供了包含本文描述的抗原结合构建体的药物组合物。药物组合物包含所述构建体和药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的”意为通过联邦或国家政府监管机构批准或列入美国药典或其它普遍公认的药典中用于动物，并且更特别地用于人。术语“载体”是指治疗剂与之一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可为无菌液体，如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些方面，载体是在自然界中尚未发现的人造载体。当药物组合物经静脉施用时可用水作为载体。也可采用盐水溶液及含水葡萄糖和甘油溶液作为液体载体，特别是对于可注射液而言。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、水稻、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。若需要，所述组合物也可含有少量的润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。这些组合物可呈溶液、混悬剂、乳剂、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释制剂等形式。可用传统的粘合剂和载体如甘油三酯将组合物配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体如药用级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。在“Remington's Pharmaceutical Sciences”中E.W.Martin描述了合适的药物载体的实例。此类组合物将含有治疗有效量的优选呈纯化形式的化合物，连同适量的载体以便向患者提供用于正确施用的形式。所述制剂应适合施用模式。
在某些实施方案中，根据常规程序将包含所述构建体的组合物配制成适于向人类静脉施用的药物组合物。通常，用于静脉施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，所述组合物也可包括助溶剂和局部麻醉剂如利多卡因(lignocaine)以减轻注射部位的疼痛。通常，所述成分在指示活性剂的量的气密容器如安瓿或小袋中呈单位剂型，例如，呈冻干粉剂或无水浓缩物单独提供或混在一起。当要通过输注施用所述组合物时，可用装有药用级无菌水或盐水的输液瓶分配组合物。当通过注射施用所述组合物时，可提供一安瓿的注射用无菌水或盐水，以便可在施用之前混合所述成分。
在某些实施方案中，将本文描述的组合物配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的阴离子形成的盐，及与阳离子如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁异丙胺、三乙胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的阳离子形成的盐。
治疗方法
在某些实施方案中，提供了一种治疗疾病或病症的方法，其包括以有效治疗、预防或改善所述疾病或病症的量，向需要此类治疗、预防或改善的受试者施用本文描述的抗原结合构建体。
“病症”是指将得益于用本文描述的抗原结合构建体或方法治疗的任何病状。这包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易感染所讨论的病症的那些病理状况。在一些实施方案中，所述病症为癌症，如下面更详细地描述那样。
术语“受试者”是指为治疗、观察或实验的对象的动物，在一些实施方案中为哺乳动物。动物可为人、非人灵长类动物、宠物(例如，狗、猫等)、家畜(例如，牛、羊、猪、马等)或实验动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文中所用的术语“哺乳动物”包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛、马和猪。
“治疗”是指试图改变受治个体或细胞的自然病程的临床干预，并且可以是为了预防或在临床病理过程中进行。理想的治疗效果包括预防疾病发生或复发，缓和症状，减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体用于延迟疾病或病症的发展。在一个实施方案中，本文描述的抗原结合构建体和方法实现肿瘤消退。在一个实施方案中，本文描述的抗原结合构建体和方法实现肿瘤/癌症生长的抑制。
理想的治疗效果包括但不限于预防疾病发生或复发，缓和症状，减少疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展的速率，改善或减轻疾病状态，提高生存期及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本文描述的抗原结合构建体用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。
如本文中所用的术语“有效量”是指将实现所述方法的目标，例如在一定程度上减轻受治疾病、病状或病症的一种或多种症状而施用的构建体的量。在与治疗性蛋白质的异常表达和/或活性相关的疾病或病症的治疗、抑制和预防方面将有效的本文描述的组合物的量可通过标准临床技术测定。另外，可任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。要在制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每位患者的情况而决定。由从体外或动物模型测试***得到的剂量反应曲线推断有效剂量。
向受试者施用抗原结合构建体。已知各种递送***并且可用于施用本文描述的抗原结合构建体制剂，例如，封装在脂质体、微粒、微胶囊中，能够表达所述化合物的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987))，作为逆转录病毒或其它载体的一部分的核酸的构建等。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。所述化合物或组合物可通过任何方便的途径施用，例如通过输注或快速浓注，通过上皮或粘膜皮肤内衬(例如，口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收并且可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，在某些实施方案中，理想的是将本文描述的抗原结合构建体组合物通过任何合适的途径，包括心室内和鞘内注射引入中枢神经***中；用(例如)与储库，如Ommaya储库连接的脑室内导管可利于脑室内注射。也可采用肺部施用，例如，通过使用吸入器或喷雾器，和具有雾化剂的制剂。
在一个具体实施方案中，理想的是向需要治疗的区域局部施用本文描述的抗原结合构建体或组合物；这可通过(例如而非限制)手术期间局部输注、局部敷用(例如在手术后连同伤口敷料一起)、注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物而实现，所述植入物为多孔、无孔或凝胶材料，包括膜如硅橡胶膜或纤维。优选地，当施用蛋白质，包括本文描述的抗原结合构建体时，必须小心使用向其中吸收蛋白质的材料。
在另一个实施方案中，抗原结合构建体或组合物可以在囊泡，尤其是脂质体中递送(参见Langer，Science 249:1527-1533(1990)；Treat等，在Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer中，Lopez-Berestein和Fidler(编辑)，Liss,NewYork，第353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，第317-327页；通常参见同上)。
再一个实施方案中，抗原结合构建体或组合物可以在控释***中递送。在一个实施方案中，可以使用泵(参见Langer，同上；Sefton，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等，Surgery 88:507(1980)；Saudek等，N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料(参见Medical Applications of ControlledRelease，Langer和Wise(编辑)，CRC Pres.,Boca Raton,Fla.(1974)；Controlled DrugBioavailability,Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(编辑)，Wiley,New York(1984)；Ranger和Peppas,J.，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983)；同样参见Levy等，Science 228:190(1985)；During等，Ann.Neurol.25:351(1989)；Howard等，J.Neurosurg.71:105(1989))。再一个实施方案中，可将控释***置于治疗目标，例如脑部附近，从而仅需全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson，在Medical Applications ofControlled Release中，第2卷，第115-138页(1984))。
在包含编码本文描述的抗原结合构建体的核酸的一个具体实施方案中，可通过将核酸构建为恰当核酸表达载体的一部分并将其施用使其变成细胞内的，例如通过使用逆转录病毒载体(参见美国专利第4,980,286号)，或通过直接注射，或通过使用微粒轰击(例如，基因枪；Biolistic,Dupont)或涂布脂质或细胞表面受体或转染剂，或通过使其处于与已知进入细胞核的同源盒样肽的连接中施用(参见例如，Joliot等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:1864-1868(1991))等在体内施用核酸以促进其编码的蛋白质的表达。可选地，可以在细胞内引入核酸并且通过同源重组并入宿主细胞DNA中以便表达。
在某些实施方案中本文描述的抗原结合构建体作为与具有非重叠结合靶表位的抗原结合构建体的组合施用。
在疾病或病症的治疗、抑制和预防中将有效的抗原结合构建体的量可通过标准临床技术测定。另外，可任选地采用体外测定以帮助鉴定最佳剂量范围。要在制剂中采用的精确剂量还将取决于施用途径和疾病或病症的严重性，并且应根据从业者的判断和每位患者的情况而决定。由从体外或动物模型测试***得到的剂量反应曲线推断有效剂量。
本文描述的抗原结合构建体可单独或与其它类型的治疗(例如，放疗、化疗、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)组合施用。通常，优选施用与患者相同物种的物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)的产品。因此，在一个实施方案中，向人患者施用人抗原结合构建体、片段衍生物、类似物或核酸用于治疗或预防。
治疗癌症的方法
本文描述了使用本文描述的抗原结合构建体在受试者中治疗HER2+癌症或肿瘤的方法，及抑制HER2+肿瘤细胞生长或杀伤HER2+肿瘤细胞的方法。
所谓HER2+癌症意指表达HER2，使得本文描述的抗原结合构建体能够与所述癌症结合的癌症。正如本领域中所知，HER2+癌症表达不同水平的HER2。为测定癌症中的ErbB，例如ErbB2(HER2)表达，各种诊断/预后测定可用。在一个实施方案中，可通过IHC，例如使用(Dako)分析ErbB2过表达。可使来自于肿瘤活检的石蜡包埋组织切片经历IHC测定并且符合如下ErbB2蛋白质染色强度标准：
得分0：未观察到染色或在少于10％的肿瘤细胞中观察到膜染色。
得分1+：在多于10％的肿瘤细胞中检测到模糊的/几乎不能看出的膜染色。仅在其一部分膜中细胞被染色。
得分2+：在多于10％的肿瘤细胞中观察到弱至中等的全膜染色。
得分3+：在多于10％的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的全膜染色。
对于ErbB2过表达评估得分为0或1+的那些肿瘤可表征为不过表达ErbB2，而得分为2+或3+的那些肿瘤可表征为过表达ErbB2。
可选地，或另外，可对***(formalin)固定、石蜡包埋的肿瘤组织进行荧光原位杂交(FISH)测定如INFORMTM(由Ventana,Ariz.销售)或PATHVISIONTM(Vysis,Ill.)以确定肿瘤中ErbB2过表达的程度(若有)。与IHC测定相比，测量HER2基因扩增的FISH测定似乎与患者对用治疗的反应相关性更佳，并且目前被认为是鉴定可能得益于治疗的患者的优选测定。
表D描述了在几个代表性乳腺癌和其它癌细胞系上HER2的表达水平(Subik等(2010)Breast Cancer:Basic Clinical Research:4；35-41；Prang等(2005)BritishJournal of Cancer Research:92；342-349)。如表中所示，认为MCF-7和MDA-MB-231细胞是HER2低表达细胞；认为JIMT-1和ZR-75-1细胞是HER2中等表达细胞，并且认为SKBR3和BT-474细胞是HER2高表达细胞。认为SKOV3(卵巢癌)细胞是HER2中等表达细胞。
本文描述了治疗患有HER2+癌症或肿瘤的受试者的方法，其包括向受试者施用有效量的包含本文描述的抗原结合构建体的药物组合物。
本文还描述了本文描述的HER2抗原结合构建体用于制造用于治疗癌症或肿瘤的药剂的用途。本文还描述了用于癌症或肿瘤治疗的HER2抗原结合构建体。
在具体实施方案中，抗原结合构建体为v10000、v7091、v5019或v5020。在一个实施方案中，抗原结合构建体为v10000。在一些实施方案中，抗原结合构建体与美登素(DM1)偶联。当与DM1偶联的抗原结合构建体内化到肿瘤细胞中时，DM1在细胞内从构建体裂解，并杀伤肿瘤细胞。
在一些实施方案中，受治受试者患有胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、***、卵巢癌、脑癌、子宫内膜癌、膀胱癌、非小细胞肺癌或表皮源癌症。在一些实施方案中，肿瘤是转移性的。
一般而言，受治受试者中的肿瘤每个肿瘤细胞平均表达10,000或更多个HER2拷贝。在某些实施方案中，如通过IHC测定，肿瘤为HER2 0-1+、1+、HER2 2+或HER2 3+。在一些实施方案中肿瘤为HER2 2+或更低，或HER2 1+或更低。
在一些实施方案中，用抗原结合构建体治疗的受试者的肿瘤为乳腺癌。在一个具体实施方案中，乳腺癌表达2+水平或更低的HER2。在一个具体实施方案中，乳腺癌表达1+水平或更低的HER2。在一些实施方案中，乳腺癌表达***受体(ER+)和/或孕酮受体(PR+)。在一些实施方案中，乳腺癌为ER-和/或PR-。在一些实施方案中，乳腺癌具有扩增的HER2基因。在一些实施方案中，乳腺癌为HER2 3+***受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PR-)、曲妥珠单抗抗性、化疗抗性浸润性乳腺导管癌。在另一个实施方案中，乳腺癌为HER2 3+ER-、PR-、曲妥珠单抗抗性炎性乳腺癌。在另一个实施方案中，乳腺癌为HER2 3+、ER-、PR-、浸润性导管癌。在另一个实施方案中，乳腺癌为HER2 2+HER2基因扩增的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌。在一些实施方案中，乳腺癌为三阴性(ER-、PR-及HER2低表达)。
在一个实施方案中，所述肿瘤是具有扩增的HER2基因的HER2 2/3+卵巢上皮腺癌。
本文提供了用于治疗患有抗或变得抗其它标准护理疗法的HER2+肿瘤的受试者的方法，其包括向受试者施用包含本文描述的抗原结合构建体的药物组合物。在某些实施方案中，任选地与一种或多种当前的抗HER2疗法组合，向对当前疗法无反应的受试者提供本文描述的抗原结合构建体。在一些实施方案中，当前的抗HER2疗法包括但不限于抗HER2或抗HER3单特异性二价抗体、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、T-DM1、双特异性HER2/HER3scFv或其组合。在一些实施方案中，所述癌症对各种化疗剂如紫杉烷有抗性。在一些实施方案中所述癌症对曲妥珠单抗有抗性。在一些实施方案中所述癌症对帕妥珠单抗有抗性。在一个实施方案中，所述癌症对TDM1(与DM1偶联的曲妥珠单抗)有抗性。在一些实施方案中，受试者先前已经用抗HER2抗体如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗或DM1治疗。在一些实施方案中，受试者先前尚未用抗HER2抗体治疗。在一个实施方案中，当患者在先前抗HER2疗法时已有进展时，向受试者提供抗原结合构建体以治疗转移性癌症。
本文提供了治疗患有HER2+肿瘤的受试者的方法，其包括提供有效量的包含本文描述的抗原结合构建体连同另外的抗肿瘤剂的药物组合物。所述另外的抗肿瘤剂可为如上所述的治疗性抗体，或化疗剂。与本发明的抗原结合构建体组合使用的化疗剂包括顺铂、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康(irinotecan)、依托泊苷、长春花碱、培美曲塞(pemetrexed)、5-氟尿嘧啶(有或无亚叶酸)、卡培他滨、卡铂、表柔比星、奥沙利铂(oxaliplatin)、亚叶酸钙(folfirinox)、abraxane和环磷酰胺。
在一些实施方案中，所述肿瘤为非小细胞肺癌，并且所述另外的试剂为顺铂、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春花碱或培美曲塞中的一种或多种。在实施方案中，所述肿瘤为胃癌或胃部癌，并且所述另外的试剂为5-氟尿嘧啶(有或无亚叶酸)、卡培他滨、卡铂、顺铂、多西他赛、表柔比星、伊立替康、奥沙利铂或紫杉醇中的一种或多种。在其它实施方案中，所述肿瘤为胰腺癌，并且所述附加试剂为吉西他滨、亚叶酸钙、abraxane或5-氟尿嘧啶中的一种或多种。在其它实施方案中，所述肿瘤为***和/或孕酮阳性乳腺癌，并且所述另外的试剂为(a)多柔比星和表柔比星的组合，(b)紫杉醇和多西他赛的组合，或(c)5-氟尿嘧啶、环磷酰胺和卡铂的组合中的一种或多种。在其它实施方案中，所述肿瘤为头颈癌，并且所述另外的试剂为紫杉醇、卡铂、多柔比星或顺铂中的一种或多种。在其它实施方案中，所述肿瘤为卵巢癌并且所述另外的试剂可为顺铂、卡铂或紫杉烷如紫杉醇或多西他赛中的一种或多种。
所述另外的试剂可与抗原结合构建体同时或依次向受试者施用。
用抗原结合构建体治疗的受试者可为人、非人灵长类动物或其它哺乳动物如小鼠。
在一些实施方案中，向患有肿瘤的受试者提供有效量的抗原结合构建体的结果是缩小肿瘤，抑制肿瘤的生长，增加肿瘤进展的时间，延长受试者的无病生存期，减少转移，增加受试者的无进展生存期，或增加受试者的总生存期或增加接受治疗的一组受试者的总生存期。
本文还描述了杀伤HER2表达肿瘤细胞或抑制HER2表达肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与本文提供的抗原结合构建体接触。
在各个实施方案中，肿瘤细胞可为HER2 1+或2+人胰腺癌细胞、HER2 3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2-扩增乳腺癌细胞、HER20+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+人卵巢癌细胞。
在抗原结合构建体与DM1偶联的实施方案中，肿瘤细胞可为HER2 1+或2+或3+人胰腺癌细胞、HER2 2+转移性胰腺癌细胞、HER2 0+/1+、+3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、HER2 0+间变性肺癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 0+、1+或3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2扩增乳腺癌细胞、HER2 0+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 0+人乳腺导管癌(基底B型、间充质样三阴性)细胞、HER2 2+ER+乳腺癌细胞、HER2 0+人转移性乳腺癌细胞(ER-、HER2-扩增、管腔A型、TN)、人子宫中胚叶肿瘤(混合III级)细胞、2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+人皮肤表皮样癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+恶性黑素瘤细胞、人宫颈表皮样癌、HER2 1+人膀胱癌细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+、2+或3+人卵巢癌细胞。
在一些实施方案中肿瘤细胞可为以下细胞系中的一种或多种(在图37和38中示出)：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2；肺部肿瘤细胞系Calu-3、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit 562、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、BT-20、JIMT-1、SkBr3、BT-474；子宫肿瘤细胞系TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系Malme-3M；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；卵巢肿瘤细胞系CaOV3和SKOV3。
在抗原结合构建体与DM1偶联的实施方案中，肿瘤细胞可为以下细胞系中的一种或多种(在图37和38中示出)：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2、SW 1990、Panc1；肺部肿瘤细胞系A549、Calu-3、Calu-6、NCI-H2126、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit562、SCC-15、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系Colo201、DLD-1、HCT116、HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系SNU-1、SNU-16、NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系SkBr3、MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、ZR-75-1、BT-20、BT549、BT-474、CAMA-1、MDAMB453、JIMT-1、T47D；子宫肿瘤细胞系SK-UT-1、TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系A431、Malme-3M、SKEMEL28；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；肾肿瘤细胞系ACHN；卵巢肿瘤细胞系CaOV3、Ovar-3和SKOV3。
试剂盒及制品
本文还描述了包含一个或多个抗原结合构建体的试剂盒。试剂盒的单独组分将被包装在独立的容器中并且，伴随此类容器的可以是呈管制医药品或生物产品的生产、使用或销售的政府机关所规定的形式的须知，该须知反映了该机关对生产、使用或销售的批准。试剂盒可任选地装有概述抗原结合构建体的使用方法或施用方案的说明书或指南。
当试剂盒的一种或多种组分作为溶液，例如水溶液或无菌水溶液提供时，容器装置本身可为吸入器、注射器、移液管、滴眼管或其它类似装置，溶液可从中施用给受试者或施加到试剂盒的其它组分中并与之混合。
试剂盒的组分也可以呈干燥或冻干形式提供并且试剂盒可另外装有用于冻干组分的复水的合适溶剂。无论容器的数量或类型如何，本文描述的试剂盒也可包含帮助向患者施用组合物的器具。此类器具可为吸入器、鼻喷雾装置、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼管或类似医学上批准的递送工具。
在本文描述的另一方面，提供了装有用于上述病症的治疗、预防和/或诊断的材料的制品。所述制品包括容器及容器上或伴随容器的标签或包装说明书。合适的容器包括，例如，瓶、小瓶、注射器、静脉(IV)输液袋等。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。容器容纳单独的组合物或与对治疗、预防和/或诊断所述病状有效的另一种组合物组合的并且可具有无菌进入孔(例如容器可为静脉输液袋或具有可用皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中至少一种活性剂为本文描述的T细胞活化抗原结合构建体。标签或包装说明书指出该组合物用于治疗所选病状。而且，所述制品可包含(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本文描述的抗原结合构建体；和(b)其中装有组合物的第二容器，其中所述组合物包含另一种细胞毒性剂或其它治疗剂。本文描述的这个实施方案中的制品还可包含指出所述组合物可用于治疗特定病状的包装说明书。可选地，或另外，所述制品还可包含第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的缓冲剂，如抑菌剂注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和用户角度来看合乎需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针和注射器。
多肽和多核苷酸
本文描述的抗原结合构建体包含至少一个多肽。还描述了编码本文描述的多肽的多核苷酸。通常分离抗原结合构建体。
如本文中所用，“分离”意指已经从其自然细胞培养环境中鉴定并分离和/或回收了试剂(例如，多肽或多核苷酸)。其自然环境的污染物组分是会干扰抗原结合构建体的诊断或治疗用途的材料，并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。分离还指已经(例如)经由人为干涉通过合成方式产生的试剂。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可交换地用于指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述和对蛋白质的描述，并且反之亦然。该术语适用于自然发生的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非自然编码的氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，该术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指自然发生和非自然发生的氨基酸，以及以类似于自然发生的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。自然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)及吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与自然发生的氨基酸相同的基本化学结构，即与氢结合的碳、羧基、氨基和R基团的化合物，如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、甲基蛋氨酸锍盐。此类类似物具有经修饰的R基团(如正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保持与自然发生的氨基酸相同的基本化学结构。提到氨基酸包括，例如，自然发生的成蛋白质性(proteogenic)L-氨基酸；D-氨基酸，经化学修饰的氨基酸如氨基酸变体和衍生物；自然发生的非成蛋白质性氨基酸如β-丙氨酸、鸟氨酸等；及具有本领域已知是氨基酸特有的性质的化学合成化合物。非自然发生的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如，α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如，2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链上具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)及其中侧链上的羧酸官能团被磺酸基团置换的氨基酸(例如，磺基丙氨酸)。非自然氨基酸，包括合成的非天然氨基酸、经取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸向本发明蛋白质中的并入可在许多不同方面有利。含D-氨基酸的肽等与含L-氨基酸的对应物相比在体外或体内表现出增强的稳定性。因此，并入D-氨基酸的肽等的构建在期望或需要更高的细胞内稳定性时可特别有用。更具体地，D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶有抗性，从而在期望此类性质时提供提高的分子生物利用率和延长的体内寿命。另外，因为向T辅助细胞的呈递受主要组织相容性复合物II类限制而不能有效加工D-肽等，并且因此，不大可能在整个生物体中诱导体液免疫应答。
在本文中可用其通常已知的三字母符号或用IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号指氨基酸。同样，可用其普遍认可的单字母符号指核苷酸。
在本发明中还包括编码抗原结合构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”旨在指示一段连续的两个或更多个核苷酸分子。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源的，或其任何组合。
术语“核酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限定，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物，具有与参考核酸相似的结合性质并且以类似于自然发生的核苷酸的方式代谢的核酸。除非另外特别限定，否则该术语还指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、用于反义技术中的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺等)。除非另外指出，否则特定核酸序列还暗含其保守性修饰变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。特别地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或全部)密码子的第三个位置经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列而实现(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“保守性修饰变体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，“保守性修饰变体”是指编码相同或基本上相同的氨基酸序列的那些核酸，或其中所述核酸不将氨基酸序列编码成基本上相同的序列。由于遗传密码的简并性，许多功能相同的核酸编码任何指定蛋白质。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU全部编码氨基酸丙氨酸。因此，在密码子指定丙氨酸的每个位置，可将密码子改为任何相应的所需密码子，而不改变编码的多肽。此类核酸变异为“沉默变异”，是保守性修饰变异的一种。本文编码多肽的每个核酸序列也描述了核酸每种可能的沉默变异。本领域的普通技术人员将认识到核酸中的每个密码子(除通常是蛋氨酸的唯一密码子的AUG和通常是色氨酸的唯一密码子的TGG外)均可修饰以产生功能相同的分子。因此，在每个描述的序列中隐含了编码多肽的核酸的每个沉默变异。
至于氨基酸序列，本领域的普通技术人员将认识到对核酸、肽、多肽或蛋白质序列进行的在编码序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或一小部分氨基酸的单独取代、缺失或添加，在所述改变导致氨基酸缺失、氨基酸添加或氨基酸经化学相似氨基酸取代时，为“保守性修饰变体”。本领域的普通技术人员已知提供了功能相似氨基酸的保守性取代表。此类保守性修饰变体是除本文描述的多态变体、种间同源物和等位基因以外的并且不排除这些。
本领域的普通技术人员已知提供了功能相似氨基酸的保守性取代表。下列八组各自含相互的保守性取代的氨基酸：1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和[0139]8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)(参见，例如，Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W H Freeman&Co.；第2版(1993年12月)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的情况下，术语“相同”或“同一性”百分比涉及相同的两个或更多个序列或子序列。正如使用以下序列比较算法之一(或本领域普通技术人员可用的其它算法)或通过人工比对和目视检查所测量的那样，在比较窗口或指定区域上比较和比对最大一致性时，如果序列有一定比例的氨基酸残基或核苷酸相同(即，在指定区域上约60％同一性、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％同一性)，则序列“大体上相同”。这个定义还涉及测试序列的互补序列。可在长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或在长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或未指定时，在多核苷酸或多肽的整个序列上存在同一性。编码本发明的多肽的多核苷酸，包括来自于除人以外的物种的同源物，可通过包括以下步骤的方法获得：在严格杂交条件下用具有本文描述的多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库，并且分离含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术为技术人员所公知。
对于序列比较而言，通常一个序列作为与测试序列比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如有必要指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
本文中所使用的“比较窗口”包括参考具有选自以下的任一数量的连续位置的区段：20至600，通常约50至约200，更通常地约100至约150，在该区段中在对两个序列进行最优比对后，可将序列与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法为本领域普通技术人员已知。用于比较的最优序列比对可以按以下方法来进行，包括但不限于，通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性搜索方法，通过计算机执行这些算法(Wisconsin遗传学软件包(Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)，或通过人工比对和目视检查(参见，例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的一个实例为BLAST和BLAST2.0算法，其分别在Altschul等(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中有描述。用于进行BLAST分析的软件通过在万维网ncbi.nlm.nih.gov上可用的国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)公开可用。BLAST算法参数W、T和X决定了算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列而言)默认使用字长(W)为11、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序默认使用字长为3、期望值(E)为10及BLOSUM62打分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915)比对(B)为50、期望值(E)为10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。通常在关闭“低复杂度”滤波器的情况下进行BLAST算法。
BLAST算法还进行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种对相似性的量度是最小和概率(smallest sum probability)(P(N))，其指示在两个核苷酸或氨基酸序列之间因偶然而发生匹配的概率。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2，或小于约0.01，或或小于约0.001，则认为核酸与参考序列相似。
短语“与……选择性(或特异性)杂交”是指在严格杂交条件下分子仅与特定核苷酸序列(当该序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时)的结合、双链化或杂交。
短语“严格杂交条件”是指如本领域所知在低离子强度和高温条件下DNA、RNA或其它核酸或其组合的序列的杂交。通常，在严格条件下探针将与其在核酸复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件依赖于序列并且在不同环境下将会不同。越长的序列在越高的温度下特异性杂交。在Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Probes，“Overview of principles of hybridizationand the strategy of nucleic acid assays”(1993)中找到对核酸杂交的大量指导。
如本文中所用，术语“工程化”被认为包括对肽骨架的任何操纵或对自然发生的或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或单独的氨基酸侧链基团的修饰，以及这些方法的组合。通过标准的分子生物学技术表达和生成工程化蛋白质。
所谓“分离的核酸分子或多核苷酸”指已经从其天然环境中去除的核酸分子、DNA或RNA。例如，载体中所含的编码多肽的重组多核苷酸被认为已分离。分离的多核苷酸的其它实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或大体上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括通常含有多核苷酸分子的细胞中所含的多核苷酸分子，但是多核苷酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色***置的染色***置。分离的RNA分子包括体内或体外RNA转录产物，以及正链和负链形式和双链形式。本文描述的分离的多核苷酸或核酸还包括经合成方式，例如经由PCR或化学合成而产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸，在某些实施方案中，包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“聚合酶链式反应”或“PCR”通常是指例如美国专利第4,683,195号中所述，在体外扩增所需核苷酸序列的方法。一般而言，PCR方法牵涉引物延伸合成的重复循环，使用能够优先与模板核酸杂交的寡核苷酸引物。
所谓具有与本发明的参考核苷酸序列至少(例如)95％“相同”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸，是指除参考核苷酸序列的每100个核苷酸中多核苷酸序列可包括多达5个点突变外，多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同。换言之，为获得具有与参考核苷酸序列具有至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，参考序列中多达5％的核苷酸可缺失或用另一核苷酸取代，或可向参考序列中***多达参考序列中总核苷酸的5％的数量的核苷酸。参考序列的这些改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或那些末端位置之间的任何地方，单独地散布在参考序列中的残基之间或在参考序列内的一个或多个连续基团中。实际情况是，按照惯例可以使用已知的计算机程序，如以上对于多肽所讨论的计算机程序(例如，ALIGN-2)确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性。
如果衍生物或变体的氨基酸序列与来自于原始肽的100个氨基酸的序列具有至少50％同一性，则称多肽的衍生物或变体与所述肽共有“同源性”或与之“同源”。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有和衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽的片段具有至少75％同一性。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有和衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽的片段具有至少85％同一性。在某些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与具有和衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽的片段具有至少90％同一性。在一些实施方案中，衍生物的氨基酸序列与具有和衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽的片段具有至少95％同一性。在某些实施方案中，衍生物或变体与具有和衍生物相同数量的氨基酸残基的肽或肽的片段具有至少99％同一性。
术语“修饰”，如本文中所用，是指对指定多肽所做的任何变化，如对多肽长度、氨基酸序列、化学结构的变化、共翻译修饰或翻译后修饰。形式“(修饰)”的术语意指所讨论的多肽经任选地修饰，即，讨论的多肽可经修饰或未修饰。
在一些方面，抗原结合构建体包含与本文公开的表或登录号中列出的有关氨基酸序列或其片段具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，分离的抗原结合构建体包含由与本文公开的表或登录号中列出的有关核苷酸序列或其片段具有至少80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。
应理解本发明不限于本文描述的特定方案、细胞系、构建体和试剂并且正因如此可以改变。还应理解本文使用的术语仅仅是为了描述特定实施方案的目的，而非旨在限制本发明的范围。
本文提到的所有出版物和专利通过引用并入本文用于描述和公开(例如)出版物中描述的构建体和方法的目的，其可以连同当前描述的发明一起使用。本文讨论的出版物只是为了在本申请的提交日期之前公开而提供。不得将本文任何内容解释为承认本发明人无权凭借先前发明或出于任何其它原因使本发明先于此公开。
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实施例
下面是进行本发明的具体实施方案的实施例。提供实施例仅仅是为了说明的目的，而非旨在以任何方式限制本发明的范围。已经做出努力确保关于所用数字(例如，量、温度等)的精确性，但是当然应允许一定实验误差和偏差。
除非另外指出，否则本发明的实践将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法。文献中全面地解释了此类技术。参见，例如，T.E.Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman和公司，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers，Inc.，当前增加)；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(1989年，第2版)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press，Inc.)；Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版(Easton，Pennsylvania：Mack Publishing Company，1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)A和B卷(1992)。
实施例1：示例性抗HER2双特异性抗体和对照的制备
如下所述制备多种示例性抗HER2双互补位抗体(或抗原结合构建体)和对照。已经制备了呈不同形式的抗体和对照，并且表1中示出了示例性双互补位形式的示意图。在图1所示的所有形式中，用一条显示为黑色的链(A链)和另一条显示为灰色的链(B链)描绘异二聚体Fc，而一个抗原结合结构域(1)显示为阴影线填充，而另一个抗原结合结构域(2)显示为白色。
图1A描绘呈Fab-Fab形式的双互补位抗体的结构。图1B至1E描绘呈scFv-Fab形式的双互补位抗体的可能型式的结构。在图1B中，抗原结合结构域1为scFv，与A链融合，而抗原结合结构域2为Fab，与B链融合。在图1C中，抗原结合结构域1为Fab，与A链融合，而抗原结合结构域2为scFv，与B链融合。在图1D中，抗原结合结构域2为Fab，与A链融合，而抗原结合结构域1为scFv，与B链融合。在图1E中，抗原结合结构域2为scFv，与A链融合，而抗原结合结构域1为Fab，与B链融合。在图1F中，两个抗原结合结构域均为scFv。
在实施例之后的序列表中提供了以下变体的序列。使用Kabat和Chothia方法的组合鉴定CDR区。区域可根据用于鉴定的方法而略有不同。
示例性抗HER2双互补位抗体
如表1所示制备示例性抗HER2双互补位抗体。
表1：示例性抗HER2双互补位抗体
注意：
·CH3编号根据EU索引，如同Kabat中提到EU抗体的编号那样(Edelman等，1969，Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85)；
·Fab或可变结构域编号根据Kabat(Kabat和Wu，1991；Kabat等，Sequences ofproteins of immunological interest。第5版-美国卫生与人类服务部(US Departmentof Health and Human Services)，NIH出版n°91-3242，第647页(1991))
·“含表位的结构域”＝与抗原结合部分结合的HER2的结构域；
·“抗体名称”＝抗体结合部分从中来源的抗体，存在时包括与野生型相比的取代；
·“Fab取代”＝Fab中促进轻链正确配对的取代；
·“CH3序列取代”＝CH3结构域中促进异二聚体Fc形成的取代
示例性抗HER2单价对照抗体
v1040：单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自曲妥珠单抗A链上的Fab，并且Fc区是A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V，B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体，并且B链的铰链区具有突变C226S；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。
v630-单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自曲妥珠单抗A链上的scFv，并且Fc区是A链中具有突变L351Y_S400E_F405A_Y407V，B链中具有突变T366I_N390R_K392M_T394W的异二聚体；并且铰链区在两条链上均具有突变C226S(EU编号)；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。
v4182：单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自帕妥珠单抗A链上的Fab，并且Fc区是A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V，B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体，并且B链的铰链区具有突变C226S；抗原结合结构域与HER2的结构域2结合。
示例性抗HER2单特异性二价抗体对照(全尺寸抗体(full-sized antibody)，FSA)
v506是在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞内部产生的野生型抗HER2，作为对照。两个HER2结合结构域均衍生自呈Fab形式的曲妥珠单抗并且Fc为野生型同二聚体；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。这种抗体也称为曲妥珠单抗类似物。
v792是具有IgG1铰链的野生型曲妥珠单抗，其中两个HER2结合结构域均衍生自呈Fab形式的曲妥珠单抗，并且Fc区是A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。这种抗体也称为曲妥珠单抗类似物。
v4184是二价抗HER2抗体，其中两个HER2结合结构域均衍生自呈Fab形式的帕妥珠单抗，并且Fc区是A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V且B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体。抗原结合结构域与HER2的结构域2结合。这种抗体也称为帕妥珠单抗类似物。
hIgG是商用非特异性多克隆抗体对照(Jackson ImmunoResearch，#009-000-003)。
如下克隆并表达这些抗体和对照(除人IgG以外)。使用针对人/哺乳动物表达优化的密码子经由基因合成构建编码抗体重链和轻链的基因。由已知的结合HER2/neu结构域4的抗体生成曲妥珠单抗Fab序列(Carter P.等(1992)Humanization of an antip185HER2antibody for human cancer therapy.Proc Natl Acad Sci 89,4285.)并且Fc为IgG1同种型。由曲妥珠单抗的VH和VL结构域使用甘氨酸-丝氨酸接头生成scFv序列(Carter P.等(1992)Humanization of an anti p185her2antibody for human cancertherapy.Proc Natl Acad Sci 89,4285.)。由已知的结合HER2/neu结构域2的抗体生成帕妥珠单抗Fab序列(Adams CW等(2006)Humanization of a recombinant monoclonalantibody to produce a therapeutic her dimerization inhibitor,Pertuzumab.Cancer Immunol Immunother,2006；55(6):717-27)。
最终基因产物经亚克隆至哺乳动物表达载体PTT5(NRC-BRI,Canada)中并且在CHO细胞中表达(Durocher,Y.,Perret,S.和Kamen,A.High-level and high-throughputrecombinant protein production by transient transfection of suspension-growing CHO cells.Nucleic acids research 30,e9(2002))。
在指数生长期(150至200万个细胞/ml)用1mg/ml 25kDa聚乙烯亚胺水溶液(PEI，polysciences)按2.5:1的PEI:DNA比率转染CHO细胞。(Raymond C.等A simplifiedpolyethylenimine-mediated transfection process for large-scale and high-throughput applications.Methods.55(1):44-51(2011))。为测定形成异二聚体的最佳浓度范围，按允许异二聚体形成的重链a(HC-A)、轻链(LC)和重链B(HC-B)的最佳DNA比率(例如，HC-A/HC-B/LC比率＝30:30:40(v5019)转染DNA。5-6天后用在4000rpm下离心后收集的培养基收获转染的细胞并且使用0.45μm过滤器澄清。
将澄清的培养基装到MabSelect SuRe(GE Healthcare)蛋白-A柱上并用10倍柱体积的PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤。用10倍柱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱抗体，合并成分含有经pH 11的TRIS中和的抗体。
通过凝胶过滤(SEC)进一步纯化蛋白-A抗体洗脱物。对于凝胶过滤，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL并经由AKTA Express FPLC按1mL/min的流速装到Sephadex 200HiLoad16/600 200pg柱(GE Healthcare)上。按1mL/min的流速使用PBS缓冲液(pH 7.4)。收集对应纯化抗体的成分，浓缩至约1mg/mL。
如上所述克隆、表达并纯化具有不同分子形式的示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体(例如v6717，scFv-scFv IgG1；v6903和v6902Fab-Fab IgG1；v5019、v7091和v10000Fab-scFv IgG1)。
为定量抗体纯度和测定靶异二聚体蛋白和可能的同二聚体和/或半抗体和/或错配轻链污染物的量，进行LC-MS完整的质量分析。如实施例2中所述进行LC-MS完整的质量分析，用于ADC分子的DAR分析计算除外。
数据示于表2中。表2显示这些双互补位抗体的表达和纯化对于v6717而言产生100％的所需产物，对于v6903而言产生91％的所需异二聚体产物，并且对于v6902而言产生62％的所需产物。括号内的数字指+81Da的主峰加上侧峰的量。通常用含有C端HA标签的变体(如v6903和v6902的变体)检测到这个侧峰。对于v6903和v6903而言，将主峰和侧峰加起来得到大约98％和67％的异二聚体纯度。基于高异二聚体纯度，鉴定v6903为代表性Fab-Fab抗HER2双互补位变体，用于和scFv-scFv和Fab-scFv形式直接比较。在所有形式比较测定中均包括v6903。
表2：抗体的表达和纯化
变体 所需异二聚体种类(+侧峰)
6717 100.0
6903 90.9(97.7)
6902 62.4(67.4)
实施例2：示例性抗HER2双互补位抗体药物偶联物(ADC)的制备
制备以下抗HER2双互补位抗体药物偶联物(抗HER2双互补位ADC)。制备变体5019、7091、10000和506的ADC。这些ADC鉴定如下：
v6363(与DM1偶联的v5019)
v7148(与DM1偶联的v7091)
v10553(与DM1偶联的v10000)
v6246(与DM1偶联的v506，类似于T-DM1、曲妥珠单抗-emtansine)
v6249(与DM1偶联的人IgG)
经由与美登素直接偶合而制备ADC。如实施例1中所述，通过蛋白A和SEC纯化的抗体(>95％纯度)用于制备ADC分子。按照Kovtun YV、Audette CA、Ye Y等Antibody-drugconjugates designed to eradicate tumors with homogeneous and heterogeneousexpression of the target antigen.Cancer Res 2006；66:3214-21中描述的方法偶联ADC。正如通过LC/MS所测定和如下所述，ADC具有每个抗体3.0个美登木素生物碱分子的平均摩尔比。
ADC偶联反应中所用试剂的详情如下：偶联缓冲液1：50mM磷酸钾/50mM氯化钠，pH6.5，2mM EDTA。偶联缓冲液2：50mM琥珀酸钠，pH 5.0。ADC配制缓冲液：20mM琥珀酸钠、6％(w/v)海藻糖、0.02％聚山梨醇酯20，pH 5.0。二甲基乙酰胺(DMA)；10mM于DMA中的SMCC(偶联之前制备)、10mM于DMA中的DM1-SH(偶联之前制备)、1mM于PBS中的DTNB、1mM于缓冲液中的半胱氨酸、20mM琥珀酸钠，pH 5.0。UV-VIS分光光度计(来自于Fisher Scientific的Nanodrop 100)、PD-10柱(GE Healthcare)。
ADC制备如下。将原始抗体溶液装到PD-10柱上，该柱先前用25mL偶联缓冲液1，接着用0.5ml偶联缓冲液1平衡。收集抗体洗脱物并且在A280下测量浓度并将浓度调至20mg/mL。制备10mM于DMA中的SMCC-DM1溶液。向抗体溶液中添加7.5摩尔当量的SMCC-DM1-抗体并且添加DMA至10％v/v的最终DMA体积。简单地混合反应物并且在室温下温育2h。第二根PD-10柱用25ml偶联缓冲液1平衡并且向柱中添加抗体-MCC-DM1溶液，接着添加0.5ml缓冲液1。收集抗体-MCC-DM1洗脱物并且测量抗体溶液的A252和A280。计算抗体-MCC-DM1浓度(□＝1.45mg-1cm-1或217500M-1cm-1)。在SEC-HPLC柱上分析ADC进行高MW分析(SEC-HPLC柱TOSOH，G3000-SWXL，7.8mmx30cm，缓冲液、100mM磷酸钠、300mM氯化钠，pH 7.0，流速：1ml/min)。
使用Tosoh TSK凝胶丁基-NPR柱(4.6mmx3.5mmx2.5mm)通过HIC-HPLC分析ADC药物:抗体比率(DAR)。洗脱按1ml/min在25分钟内使用10-90％缓冲液B，接着用100％缓冲液B的梯度进行4分钟。缓冲液A包含20mM磷酸钠、1.5M硫酸铵(pH 7.0)。缓冲液B包含20mM磷酸钠、25％v/v异丙醇(pH 7.0)。
用LC-MS通过以下方法测定ADC药物:抗体比率(DAR)。在装入LC-MS之前用肽N-糖酰胺酶F(PNGase F)使抗体去糖基化。在下列条件下在Agilent 1100系列HPLC上进行液相色谱法。
流速：1mL/min柱后分流至100uL/min进入MS。溶剂：A＝0.1％于ddH2O中的甲酸，B＝65％乙腈、25％THF、9.9％ddH20、0.1％甲酸。柱：2.1x30mm PorosR2。柱温：80℃；溶剂也经预热。梯度：20％B(0-3min)、20-90％B(3-6min)、90-20％B(6-7min)、20％B(7-9min)。
随后在下列条件下在LTQ-Orbitrap XL质谱仪上进行质谱分析(MS)：使用Ion MaxElectrospray的电离法。校准和调谐方法：按10μL/min的流速输注2mg/mL的CsI溶液。在m/z2211上使用自动调谐功能调谐Orbitrap(观察到的总体CsI离子范围：1690至2800)。锥孔电压：40V；镜筒透镜：115V；FT分辨率：7,500；扫描范围m/z400-4000；扫描延迟：1.5min。使用Thermo的Promass反卷积软生成数据的分子量曲线。根据在每个部分峰值处观察到的DAR确定样品的平均DAR(使用的计算：∑(DARx部分峰值强度))。
表3总结了ADC分子的平均DAR。示例性抗HER2双互补位抗体和对照的平均DAR大约为3。
表3：ADC的平均DAR
DAR(LC-MS) DAR(HIC) n
v6246 2.9 3.0 5
v6363 2.6 3.3 5
v7148 3.4 3.9 1
v10553 4.0 4.0 1
实施例3：抗HER2双互补位抗体的表达和实验室规模纯化
使实施例1中描述的抗HER2双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)在10和/或25L体积中表达并且如下通过蛋白A和尺寸排阻色谱法(SEC)纯化。
将澄清的培养基装到MabSelect SuRe(GE Healthcare)蛋白-A柱上并用10倍柱体积的PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤。用10倍柱体积的柠檬酸盐缓冲液(pH 3.6)洗脱抗体，合并成分含有经pH 11的Tris中和的抗体。
通过凝胶过滤(SEC)进一步纯化蛋白-A抗体洗脱物。对于凝胶过滤，将3.5mg抗体混合物浓缩至1.5mL并经由AKTA Express FPLC按1mL/min的流速装到Sephadex 200HiLoad16/600 200pg柱(GE Healthcare)上。按1mL/min的流速使用pH 7.4的PBS缓冲液。收集对应纯化抗体的成分，浓缩至约1mg/mL。如实施例2中所述，通过LC-MS分析纯化的蛋白质。
图2A和2B中示出了10L表达及实验室规模蛋白A和SEC纯化的结果。图2A示出了蛋白A纯化的v5019的SEC色谱并且图2B示出了非还原性SDS-PAGE凝胶，其比较蛋白A合并成分以及SEC成分15和19和合并SEC成分16-18的相对纯度。这些结果显示抗HER2双互补位抗体表达并且通过蛋白A和SEC纯化得到纯蛋白质样品。通过UPLC-SEC和LC-MS分析进行进一步定量并且在实施例4中有描述。
在图2C中示出了25L表达及实验室规模蛋白A纯化的结果。图2C示出了SDS-PAGE凝胶，其比较蛋白A纯化的v10000的相对纯度。泳道M含有：蛋白质分子量标准；泳道1含有：还原条件下的v10000；泳道2含有非还原条件下的v10000。SDS-PAGE凝胶显示v10000纯净并且在非还原条件下在大约125kDa的正确预测分子量处。在还原条件下两条重链带可见，对应于CH-A重链(大约49kDa)和CH-B重链(大约52.5kDa)；CH-A轻链可见并且在大约23.5kDa的正确预测分子量处。这些结果显示抗HER2双互补位抗体表达并且通过蛋白A一步纯化得到纯蛋白质样品。通过UPLC-SEC和LC-MS分析进行进一步定量并且在实施例4中有描述。
实施例4：通过UPLC-SEC和LC-MS分析双互补位抗HER2抗体纯度
用描述的方法通过UPLC-SEC测定示例性蛋白A和SEC纯化的双互补位抗HER2异源多聚体的纯度和聚集百分比。
使用设为30℃(2.5mL，4.6x150mm，不锈钢，1.7μm粒子)的Waters BEH200SEC柱按0.4ml/min进行UPLC-SEC分析。运行时间由7min组成并且每次注射的总体积为2.8mL，运行缓冲液为25mM磷酸钠、150mM柠檬酸钠(pH 7.1)；及150mM磷酸钠(pH 6.4-7.1)。在190-400nm下并且用在280nm下激发且从300-360nm采集发射的荧光促进通过吸光度的检测。用Empower 3软件分析峰值积分。
在图3A中示出了合并的v5019SEC成分的UPLC-SEC结果。这些结果表明通过蛋白A和SEC色谱法将示例性抗HER2双互补位抗体纯化至>99％纯度，含有少于1％的HMW物质。
在图3B中示出了合并的v10000蛋白A成分的UPLC-SEC结果。这些结果表明通过蛋白A色谱法将示例性抗HER2双互补位抗体纯化至>96％纯度，含有少于1％的HMW物质。
在标准条件下通过实施例2中描述的方法使用LC-MS测定示例性双互补位抗HER2抗体的纯度。图4A中示出了来自于对v5019的合并SEC成分的LC-MS分析的结果。该数据显示示例性双互补位抗HER2异二聚体具有100％的异二聚体纯度。图4B中示出了来自于对v10000的合并蛋白A成分的LC-MS分析的结果。该数据显示示例性双互补位抗HER2异二聚体在一步蛋白A纯化后具有98％的异二聚体纯度。
通过蛋白A色谱法和/或蛋白A和SEC纯化的抗体用于以下实施例中描述的测定。
实施例5：通过蛋白A和CEX色谱法纯化的双互补位抗HER2抗体的大规模表达及可 生产性评估
在实施例1中描述的示例性抗HER2双互补位抗体v5019如下以25L规模表达并纯化。
从上清液获得抗体，接着进行两步纯化法，其由蛋白A纯化(MabSelectTM树脂；GEHealthcare)，接着是按照所述方案的阳离子交换色谱法(HiTrapTM SP FF树脂；GEHealthcare)组成。
将CHO-3E7细胞保持在定轨振荡器(VWR Scientific,Chester,PA)上37℃下具有5％CO2的锥形烧瓶(Erlenmeyer Flask)(Corning Inc.,Acton,MA)中的无血清FreestyleCHO表达培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)中。转染前两天，使用摇动式生物反应器***20/50(Wave Bioreactor System 20/50)(GE Healthcare Bio-Science Corp)按适当密度将细胞接种在50L CellBag中，体积为25L。在转染当天，将DNA和PEI(Polysciences,Eppelheim,Germany)按最佳比率混合并且使用实施例1中描述的方法添加到细胞中。第6天收集的细胞上清液用于进一步纯化。
对细胞培养肉汤进行离心和过滤，然后按10.0mL/min装到包装在XK26/20(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)中的30mL MabselectTM树脂上。用适当缓冲液洗涤和洗脱之后，收集成分并用1M Tris-HCl(pH 9.0)中和。经由包装在XK16/20(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)中的20mL SP FF树脂进一步纯化靶蛋白。经MabSelectTM纯化的样品用20mM NaAC(pH 5.5)稀释以将电导率调至<5ms/cm并且添加50mM柠檬酸(pH3.0)将样品pH值调至5.5。按1mL/min将样品装到HiTrapTM SP FF树脂(GE Healthcare)上并用20mM NaAC洗涤。使用0-100％的20mM NaAC、1M NaCl(pH5.5)梯度洗脱，10倍柱体积(CV)按1mL/min洗脱蛋白质。
通过如实施例1中描述的SDS-PAGE分析纯化的蛋白质，并且通过实施例4中描述的方法通过LC-MS分析异二聚体纯度。结果示于图5A和5B中。图5A示出了MabSelectTM和HiTrapTM SP FF纯化后v5019的SDS-PAGE结果，泳道M含有：蛋白质分子量标准；条带1：还原条件下的v5019(3μg)；泳道2：非还原条件下的v5019(2.5μg)。SDS-PAGE凝胶显示v5019在MabSelectTM和HiTrapTM SP FF纯化后相对较纯，并且在非还原条件下，在大约125kDa的正确预测分子量处。在还原条件下两条重链带可见，对应于CH-A重链(大约49kDa)和CH-B重链(大约52.5kDa)；CH-A轻链可见并且在大约23.5kDa的正确预测质量处。
使用实施例4中描述的方法进行经MabSelectTM和HiTrapTM SP FF纯化的v5019的LC-MS分析以测定异二聚体纯度。图5B中示出了来自于LC-MS分析的结果。这些结果显示使用MabSelectTM和HiTrapTM SP FF纯化v5019得到具有>99％异二聚体纯度且具有很少(<1％)或不可检测的同二聚体或半抗体污染的蛋白质。
实施例6：表达低至高水平HER2的细胞系中双互补位抗HER2抗体的Bmax与对照的 Bmax的比较
进行以下实验以测量与对照相比，示例性双互补位抗HER2抗体与表达不同水平的HER2的细胞结合的能力。所用细胞系为SKOV3(HER2 2+/3+)、JIMT-1(HER2 2+)、MDA-MB-231(HER2 0/1+)和MCF7(HER2 1+)。测试的双互补位抗HER2抗体包括v5019、v7091和v10000。如下所述，经Bmax和表观KD(平衡解离常数)的具体测量，测定双互补位抗HER2抗体与HER2表达(HER2+)细胞结合的能力。
通过流式细胞术测定测试抗体与HER2+细胞表面的结合。用PBS洗涤细胞并且按1x105个细胞/100μl重新悬浮在DMEM中。向每个微量离心管添加100μl细胞悬浮液，接着按10μl/管添加抗体变体。所述管在旋转器上4℃温育2小时。微量离心管在室温下以2000RPM离心2min并且用500μl培养基洗涤细胞团块。使每个细胞团块重新悬浮在100μl于培养基中稀释为2μg/份样品的荧光染料标记的二抗中。然后在旋转器上4℃温育样品1小时。温育之后，在2000rpm下离心细胞2min并且在培养基中洗涤。使细胞重新悬浮在500μl培养基中，在装有5μl碘化丙啶(PI)的管中过滤并且在BD LSR II流式细胞仪上根据生产商的说明进行分析。通过FACS和在GraphPad Prism中进行的数据分析和曲线拟合估计示例性双互补位抗HER2异二聚体抗体和对照抗体的KD。
结果示于图6A-6G中。结果证明示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)可以与HER2+细胞结合，与抗HER2FSA(v506)相比Bmax高大约1.5倍。图6A-6G中的结果也显示双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)可以与HER2+细胞结合，与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比Bmax相似。
在图6A、6E及表4和表5中示出了对于HER2+SKOV3细胞(HER2 2/3+)的结合结果。图6A和表4中的结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)在与SKOV3细胞的结合方面与两种不同的抗HER2FSA(v506或v4184)相比展示出高大约1.5倍的Bmax。结果还显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比展示出相等Bmax。v5019与SKOV3结合的表观KD与单独的抗HER2FSA(v506或v4184)或两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比高大约2至4倍。
表4：与SKOV3细胞的结合
图6E和表5中的结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、7091和v10000)在与SKOV3细胞的结合方面与两种不同的抗HER2FSA(v506或v4184)相比展示出高大约1.5至1.6倍的Bmax。结果还显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、7091和v10000)与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比展示出相等Bmax。v5019、7091和v10000及两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合与SKOV3结合的表观KD与单独的抗HER2FSA(v506或v4184)相比高大约2至3倍。
表5：与SKOV3细胞的结合
在JIMT-1细胞系(HER2 2+)中的结合曲线示于图6B和表6中。这些结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)在与JIMT-1细胞的结合方面与抗HER2FSA(v506)相比展示出高大约1.5倍的Bmax。结果还显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比展示出相等Bmax。v5019与JIMT-1结合的表观KD与抗HER2FSA(v506)相比高大约2倍，而与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比相似(高大约1.2倍)。
表6：与JIMT-1细胞的结合
在MCF7细胞系(HER2 1+)中的结合曲线示于图6C、6F及表7和8中。这些结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、7091和v10000)在与MCF7细胞的结合方面与抗HER2FSA(v506)相比展示出高大约1.5倍的Bmax。图6C中的结果还显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比展示出相等Bmax。v5019与MCF7结合的表观KD与抗HER2FSA(v506)和两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相似。
表7：与MCF7细胞的结合
图6F和表8中的结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)与FSA单特异性v506相比展示出高大约1.6至1.7倍的Bmax。v5019、v7091和v10000的表观KD与抗HER2FSA(v506)相似。
表8：与MCF7细胞的结合
在MDA-MB-231细胞系(HER2 0/1+)中的结合曲线示于图6D和表9中。这些结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)在与MDA-MB-231细胞的结合方面与抗HER2FSA(v506)相比展示出高大约1.5倍的Bmax。结果还显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比展示出相等Bmax。v5019与MDA-MB-231结合的表观KD与抗HER2FSA(v506)相比低大约2.4倍而与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比高大约1.7倍。
表9：与MDA-MB-231细胞的结合
在WI-38肺成纤维细胞系中的结合曲线示于图6G和表10中。WI-38细胞系是表达基底水平(HER2 0+，约10,000个受体/个细胞)的HER2的正常肺上皮细胞(Carter等1992，PNAS，89：4285-4289；Yarden 2000，HER2：Basic Research，Prognosis and Therapy)。这些结果显示示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)在与WI-38细胞的结合方面与抗HER2FSA(v506)相比展示出等效细胞表面修饰(decoration)(Bmax)；然而，注意到对于v506的结合似乎未达到饱和，并且因此不能测定KD。示例性双互补位抗HER2抗体之间的表观KD相等。
表10：与WI-38细胞的结合
抗体变体 KD(nM) Bmax
v506 未测定 约366
v5019 7.0 380
v7091 8.3 371
v10000 8.4 418
这些结果显示示例性双互补位抗HER2抗体可与HER2 1+、2+和3+肿瘤细胞结合，达到比抗HER2单特异性FSA高大约1.5至1.6倍的水平，并且示例性双互补位抗HER2抗体可与HER2 1+、2+和3+肿瘤细胞结合，达到与具有不同表位特异性的两种独特单特异性抗HER2FSA的组合等效的水平。这些结果还显示双互补位抗HER2抗体(即与单特异性抗HER2抗体v506相比)未显示出与表达大约10,000个HER2受体/个细胞或更少的基底HER2表达细胞的结合增加，并且与双互补位抗HER2抗体的细胞表面结合增加的阈值出现在HER2受体水平为大约>10,000个受体/个细胞时。基于该数据，预期示例性双互补位抗HER2抗体与HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞的细胞表面结合将增加，但是与按大约10,000个受体或更少表达基底水平的HER2受体的非肿瘤细胞的细胞表面结合不会增加。
实施例7：双互补位抗HER2抗体抑制HER2+细胞生长的能力
测量示例性双互补位抗HER2抗体抑制表达3+和2+水平的HER2的细胞生长的能力。在HER2 3+细胞系BT-474、SKBr3、SKOV3和HER2 2+JIMT-1中进行实验。测试双互补位抗HER2抗体v5019、v7091和v10000。如下所述测量双互补位抗HER2抗体抑制BT-474细胞(200nM抗体)、SKOV3、SKBr3和JIMT-1细胞(300nM抗体)的能力。
将测试抗体稀释于培养基中并按10μl/孔添加到细胞中，一式三份。将板在37℃下温育3天。使用AlamarBlueTM(Biosource#dal1100)或测量细胞活力并且按照生产商的说明读取吸光度。将数据归一化为未处理的对照并且在GraphPad prism中进行分析。
生长抑制结果示于图7A-E中。表11A和11B中提供了结果的总结。图7A-B和表11A的结果表明示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)能够抑制HER2+SKOV3和BT-474细胞系的生长。图10A显示抗HER2双互补位抗体在与抗HER2FSA(v506)相比时和在与两种抗HER2FSA抗体(v506+v4184)的组合相比时，介导对SKOV3的最强生长抑制。
表11A：对HER2 3+癌细胞的生长抑制
图7C-E和表11B中的结果表明示例性抗HER2双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)可以抑制HER2 3+SKBR3、HER2 2+/3+SKOV3和HER2 2+JIMT-1肿瘤细胞系的生长。图7C显示抗HER2双互补位抗体v7091和v10000介导对HER2 3+SKBr3乳腺肿瘤细胞的最强生长抑制。图7D显示抗HER2双互补位抗体(v7091和v10000)介导对HER2 3+SKOV3卵巢肿瘤细胞的最强生长抑制。图7E显示抗HER2双互补位抗体(v7091和v10000)介导对HER2 2+赫塞汀(Herceptin)抗性JIMT-1肿瘤细胞的最强生长抑制。在测试的所有细胞系中，示例性抗HER2双互补位抗体(v7091和v10000)与抗HER2FSA单特异性抗体(v506)相比介导更强的生长抑制。
表11B：对HER2 3+癌细胞的生长抑制
这些结果显示示例性饱和浓度的双互补位抗HER2抗体可以抑制HER2 3+和2+乳腺和卵巢肿瘤细胞及HER2 2+曲妥珠单抗抗性肿瘤细胞生长，比FSA抗HER2单特异性抗体强大约20％。
实施例8：与HER2ECD相比双互补位抗HER2抗体的互补位与二聚HER2优先结合
进行该实验是为了测定示例性双互补位抗HER2抗体单独的互补位与二聚HER2和HER2ECD结合的能力，作为膜结合HER2(HER2-Fc)和脱落HER2ECD之间差异性结合的替代。实验如下进行。
表面等离子体共振(SPR)分析：使用来自于Biacore(GE Healthcare)的T200***通过SPR测量单价抗HER2抗体(v1040或v4182)与HER2胞外结构域(sHER-2，EbioscienceBMS362，_其编码全长蛋白质的氨基酸23-652)和HER2-Fc(二聚HER2-Fc融合物，其编码胞外结构域的氨基酸1-652；Sino Biological Inc.，10004-H02H)结合的亲和力。通过以下方法测定与HER2ECD的结合。通过达到44RU(反应单位)水平的胺偶合将在10mm Hepes(pH 6.8)中的HER2ECD固定在CM5芯片上。使单价抗HER2抗体通过HER2固定芯片的表面，浓度范围为0.76-60nM。通过以下方法测定与HER2-Fc的结合。通过达到43RU水平的胺偶合将在10mmHepes(pH 6.8)中的HER2-Fc固定在CM5芯片上。使单价抗HER2抗体通过HER2固定芯片的表面，浓度范围为0.76-60nM。分析对于结合的抗体浓度，一式三份。使用单循环动力学方法测定平衡解离结合常数(KD)和动力学参数(ka和kd)。将传感图(Sensogram)全局性拟合为1:1Langmuir结合模型。所有实验均在室温下进行。
结果示于图8A、图8B、表11C和表11D中。图8A和表11C中的结果示出了单价抗HER2抗体(v1040；代表示例性抗HER2双互补位抗体的CH-B上的抗原结合结构域)的SPR结合数据。图8A说明了v1040与固定的HER2ECD或HER2-Fc结合的KD值(nM)并且显示单价抗HER2抗体与HER2-Fc的结合与HER2ECD相比具有更低的KD。表11C示出了单价抗HER2抗体(OA)与全尺寸抗HER2抗体(FSA)相比在与HER2ECD和HER2-FC(‘HER2mem’)结合中的ka(1/M s)和kd(1/s)值。该数据示出了OA和FSA与HER2ECD和HER2-Fc结合的相当的结合(ka)和分离(kd)速率。
表11C：单价抗HER2抗体(OA)与全尺寸抗HER2抗体(FSA)相比在与HER2ECD和HER2-FC(‘HER2mem’结合中的ka(1/Ms)和kd(1/s)值
ka(1/Ms) kd(1/s)
OA与HER2ECD 2.00E+05 6.15E-05
FSA与HER2ECD 4.14F+05 2.01E-05
OA与HER2mem 1.88E+05 4.38E-05
FSA与HER2mem 3.41E+05 4.94E-06*
图8B和表11D中的结果示出了单价抗HER2抗体(v4182；代表示例性抗HER2双互补位抗体的CH-A上的抗原结合结构域)的SPR结合数据。图8B说明了v4182与固定的HER2ECD或HER2-Fc结合的KD值(nM)并且显示单价抗HER2抗体与HER2-Fc的结合与HER2ECD相比具有更低的KD。表11D示出了单价抗HER2抗体(OA)与全尺寸抗HER2抗体(FSA)相比在与HER2ECD和HER2-FC(‘HER2mem’)结合中的ka(1/M s)和kd(1/s)值。该数据示出了OA和FSA与HER2ECD和HER2-Fc结合的相当的结合(ka)和分离(kd)速率。
表11D：
ka(1/Ms) kd(1/s)
OA与HER2ECD 9.08E+04 6.17E-04
FSA与HER2ECD 9.55E+04 3.93E-04
OA与HER2mem 1.39E+05 2.04E-04
FSA与HER2mem 1.77E+05 6.84E-05
这些数据显示示例性抗HER2双互补位抗体的每个互补位与二聚HER2抗原(膜结合HER2的代表)的结合与HER2ECD相比具有更低的KD。基于该数据，预计与患病患者血清中存在的并且可以作为治疗性抗体的接收池的脱落HER2ECD相比，示例性抗HER2抗体对膜结合HER2抗原将具有更高的结合亲和力(Brodowicz T等Soluble HER-2/neu neutralizesbiologic effects of anti-HER-2/neu antibody on breast cancer cells invitro.Int J Cancer.1997；73:875-879)。例如，≤15ng/mL的基线HER2ECD水平；而患有进行性疾病的患者具有≥38ng/mL的HER2ECD。
实施例9：在HER2+细胞中双互补位抗HER2抗体的全细胞负荷和内化
进行该实验是为了评估示例性双互补位抗HER2抗体被内化于HER2 2+细胞中的能力。根据Schmidt,M.等，Kinetics of anticar cinoembryonic antigen antibodyinternalization:effects of affinity,bivalency,and stability.Cancer ImmunolImmunother(2008)57:1879-1890中详述的方案仿效直接内化法。具体地，使用488蛋白标记试剂盒(Invitrogen,cat.no.A10235)，根据生产商的说明直接标记抗体。
对于内化测定而言，用1x105个细胞/孔接种12孔板并且在37℃+5％CO2下温育过夜。第二天，按在DMEM+10％FBS中200nM添加标记抗体并且在37℃+5％CO2下温育24小时。在黑暗条件下，抽吸培养基并且用2x500μL PBS洗涤孔。为收获细胞，在37℃下添加(250μL)细胞解离缓冲液。细胞沉淀并重新悬浮在100μL无或有抗Alexa Fluor 488、50μg/mL的兔IgG成分(Molecular Probes,A1 1094)的DMEM+10％FBS中，并于冰上温育30min。分析前，添加300μL DMEM+10％FBS过滤样品4μl碘化丙啶。使用LSRII流式细胞仪分析样品。
在图9A和图9B中示出了示例性抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中内化的能力。图9A示出了在与示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2FSA对照温育24小时后，在BT-474细胞中可检测表面和内部抗体的结果。这些结果显示与示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)温育与抗HER2FSA对照相比在BT-474细胞中产生多大约2倍的内化抗体。图9B示出了在与示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2FSA对照温育24小时后，在JIMT-1细胞中可检测表面和内部抗体的结果。这些结果显示与示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)温育与抗HER2FSA对照相比在JIMT-1细胞中产生多大约2倍的内化抗体。在BT-474和JIMT-1细胞中双互补位抗HER2和抗HER2FSA之间24小时后表面染色的量相当。
图10A-F中的结果示出了在4℃下2小时后与全细胞表面结合的可检测抗体与在37℃下24小时后与表面结合的抗体的比较；除在37℃下24小时后内化抗体的量以外。图10A示出了在BT-474细胞中与示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2FSA对照温育后的结果。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和BT-474细胞一起温育24小时导致全细胞表面上检测到的抗体减少15％。图10A还显示与示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)温育后在BT-474细胞中产生与抗HER2FSA对照相比多大约2倍的内化抗体。
图10B示出了在JIMT-1细胞中用示例性抗HER2双互补位抗体和抗HER2FSA对照温育后的结果。图10B是图9B中所示实验的重复，增加了在4℃下2小时后的表面染色。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和JIMT-1细胞一起温育24小时导致全细胞表面上检测到的抗体减少57％。图10B还显示与示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)温育在BT-474细胞中在37℃下温育24小时后与抗HER2FSA对照相比产生更多的内化抗体。
图10C示出了在SKOV3细胞中与示例性抗HER2双互补位抗体温育后的结果。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和SKOV3细胞一起温育24小时导致全细胞表面上检测到的抗体减少大约32％。
图10D示出了在MCF7细胞中与示例性抗HER2双互补位抗体温育后的结果。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和MCF7细胞一起温育24小时导致全细胞表面上检测到的抗体减少大约45％。
图10E示出了在SKOV3细胞中与示例性抗HER2双互补位抗体v5019、v7091和v10000温育后的结果。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和SKOV3细胞一起温育产生与抗HER2FSA对照相比多1.5至1.8倍的内化抗体。与抗HER2FSA对照温育24小时导致在全细胞表面上检测到的抗体减少最多(约77％)。
图10F示出了在JIMT-1细胞中与示例性抗HER2双互补位抗体v5019、v7091和v10000温育后的结果。这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体和JIMT-1细胞一起温育产生与抗HER2FSA对照相比多1.4至1.8倍的内化抗体。与抗HER2双互补位抗体(v5019和v10000)温育24小时导致在全细胞表面上检测到的抗体减少最多(约64％)。
这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体与单特异性抗HER2FSA相比在HER2+细胞中具有优良的内化性质。在37℃下温育24小时后检测到的表面抗体减少表明示例性抗HER2双互补位抗体在HER2+细胞中温育后能够减少细胞表面HER2受体的量并且在HER22+肿瘤细胞中温育后表面HER2减少最多。
实施例10：抗HER2双互补位抗体在和HER2+细胞一起温育后在1、3和16小时的细胞 染色和定位
进行该实验是为了分析在不同时间点示例性抗HER2双互补位抗体在HER2+JIMT-1细胞中的内化并且按照实施例9中呈现的方法的正交法分析全细胞负荷和内化。
在无血清DMEM中在37℃+5％CO2下将JIMT-1细胞与200nM的抗体(v506、v4184、v5019或v506和v4184的组合)温育1小时、3小时和16小时。用温热无菌PBS(500ml/孔)轻轻洗涤细胞两次。在室温下用250ml的10％***/PBS溶液固定细胞10min。用PBS(500μl/孔)洗涤固定的细胞三次，用250μl/孔的含有0.2％Triton X-100的PBS透化5min，并用500μl/孔PBS洗涤三次。在室温下用500μl/孔的PBS+5％山羊血清封闭细胞1小时。去除封闭缓冲液，并且在室温下温育300μl/孔的二抗(Alexa Fluor 488偶联的AffiniPure Fab片段山羊抗人IgG(H+L)；Jackson ImmunoResearch Laboritories,Inc.；109-547-003)1小时。用500μl/孔的PBS洗涤细胞三次并且然后使用含DAPI的Prolong gold anti-fade(LifeTechnologies；#P36931)将容纳固定的细胞的盖玻片固定在载玻片上。使用OlympusFV1000共聚焦显微镜获取60倍单幅图像。
结果表明在3小时时示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)内化到JIMT-1细胞中并且主要位于细胞核附近。比较温育3小时的图像显示与两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合相比和与单独的抗HER2FSA(v506或v4184)相比，与抗HER2双互补位抗体相关的内部染色的量更大。将抗HER2双互补位抗体(v5019)结果与抗HER2FSA(v4184)做比较时看到抗体染色的细胞定位方面的差异；其中抗HER2FSA(v4184)在1、3和16小时时间点显示出明显的质膜染色。对于抗HER2FSA(v506)、两种抗HER2FSA(v506+v4184)的组合及抗HER2双互补位抗体处理(数据未示出)而言，可检抗体的量在第16小时减少。
这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体v5019内化于HER2+细胞中并且在3小时温育后内化抗体可检。这些结果与实施例9中呈现的结果一致，显示示例性抗HER2双互补位抗体与抗HER2FSA相比在HER2+细胞中可以内化达到更大的量。
实施例11：与对照相比双互补位抗HER2抗体介导的HER2+细胞的ADCC
进行该实验是为了测量示例性双互补位抗HER2抗体在SKOV3细胞(卵巢癌，HER2 2+/3+)中介导ADCC的能力。
将靶细胞与测试抗体(从45μg/ml开始的10倍递减浓度)预温育30分钟，接着按5:1的效应细胞/靶细胞比率添加效应细胞并且在37℃+5％CO2下继续温育6小时。用8种从45μg/ml开始10倍递减的浓度测试样品。使用LDH测定试剂盒测量LDH释放量。
用不同浓度的样品，以5:1、3:1和1:1的效应细胞/靶细胞(E/T)比率进行剂量-反应研究。使用GraphPad prism用S形剂量反应非线性回归拟合分析半最大有效浓度(EC50)值。
将细胞保持在37℃/5％CO2下的McCoy 5a完全培养基中并定期用补充了10％FBS的合适培养基根据来自于ATCC的方案传代培养。传代数少于p10的细胞用于测定。在用于测定之前用补充了1％FBS和1％青霉素/链霉素的无酚红DMEM培养基将样品稀释到介于0.3-300nM之间的浓度。
图11A和表12中示出了在5:1的效应细胞/靶细胞比率下HER2+SKOV3细胞中的ADCC结果。这些结果显示与抗HER2FSA(v792)和两种不同的抗HER2FSA的组合(v792+v4184)相比时，示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)通过ADCC介导最大百分比的最大限度靶细胞裂解。示例性双互补位抗HER2抗体介导的最大限度细胞裂解的差异与抗HER2FSA相比高大约1.6倍，而与两种不同的抗HER2FSA(v792+v4184)的组合相比高大约1.2倍。
表12：
图11B和表13中示出了在3:1的效应细胞/靶细胞比率下HER2+SKOV3细胞中的ADCC结果。这些结果显示与抗HER2FSA(v792)和两种不同的抗HER2FSA的组合(v792+v4184)相比时，示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)通过ADCC介导最大百分比的最大限度靶细胞裂解。示例性双互补位抗HER2抗体介导的最大限度细胞裂解的差异与抗HER2FSA相比高大约1.3倍，而与两种不同的抗HER2FSA(v792+v4184)的组合相比高大约1.8倍。
表13：
图11C和表14中示出了在1:1的效应细胞/靶细胞比率下HER2+SKOV3细胞中的ADCC结果。这些结果显示与抗HER2FSA(v792)和两种不同的抗HER2FSA的组合(v792+v4184)相比时，示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)通过ADCC介导最大百分比的最大限度靶细胞裂解。示例性双互补位抗HER2抗体介导的最大限度细胞裂解的差异与抗HER2FSA相比高大约1.8倍，而与两种不同的抗HER2FSA(v792+v4184)的组合相比高大约1.13倍。
表14：
图11和表12-14中的结果显示与抗HER2FSA和两种抗HER2FSA的组合相比时，示例性双互补位HER2抗体在不同E:T比率下均介导SKOV3细胞的最强ADCC。在化疗后表达可变和/或减少的循环效应细胞的HER2+患病患者中将预计会观察到抗HER2双互补位抗体介导的ADCC增加(Suzuki E.等Clin Cancer Res2007；13:1875-1882)。图11中的观察结果与实施例6中呈现的全细胞结合Bmax一致，其显示与抗HER2FSA相比，在与示例性抗HER2双互补位抗体的细胞结合增加大约1.5倍。
实施例12：示例性抗HER2抗体与HER2ECD结合的能力
SPR测定用于评价示例性抗HER2双互补位抗体与HER2ECD结合的机制；具体地，用于了解一个双互补位抗体分子的两个互补位是否可以与一个HER2ECD结合(顺式结合；1:1抗体:HER2分子)或一个双互补位抗体的每个互补位是否可以结合两个不同的HER2ECD(反式结合；1:2抗体:HER2分子)。图14中说明了顺式与反式结合的示意图。分离速率降低(更慢)与抗体捕获水平(表面密度)提高之间的相关性指示反式结合(即一个抗体分子与两个HER2分子结合。
使用来自于Biacore(GE Healthcare)的T200***通过SPR测量示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与重组人HER2的亲和力及结合动力学参数并且与单价抗HER2抗体(v630或v4182；包含v5019的单独互补位)的亲和力及结合动力学参数比较。使用标准胺偶合将介于2000和4000RU之间在介于5和10μg/ml之间的浓度下注射的抗人Fc固定在CM5芯片上。单价抗HER2抗体(v630或v4182)和示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)被捕获在抗人Fc上(在PBST中在范围为0.08至8μg/ml的浓度下，按10μl/min注射1分钟)，反应水平范围为350-15RU。将重组人HER2稀释于PBST中并且在120nM、200nM或300nM的起始浓度下稀释3倍注射并且按50μl/分钟的流速注射3分钟，接着在末次注射结束时再解离30分钟。分析HER2稀释物，一式两份。将传感图全局性拟合为1:1Langmuir结合模型。所有实验均在25℃下进行。
结果示于图12和图13中。
图12A中的结果示出了在一定注射和捕获抗体浓度范围内在芯片表面上单价抗HER2(v630和v4182)及示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与重组人HER2结合的ka(1/Ms)。这些结果显示对于v630、v4182和v5019而言时在不同抗体捕获水平下ka不变。
图12B中的结果示出了在一定注射和捕获抗体浓度范围内在芯片表面上单价抗HER2(v630和v4182)及示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与重组人HER2结合的kd(1/s)。这些结果显示仅对于示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)而言在递增的抗体捕获水平下kd降低。
图12C中的结果示出了在一定注射和捕获抗体浓度范围内在芯片表面上单价抗HER2(v630和v4182)及示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与重组人HER2结合的KD(M)。这些结果显示仅对于示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)而言在递增的抗体捕获水平下KD降低。这个结果与图15B中所示递减的kd值相关。
图13A中的结果示出了在一定抗体捕获水平范围内示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)与重组人HER2结合的kd(1/s)。这些结果显示kd值与芯片表面上捕获的抗体的更高RU成反比(即在越高的抗体捕获水平下分离速率越慢)。结果表明正如在较高的抗体捕获水平下分离速率降低所证明那样，示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)能够结合两个独立HER2分子上的HER2ECD2和HER2ECD4(即反式结合)。该数据受图47中呈现且实施例43中讨论的类似实验支持，其中二价单特异性抗HER2FSA(v506)展示出顺式结合(1:1抗体:HER2)，其中正如对这种分子所预期的那样，kd(1/s)和KD(M)值在递增的抗体捕获水平下保持不变。
图13B中的结果示出了在一定抗体捕获水平范围内单价抗HER2抗体(v4182)与重组人HER2结合的kd(1/s)。这些结果显示在芯片表面上捕获的不同抗体RU范围内kd值无变化。这些结果显示单价抗HER2抗体(v4182)1:1单价结合(顺式结合)。
图13C中的结果示出了在一定抗体捕获水平范围内单价抗HER2抗体(v630)与重组人HER2结合的kd(1/s)。这些结果显示在芯片表面上捕获的不同抗体RU范围内kd值无变化。这些结果显示单价抗HER2抗体(v630)1:1单价结合(顺式结合)。该数据受图47中呈现且实施例43X中讨论的实验支持，其中二价单特异性抗HER2FSA(v506)在kd(1/s)上未显示出变化。
图12和图13中的结果表明示例性双互补位抗HER2抗体(v5019)能够呈反式同时与两个HER2分子结合(抗体:HER2比率1:2)。通过SPR检测的反式结合机制与实施例6中呈现的较高细胞表面饱和结合数据(Bmax)，连同实施例9和10中呈现的内化数据一致。
实施例13：示例性双互补位抗HER2抗体温育对BT-474细胞中AKT磷酸化的影响
使用AKT Colorimetric In-Cell ELISA试剂盒(Thermo Scientifiic；目录号62215)根据生产商的说明，做以下修改测试示例性抗HER2双互补位抗体减少BT-474细胞中的pAKT信号传导的能力。按5x103个/孔接种细胞并且在37℃+5％CO2下温育24小时。将细胞与100nM抗体温育30min，接着与rhHRG-β1温育15min。根据说明洗涤、固定及透化细胞。添加二抗(1:5000；Jackson ImmunoReasearch，HRP-驴抗小鼠IgG，JIR，Cat#715-036-150；HRP-驴抗兔IgG，JIR，目录号711-036-452)并且根据生产商的说明进行测定。
图15中的结果显示与示例性抗HER2双互补位抗体温育在HRGβ1的存在下相对于人IgG对照(CTL)介导p-Akt水平降低大约1.2倍。两种抗HER2FSA的组合(v506+v4184)在HRGβ1的存在下介导p-Akt水平降低最多，与人IgG对照相比低大约1.5倍。在无配体(HRGβ1)时用示例性抗HER2双互补位抗体与人IgG对照抗体相比检测到p-Akt适度降低。
这些数据显示示例性抗HER2双互补位抗体可以阻断HER2+细胞中的配体活化的信号传导。
实施例14：双互补位抗HER2抗体对心肌细胞活力的影响
测量示例性双互补位抗HER2抗体和ADC对心肌细胞活力的影响是为了获得潜在心脏毒性作用的初步指征。
根据生产商的说明培育表达基底水平的HER2受体的iCell心肌细胞(CellularDynamics International，CMC-100-010)并且用作靶细胞以评估在抗体处理后的心肌细胞健康状况。测定如下进行。将细胞接种在96孔板中(15,000个细胞/孔)并维持48小时。将细胞培养基更换为维持培养基并将细胞维持72小时。为评估抗体诱导的心脏毒性的影响，用10和100nM的单独或组合变体处理细胞72小时。为评估蒽环类诱导的心脏毒性的影响(单独的或与示例性双互补位抗HER2抗体组合)，用3uM(约IC20)多柔比星处理细胞1小时，接着用10和100nM的单独或组合变体处理72小时。通过用发光细胞生存期测定(Promega，G7570)和/或磺酰罗丹明(Sigma 230162-5G)按照生产商的说明定量细胞ATP水平而评估细胞活力。
结果示于图16A-C中。图16A中的结果显示将心肌细胞与治疗相关浓度的示例性抗HER2双互补位抗体(v5019)和示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)温育，相对于未处理的对照(‘mock’)不影响心肌细胞活力。
图16B中的结果显示将心肌细胞与治疗相关浓度的示例性抗HER2双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)和示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)温育相对于未处理的对照(‘mock’)对心肌细胞活力没有影响。基于图16A和16B中的结果，预计示例性抗HER2双互补位抗体和示例性抗HER2双互补位ADC应不会(例如)通过线粒体功能障碍诱导心肌病，正如用其它抗HER2靶向抗体所报道的一样(Grazette L.P.等Inhibition ofErbB2Causes Mitochondrial Dysfunction in Cardiomyocytes；Journal of theAmerican College of Cardiology:2004；44:11)。
图16C中的结果显示用多柔比星预处理心肌细胞，接着与治疗相关浓度的示例性抗HER2双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)和示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)温育相对于未处理的对照+多柔比星(‘Mock+多柔比星’)对心肌细胞活力没有影响。基于图16C中的结果，预计示例性抗HER2双互补位抗体和示例性抗HER2双互补位ADC在接受蒽环类同时治疗的患者中应不会引起心功能障碍的风险升高(Seidman A、Hudis C、Pierri MK等Cardiac dysfunction in the trastuzumab clinical trialsexperience.J Clin Oncol(2002)20:1215-1221)。
图16A-C显示将心肌细胞与抗HER2双互补位抗体和ADC温育与单特异性抗HER2FSA抗体(v506)、抗HER2FSA抗体组合(v506+v4184)和ADC(v6246)相比，单独或与多柔比星组合处理时具有等效作用。基于这些结果，预计示例性抗HER2双互补位抗体和ADC与抗单特异性抗HER2FSA、曲妥珠单抗或ADC、T-DM1相比不会具有更强的心脏毒性作用。
实施例15：示例性双互补位抗HER2-ADC在HER2+细胞中的细胞毒性
测量示例性双互补位抗HER2-ADC抗体(v6363、v7148和v10553)在HER2+细胞中介导细胞毒性的能力。在一些情况下将与DM1偶联的人IgG(v6249)用作对照。在HER2+乳腺肿瘤细胞系JIMT-1、MCF7、MDA-MB-231、HER2+卵巢肿瘤细胞系SKOV3和HER2+胃细胞系NCI-N87中进行实验。评价示例性双互补位抗HER2-ADC抗体在HER2+细胞中的细胞毒性并且与单特异性抗HER2FSA-ADC(v6246)和抗HER2-FSA-ADC+抗HER2-FSA对照(v6246+v4184)做比较。如实施例7中所述执行所述方法，做以下修改。将抗HER2ADC与SKOV3和JIMT-1(图17A和B)靶细胞一起温育24小时，洗涤细胞，更换培养基并且在37℃下温育5天后评价细胞生存期。抗HER2ADC与靶MCF7和MDA-MB-231靶细胞一起温育6小时(图17C和D)，洗涤细胞，更换培养基并且在37℃下温育5天后评价细胞生存期。在图17E-G中，将抗HER2ADC同时与SKOV3、JIMT-1、NCI-N87靶细胞一起温育5天。如实施例7中所述使用AlamarBlueTM(图17A-D)或(图17E-G)测量细胞活力。
结果示于图17A-G中并且数据总结于表15和16中。
图17A及表15和16中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)和抗HER2-FSA-ADC+抗HER2-FSA(v6246+v4184)的组合相比在JIMT-1中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约13倍的优良EC50。
图17B及表15中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)和抗HER2-FSA-ADC+抗HER2-FSA(v6246+v4184)的组合相比在SKOV3中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约5倍的优良EC50。
图17C及表15中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)和抗HER2-FSA-ADC+抗HER2-FSA(v6246+v4184)的组合相比在MCF7中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约2倍的优良EC50。
图17D及表15中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)和抗HER2-FSA-ADC+抗HER2-FSA(v6246+v4184)的组合相比在MDA-MB-231中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约2倍的优良EC50。
表15：
图17E及表16中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)相比在SKOV3卵巢肿瘤细胞中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约2至7倍的优良EC50值。
图17F及表16中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)与抗HER2-FSA-ADC(v6246)相比在JIMT-1乳腺肿瘤细胞中更具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比低大约6至9倍的优良EC50值。
图17G及表16中的结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)在NCI-N87胃肿瘤细胞中具细胞毒性。示例性抗HER2双互补位ADC具有与抗HER2-FSA-ADC对照相比大致相等的EC50值。
表16：
这些结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)与抗HER2-FSA-ADC对照相比在HER2 3+、2+和1+乳腺肿瘤细胞中更具细胞毒性。这些结果还显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363、v7148和v10553)在HER2 2/3+胃肿瘤细胞中具细胞毒性。这些结果与实施例9中呈现的内化结果一致。
实施例16：双互补位抗HER2抗体在人卵巢癌细胞异种移植模型中的作用
使用建立的人卵巢癌细胞来源的异种移植模型SKOV3评估示例性双互补位抗HER2抗体的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***1mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到220mm3的平均体积；然后将动物随机分为3个处理组：IgG对照、抗HER2FSA(v506)和双互补位抗HER2抗体(v5019)。
每组包括15只动物。每个组的剂量如下：
A)在研究第1天以30mg/kg的负荷剂量将IgG对照静脉给药，然后是20mg/kg的维持剂量每周两次直至研究第39天。
B)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA(v506)静脉给药，然后是10mg/kg的维持剂量每周两次直至研究第18天。在第22至39天，将5mg/kg抗HER2FSA静脉给药，每周两次。同时按5mg/kg将抗HER2FSA(v4184)腹膜内给药，每周两次。
C)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将双互补位抗HER2抗体静脉给药，然后是10mg/kg的维持剂量每周两次直至研究第39天。
在研究过程中每周测量肿瘤体积两次，在第22天评估反应数和中位生存期。结果示于图18和表17中。
双互补位抗HER2和抗HER2FSA与IgG对照相比展示出优良的肿瘤生长抑制。双互补位抗HER2抗体与抗HER2FSA组合相比诱导优良的肿瘤生长抑制(图18A)。在第22天双互补位抗HER2抗体与抗HER2FSA v506相比伴有反应肿瘤数增加(分别为11和5)(表17)。示例性双互补位抗HER2抗体和抗HER2FSA与IgG对照相比展示出优良的生存期。双互补位抗HER2抗体与抗HER2FSA(36天)相比具有优良的中位生存期(61天)(图18B和表17)。在研究第22天添加第二抗HER2FSA(v4184)与抗HER2FSA(v506)组合。两种抗HER2FSA的组合与单独的抗HER2FSA(v506)相比诱导进一步的肿瘤生长抑制。
表17：
实施例17：双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人卵巢癌细胞系异种移植模 型中的作用
使用建立的人卵巢癌细胞来源的异种移植模型SKOV3评估与DM1偶联的示例性双互补位抗HER2抗体(v6363)的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***1mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到220mm3的平均体积；然后将动物随机分为3个处理组：IgG对照、抗HER2FSA-ADC和双互补位抗HER2-ADC。
每组包括15只动物。每个组的剂量如下：
A)在研究第1天以30mg/kg的负荷剂量将IgG对照静脉给药，然后是20mg/kg的维持剂量每周两次直至研究第39天。
B)在研究第1天以10mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA-ADC(v6246)静脉给药，然后在第15和29天是5mg/kg的维持剂量。
C)在研究第1天以10mg/kg的负荷剂量将双互补位抗HER2抗体-ADC(v6363)静脉给药，然后在第15和29天是5mg/kg的维持剂量。
在整个研究期间测量肿瘤体积，并在第22天评估反应数和中位生存期。结果示于图19中。表18中示出了结果总结。
双互补位抗HER2-ADC和抗HER2FSA-ADC抑制肿瘤生长比IgG对照更佳(图19A和表18)。双互补位抗HER2-ADC抑制肿瘤生长达到比抗HER2FSA-ADC更高的程度。双互补位抗HER2-ADC组与抗HER2FSA-ADC相比伴有反应肿瘤数增加(分别为11和9)。双互补位抗HER2-ADC和抗HER2FSA-ADC组与IgG对照相比展示出优良的生存期(图19B和表18)。与具有36天的中位生存期的抗HER2FSA-ADC相比，双互补位抗HER2抗体组展示出61天的中位生存期(图19B和表18)。
表18：
实施例18：双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人原代细胞异种移植模型 (HBCx-13b)中的作用
使用来自于人乳腺癌的曲妥珠单抗抗性患者来源的异种移植模型HBCx-13B，评估与DM1偶联的示例性双互补位抗HER2抗体的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***20mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到100mm3的平均体积；然后将动物随机分为3个处理组：抗HER2FSA(v506)、抗HER2FSA-ADC(v6246)和双互补位抗HER2-ADC(v6363)。每个组包括7只动物。每个组的剂量如下：
A)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA静脉给药，然后在研究第4、8、11、15、18、22和25天施用10mg/kg的维持剂量。
B)在研究第1天以10mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA-ADC静脉给药，然后在第22天是5mg/kg的维持剂量。
C)在研究第1天以10mg/kg的负荷剂量将双互补位抗HER2抗体-ADC静脉给药，然后在第22天是5mg/kg的维持剂量。
在整个研究期间测量肿瘤体积，并在第50天评估平均肿瘤体积、完全反应和零残留疾病参数。结果示于图20中。表19中示出了结果总结。
双互补位抗HER2-ADC和抗HER2FSA-ADC比抗HER2FSA(v506)展示出更强的肿瘤生长抑制。双互补位抗HER2-ADC抑制肿瘤生长比抗HER2FSA-ADC更佳。双互补位抗HER2-ADC组与抗HER2FSA-ADC组相比伴有显示出完全反应(比基线降低10％以上)(分别为7和4)和显示出零残留疾病(分别为5和2)的肿瘤数增加。
表19：
实施例19：双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人原代细胞异种移植模型 (T226)中的作用
使用来自于人乳腺癌的患者来源的曲妥珠单抗抗性异种移植模型T226，评估示例性双互补位抗HER2-ADC的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***20mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到100mm3的平均体积；然后将动物随机分为4个处理组：IgG对照(n＝15)、抗HER2FSA(v506；n＝15)、抗HER2FSA-ADC(v6246；n＝16)和双互补位抗HER2-ADC偶联物(v6363；n＝16)。每个组的剂量如下：
A)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将IgG对照静脉给药，并且在研究第4、8、11、15、18、22和25天施用10mg/kg的维持剂量。
B)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA静脉给药，并且在研究第4、8、11、15、18、22和25天施用10mg/kg的维持剂量。
C)在研究第1和15天以5mg/kg将抗HER2FSA-ADC静脉给药。
D)在研究第1和15天以5mg/kg将双互补位抗HER2-ADC偶联物静脉给药。
在整个研究期间测量肿瘤体积，并在第31天评估平均肿瘤体积和完全反应参数。结果示于图21中。表20中示出了结果总结。
双互补位抗HER2-ADC和抗HER2FSA-ADC与抗HER2FSA(v506)和IgG对照相比展示出更佳的肿瘤生长抑制。在这种模型中示例性双互补位抗HER2-ADC与抗HER2FSA-ADC相比(图21和表20)诱导等效肿瘤生长抑制和完全基线消退。
表20：
实施例20：双互补位抗HER2抗体药物偶联物(ADC)在人原代细胞异种移植模型 (HBCx-5)中的作用
使用来自于人乳腺癌的患者来源的曲妥珠单抗抗性异种移植模型HBCx-5(浸润性导管癌，管腔B型)，评估示例性双互补位抗HER2-ADC的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***20mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到100mm3的平均体积；然后将动物随机分为4个处理组：IgG对照(n＝15)、抗HER2FSA(v506；n＝15)、抗HER2FSA-ADC(v6246；n＝16)和双互补位抗HER2-ADC(v6363；n＝16)。每个组的剂量如下：
A)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将IgG对照静脉给药，并且在研究第4、8、11、15、18、22和25天施用10mg/kg的维持剂量。
B)在研究第1天以15mg/kg的负荷剂量将抗HER2FSA静脉给药，并且在研究第4、8、11、15、18、22和25天施用10mg/kg的维持剂量。
C)在研究第1和15、22、29、36天以10mg/kg将抗HER2FSA-ADC静脉给药。
D)在研究第1和15、22、29、36天以10mg/kg将双互补位抗HER2-ADC静脉给药。
在整个研究期间测量肿瘤体积，并在第43天评估平均肿瘤体积、T/C比率、反应数、完全反应和零残留疾病参数。结果示于图22中。表21中示出了结果总结。
双互补位抗HER2-ADC和抗HER2FSA-ADC与抗HER2FSA(v506)和IgG对照相比展示出更佳的肿瘤生长抑制。在曲妥珠单抗抗性HBCx-5人乳腺癌异种移植模型中示例性双互补位抗HER2-ADC与抗HER2FSA-ADC相比(图22和表21)诱导等效肿瘤生长抑制而且具有增加的反应数。
表21：
实施例21：在人细胞系异种移植模型(SKOV3)中双互补位抗HER2抗体药物偶联物 (ADC)对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响
使用实施例17中描述的建立的人卵巢癌细胞来源的异种移植模型SKOV3评估在抗HER2治疗抗性肿瘤中示例性双互补位抗HER2-ADC的抗肿瘤功效。
按照如实施例17中所述的方法，做以下修改。在研究第1天以15mg/kg并且在第4、8、15天以10mg/kg为一个群组的动物静脉给药抗HER2抗体；然而，在这种模型中这种处理到第15天也未能展示出有效反应。然后将该处理组转为用示例性双互补位抗HER2抗体药物偶联物(v6363)处理并且在研究第19和27天以5mg/kg和在研究第34、41和48天以15mg/kg给药。
在整个实验过程中每周测量肿瘤体积两次。
结果示于图23中并且表明用示例性双互补位抗HER2-ADC(v6363)处理的组显示肿瘤消退至小于220mm3的初始平均体积的平均肿瘤体积。
实施例22：在人原代细胞异种移植模型(HBCx-13b)中双互补位抗HER2抗体药物偶 联物(ADC)对抗HER2治疗抗性肿瘤的影响
使用来自于人乳腺癌的曲妥珠单抗抗性患者来源的异种移植模型HBCx-13B，评估与DM1偶联的示例性双互补位抗HER2抗体的抗肿瘤功效。
按照如实施例18中所述的方法，做以下修改。在研究第1天以15mg/kg并且在第4、8、15、18、22和25天以10mg/kg为一个群组的动物静脉给药双特异性抗ErbB家族靶向抗体；然而，这种处理也未能展示出有效反应。然后将该处理组转为用示例性双互补位抗HER2抗体药物偶联物(v6363)处理并且在第31、52天以10mg/kg和在第45天以5mg/kg给药。在整个研究持续期间测量肿瘤体积。
结果示于图24中。这些结果显示示例性双互补位抗HER2-ADC(v6363)防止肿瘤进展。从首次剂量到第57天，v6363处理组的肿瘤体积增长低于2％，而在同一时间间隔v506处理组生长110％以上。
实施例23：示例性双互补位抗HER2抗体的岩藻糖含量的分析
进行糖肽分析以定量示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)的N连接聚糖的岩藻糖含量。
如下进行糖肽分析。在56℃下用10mM DTT还原抗体样品1小时并且在室温下用55mM碘乙酰胺烷基化1小时并在37℃下在50mM碳酸氢铵中经胰蛋白酶溶液消化过夜。在QTof-Ultima上通过纳米LC-MS/MS分析胰蛋白酶消化物。用Mascot搜索NCBI数据库以鉴定蛋白质序列。使用MaxEnt3(MassLynx)去卷积糖肽离子并定量不同的糖型。
糖肽分析结果的总结在表22中。示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)的N连接的聚糖大约90％岩藻糖基化(10％N连接聚糖无岩藻糖)。单特异性抗HER2FSA(v506)N连接的聚糖大约96％岩藻糖基化(4％N连接的聚糖无岩藻糖)并且 大约87％岩藻糖基化(4％N连接的聚糖无岩藻糖)。
表22：Fc N连接的糖肽分析
这些结果显示在CHO细胞中瞬时表达的双互补位抗HER2抗体(具有异二聚体Fc)与商用相比在N-聚糖中具有高大约3％的岩藻糖含量。在CHO细胞中瞬时表达的同二聚体抗HER2FSA(v506)具有大约为96％的最高岩藻糖含量。
实施例24：示例性双互补位抗HER2抗体的热稳定性
如下所述通过DSC测量示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)和ADC(v6363、v7148和v10533)的热稳定性。
在MicroCalTM VP-Capillary DSC(GE Healthcare)中使用在PBS中调节为约0.3mg/ml的纯蛋白样品(抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC)进行DSC。从20至100℃按60℃/小时的速率，以低反馈、8秒过滤、5分钟preTstat和70psi氮气压力扫描样品。使用Origin7软件对所得热谱图进行分析。
示例性双互补位抗HER2抗体(v5019、v7091和v10000)的热稳定性结果示于图25A-C中。图25A示出了v5019的热谱图(thermogram)；Fc和各自的A链Fab具有75℃的Tm而5019的B链scFv具有69℃的Tm。图25B示出了v10000的热谱图；Fc CH3结构域具有82℃的Tm，Fab A链具有76.5℃的Tm且B链scFv有69.5℃的Tm。图25C示出了v7091的热谱图；Fc CH3结构域具有82℃的Tm，Fab A链具有76.7℃的Tm且B链scFv有69.5℃的Tm。
示例性双互补位抗HER2ADC(v6363、v7148和v10533)的热稳定性结果示于图26A-C中。图26A示出了v6363的热谱图；Fc具有75℃的Tm且A链Fab和Fc CH3结构域具有75℃的Tm。6363的B链scFv具有69℃的Tm。图26B示出了v10533的热谱图；Fc CH3结构域具有83℃的Tm，A链Fab具有75.7℃的Tm，并且B链scFv具有66.2℃的Tm。图26C示出了v7148的热谱图；Fc CH3结构域具有82.6℃的Tm，A链Fab具有74.8℃的Tm且B链scFv具有66.6℃的Tm。
示例性双互补位抗体和ADC具有与野生型IgG相当的热稳定性。
实施例25：示例性双互补位抗HER2抗体引起表达不同水平的HER2的乳腺肿瘤细胞 的ADCC的能力
检查示例性双互补位抗体(v5019)引起HER2阳性3+、2+和0/1+表达HER2(三阴性)的乳腺癌细胞系的剂量依赖性ADCC的能力。如实施例11中所述进行ADCC实验，除NK效应细胞与靶细胞比率保持5:1不变外。
ADCC结果示于图27和表23中。图27A-C中的结果显示示例性双互补位抗体(v5019)与相比引起HER2阳性3+、2+和0/1+表达HER2的乳腺癌细胞高大约1.2至1.3倍的最大限度细胞裂解。结果还显示v5019(90％N-聚糖有岩藻糖)与(86％N-聚糖有岩藻糖；实施例23)相比，尽管在N-聚糖中具有高大约4％的岩藻糖含量(导致对NK细胞上CD16的结合亲和力更低)，但更有效地介导HER2阳性3+、2+和0/1+表达HER2的乳腺癌细胞的ADCC。v5019引起的更高靶细胞杀伤大概是由于如实施例6中所述肿瘤细胞修饰增加。
表23：HER2 3+、2+和0/1+表达HER2的乳腺癌细胞的ADCC
图27D中的ADCC结果显示示例性双互补位抗体(v7091和v10000)与相比在表达基底HER2的WI-38细胞系中引起类似的最大程度细胞裂解。ADCC结果支持细胞结合数据(实施例6)，显示增加的结合和ADCC的阈值出现在HER2受体水平大于10,000个HER2/个细胞时。基于该数据，预计示例性双互补位抗HER2抗体将增加HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞的细胞表面结合和ADCC，但是按大约10,000个受体或更少表达基底水平的HER2的非肿瘤细胞的细胞表面结合和ADCC不会增加。
实施例26：抗体无岩藻糖基化对ADCC的影响
检查无岩藻糖基化示例性双互补位抗体(v5019-无岩藻糖基、10000-无岩藻糖基)引起HER2阳性2/3+、2+和0/1+表达HER2(三阴性)的乳腺癌细胞系的剂量依赖性ADCC的能力。如实施例11中所述在SKOV3细胞、MDA-MB-231细胞和ZR75-1细胞中进行ADCC实验，除使用5:1的恒定NK效应细胞或PBMC效应细胞与靶(E:T)细胞比率外。如实施例1中所述，使用如von Horsten等2010Glycobiology 20:1607-1618中描述的瞬时表达的RMD酶在CHO细胞中瞬时产生无岩藻糖基化示例性双互补位抗体。如实施例23中所述测量v5019-无岩藻糖基和v10000-无岩藻糖基的岩藻糖含量并且确定小于<2％岩藻糖基化(数据未示出)。使用NK效应细胞的数据示于图28A-B中，而使用PBMC的数据示于图28C中。
图28A、图28B和表24显示无岩藻糖基化v5019(v5019-无岩藻糖基)引起HER 2/3+和0/1+表达HER2的乳腺癌细胞的ADCC，最大限度细胞裂解比高大约1.5至1.7倍。
表24：HER2 2/3+和表达基底HER2(三阴性)乳腺癌细胞的ADCC
图28C和表25中的结果显示v10000引起HER2 2+ZR-75-1乳腺癌细胞的ADCC，最大限度细胞裂解比高大约1.3倍，并且v10000-无岩藻糖基引起比高大约1.5倍的最大限度细胞裂解。
表25：HER2 2/3+乳腺癌细胞的ADCC
ADCC结果显示将用作基准时，示例性无岩藻糖基化双互补位抗体(v5019-无岩藻糖基、v10000-无岩藻糖基)与岩藻糖基化抗体(v5019实施例25、v10000)相比引起高大约15-25％的最大限度细胞裂解。这些结果显示减少Fc N-聚糖的岩藻糖含量导致由ADCC引起的最大限度细胞裂解增加。
实施例27：在外源生长刺激性配体(EGF和HRG)的存在下示例性双互补位抗HER2抗 体抑制HER2 3+乳腺癌细胞生长的能力
检查在外源生长刺激性配体(EGF和HRG)的存在下5019抑制HER2 3+乳腺癌细胞生长的能力。
向BT-474HER2 3+靶细胞中添加测试抗体和外源配体(10ng/mL HRG或50ng/mLEGF)，一式三份，并且在37℃下温育5天。使用AlamarBlueTM(37℃，2小时)测量细胞活力，在530/580nm读取吸光度。将数据归一化为未处理的对照并且使用GraphPad prism进行分析。
结果示于图29和表26中。结果显示示例性双互补位抗体v5019在无生长刺激性配体时(70％抑制)，以及在EGF(40％抑制)或HRG(约10％抑制)的存在下抑制HER2 3+乳腺癌细胞生长。抗HER2单特异性FSA(v506)不经由其它erbB受体EGFR和HER3阻断EGF或HRG诱导的肿瘤细胞生长。在经由其它伴侣erbB受体抑制HER2和配体依赖性二聚化和生长方面，v5019优于v506。
表26：HER2 3+癌细胞的生长抑制
这些结果显示示例性双互补位抗体能够减少HER2+细胞的配体依赖性生长，大概是由于抗ECD2A链Fab臂的结合和对配体刺激的受体同二聚化和异二聚化的后续阻断，及erbB信号传导。
实施例28：在浸润性乳腺导管癌的曲妥珠单抗抗性和化疗抗性HER2 3+患者来源 (PDX)的转移性乳腺癌异种移植模型中双互补位抗HER2抗体的作用
使用来自于人浸润性乳腺导管癌的HER2 3+(ER-PR阴性)患者来源的异种移植模型HBCx-13B，评估示例性双互补位抗HER2抗体v7187的抗肿瘤功效。v7187是v5019的无岩藻糖基化型式。该模型对单一试剂曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(参见实施例31)、卡培他滨、多西他赛及多柔比星/环磷酰胺的组合有抗性。
雌性无胸腺裸鼠皮下接种20mm3肿瘤碎片。然后监测肿瘤，直至达到140mm3的平均体积。然后将动物随机分为2个处理组：媒介物对照和v7187，每组8只动物。IV剂量如下。以5ml/kg制剂缓冲液将媒介物对照静脉给药，每周两次直到研究第43天。以10mg/kg将v7187静脉给药，每周两次直到研究第43天。在整个研究期间测量肿瘤体积，并且如表27所示在第43天评估其它参数。
结果示于图30和表27中。结果显示经媒介物对照处理的肿瘤显示出持续进展并且到研究第43天超过1600mm3。经v7187处理的小鼠显示出明显较强的肿瘤生长抑制(T/C-0.44)，在第43天平均肿瘤体积为740mm3。v7187在5/8肿瘤中诱导反应，在研究第43天单个肿瘤显示出完全消退和零残留疾病。经v7187处理的动物与经媒介物对照处理的0/8小鼠相比，具有更优的反应率，5/8肿瘤对治疗反应。另外，用v7187处理与媒介物对照相比明显延迟肿瘤进展，倍增时间分别为19和11天。
表27：
这些数据显示示例性抗HER2双互补位(v7187)在曲妥珠单抗+帕妥珠单抗抗性HER2 3+转移性乳腺癌肿瘤异种移植模型中有效。v7187处理具有高反应率并且可以显著地削弱标准护理治疗抗性HER2 3+乳腺癌的肿瘤进展。
实施例29：对双互补位抗HER2ADC与HER2+肿瘤细胞系结合的评估
如实施例6中所述，通过FACS分析示例性双互补位抗HER2ADC结合并饱和HER2阳性3+、2+、乳腺和卵巢肿瘤细胞系的能力。
数据示于图31中。图31A示出了v6363与SKOV3肿瘤细胞系的结合，在饱和浓度下Bmax(MFI)比T-DM1(v6246)高大约2.0倍。图31B示出了v6363与JIMT-1肿瘤细胞系结合，在饱和浓度下Bmax(MFI)比T-DM1(v6246)高大约1.6倍。这些数据显示v6363(ADC)与未偶联的v5019亲本抗体(实施例6)相比，具有细胞表面结合增加的相似肿瘤细胞结合性质。v5019与SMCC-DM1(v6363)的偶联不改变抗体的抗原结合性质。
重复FACS结合测定以包括与示例性双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)和ADC(v6363、v7148和v10553)的直接比较。数据示于图31C和图31D中。示例性双互补位抗HER2ADC(v6363、v7148和v10553)与未标记的双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)相比具有相等的细胞表面饱和度(Bmax)。
这些数据显示示例性双互补位抗体(v5019、v7091和v10000)与SMCC-DM1的偶联不改变结合性质。示例性抗HER2双互补位抗HER2ADC(v6363、v7148和v10553)与单特异性抗HER2ADC(v6246、T-DM1)相比具有增加大约1.5倍(或更高)的细胞表面结合。
实施例30：在HER2 3+(ER-PR阴性)患者来源的异种移植模型中示例性抗HER2双互 补位-ADC的剂量依赖性肿瘤生长抑制
使用来自于人浸润性乳腺导管癌的HER2 3+(ER-PR阴性)患者来源的异种移植模型HBCx-13B，评估示例性双互补位抗HER2ADC(v6363)的抗肿瘤功效。该模型对单一试剂曲妥珠单抗、曲妥珠单抗和帕妥珠单抗(参见实施例31)、卡培他滨、多西他赛及多柔比星/环磷酰胺的组合有抗性。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***20mm3肿瘤碎片接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到160mm3的平均体积；然后将动物随机分为5个处理组：非特异性人IgG对照和4个递增剂量的v6363。每组包括8-10只动物。每组的剂量如下。以10mg/kg将IgG对照静脉给药，每周两次直到研究第29天。在研究第1、15和29天以0.3、1、3或10mg/kg将v6363静脉给药。在整个研究期间评估肿瘤体积并且如表29所示进行参数评估。
结果示于图32和表28中。这些结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)在曲妥珠单抗抗性HBCx-13b PDX模型中介导剂量依赖性肿瘤生长抑制(图32A)。另外，v6363以剂量依赖性方式改善总生存期，其中与IgG对照的43天相比，对于3mg/kg和10mg/kg剂量而言中位生存时间为63天以上(图32B和表28)。3mg/kg剂量与对照(0/8)相比伴有反应率增加(5/10)。按10mg/kg剂量经v6363处理的所有小鼠不但对治疗反应(9/9)，而且显示出对肿瘤进展的预防。而且，大多数肿瘤有客观部分反应(7/9)并且，在研究结束时，许多肿瘤具有零残留疾病(6/9)。v6363在所有剂量下耐受良好，未观察到不良事件并且未观察到体重减轻。
表28：
这些数据显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)在曲妥珠单抗+帕妥珠单抗抗性HER2 3+转移性乳腺癌肿瘤异种移植模型中有效。在标准护理抗性HER2 3+乳腺癌中v6363治疗伴有高反应率，显著削弱肿瘤进展，并且延长生存期。
实施例31：在曲妥珠单抗抗性PDX HBCx-13b中双互补位抗HER2-ADC与标准护理组 合比较
评价v6363在HER2 3+、ER-PR阴性曲妥珠单抗抗性患者来源的乳腺癌异种移植模型(HBCx-13b)中的功效并且与以下组合比较：赫塞汀TM+PerjetaTM；及赫塞汀TM+多西他赛。
雌性无胸腺裸鼠经由皮下***20mm3肿瘤碎片而接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到100mm3的平均体积；然后将动物随机分为4个处理组(8-10只动物/组)：非特异性人IgG对照、赫塞汀TM+多西他赛、赫塞汀TM+PerjetaTM及v6363。每组的剂量如下。以10mg/kg将IgG对照静脉给药，每周两次直到研究第29天。以10mg/kg IV将赫塞汀TM+多西他赛组合赫塞汀TM静脉给药，每周两次直到研究第29天并且在研究第1和22天以20mg/kg将多西他赛腹膜内给药。以5mg/kg将赫塞汀TM+PerjetaTM组合赫塞汀静脉给药，每周两次直到研究第29天并且以5mg/kg将PerjetaTM静脉给药，每周两次直到研究第29天。赫塞汀TM和PeijetaTM同时给药。在研究第1、15和29天以10mg/kg将v6363静脉给药。
结果示于图33和表29中。图33A示出了随时间推移的肿瘤体积，并且图33B示出了生存期图。这些结果显示赫塞汀TM+PerjetaTM的组合与对照IgG相比不产生任何肿瘤生长抑制并且在第39天超过1800mm3。赫塞汀TM+多西他赛的组合未显著降低肿瘤生长，但与IgG对照的43天相比的确将中位生存期延长至53天。v6363产生显著的肿瘤生长抑制(T/C-0.04)，其中，所有肿瘤均对治疗反应并且7/10肿瘤经历完全消退(零残留疾病)。v6363与两种组合疗法相比显著延长了生存期。群组的体重未受治疗显著影响。
表29：
这些结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)就在这个异种移植模型中测试的所有参数而言，优于标准护理组合。
实施例32：在HER2+曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞来源的肿瘤异种移植模型中双互 补位抗HER2-ADC的功效
评价在HER2 3+曲妥珠单抗抗性乳腺癌细胞来源(JIMT-1、HER2 2+)的异种移植模型中v6363的功效(Tanner等2004.Molecular Cancer Therapeutics 3:1585-1592)。
雌性RAG2小鼠皮下接种肿瘤。监测肿瘤，直至其达到115mm3的平均体积；然后将动物随机分为2个处理组：曲妥珠单抗(n＝10)和v6363。每个组的剂量如下。在研究第1天以15mg/kg将曲妥珠单抗静脉给药并且以10mg/kg给药每周两次直到研究第26天。在研究第1和15天以5mg/kg且在第23和30天以10mg/kg并且在第37和44天以9mg/kg将v6363静脉给药。
结果示于图34和表30中。这些结果显示在研究第36天v6363与曲妥珠单抗相比显著抑制肿瘤生长(T/C-0.74)。v6363和曲妥珠单抗处理未显示改变体重。在首次10mg/kg剂量7天后，v6363血清暴露为17.9μg/ml。
表30：
这些结果显示示例性抗HER2双互补位ADC(v6363)在曲妥珠单抗抗性乳腺癌中有效并且在治疗对当前标准护理有抗性的乳腺癌方面具有潜在效用。
实施例33：FcγR与抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC的异二聚体Fc的 结合
评估具有异二聚体Fc的抗HER2双互补位抗体(v5019、v7019、v10000)和ADC(v6363、v7148个v10553)与人FcγR的结合并且与具有同二聚体Fc的抗HER2FSA(v506)和ADC(v6246)做比较。
使用ProteOn XPR36(BIO-RAD)通过SPR测量FcγR对抗体Fc区的亲和力。通过标准胺偶合将HER2固定(3000RU)在CM5芯片上。抗体被抗原捕获在HER2表面。按不同浓度(20-30μl/min)注射纯化FcγR 2分钟，接着解离4分钟。将传感图全局性拟合为1:1Langmuir结合模型。所有实验均在25℃下进行。
结果示于表31中。示例性异二聚体抗HER2双互补位抗体和ADC以相当的亲和力与CD16aF、CD16aV158、CD32aH、CD32aR131、CD32bY163和CD64A结合。抗体与SMCC-DM1的偶联不会对FcγR结合产生负面影响。异二聚体抗HER2双互补位抗体与同二聚体抗HER2FSA(v506)和ADC(v6246)相比，对CD16aF、CD32aR131、CD32aH的亲和力高大约1.3至2倍。这些结果显示异二聚体抗HER2双互补位抗体和ADC以与野生型同二聚体IgG1相似或更高的亲和力结合免疫效应细胞上不同多形态形式的FcγR。
表31：通过SPR测定的人FcγR结合
实施例34：在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿瘤异种移植模型中体内示例 性抗HER2双互补位抗体的功效
使用实施例17中描述的建立的人卵巢癌细胞来源的异种移植模型SKOV3评估示例性双互补位抗HER2抗体v5019、v7091和v10000的抗肿瘤功效。
雌性无胸腺裸鼠在左腹侧皮下接种325,000个细胞于HBSS中的肿瘤悬浮液。监测肿瘤，直至其达到190mm3的平均体积并且以随机交错的方式编入4个处理组：非特异性人IgG对照、v5019、v7091和v10000。每个组的剂量如下。在研究第1天开始以10mg/kg将非特异性人IgG对照静脉给药，每周两次直到研究第26天。在研究第1天开始以3mg/kg将v5019、v7091和v10000静脉给药，每周两次直到研究第26天。在整个研究期间测量肿瘤体积，并且在第29天测量表32中所列的参数。
数据呈现于图35A(肿瘤生长)、图35B(生存期图)和表32中并且显示用v5019、v7091和v10000处理与IgG对照相比，在研究第29天产生相当的肿瘤生长抑制(T/C：0.53-0.71)、反应肿瘤数、进展时间和生存期。在研究第7天v5019、v7091和v10000的血清暴露相似(31-41μg/ml)。
表32：
这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体v5019、v7091和v10000在治疗适度曲妥珠单抗敏感性HER2过表达卵巢癌方面具有潜在效用。
实施例35：示例性双互补位抗her2抗体在曲妥珠单抗敏感性卵巢癌细胞来源的肿 瘤异种移植物中剂量依赖性抑制肿瘤生长
使用实施例17中描述的建立的人卵巢癌细胞来源的异种移植模型SKOV3评估示例性双互补位抗HER2抗体v10000的剂量依赖性功效。
雌性无胸腺裸鼠在左腹侧皮下接种325,000个细胞于HBSS中的肿瘤悬浮液。监测肿瘤，直至其达到190mm3的平均体积并且以随机交错的方式编入6个处理组：非特异性人IgG对照和5个递增剂量的v10000。每组包括9-13只动物。每个组的剂量如下。以10mg/kg将IgG对照静脉给药，每周两次直到研究第26天。以0.1、0.3、1、3或10mg/kg将v10000静脉给药，每周两次。
数据呈现于图36和表33中并且显示用v10000处理与对照IgG相比剂量依赖性诱导肿瘤生长抑制(T/C：0.28-0.73)。另外，在研究第29天v10000剂量依赖性地伴有肿瘤反应(在10mg/kg下为7/9而在0.1mg/kg为3/11)，进展时间增加(在10mg/kg下为24天而在0.1mg/kg为12天)。在第7天v10000的血清暴露依赖剂量并且从0.1mg/kg剂量的0.46μg/ml增加到10mg/kg剂量的79.3μg/ml。
表33：
这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体v10000以剂量依赖方式抑制肿瘤进展。
实施例36：抗HER2双互补位抗体和抗HER2双互补位-ADC抑制表达3+、2+或1+水平 的HER2和EGFR和/或HER3的细胞系生长的能力
进行以下实验以测量示例性双互补位抗HER2抗体(v10000)和相应的双互补位抗HER2ADC(v10553)抑制选择的通过IHC所定义的表达3+、2+、1+或0+水平的HER2和EGFR和/或HER3的乳腺、结直肠、胃、肺、皮肤、卵巢、肾、胰腺、头颈部、子宫和***细胞系生长的能力。
如下进行实验。唯一测定每个细胞系的最适接种密度以鉴定在测定持续72小时后产生大约60-90％融合的接种密度。每个细胞系按最适接种密度接种于96孔板中，每个细胞系在适当生长培养基中并且在36℃和5％CO2下温育24℃。连同阳性和媒介物对照一起，添加三个浓度的抗体(300、30和0.3nM的v10000；300、1、0.1nM的v10553)。阳性对照是5-FU(5-氟尿嘧啶)、紫杉醇、顺铂、依托泊苷(25μM)的化学混合剂(chemococktail)药物组合，媒介物对照由PBS组成。抗体处理和对照与细胞一起在细胞培养箱中在36℃和5％CO2下温育72小时。板在1200RPM下离心10分钟并且通过抽吸完全去除培养基。向每个孔添加RPMI SFM培养基(200μL)和MTS(20μL)并且在36℃和5％CO2下温育3小时。在490nM下读取光密度并且测定相对于媒介物对照的生长抑制百分比。
结果示于图37中并且在图38中示出了所有测试结果的总结。图37A示出了v10000的生长抑制结果。这些结果显示v10000可以抑制在3+、2+、1+或0+水平下表达HER2且共表达EGFR和/或HER3的乳腺、结直肠、胃、肺、皮肤、卵巢、肾、胰腺、头颈部、子宫和子宫内膜肿瘤细胞系的生长。图38中总结了v10000和v10553在300nM下的活性，其中‘+’指示细胞系在300nM下显示细胞活力降低，>媒介物对照的5％，而‘-’指示≤媒介物对照5％的活力。
图37B示出了v10553的生长抑制结果。这些结果显示v10553可以抑制在3+、2+、1+或0+水平下表达HER2且共表达EGFR和/或HER3的乳腺、结直肠、胃、肺、皮肤、卵巢、肾、胰腺、头颈部、子宫和***细胞系的生长(同样参见图38)。图37B中绘制的结果由在300和1nM下显示出最低限度的剂量依赖性生长抑制的细胞系定义，并且其中在1nM下的生长抑制等于或高于5％(图37B)。
这些结果显示示例性双互补位抗体v10000和ADC v10553可以抑制来源于乳腺、结直肠、胃、肺、皮肤、卵巢、肾、胰腺、头颈部、子宫和膀胱组织，表达3+、2/3+、2+、1+和0/1+水平的HER2并且共表达2+、1+水平的EGFR和/或HER3的肿瘤细胞的生长。
实施例37：抗HER2双互补位抗体介导HER2 2+、1+和0/1+癌细胞的ADCC的能力
进行以下实验以测定抗HER2双互补位抗体介导表达2+、1+和/或0/1+水平的HER2且共表达2+或1+水平的EGFR和/或HER3的肿瘤细胞的ADCC的能力。测试的抗HER2双互补位抗体为5019、10000和10154(v10000的无岩藻糖基化型式)，其中以赫塞汀TM和v506作为对照。
如实施例11和实施例25中所述以E/T 5:1用NK-92效应细胞(图39)，并且如实施例26中所述以E/T 30:1用PBMC效应细胞进行ADCC实验。
结果示于图39(NK-92效应细胞)和图40(PBMC效应细胞)中。图39A示出了HER2 2+头颈部肿瘤细胞系(下咽癌)FaDu的ADCC结果，其中抗HER2双互补位引起大约15％的最大限度细胞裂解。图39C示出了HER2 1+BxPC3胰腺肿瘤细胞系的ADCC结果，并且图39D示出了HER2 2+MiaPaca2胰腺肿瘤细胞系的ADCC结果。图39B示出了HER2 0/1+A549NSCLC(非小细胞肺癌)肿瘤细胞系的ADCC结果。在BxPC3、MiaPaca2和A549肿瘤细胞系中，v10000介导大约5％的最大限度肿瘤细胞裂解。
图40示出了在A549、NCI-N87和HCT-116细胞中的ADCC结果，其中PBMC用作效应细胞。图40A示出了HER2 0/1+A549NSCLC肿瘤细胞系的ADCC结果，其中v10000引起约28％的最大限度细胞裂解并且这与在N-连接的聚糖中具有相等水平的岩藻糖含量的赫塞汀TM相当。示例性100％无岩藻糖基化(0％岩藻糖)双互补位v10154与在N-连接的聚糖中具有大约88％岩藻糖的v10000和赫塞汀相比，显示出最大限度细胞裂解增加(40％最大限度细胞裂解)和效力增强。
图40B示出了HER2 3+胃肿瘤细胞系NCI-N87的ADCC结果。图40B显示示例性双互补位v5019(大约88％岩藻糖基化)介导大约23％的最大限度细胞裂解并且与曲妥珠单抗v506(大约98％岩藻糖基化)相比具有更低的EC50。
图40C示出了HER2 1+HCT-116结直肠肿瘤细胞系的ADCC结果。图40C显示示例性双互补位v5019(大约88％岩藻糖基化)介导大约25％的最大限度细胞裂解并且与曲妥珠单抗v506(大约98％岩藻糖基化)相比更有效。
这些结果显示示例性抗HER2双互补位抗体可以引起来源于头颈部、胃、NSCLC和胰腺肿瘤组织的HER2 01/+、2+和3+肿瘤细胞的ADCC。在作为效应细胞的NK-92细胞存在下ADCC具有明显的HER2 2+受体水平要求(即2+或更高)以显示更高(>5％)百分比的最大限度细胞裂解。然而，当PBMC细胞用作效应细胞时，达到更高水平的最大限度细胞裂解(>5％和高达28％或40％；分别为v10000和v10154)并且不依赖于HER2受体密度，因为在0/1+、1+和3+HER2受体水平下发现ADCC>5％。
实施例38：通过SPR测量的HER2结合亲和力和动力学参数
如实施例1所示，构建具有不同抗原结合部分形式的抗HER2双互补位抗体，如表1所述。所述形式包括scFv-scFv形式(v6717)、Fab-Fab形式(v6902和v6903)，连同Fab-scFv形式(v5019、v7091和v10000)。进行以下实验以比较这些示例性抗HER2双互补位抗体形式的HER2结合亲和力和动力学参数。
用来自Biacore(GE Healthcare)的T200SPR***通过单循环动力学(singlecycle kinetics)测量对鼠HER2ECD(Sino Biological 50714-M08H)的亲和力和结合动力学。使用标准胺偶合将介于2000-4000RU的抗人Fc固定在CM5芯片上。按50RU将5019捕获在抗人Fc表面。按50μl/分钟注射重组HER2ECD(1.8-120nM)3分钟，接着在末次注射后解离30分钟。分析HER2稀释物，一式两份。将传感图全局性拟合为1:1Langmuir结合模型。所有实验均在室温25℃下进行。
表34中的结果显示Fab-scFv双互补位抗体(v5019和v7091)、Fab-Fab变体(v6902和v6903)和scFv-scFv变体(v6717)具有相当的结合亲和力(1-4nM)。Fab-scFv变体v10000具有大约0.6nM的较高结合亲和力(更低的KD)。在测定中包括单特异性抗HER2ECD4抗体(v506)和抗HER2ECD2抗体(v4184)作为对照。这些结果表明包括v6717、v6902、v6903、v5019和/或v7091在内的分子形式具有相等的结合亲和力，并且因此认为这些抗体之间功能上的差异是由形式上的差异而引起。
表34：
实施例39：抗HER2双互补位抗体形式对与HER2+肿瘤细胞结合的影响
进行以下实验以比较具有不同分子形式的示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体(例如v6717，scFv-scFv IgG1；v6903和v6902Fab-Fab IgG1；v5019、v7091和v10000Fab-scFv IgG1)的全细胞结合性质(Bmax和表观KD)。
如实施例6中所述进行实验。结果示于图41和表35-38中。图41A和表35示出了示例性双互补位抗体与BT474HER2 3+乳腺肿瘤细胞系的FACS结合结果。结果显示所有抗HER2抗体与单特异性二价抗HER2抗体v506比较时具有更高的Bmax(高1.5至1.7倍)。与v506相比，Fab-scFv(v5019、v7091和v10000)和Fab-Fab(v6903)形式具有增加大约1.7倍的Bmax并且scFv-scFv形式(v6717)具有增加大约1.5倍的Bmax。FSA v506和v4184的等摩尔组合引起Bmax增加1.7倍。示例性抗HER2双互补位抗体的表观KD与单特异性v506相比高大约2至3倍。
表35：BT-474的FACS结合
抗体变体 KD(nM) Bmax
v506 9.0 23536
v10000 16 39665
v506+v4184 16 40320
v5019 21 39727
v7091 22 36718
v6717 30 36392
v6903 31 40321
图41B和表36示出了与JIMT-1HER2 2+乳腺肿瘤细胞系的FACS结合结果。结果显示所有抗HER2抗体与单特异性二价抗HER2抗体v506相比时具有更高的Bmax(高1.5至1.8倍)。与v506相比，Fab-scFv(v7091和v10000)和Fab-Fab(v6903)形式具有增加大约1.7倍的Bmax，scFv-scFv形式(v6717)具有增加大约1.5倍的Bmax并且Fab-scFv(v5019)和FSA组合(v506+v4184)具有增加大约1.8倍的Bmax。示例性抗HER2双互补位Fab-scFv抗体的表观KD与单特异性v506相比高大约2至4倍；而Fab-Fab(v6903)和scFv-scFv(v6717)的KD与v506相比高大约8倍。
表36：JIMT-1的FACS结合
抗体变体 KD(nM) Bmax
v506 3.5 2574
v10000 7.6 4435
v506+v4184 8.0 4617
v5019 12 4690
v7091 14 4456
v6717 26 3769
v6903 28 4452
图41C和表37示出了示例性双互补位抗体与HER2 1+MCF7乳腺肿瘤细胞系的FACS结合结果。结果显示抗HER2抗体v10000和FSA组合(v506+v4184)与单特异性二价抗HER2抗体v506相比具有高1.6倍的Bmax。与v506相比，Fab-scFv(v5019、v7091)具有增加大约1.4倍的Bmax；scFv-scFv形式(v6717)具有增加1.3倍的Bmax，并且Fab-Fab形式(v6903)具有增加1.2倍的Bmax。示例性抗HER2双互补位Fab-scFv、Fab-Fab(v6903)和FSA组合(v506+v4184)的表观KD与v506相比低大约2至3倍；而scFv-scFv(v6717)的KD与v506相比高大约3倍。
表37：MCF7的FACS结合
抗体变体 KD(nM) Bmax
v506+v4184 4.5 1410
v7091 6.1 1216
v5019 6.3 1201
v10000 6.8 1381
v6903 7.1 1105
v506 12 889
v6717 32 1167
图41D和表38示出了示例性双互补位抗体与HER2 0/1+MDA-MD-231乳腺肿瘤细胞系的FACS结合结果。结果显示示例性双互补位抗HER2抗体与单特异性二价抗HER2抗体v506相比具有增加大约1.3至1.4倍的Bmax。FSA组合(v506+v4184)具有增加1.7倍的Bmax。示例性抗HER2双互补位Fab-scFv抗体(v5019、v7091、v10000)和FSA组合(v506+v4184)的表观KD与v506的KD大致相等；而Fab-Fab(v6903)和scFv-scFv(v6717)与v506相比，分别具有高大约4和16倍的KD。
表38：MDA-MB-231的FACS结合
抗体变体 KD(nM) Bmax
v506 4.8 395
v10000 5.6 558
v506+v4184 7.3 662
v7091 7.9 525
v5019 8.7 548
v6903 17 534
v6717 77 524
肿瘤细胞结合结果显示与二价单特异性抗HER2抗体相比，具有不同分子形式的抗HER2双互补位抗体在HER2 3+、2+、1+和0/1+肿瘤细胞上具有增加的Bmax。在不同的抗HER2双互补位抗体中，scFv-scFv形式在HER2 3+、2+、1+和0/1+肿瘤细胞上相对于v506具有最低的Bmax增量。这些结果还显示scFv-scFv和Fab-Fab形式与单特异性v506(增加3至16倍)和双互补位Fab-scFv形式(大约2倍或更高)相比，在HER2 3+、2+、1+和0/1+肿瘤细胞上KD增加最大。KD增加指示亲和性结合减少并且表明不同的双互补位形式具有独特的与细胞表面上HER2结合的机制。
实施例40：抗HER2双互补位抗体形式对在HER2+细胞中内化的影响
进行以下实验以比较具有不同分子形式的示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体(例如，v6717，scFv-scFv IgG1；v6903和v6902Fab-Fab IgG1；v5019、v7091和v10000Fab-scFv IgG1)在表达不同水平的HER2的HER2+细胞中内化的能力。
如实施例9详述那样进行实验。结果示于图42和表39-41中。图42A和表39示出了在HER23+BT-474中的内化结果。这些结果显示Fab-scFv形式(v10000)和FSA组合(v506+v4184)与单特异性抗HER2v506相比，具有高2.2倍量的胞内抗体。与v506相比，scFv-scFv形式(v6717)具有高1.9倍；Fab-scFv形式(v5019和v7091)具有高1.5至1.7倍，并且Fab-Fab形式(v6902和v6903)具有高1.2至1.3倍量的胞内抗体积聚。
表39：内化BT-474
抗体变体 表面4℃ 表面37℃ 内部37℃
v506 2156 1590 3453
v6902 2407 2077 4035
v6903 2717 986 4573
v7091 2759 2227 5111
v5019 2867 2675 5710
v6717 2006 1212 6498
v10000 3355 2851 7528
v506+v4184 3998 2326 7569
图42B和表40示出了在HER2 2+JIMT-1中的内化结果。这些结果显示Fab-scFv形式(v10000)和FSA组合(v506+v4184)与单特异性抗HER2v506相比分别具有高1.8和1.9倍量的胞内抗体。与v506相比，scFv-scFv形式(v6717)和Fab-scFv形式(v5019)具有高1.4倍；并且Fab-scFv(v7091)和Fab-Fab形式(v6902和v6903)具有高1.2倍量的胞内抗体积聚。
表40：内化JIMT-1
图42C和表41示出了在HER2 1+MCF7中的内化结果。这些结果显示scFv-scFv形式和Fab-scFv形式与单特异性抗HER2v506相比具有高3.0和2.8倍量的胞内抗体。与v506相比，Fab-scFv形式(v10000)和FSA组合(v506+v4184)具有高大约2倍；Fab-scFv(v7091)和Fab-Fab(v6903)形式具有高1.8倍量的胞内抗体积聚。
表41：内化MCF7
这些结果显示具有不同分子形式的抗HER2双互补位抗体在就抗原结合结构域的结构和形式而言不同的HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞中具有独特的内化程度。一般而言，v506和v4184的单特异性FSA组合、Fab-scFv(v10000、v7091和v5019)和scFv-scFv(v6717)双互补位形式在HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞中具有更高的内化值。然而，Fab-Fab双互补位形式(v6902和v6903)在HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞中具有最低的内化值。这些数据表明抗原结合结构域的分子形式和几何间距对双互补位抗体交联HER2受体及随后在HER2+肿瘤细胞中内化的能力有影响。在两个抗原结合结构域之间具有最大距离的Fab-Fab双互补位形式，产生最低的内化程度，而在抗原结合结构域之间具有较短距离的Fab-scFv和scFv-scFv形式，在HER2+细胞中具有较强的内化。这与Jost等2013，Structure 21，1979-1991)中描述的效力和较短接头长度之间的相关性一致。
实施例41：抗HER2双互补位抗体形式对HER2+细胞中的ADCC的影响
进行以下实验以比较具有不同分子形式的示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体(例如，v6717，scFv-scFv IgG1；v6903和v6902Fab-Fab IgG1；v5019、v7091和v10000Fab-scFv IgG1)在表达不同水平的HER2的HER2+细胞中介导ADCC的能力。
在进行ADCC测定之前，对抗体样品进行糖肽分析以定量N连接的糖肽中的岩藻糖含量。按照如实施例23中所述的方法。结果示于表42中；数据显示示例性双互补位变体v5019、v6717、v6903在N连接的聚糖中具有相等的岩藻糖含量(91-93％)。选择在N-聚糖中具有相等的岩藻糖水平的抗体样品进行ADCC测定以在ADCC测定结果的解释中对岩藻糖含量归一化。
表42：LC-MS胰蛋白酶消化肽分析
变体 观察到有岩藻糖的糖肽的百分比 观察到无岩藻糖的糖肽的百分比
v6903 90.7 9.3
v6717 92.8 7.2
v5019 91.3 8.7
如实施例11中所述以E/T:5:1用NK-92效应细胞进行ADCC实验。ADCC结果示于图43和表43-45中。图43A和表43示出了在HER2 2+JIMT-1乳腺肿瘤细胞中的ADCC结果。这些数据显示v5019、v6717和v6903引起类似水平的最大限度细胞裂解并且当HER2 2+肿瘤细胞为靶标时scFv-scFv形式(v6717)与v5019和v6903相比效力较低。
表43：JIMT-1ADCC
抗体变体 EC50(nM) 最大限度细胞裂解％
v6903 约0.03 48
v5019 约0.16 47
v6717 约0.72 51
图43B和表44示出了在HER2 1+MCF7乳腺肿瘤细胞中的ADCC结果。这些数据显示v5019和v6717与v6903(24％)相比具有略高的最大限度细胞裂解(27-30％)。这些数据还显示v6717效力较低，其次是v6903和v5019，其具有更低的EC50值。
表44：MCF7ADCC
抗体变体 EC50(nM) 最大限度细胞裂解％
v5019 约0.69 27
v6717 109 30
v6903 0.94 24
图43C和表45示出了在HER2 0/1+MDA-MB-231乳腺肿瘤细胞中的ADCC结果。这些数据显示v5019与v6903(62％)和v6717(63％)相比具有略高的最大限度细胞裂解(77％)。这些数据还显示v6717效力较低，其次是v6903和v5019，其具有更低的EC50值。
表45：MDA-MB-231ADCC
抗体变体 EC50(nM) 最大限度细胞裂解％(仅最高)
v5019 0.20 71
v6717 10 63
v6903 0.79 62
这些数据显示示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体在HER2 2+和1+肿瘤细胞中通过ADCC引起类似水平的最大限度细胞裂解。尽管在最大限度细胞裂解方面类似，但这些数据还显示不同的分子形式具有独特的ADCC效力。在HER2 2+和HER2 1+中scFv-scFv效力最低(EC50值最高)。在针对HER2 1+细胞的ADCC数据中看到三种形式间的差异性效力，其中EC50值v6717>v6903>v5019。这些数据与实施例40中呈现的观察结果(FACS结合)一致，其中在Fab-Fab和scFv-scFv形式的情况下观察到KD增大(亲和力降低)。
实施例42：抗HER2双互补位抗体形式对HER2+肿瘤细胞生长的影响
进行以下实验以比较抗HER2双互补位抗体形式对HER2 3+、2+和1+肿瘤细胞生长(基本生长或受配体刺激的生长)的影响。如实施例15所述测量基本生长，而如实施例27所述测量受配体刺激的生长。在两种类型的实验中，将生长测量为相对于对照处理的存活％。
图44和表46示出了在外源生长刺激性配体(EGF和HRG)的存在下，示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体对HER2 3+乳腺癌细胞(BT-474)生长的影响。在无EGF或HRG时，抗HER2双互补位抗体能够抑制BT-474细胞的生长，其中每个处理组的存活％等级如下：v6903<v506+v4184<506<v7091<v5019<v10000<v6717。在HRG的存在下，仅用v506+v4184的FSA组合实现相对于mock对照的生长抑制。在EGF的存在下，实现相对于mock对照的生长抑制，其中每个处理组的存活％等级如下：v6903<v506+v4184<7091<v10000<5019。
表46
图45示出了抗HER2双互补位抗体形式对SKBr3HER2 3+细胞系的生长抑制的剂量依赖性影响。数据与图44中呈现的结果一致，其中在HER2 3+肿瘤细胞中双互补位形式的效力/功效等级顺序如下Fab-Fab>Fab-scFv>scFv-scFv。
图46中示出了抗HER2双互补位抗体形式对HER2+细胞存活的影响，其中图46A示出了在300nM下在曲妥珠单抗敏感性SKOV3HER2 2+/3+细胞系中的结果；图46B示出了在300nM下在JIMT-1HER2 2+(曲妥珠单抗抗性)细胞中的结果，并且图46C示出了在300nM下在MCF7HER2 1+细胞系中的结果。在SKOV3细胞系中，在双互补位形式之间在生长抑制程度上观察到少许差异，并且在JIMT-1和MCF7细胞中用任何测试抗体均未观察到生长抑制。
图44和图45中的数据显示具有Fab-scFv和Fab-Fab形式的抗H ER2ECD2x ECD4双互补位抗体(v5019、v7091、v10000、v6903)在EGF或HRG缺乏和存在时能够抑制HER2 3+肿瘤细胞生长。在H ER2 3+细胞系BT-474和SKBR3中，相对于mock对照的生长抑制等级顺序如下，其中v506+v4184>v6903>v7091>v10000>v5019>v506>v6717。抗原结合结构域之间的距离(Fab-Fab>Fab-scFv>scFv-sc Fv)与在HER2 3+肿瘤细胞中的生长抑制的等级顺序相关。基于在曲妥珠单抗敏感性肿瘤细胞BT-474和SKBr3中的数据，可预计形式间的生长抑制差异在HER2 3+水平下显著，但是在HER2 2+或HER2 1+水平下不太显著。
实施例43：对不同抗体捕获水平下HER2结合亲和力和动力学的评价
进行以下实验以通过SPR比较示例性抗HER2ECD2x ECD4双互补位抗体在不同表面密度下捕获时的HER2结合动力学(kd，分离速率)。分离速率降低与抗体捕获水平(表面密度)提高之间的相关性指示反式结合(即一个抗体分子与两个HER2分子结合，如实施例12所述)。在这项实验中，将Fab-Fab形式(v6903)与Fab-scFv形式(v7091)做比较以测定变体间在反式结合方面的潜在差异。由于抗原结合结构域之间较大的空间距离，假设Fab-Fab形式能够顺式结合(工程化一个HER2分子上的ECD 2和4)；然而，Fab-scFv将由于其抗原结合结构域之间的距离较短而不能顺式结合。抗HER2单特异性v506包括在内作为对照。
如实施例12中所述，通过SPR进行实验。数据示于图47中。图47A示出了用v6903和v7091在不同抗体捕获水平下kd(1/s)的图和线性回归分析。v7091和v6093两者随着表面捕获水平提高显示出分离速率降低的趋势；然而，与Fab-scFv变体(v7091；P值＝0.023)的相关性显著，而不是Fab-Fab形式(v6093；P值＝0.053)。对于抗HER2单特异性对照v506而言，随着抗体捕获水平变化，分离速率保持不变。
图47B示出了用v6903和v7091在不同抗体捕获水平下KD(M)的图和线性回归分析。与分离速率比较类似，v7091和v6093两者随着表面捕获水平提高显示出亲和力增强(KD值降低)的趋势。然而，与Fab-scFv变体(v7091；P值＝0.04)的相关性显著，而不是Fab-Fab形式(v6093；P值＝0.51)。对于抗HER2单特异性对照v506而言，随着抗体捕获水平变化，KD保持不变。图47中的数据显示Fab-Fab和Fab-scFv抗HER2双互补位抗体形式随着抗体表面捕获水平提高显示出分离速率降低的趋势；这些趋势与单特异性抗Her2抗体相比是独特的。
实施例44：帕妥珠单抗Fab的亲和力和稳定性工程化
如表1所示，一种变体(v10000)含有帕妥珠单抗Fab中的突变。这种Fab衍生自计算机模拟的亲和力和稳定性工程化成果，在实验室将其作为单价或单臂抗体(OAA)测量。
变体9996：单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自帕妥珠单抗A链上的Fab，VL区中具有Y96A且VH区中具有T30A/A49G/L69F(Rabat编号)并且Fc区是在A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(EU编号)，在B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W(EU编号)的异二聚体，并且B链的铰链区具有突变C226S；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。
变体10014：单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自帕妥珠单抗A链上的Fab，VL区中具有Y96A且VH区中具有T30A(Rabat编号)并且Fc区是在A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(EU编号)，在B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W(EU编号)的异二聚体，并且B链的铰链区具有突变C226S；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。
变体10013：单价抗HER2抗体，其中HER2结合结构域是衍生自帕妥珠单抗A链上的Fab，并且Fc区是在A链中具有突变T350V_L351Y_F405A_Y407V(EU编号)，在B链中具有突变T350V_T366L_K392L_T394W(EU编号)的异二聚体，并且B链的铰链区具有突变C226S；抗原结合结构域与HER2的结构域4结合。
进行以下实验以比较工程化帕妥珠单抗变体的HER2结合亲和力和稳定性。
如实施例1中所述克隆并表达OAA变体。
如实施例1中所述，通过蛋白A色谱法和尺寸排阻色谱法纯化OAA。
使用Caliper LabChip GXII(Perkin Elmer#760499)通过非还原高通量蛋白质表达测定评估异二聚体纯度(即，具有异二聚体Fc的OAA的量)。程序根据HT蛋白质表达LabChip用户指南(HT Protein Express LabChip User Guide)第2版LabChip GXII使用手册(LabChip GXII User Manual)进行，做以下修改。连同7μl的HT蛋白质表达样品缓冲液(Perkin Elmer#760328)一起，向96孔板的单独孔中添加2μl或5μl(浓度范围5-2000ng/μl)的异二聚体样品。然后使异二聚体样品在70℃下变性15min。使用HT蛋白质表达芯片(Perkin Elmer#760499)和Ab-200测定装置操作LabChip仪器。使用后，用MilliQ水清洁芯片并储存于4℃下。
如用实施例24所示的方案通过DSC测定那样，通过测量解链温度或Tm评估样品的稳定性。在SEC纯化之前和之后测量DSC。
按照来自于实施例12的方案通过SPR测量样品对HER2ECD的亲和力。在SEC纯化之前和之后测量SPR。如表47A和47B中所总结的那样，与野生型帕妥珠单抗相比，可变结构域中的突变已增强了Fab的HER2亲和力，同时保持了野生型稳定性。(1通过Caliper LabChip测定的纯度；2KD(野生型)/KD(突变体)
表47A：
表47B：
实施例中采用的试剂通常可商购或者可以使用本领域已知的可商购的仪器、方法或试剂制备。前述实施例说明了本文描述的各个方面及本文描述的方法的实践。实施例并非旨在提供对本发明许多不同实施方案的详尽描述。因此，虽然为了理解清楚的目的已经通过说明和举例的方式相当详细地描述了前述发明，但是本领域的普通技术人员将容易认识到在不背离所附权利要求书的精神或范围的前提下，可以对其做许多变化和修改。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用在本文中并入说明书中，其程度如同特别地且单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用并入本文一样。
序列表
变体 H1克隆名称 H2克隆名称 L1克隆名称 L2克隆名称
792 1011 1015 -2 -2
5019 3057 720 1811 NA
5020 719 3041 NA 1811
7091 3057 5244 1811 NA
10000 6586 5244 3382 NA
6903 5065 3468 5037 3904
6902 5065 3468 5034 3904
6717 3317 720 NA NA
1040 4560 4553 NA 4561
630 719 716 NA NA
4182 4560 3057 NA 1811
506 642 642 -2 -2
4184 3057 3041 1811 1811
9996 4372 6586 NA 3382
帕妥珠单抗变体CDR-L3：QQYYIYPAT
克隆3382，变体10000(SEQ ID NO:347)
帕妥珠单抗变体CDR-H1：GFTFADYT
克隆6586，变体10000(SEQ ID NO:348)
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种抗原结合构建体，其包含
单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体；
单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2 ECD4(胞外结构域4)抗原的第二抗原结合多肽构建体；
第一和第二接头多肽，其中所述第一接头多肽与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接，并且所述第二接头多肽与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接；
其中所述接头多肽能够相互形成共价键，
并且其中所述第一或所述第二抗原结合多肽中的一个或两者为scFv。
2.根据权利要求1所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二接头多肽各自包含选自IgG1、IgG2或IgG4铰链区的免疫球蛋白铰链区多肽。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合构建体，其中所述第一和/或第二接头多肽与骨架，任选地与Fc可操作地连接。
4.根据权利要求1或2所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二接头多肽与包含第一和第二Fc多肽的二聚Fc可操作地连接，所述Fc多肽各自包含CH3序列，其中所述第一Fc多肽与所述第一接头多肽可操作地连接，并且所述第二接头多肽与所述第二接头多肽可操作地连接。
5.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中(i)所述第一抗原结合多肽构建体为scFv而所述第二抗原结合多肽构建体为Fab；或(ii)所述第一抗原结合多肽构建体为Fab而所述第二抗原结合多肽构建体为scFv；或(iii)所述第一抗原结合多肽构建体和所述第二抗原结合多肽构建体两者均为scFv。
6.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中
i.所述第一抗原结合多肽构建体为Fab而所述第二抗原结合多肽构建体为scFv并且所述第一抗原结合多肽构建体Fab包含
a.第一可变重链多肽VH1，其包含v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)或v10000(SEQ ID NO:99)的帕妥珠单抗臂的VH和
b.第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ IDNO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)或v10000(SEQ ID NO:71)的帕妥珠单抗臂的VL；
并且所述第二抗原结合多肽构建体scFv包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)或v10000(SEQ ID NO:305)的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)或v10000(SEQ ID NO:297)的曲妥珠单抗臂的VL；或
ii.所述第一抗原结合多肽构建体为scFv而所述第二抗原结合多肽构建体为Fab并且所述第一抗原结合多肽构建体scFv包含
(a)第一可变重链多肽VH1，其包含v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)或v10000(SEQ ID NO:99))的帕妥珠单抗臂的VH和
(b)第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ ID NO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)或v10000(SEQ ID NO:71)的帕妥珠单抗臂的VL
并且所述第二抗原结合多肽构建体Fab包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)或v10000(SEQ ID NO:305))的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)或v10000(SEQ ID NO:297)的曲妥珠单抗臂的VL；或
iii.所述第一抗原结合多肽构建体为scFv并且所述第二抗原结合多肽构建体为scFv并且所述第一抗原结合多肽构建体scFv包含
(a)第一可变重链多肽VH1，其包含v5019(SEQ ID NO:221)、v5020(SEQ ID NO:205)、v7091(SEQ ID NO:221)、v6717(SEQ ID NO:267)或v10000(SEQ ID NO:99)的帕妥珠单抗臂的VH，和
(b)第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019(SEQ ID NO:35)、v5020(SEQ ID NO:35)、v7091(SEQ ID NO:35)、v6717(SEQ ID NO:259)或v10000(SEQ ID NO:71)的帕妥珠单抗臂的VL，
并且所述第二抗原结合多肽构建体scFv并且包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019(SEQ ID NO:179)、v5020(SEQ ID NO:157)、v7091(SEQ ID NO:305)、v6717(SEQ ID NO:179)或v10000(SEQ ID NO:305))的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019(SEQ ID NO:171)、v5020(SEQ ID NO:149)、v7091(SEQ ID NO:297)、v6717(SEQ ID NO:171)或v10000(SEQ ID NO:297)的曲妥珠单抗臂的VL。
7.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体选自
i.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含氨基酸序列SEQ IDNO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:337，或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348；
ii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含与SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:337，或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348的三个VH CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
iii.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列包含SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340，或SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的三个VL CDR序列的氨基酸序列；
iv.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列和与SEQ ID NO:338、SEQID NO:339和SEQ ID NO:340，或SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340具有至少90％同一性的三个VL CDR序列的氨基酸序列具有至少90％同一性；
v.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340；或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的六个CDR序列的氨基酸序列；或
vi.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含与SEQ ID NO:335、SEQ IDNO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340；或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的六个CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合多肽选自
vii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342和SEQ ID NO:343的三个VH CDR序列的氨基酸序列；
viii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含与SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342和SEQ ID NO:343的三个VH CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
ix.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列包含SEQ ID NO:344、SEQID NO:345和SEQ ID NO:346的三个VL CDR序列的氨基酸序列；
x.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列与SEQ ID NO:344、SEQ IDNO:345和SEQ ID NO:346的三个VL CDR序列的氨基酸序列具有至少90％同一性；
xi.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含SEQ ID NO:341、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:346的六个CDR序列的氨基酸序列；或
xii.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含与SEQ ID NO:341、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:346的六个CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体：(i)阻断帕妥珠单抗与ECD2的结合50％或更高，和/或(ii)所述第二抗原结合多肽阻断曲妥珠单抗与ECD4的结合50％或更高。
9.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含对HER2 ECD2有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体之一，并且所述第二抗原结合多肽构建体包含对HER2 ECD4有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体之一。
10.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含与对HER2 ECD2有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且所述第二抗原结合多肽构建体包含与对HER2 ECD4有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
11.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其选自v5019、v10000、v7091、v5020和v6717。
12.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体为Fab并且所述第二抗原结合多肽构建体为scFv，并且其中所述抗原结合构建体与具有两个Fab的参考双互补位抗原结合构建体相比
(i)诱导在HER2 3+细胞中增强的受体内化和/或
(ii)在ADCC(抗体指导的细胞毒性作用)测定中对HER2 1+细胞展示出更高效力。
13.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体为scFv，并且其中所述抗原结合构建体与具有两个Fab的参考抗原结合构建体相比诱导在HER2 1+、2+和3+细胞中增强的受体内化。
14.一种经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含单价且特异性地结合HER2 ECD2的一个或多个抗原结合多肽构建体，每个多肽构建体包含VH和VL，其中所述VH包含三个CDR序列，所述三个CDR序列包含SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348的三个VH CDR序列的氨基酸序列，并且所述VL包含三个CDR序列，所述三个CDR序列包含SEQ ID NO:338、SEQ IDNO:347和SEQ ID NO:340的三个VL CDR序列的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述VH包含v9996的VH并且VL包含v9996的VL。
16.根据权利要求14或15所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述抗原结合多肽构建体包含与v9996的VH和v9996的VL具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求14-16所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述经修饰的帕妥珠单抗构建体为单价的、二价的或多价的。
18.根据权利要求14-17所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述构建体为(i)单价的并且包含Fab或scFv，(ii)为二价的并且包含Fab和scFv，或(iii)为二价的并且包含两个scFv。
19.根据权利要求14-17所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述构建体为单价的并且与帕妥珠单抗相比对HER2 ECD2展示出增加7至9倍的亲和力。
20.根据权利要求14-19所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含经或不经接头与所述抗原结合多肽构建体连接的二聚Fc。
21.根据权利要求14-20所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述经修饰的帕妥珠单抗构建体包含第一和第二抗原结合多肽构建体，及各自包含CH3序列的第一和第二Fc多肽，其中所述第一Fc多肽经或不经第一接头与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接，并且所述第二单体Fc多肽经或不经第二接头与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接。
22.根据权利要求20和21所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含多肽接头。
23.根据权利要求22所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述接头包含IgG1铰链区。
24.根据权利要求20和21所述的经修的饰帕妥珠单抗构建体，其中所述Fc为人Fc。
25.根据权利要求20和21所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述Fc为人IgG1Fc。
26.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含异二聚体Fc，其中所述二聚化CH3序列的解链温度(Tm)为约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高。
27.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体Fc。
28.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在经由单个细胞表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体Fc。
29.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰的异二聚体Fc。
30.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰的异二聚体Fc，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体的形成。
31.根据任何前述权利要求所述的构建体，根据EU编号与野生型同二聚体Fc相比其包含
i.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T366I_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
ii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_S400E_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc，
iii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和在所述第二多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
iv.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
v.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
vi.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
vii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc。
32.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含含有至少一个CH2结构域的异二聚体Fc。
33.根据权利要求32所述的构建体，其中所述异二聚体Fc的所述CH2结构域包含一个或多个修饰。
34.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含含有促进Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰的异二聚体Fc。
35.根据任何前述权利要求所述的构建体，其中所述构建体是糖基化的。
36.根据任何前述权利要求所述的构建体，其中所述构建体与药物偶联。
37.根据权利要求36所述的构建体，其中所述药物为美登素(DM1)。
38.根据权利要求36所述的构建体，其中所述构建体经SMCC接头与DM1偶联。
39.一种药物组合物，其包含根据任何前述权利要求所述的构建体和药物载体。
40.根据权利要求39所述的药物组合物，所述药物载体包括缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂。
41.一种用于药品中的药物组合物，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体。
42.一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体。
43.一种治疗患有HER2表达(HER2+)肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-38中任一项所述的构建体或根据权利要求39-42中任一项所述的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗的结果是缩小所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、增加所述肿瘤进展的时间、延长所述受试者的无病生存期、减少转移、增加所述受试者的无进展生存期或增加所述受试者的总生存期。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述肿瘤为胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮肤癌。
46.根据权利要求43-45所述的方法，其中所述肿瘤包含每个肿瘤细胞表达平均10,000个或更多个HER2拷贝的细胞。
47.根据权利要求43-46所述的方法，其中如通过免疫组织化学(IHC)所测定，所述肿瘤为HER2 1+、HER2 2+或HER2 3+。
48.根据权利要求47所述的方法，其中如通过IHC所测定，所述肿瘤表达2+或更低水平的HER2。
49.根据权利要求43所述的方法，其中如通过IHC所测定，所述HER2+肿瘤是表达HER2 2+/3+的卵巢癌并且经基因扩增并且对曲妥珠单抗适度敏感。
50.根据权利要求43所述的方法，其中如通过免疫组织化学(IHC)所测定，所述HER2+肿瘤是表达2+水平或更低的HER2的乳腺癌。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述HER2+肿瘤是(i)HER2 3+***受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PR-)、曲妥珠单抗抗性、化疗抗性浸润性乳腺导管癌，(ii)HER2 3+ER-、PR-、曲妥珠单抗抗性炎性乳腺癌，(iii)HER2 3+、ER-、PR-浸润性导管癌或(iv)HER2 2+HER2基因扩增的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌。
52.根据权利要求43-51所述的方法，其中所述受试者先前尚未用抗HER2抗体治疗。
53.根据权利要求43-51所述的方法，其中所述肿瘤对帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和/或TDM1有抗性或使用其难治。
54.根据权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和/或TDM1治疗。
55.根据权利要求43-54中任一项所述的方法，其中所述构建体选自v5019、v10000、v7091、v5020或v6717。
56.根据权利要求43-55中任一项所述的方法，其中施用是通过注射或输注进行。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用另外的试剂，任选地化疗剂。
58.根据权利要求57所述的方法，其中
i.所述肿瘤为非小细胞肺癌，并且所述另外的试剂为顺铂、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春花碱或培美曲塞中的一种或多种；
ii.所述肿瘤为胃癌或胃部癌，并且所述另外的试剂为5-氟尿嘧啶(有或无亚叶酸)、卡培他滨、卡铂、顺铂、多西他赛、表柔比星、伊立替康、奥沙利铂或紫杉醇中的一种或多种；
iii.所述肿瘤为胰腺癌，并且所述另外的试剂为吉西他滨、亚叶酸钙、abraxane或5-氟尿嘧啶中的一种或多种；
iv.所述肿瘤为***和/或孕酮阳性乳腺癌，并且所述另外的试剂为(a)多柔比星和表柔比星的组合，(b)紫杉醇和多西他赛的组合，或(c)氟尿嘧啶、环磷酰胺和卡铂的组合中的一种或多种；
v.所述肿瘤为头颈癌，并且所述另外的试剂为紫杉醇、卡铂、多柔比星或顺铂中的一种或多种；
vi.所述肿瘤为卵巢癌并且所述另外的试剂为顺铂、卡铂或紫杉烷如紫杉醇或多西他赛中的一种或多种。
59.根据权利要求43-58所述的方法，其中所述受试者为人。
60.一种检测或测量样品中的HER2的方法，其包括使所述样品与根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体接触并且检测或测量结合复合物。
61.一种抑制、减少或阻断细胞中的HER2信号传导的方法，其包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体。
62.一种杀伤HER2表达肿瘤细胞或抑制HER2表达肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞为HER2 1+或2+人胰腺癌细胞、HER2 3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2-扩增乳腺癌细胞、HER2 0+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+人卵巢癌细胞。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞为HER2 1+或2+或3+人胰腺癌细胞、HER2 2+转移性胰腺癌细胞、HER2 0+/1+、+3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、HER2 0+间变性肺癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 0+、1+或3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2扩增乳腺癌细胞、HER2 0+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 0+人乳腺导管癌(基底B型、间充质样三阴性)细胞、HER2 2+ER+乳腺癌细胞、HER2 0+人转移性乳腺癌细胞(ER-、HER2-扩增、管腔A型、TN)、人子宫中胚叶肿瘤(混合III级)细胞、2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+人皮肤表皮样癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+恶性黑素瘤细胞、人宫颈表皮样癌细胞、HER2 1+人膀胱癌细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+、2+或3+人卵巢癌细胞，并且其中所述抗原结合构建体与美登素(DM1)偶联。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞是选自以下的细胞：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2；肺部肿瘤细胞系Calu-3、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit 562、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、BT-20、JIMT-1、SkBr3、BT-474；子宫肿瘤细胞系TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系Malme-3M；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；卵巢肿瘤细胞系CaOV3和SKOV3。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞是选自以下的细胞：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2、SW 1990、Panc1；肺部肿瘤细胞系A549、Calu-3、Calu-6、NCI-H2126、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit 562、SCC-15、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系Colo201、DLD-1、HCT116、HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系SNU-1、SNU-16、NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系SkBr3、MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、ZR-75-1、BT-20、BT549、BT-474、CAMA-1、MDAMB453、JIMT-1、T47D；子宫肿瘤细胞系SK-UT-1、TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系A431、Malme-3M、SKEMEL28；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；肾肿瘤细胞系ACHN；卵巢肿瘤细胞系CaOV3、Ovar-3和SKOV3；并且其中所述抗原结合构建体与美登素偶联。
67.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自HER2 2/3+、基因扩增型卵巢癌细胞；HER2 0+/1+三阴性乳腺癌细胞；ER+、HER2 1+乳腺癌细胞；曲妥珠单抗抗性HER2 2+乳腺癌细胞；ER+、HER2+乳腺癌细胞；或HER2 3+乳腺癌细胞。
68.一种生成根据权利要求1-38所述的构建体的方法，其包括在适于表达所述抗原结合构建体的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体的多核苷酸；并且纯化所述构建体。
69.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸集合，其包含编码根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体的至少一个多肽的至少一个核酸序列。
70.根据权利要求69所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸或多核苷酸集合为cDNA。
71.一种多核苷酸或分离的多核苷酸集合，其编码v5019、v7091、v10000、v5020或v6717。
72.一种载体或载体集合，其包含根据权利要求69-71所述的多核苷酸或多核苷酸集合中的一种或多种。
73.根据权利要求72所述的包含所述核苷酸或多核苷酸集合中的一种或多种的载体或载体集合，其选自质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
74.一种分离的细胞，其包含根据权利要求69-71所述的多核苷酸或多核苷酸集合，或根据权利要求72或73所述的载体或载体集合。
75.根据权利要求74所述的分离的细胞，其为杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
76.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体和使用说明书。
77.根据权利要求35所述的构建体，其中所述构建体是无岩藻糖基化的。

Claims (77)

1.一种抗原结合构建体，其包含
单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2(人表皮生长因子受体2)ECD2(胞外结构域2)抗原的第一抗原结合多肽构建体；
单价且特异性地结合HER2表达细胞上的HER2 ECD4(胞外结构域4)抗原的第二抗原结合多肽构建体；
第一和第二接头多肽，其中所述第一接头多肽与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接，并且所述第二接头多肽与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接；
其中所述接头多肽能够相互形成共价键，
并且其中所述第一或所述第二抗原结合多肽中的一个或两者为scFv。
2.根据权利要求1所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二接头多肽各自包含选自IgG1、IgG2或IgG4铰链区的免疫球蛋白铰链区多肽。
3.根据权利要求1或2所述的抗原结合构建体，其中所述第一和/或第二接头多肽与骨架，任选地与Fc可操作地连接。
4.根据权利要求1或2所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二接头多肽与包含第一和第二Fc多肽的二聚Fc可操作地连接，所述Fc多肽各自包含CH3序列，其中所述第一Fc多肽与所述第一接头多肽可操作地连接，并且所述第二接头多肽与所述第二接头多肽可操作地连接。
5.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中(i)所述第一抗原结合多肽构建体为scFv而所述第二抗原结合多肽构建体为Fab；或(ii)所述第一抗原结合多肽构建体为Fab而所述第二抗原结合多肽构建体为scFv；或(iii)所述第一抗原结合多肽构建体和所述第二抗原结合多肽构建体两者均为scFv。
6.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中
i.所述第一抗原结合多肽构建体为Fab并且包含
a.第一可变重链多肽VH1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VH和
b.第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VL；并且
ii.所述第二抗原结合多肽构建体为scFv并且包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VL；
ii.所述第一抗原结合多肽构建体为scFv并且包含
(a)第一可变重链多肽VH1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VH和
(b)第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VL并且
所述第二抗原结合多肽构建体为Fab并且包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VL；或
iii.所述第一抗原结合多肽构建体为scFv并且包含
(a)第一可变重链多肽VH1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VH，和
(b)第一可变轻链多肽VL1，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的帕妥珠单抗臂的VL，并且
所述第二抗原结合多肽构建体为scFv并且包含
(a)第二可变重链多肽VH2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VH和
(b)第二可变轻链多肽VL2，其包含v5019、v5020 v7091、v6717或v10000)的曲妥珠单抗臂的VL。
7.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体选自
i.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含氨基酸序列SEQ IDNO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:337，或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348；
ii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含与SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:337，或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348的三个VH CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
iii.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列包含SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340，或SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的三个VL CDR序列的氨基酸序列；
iv.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列和与SEQ ID NO:338、SEQID NO:339和SEQ ID NO:340，或SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340具有至少90％同一性的三个VL CDR序列的氨基酸序列具有至少90％同一性；
v.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340；或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的六个CDR序列的氨基酸序列；或
vi.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含与SEQ ID NO:335、SEQ IDNO:336、SEQ ID NO:337、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:339和SEQ ID NO:340；或SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336、SEQ ID NO:348、SEQ ID NO:338、SEQ ID NO:347和SEQ ID NO:340的六个CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列，并且所述第二抗原结合多肽选自
vii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342和SEQ ID NO:343的三个VH CDR序列的氨基酸序列；
viii.包含三个VH CDR序列的多肽构建体，所述三个VH CDR序列包含与SEQ ID NO:341、SEQ ID NO:342和SEQ ID NO:343的三个VH CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列；
ix.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列包含SEQ ID NO:344、SEQID NO:345和SEQ ID NO:346的三个VL CDR序列的氨基酸序列；
x.包含三个VL CDR序列的多肽构建体，所述三个VL CDR序列与SEQ ID NO:344、SEQ IDNO:345和SEQ ID NO:346的三个VL CDR序列的氨基酸序列具有至少90％同一性；
xi.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含SEQ ID NO:341、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:346的六个CDR序列的氨基酸序列；或
xii.包含六个CDR序列的多肽构建体，所述六个CDR序列包含与SEQ ID NO:341、SEQ IDNO:342、SEQ ID NO:343、SEQ ID NO:344、SEQ ID NO:345和SEQ ID NO:346的六个CDR序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
8.根据上述权利要求中任一项所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体：(i)阻断帕妥珠单抗与ECD2的结合50％或更高，和/或(ii)所述第二抗原结合多肽阻断曲妥珠单抗与ECD4的结合50％或更高。
9.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含对HER2 ECD2有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体之一，并且所述第二抗原结合多肽构建体包含对HER2 ECD4有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体之一。
10.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体包含与对HER2 ECD2有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列并且所述第二抗原结合多肽构建体包含与对HER2 ECD4有特异性的所述v5019、v10000、v7091、v5020或v6717抗原结合多肽构建体具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
11.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其选自v5019、v10000、v7091、v5020和v6717。
12.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一抗原结合多肽构建体为Fab并且所述第二抗原结合多肽构建体为scFv，并且其中所述抗原结合构建体与具有两个Fab的参考双互补位抗原结合构建体相比
(i)诱导在HER2 3+细胞中增强的受体内化和/或
(ii)在ADCC(抗体指导的细胞毒性作用)测定中对HER2 1+细胞展示出更高效力。
13.根据任何前述权利要求所述的抗原结合构建体，其中所述第一和第二抗原结合多肽构建体为scFv，并且其中所述抗原结合构建体与具有两个Fab的参考抗原结合构建体相比诱导在HER2 1+、2+和3+细胞中增强的受体内化。
14.一种经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含单价且特异性地结合HER2 ECD2的一个或多个抗原结合多肽构建体，每个多肽构建体包含VH和VL，其中所述VH包含三个CDR序列，所述三个CDR序列包含SEQ ID NO:335、SEQ ID NO:336和SEQ ID NO:348的三个VH CDR序列的氨基酸序列，并且所述VL包含三个CDR序列，所述三个CDR序列包含SEQ ID NO:338、SEQ IDNO:347和SEQ ID NO:340的三个VL CDR序列的氨基酸序列。
15.根据权利要求14所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述VH包含v9996的VH并且VL包含v9996的VL。
16.根据权利要求14或15所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述抗原结合多肽构建体包含与v9996的VH和v9996的VL具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求14-16所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述经修饰的帕妥珠单抗构建体为单价的、二价的或多价的。
18.根据权利要求14-17所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述构建体为(i)单价的并且包含Fab或scFv，(ii)为二价的并且包含Fab和scFv，或(iii)为二价的并且包含两个scFv。
19.根据权利要求14-17所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述构建体为单价的并且与帕妥珠单抗相比对HER2 ECD2展示出增加7至9倍的亲和力。
20.根据权利要求14-19所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含经或不经接头与所述抗原结合多肽构建体连接的二聚Fc。
21.根据权利要求14-20所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述经修饰的帕妥珠单抗构建体包含第一和第二抗原结合多肽构建体，及各自包含CH3序列的第一和第二Fc多肽，其中所述第一Fc多肽经或不经第一接头与所述第一抗原结合多肽构建体可操作地连接，并且所述第二单体Fc多肽经或不经第二接头与所述第二抗原结合多肽构建体可操作地连接。
22.根据权利要求20和21所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其包含多肽接头。
23.根据权利要求22所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述接头包含IgG1铰链区。
24.根据权利要求20和21所述的经修的饰帕妥珠单抗构建体，其中所述Fc为人Fc。
25.根据权利要求20和21所述的经修饰的帕妥珠单抗构建体，其中所述Fc为人IgG1Fc。
26.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含异二聚体Fc，其中所述二聚化CH3序列的解链温度(Tm)为约68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、77.5、78、79、80、81、82、83、84或85℃或更高。
27.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体Fc。
28.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在经由单个细胞表达时以大于约75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％的纯度形成的异二聚体Fc。
29.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰的异二聚体Fc。
30.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰的异二聚体Fc，所述修饰促进具有与野生型同二聚体Fc相当的稳定性的异二聚体的形成。
31.根据任何前述权利要求所述的构建体，根据EU编号与野生型同二聚体Fc相比其包含
i.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T366I_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
ii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_S400E_F405A_Y405V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc，
iii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和在所述第二多肽中的修饰T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
iv.具有在所述第一Fc多肽中的修饰L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
v.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392L_T394W的异二聚体IgG1 Fc；
vi.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc；或
vii.具有在所述第一Fc多肽中的修饰T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和在所述第二Fc多肽中的修饰T350V_T366L_N390R_K392M_T394W的异二聚体IgG1 Fc。
32.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含含有至少一个CH2结构域的异二聚体Fc。
33.根据权利要求32所述的构建体，其中所述异二聚体Fc的所述CH2结构域包含一个或多个修饰。
34.根据任何前述权利要求所述的构建体，其包含含有促进Fc-γ受体的选择性结合的一个或多个修饰的异二聚体Fc。
35.根据任何前述权利要求所述的构建体，其中所述构建体是糖基化的。
36.根据任何前述权利要求所述的构建体，其中所述构建体与药物偶联。
37.根据权利要求36所述的构建体，其中所述药物为美登素(DM1)。
38.根据权利要求36所述的构建体，其中所述构建体经SMCC接头与DM1偶联。
39.一种药物组合物，其包含根据任何前述权利要求所述的构建体和药物载体。
40.根据权利要求36所述的药物组合物，所述药物载体包括缓冲剂、抗氧化剂、低分子量分子、药物、蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂质、螯合剂、稳定剂或赋形剂。
41.一种用于药品中的药物组合物，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体。
42.一种用于癌症治疗的药物组合物，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体。
43.一种治疗患有HER2表达(HER2+)肿瘤的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1-38中任一项所述的构建体或根据权利要求39-42中任一项所述的药物组合物。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述治疗的结果是缩小所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、增加所述肿瘤进展的时间、延长所述受试者的无病生存期、减少转移、增加所述受试者的无进展生存期或增加所述受试者的总生存期。
45.根据权利要求43或44所述的方法，其中所述肿瘤为胰腺癌、头颈癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌、肾癌、***、卵巢癌、子宫内膜癌、子宫癌、恶性黑素瘤、咽癌、口腔癌或皮肤癌。
46.根据权利要求43-45所述的方法，其中所述肿瘤包含每个肿瘤细胞表达平均10,000个或更多个HER2拷贝的细胞。
47.根据权利要求43-46所述的方法，其中如通过免疫组织化学(IHC)所测定，所述肿瘤为HER2 1+、HER2 2+或HER2 3+。
48.根据权利要求47所述的方法，其中如通过IHC所测定，所述肿瘤表达2+或更低水平的HER2。
49.根据权利要求43所述的方法，其中如通过IHC所测定，所述HER2+肿瘤是表达HER2 2+/3+的卵巢癌并且经基因扩增并且对曲妥珠单抗适度敏感。
50.根据权利要求43所述的方法，其中如通过免疫组织化学(IHC)所测定，所述HER2+肿瘤是表达2+水平或更低的HER2的乳腺癌。
51.根据权利要求43所述的方法，其中所述HER2+肿瘤是(i)HER2 3+***受体阴性(ER-)、孕酮受体阴性(PR-)、曲妥珠单抗抗性、化疗抗性浸润性乳腺导管癌，(ii)HER2 3+ER-、PR-、曲妥珠单抗抗性炎性乳腺癌，(iii)HER2 3+、ER-、PR-浸润性导管癌或(iv)HER2 2+HER2基因扩增的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗抗性乳腺癌。
52.根据权利要求43-51所述的方法，其中所述受试者先前尚未用抗HER2抗体治疗。
53.根据权利要求43-51所述的方法，其中所述肿瘤对帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和/或TDM1有抗性或使用其难治。
54.根据权利要求43-51中任一项所述的方法，其中所述受试者先前已经用帕妥珠单抗、曲妥珠单抗和/或TDM1治疗。
55.根据权利要求43-54中任一项所述的方法，其中所述构建体选自v5019、v10000、v7091、v5020或v6717。
56.根据权利要求43-55中任一项所述的方法，其中施用是通过注射或输注进行。
57.根据权利要求43-56中任一项所述的方法，其还包括向所述受试者施用另外的试剂，任选地化疗剂。
58.根据权利要求57所述的方法，其中
i.所述肿瘤为非小细胞肺癌，并且所述另外的试剂为顺铂、卡铂、紫杉醇、白蛋白结合型紫杉醇、多西他赛、吉西他滨、长春瑞滨、伊立替康、依托泊苷、长春花碱或培美曲塞中的一种或多种；
ii.所述肿瘤为胃癌或胃部癌，并且所述另外的试剂为5-氟尿嘧啶(有或无亚叶酸)、卡培他滨、卡铂、顺铂、多西他赛、表柔比星、伊立替康、奥沙利铂或紫杉醇中的一种或多种；
iii.所述肿瘤为胰腺癌，并且所述另外的试剂为吉西他滨、亚叶酸钙、abraxane或5-氟尿嘧啶中的一种或多种；
iv.所述肿瘤为***和/或孕酮阳性乳腺癌，并且所述另外的试剂为(a)多柔比星和表柔比星的组合，(b)紫杉醇和多西他赛的组合，或(c)氟尿嘧啶、环磷酰胺和卡铂的组合中的一种或多种；
v.所述肿瘤为头颈癌，并且所述另外的试剂为紫杉醇、卡铂、多柔比星或顺铂中的一种或多种；
vi.所述肿瘤为卵巢癌并且所述另外的试剂为顺铂、卡铂或紫杉烷如紫杉醇或多西他赛中的一种或多种。
59.根据权利要求43-58所述的方法，其中所述受试者为人。
60.一种检测或测量样品中的HER2的方法，其包括使所述样品与根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体接触并且检测或测量结合复合物。
61.一种抑制、减少或阻断细胞中的HER2信号传导的方法，其包括向所述细胞施用有效量的根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体。
62.一种杀伤HER2表达肿瘤细胞或抑制HER2表达肿瘤细胞生长的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体接触。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞为HER2 1+或2+人胰腺癌细胞、HER2 3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2-扩增乳腺癌细胞、HER2 0+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+人卵巢癌细胞。
64.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞为HER2 1+或2+或3+人胰腺癌细胞、HER2 2+转移性胰腺癌细胞、HER2 0+/1+、+3+人肺癌细胞、HER2 2+高加索人细支气管肺泡癌细胞、HER2 0+间变性肺癌细胞、人非小细胞肺癌细胞、人咽癌细胞、HER2 2+人舌鳞状细胞癌细胞、HER2 2+咽部鳞状细胞癌细胞、HER2 1+或2+人结直肠癌细胞、HER2 0+、1+或3+人胃癌细胞、HER2 1+人乳腺导管ER+(***受体阳性)癌细胞、HER2 2+/3+人ER+、HER2扩增乳腺癌细胞、HER2 0+/1+人三阴性乳腺癌细胞、HER2 0+人乳腺导管癌(基底B型、间充质样三阴性)细胞、HER2 2+ER+乳腺癌细胞、HER2 0+人转移性乳腺癌细胞(ER-、HER2-扩增、管腔A型、TN)、人子宫中胚叶肿瘤(混合III级)细胞、2+人子宫内膜癌细胞、HER2 1+人皮肤表皮样癌细胞、HER2 1+肺转移性恶性黑素瘤细胞、HER2 1+恶性黑素瘤细胞、人宫颈表皮样癌细胞、HER2 1+人膀胱癌细胞、HER2 1+人***细胞、Her2 1+人肾细胞癌细胞或HER2 1+、2+或3+人卵巢癌细胞，并且其中所述抗原结合构建体与美登素(DM1)偶联。
65.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞是选自以下的细胞：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2；肺部肿瘤细胞系Calu-3、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit 562、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、BT-20、JIMT-1、SkBr3、BT-474；子宫肿瘤细胞系TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系Malme-3M；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；卵巢肿瘤细胞系CaOV3和SKOV3。
66.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞是选自以下的细胞：胰腺肿瘤细胞系BxPC3、Capan-1、MiaPaca2、SW 1990、Panc1；肺部肿瘤细胞系A549、Calu-3、Calu-6、NCI-H2126、NCI-H322；头颈部肿瘤细胞系Detroit 562、SCC-15、SCC-25、FaDu；结直肠肿瘤细胞系Colo201、DLD-1、HCT116、HT29、SNU-C2B；胃肿瘤细胞系SNU-1、SNU-16、NCI-N87；乳腺肿瘤细胞系SkBr3、MCF-7、MDAMB175、MDAMB361、MDA-MB-231、ZR-75-1、BT-20、BT549、BT-474、CAMA-1、MDAMB453、JIMT-1、T47D；子宫肿瘤细胞系SK-UT-1、TOV-112D；皮肤肿瘤细胞系A431、Malme-3M、SKEMEL28；***细胞系Caski、MS751；***细胞系T24；肾肿瘤细胞系ACHN；卵巢肿瘤细胞系CaOV3、Ovar-3和SKOV3；并且其中所述抗原结合构建体与美登素偶联。
67.根据权利要求62所述的方法，其中所述肿瘤细胞选自HER2 2/3+、基因扩增型卵巢癌细胞；HER2 0+/1+三阴性乳腺癌细胞；ER+、HER2 1+乳腺癌细胞；曲妥珠单抗抗性HER2 2+乳腺癌细胞；ER+、HER2+乳腺癌细胞；或HER2 3+乳腺癌细胞。
68.一种生成根据权利要求1-38所述的构建体的方法，其包括在适于表达所述抗原结合构建体的条件下培养宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体的多核苷酸；并且纯化所述构建体。
69.一种分离的多核苷酸或分离的多核苷酸集合，其包含编码根据权利要求1-38所述的抗原结合构建体的至少一个多肽的至少一个核酸序列。
70.根据权利要求69所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸或多核苷酸集合为cDNA。
71.一种多核苷酸或分离的多核苷酸集合，其编码v5019、v7091、v10000、v5020或v6717。
72.一种载体或载体集合，其包含根据权利要求69-71所述的多核苷酸或多核苷酸集合中的一种或多种。
73.根据权利要求72所述的包含所述核苷酸或多核苷酸集合中的一种或多种的载体或载体集合，其选自质粒、病毒载体、非附加型哺乳动物载体、表达载体和重组表达载体。
74.一种分离的细胞，其包含根据权利要求69-71所述的多核苷酸或多核苷酸集合，或根据权利要求72或73所述的载体或载体集合。
75.根据权利要求74所述的分离的细胞，其为杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或HEK293细胞。
76.一种试剂盒，其包含根据权利要求1-38中任一项所述的构建体和使用说明书。
77.根据权利要求35所述的构建体，其中所述构建体是无岩藻糖基化的。
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