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具体实施方式
本文描述了一种治疗受试者的胆道癌(BTC)的方法,包括向患者施用靶向HER2的双特异性抗原结合构建体。在一些实施方案中,靶向HER2的双特异性抗原结合构建体与澳瑞他汀(auristatin)类似物连接(在本文中称为抗体-药物缀合物或ADC)。在一些实施方案中,靶向HER2的双特异性抗原结合构建体可用于治疗胆囊癌或胆管癌的方法中。在其它实施方案中,靶向HER2的双特异性抗原结合构建体在施用于患有BTC的受试者时可导致受试者中肿瘤或病灶的大小减小。在其它实施方案中,靶向HER2的双特异性抗原结合构建体的施用可在受试者中引起完全应答(CR)、部分应答(PR)或稳定疾病(SD),如通过RECIST 1.1指南所测量的。
本文还描述了一种治疗BTC的方法,包括将靶向HER2的双特异性抗原结合构建体与一种或多种化疗剂联合施用于受试者。
定义
除非另有定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用,除非另有说明,否则术语“约”是指相比于给定值的大约+/-10%的变化。应当理解,这种变化始终包括在本文提供的任何给定值中,无论是否被具体提及。
词语“一(a/an)”在本文中与术语“包含”结合使用时可表示“一个”,但在某些实施方案中也与“一个或多个”、“至少一个”或“一个或多于一个”的含义一致。
如本文所用,术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”及其语法变型是包括性的或开放式的,并且不排除额外的、未列举的要素和/或方法步骤。术语“基本上由……组成”当在本文中与组合物、用途或方法结合使用时,表示可能存在额外的要素和/或方法步骤,但这些添加不会实质上影响所列举的组合物、方法或用途起作用的方式。术语“由……组成”当在本文中与组合物、用途或方法结合使用时,排除额外要素和/或方法步骤的存在。在本文描述为包括某些要素和/或步骤的组合物、用途或方法在某些实施方案中也可以基本上由那些要素和/或步骤组成,而在其它实施方案中由那些要素和/或步骤组成,无论这些实施方案是否明确提及。
可预期的是,本文讨论的任何实施方案都可以关于本文公开的任何方法、用途或组合物来实施。
结合本文公开的实施方案描述的特定特征、结构和/或特性可以与结合本文公开的另一个实施方案描述的特征、结构和/或特性以任何合适的方式组合以提供一个或多个其它实施方案。
还应理解,在一个实施方案中对特征的肯定叙述用作排除替代实施方案中的特征的基础。例如,在针对给定实施方案或权利要求提供选项列表的情况下,应当理解,可从所述列表中删除一个或多个选项并且缩短的列表可形成替代实施方案,无论这样的替代实施方案是否明确提及。
结合HER2的双特异性抗原结合构建体
结合HER2的双特异性抗原结合构建体(也称为双特异性抗HER2抗原结合构建体)描述如下。
术语“抗原结合构建体”是指试剂,例如能够结合抗原的多肽或多肽复合物。在一些方面,抗原结合构建体是与所关注的抗原特异性结合的多肽。抗原结合构建体可以是单体、二聚体、多聚体、蛋白质、肽、或蛋白质或肽复合物;抗体、抗体片段或其抗原结合片段;scFv等。抗原结合构建体可以是单特异性、双特异性或多特异性的多肽构建体。在一些方面,抗原结合构建体可包括例如与一种或多种Fc连接的一种或多种抗原结合组分(例如,Fab或scFv)。下文描述并在实施例中提供了抗原结合构建体的其它实例。
术语“双特异性”旨在包括任何试剂,例如抗原结合构建体,其具有两个抗原结合部分(例如抗原结合多肽构建体),每个部分具有独特的结合特异性。例如,第一抗原结合部分结合第一抗原上的表位,并且第二抗原结合部分结合第二抗原上的表位。如本文所用,术语“双互补位”是指双特异性抗体,其中第一抗原结合部分和第二抗原结合部分结合相同抗原上的不同表位。双互补位双特异性抗体可结合同一抗原分子上的两个表位,或者它可结合两个不同抗原分子上的表位。
单特异性抗原结合构建体是指具有一种结合特异性的抗原结合构建体。换句话说,两个抗原结合部分都结合相同抗原上的相同表位。单特异性抗原结合构建体的实例包括与HER2结合的曲妥珠单抗和帕妥珠单抗。
抗原结合构建体可以是抗体或其抗原结合部分。如本文所用,“抗体”或“免疫球蛋白”是指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽,其特异性结合并识别分析物(例如抗原)。公认的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因,以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链分类为κ或λ。抗体或免疫球蛋白的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA、IgD、IgE、IgG和IgM,并且这些中的一些可进一步分为亚类(同种型),例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成,每对具有一条“轻”(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端结构域定义了一个约100至110个或更多个氨基酸的可变区,主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链结构域。IgG1重链分别包含从N末端到C末端的VH、CH1、CH2和CH3结构域。轻链包含从N末端到C末端的VL和CL结构域。IgG1重链包含CH1和CH2结构域之间的铰链。在某些实施方案中,免疫球蛋白构建体包含至少一个来自连接至治疗性多肽的IgG、IgM、IgA、IgD或IgE的免疫球蛋白结构域。在一些实施方案中,在本文提供的抗原结合构建体中发现的免疫球蛋白结构域来自或衍生自基于免疫球蛋白的构建体,例如双抗体或纳米抗体。在某些实施方案中,本文所述的免疫球蛋白构建体包含来自重链抗体如骆驼抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。在某些实施方案中,本文提供的免疫球蛋白构建体包含来自哺乳动物抗体如牛抗体、人类抗体、骆驼抗体、小鼠抗体或任何嵌合抗体的至少一个免疫球蛋白结构域。
“互补决定区”或“CDR”是有助于抗原结合特异性和亲和力的氨基酸序列。“框架”区(FR)可帮助维持CDR的适当构象,以促进抗原结合区与抗原之间的结合。在结构上,框架区可位于CDR之间的抗体中。可变区通常表现出由三个高变区(也称为CDR)连接的相对保守的框架区(FR)的相同一般结构。来自重链和轻链可变结构域的CDR通常由框架区对齐,这可实现与特定表位的结合。从N末端到C末端,轻链和重链可变结构域通常包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。除非另有说明,否则将氨基酸分配给每个结构域通常是按照Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutesof Health,Bethesda,Md.(1987和1991))的定义。通常,免疫球蛋白的可变部分中有三个重链和三个轻链CDR(或CDR区)。三个重链CDR在本文中称为CDRH1、CDRH2和CDRH3,而三个轻链CDR称为CDRL1、CDRL2和CDRL3。因此,如本文所用的“CDR”可指所有三个重链CDR或所有三个轻链CDR(或所有重链CDR和所有轻链CDR,如果适当的话)。CDR为抗体与抗原或表位的结合提供了大多数接触残基。通常,三个重链CDR和三个轻链CDR是结合抗原所必需的。然而,在一些情形下,即使单个可变结构域也可赋予抗原以结合特异性。此外,如本领域已知的,在一些情况下,抗原结合也可通过最少一个或多个选自VH和/或VL结构域的CDR(例如CDRH3)的组合而发生。
CDR序列的许多不同定义是常用的,包括由Kabat等人(1983,Sequences ofProteins of Immunological Interest,NIH Publication No.369-847,Bethesda,MD)、Chothia等人(1987,J Mol Biol,196:901-917)以及IMGT、AbM(University of Bath)和Contact(MacCallum R.M.和Martin A.C.R.和Thornton J.M,(1996),Journal ofMolecular Biology,262(5),732-745)定义描述的那些。举例来说,下表1中提供了根据Kabat、Chothia、IMGT、AbM和Contact的CDR定义。因此,如对于本领域技术人员显而易见的,CDR的确切编号和位置可基于所采用的编号***而不同。然而,应当理解,本文中VH的公开内容包括由任何已知编号***定义的相关(固有)重链CDR(HCDR)的公开内容。类似地,本文中VL的公开内容包括由任何已知编号***定义的相关(固有)轻链CDR(LCDR)的公开内容。
表1:常见的CDR定义1
1Kabat或Chothia编号***可用于除Contact外的所有定义的HCDR2、HCDR3和轻链CDR,Contact使用Chothia编号
2使用Kabat编号。Kabat编号方案中划分Chothia和IMGT CDR-H1环末端的位置因环长度而异,因为Kabat将***置于这些CDR定义之外的位置35A和35B。然而,IMGT和Chothia CDR-H1环可使用Chothia编号明确定义。使用Chothia编号的CDR-H1定义:KabatH31-H35、Chothia H26-H32、AbM H26-H35、IMGT H26-H33、Contact H30-H35。
如本文所用,术语“单链”是指包含通过肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在某些实施方案中,抗原结合多肽构建体之一是单链Fv分子(scFv)。如本文更详细描述的,scFv具有通过多肽链从其C末端连接至重链可变结构域(VH)的N末端的轻链可变结构域(VL)。或者,scFv可以是其中VH的C末端通过多肽链连接到VL的N末端的多肽链。
抗原结合多肽构建体
双特异性抗HER2抗原结合构建体包含两个抗原结合多肽构建体,每个都结合于HER2的特定结构域或表位。在一个实施方案中,每个抗原结合多肽构建体结合于HER2的细胞外结构域,例如ECD2或ECD4。取决于应用,抗原结合多肽构建体可以是例如Fab或scFv。
双特异性抗HER2抗原结合构建体的形式决定了双特异性抗HER2抗原结合构建体的功能特性。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体具有scFv-Fab形式(即一种抗原结合多肽构建体是scFv并且另一种抗原结合多肽构建体是Fab,也称为Fab-scFv形式)。在另一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体具有scFv-scFv形式(即两种抗原结合多肽构建体都是scFv)。
“Fab片段”(也称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含参与抗原结合的互补决定环(CDR,也称为高变区)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于在重链CH1结构域的羧基末端处添加了几个残基,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。
“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH和VL结构域,其中这些结构域存在于单个多肽链中。在一个实施方案中,Fv多肽还包含位于VH和VL结构域之间的多肽接头,其使得scFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于scFv的综述,参见Pluckthun,The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185;美国专利第5,571,894号;和美国专利第5,587,458号。
抗原结合构建体的形式和功能
本文提供了具有两个抗原结合多肽构建体的双特异性抗HER2抗原结合构建体,其中第一个与HER2 ECD2特异性结合,并且其中第二个与HER2 ECD4特异性结合。双特异性抗HER2抗原结合构建体的形式使得第一或第二抗原结合多肽中的至少一个是scFv。双特异性抗HER2抗原结合构建体的形式可以是scFv-scFv、或Fab-scFv或scFv-Fab(分别为第一抗原结合多肽构建体-第二抗原结合多肽)。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体在体外表现出抗肿瘤活性,例如(i)在存在或不存在表皮生长因子或调蛋白刺激的情况下抑制癌细胞生长的能力,(ii)在癌细胞中内化的能力(通过与HER2抗原结合并使其内化)和(iii)介导抗体导向效应细胞杀伤(ADCC)的能力。在裸双特异性抗HER2抗原结合构建体和与澳瑞他汀类似物缀合的双特异性抗HER2抗原结合构建体下以及在不同水平的HER2表达(1+、2+和3+)下都观察到这些体外活性。
如国际专利公开第WO2015/077891号中所述,双特异性抗HER2抗原结合构建体的形式(scFv/scFv、scFv/Fab或Fab/Fab)对于确定其功能概况很重要。在某些实施方案中,与其中ECD2-和ECD4-结合多肽构建体都是Fab的参考抗原结合构建体相比,抗HER2结合构建体表现出增加的被表达HER2的肿瘤细胞内化的能力。预期可通过增加一种或两种抗原结合多肽构建体对ECD2或ECD4的亲和力来进一步提高双特异性抗HER2抗原结合构建体的内化程度。在其中ECD2结合多肽是Fab并且ECD4结合多肽是scFv的一个实施方案中,与具有Fab/Fab形式的同等亲和力的构建体相比,所述构建体被更大程度地内化,并且通过高表达和低表达HER2的肿瘤细胞,在与具有scFv/scFv形式的同等亲和力的构建体相似的程度上被内化。易于内化的实施方案是抗体-药物缀合物的良好候选者,其需要被肿瘤细胞内化以实现杀伤。相反,在某些实施方案中,与具有Fab/Fab形式的同等亲和力的构建体相比,不容易内化的双特异性抗HER2抗原结合构建体在ADCC杀伤表达低水平HER2的肿瘤细胞方面表现出增加的效力。在一个实施方案中,具有Fab/scFv形式的双特异性抗HER2抗原结合构建体在ADCC杀伤表达低水平HER2(HER2 0-1+或1+)的肿瘤细胞方面比具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体更有效,而具有Fab/Fab形式的抗HER2构建体又比具有scFv/scFv形式的双特异性抗HER2抗原结合构建体更有效。一些实施方案的增强的ADCC效力可能是由于1)它们与具有低HER2受体密度的细胞亲合性结合并随后将HER2受体聚集在靶细胞表面上并介导下游细胞介导的杀伤的能力增强;和/或2)它们保持在细胞表面上的能力增强(而不是引起内化);因此它们更可用于细胞介导的效应子杀伤。
HER2
本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体包含结合于HER2的ECD2和ECD4的抗原结合多肽构建体。
表述“ErbB2”和“HER2”在本文中可互换使用并且指例如在Semba等人,PNAS(USA)82:6497-6501(1985)和Yamamoto等人,Nature 319:230-234(1986)(Genebank登录号X03363)中描述的人类HER2蛋白。术语“erbB2”和“neu”是指编码人类ErbB2蛋白的基因。p185或p185neu是指neu基因的蛋白质产物。
HER2是一种HER受体。“HER受体”是一种受体蛋白酪氨酸激酶,其属于人表皮生长因子受体(HER)家族并包括EGFR、HER2、HER3和HER4受体。HER受体通常将包含可结合HER配体的细胞外结构域;亲脂性跨膜结构域;保守的细胞内酪氨酸激酶结构域;和羧基末端信号传导结构域,带有几个可被磷酸化的酪氨酸残基。“HER配体”是指结合和/或激活HER受体的多肽。
HER2的细胞外(胞外)结构域包含四个结构域,结构域I(ECD1,氨基酸残基约1-195)、结构域II(ECD2,氨基酸残基约196-319)、结构域III(ECD3,氨基酸残基约320-488)和结构域IV(ECD4,氨基酸残基约489-630)(残基编号,无信号肽)。参见Garrett等人,Mol.Cell.11:495-505(2003);Cho等人,Nature 421:756-760(2003);Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004);Tse等人,Cancer Treat Rev.2012年4月;38(2):133-42(2012);或Plowman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90:1746-1750(1993)。
HER2的序列如下;ECD边界是结构域I:1-165;结构域II:166-322;结构域III:323-488;结构域IV:489-607。
“表位2C4”是HER2细胞外结构域中与抗体2C4结合的区域。表位2C4包含HER2细胞外结构域中来自结构域II的残基。2C4和帕妥珠单抗在结构域I、II和III的交界处与HER2的细胞外结构域结合。Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004)。为了筛选与2C4表位结合的抗体,可进行常规交叉阻断测定,例如在Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的。或者,可使用本领域已知的方法进行表位定位以评估抗体是否与HER2的2C4表位结合和/或可研究抗体-HER2结构(Franklin等人,Cancer Cell 5:317-328(2004))以查看HER2的哪些结构域被抗体结合。
“表位4D5”是HER2细胞外结构域中与抗体4D5(ATCC CRL 10463)和曲妥珠单抗结合的区域。该表位靠近HER2的跨膜结构域,并且在HER2的结构域IV内。为了筛选与4D5表位结合的抗体,可进行常规交叉阻断测定,例如在Antibodies,A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,Ed Harlow和David Lane(1988)中描述的。或者,可进行表位定位以评估抗体是否结合HER2的4D5表位(例如,从约残基529至约残基625的区域中的任何一个或多个残基(包括端值),参见美国专利公开第2006/0018899号的图1)。
“特异性地结合”、“特异性结合”或“选择性结合”是指结合对抗原是选择性的并且可区别于不需要的或非特异性的相互作用。双特异性抗HER2抗原结合构建体结合特定抗原决定簇的能力可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术例如表面等离子体共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad等人,Glyco J 17,323-329(2000))和传统结合测定(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))来测量。在一个实施方案中,抗原结合部分与无关蛋白质的结合程度小于双特异性抗HER2抗原结合构建体与抗原结合的程度的约10%,如例如通过SPR测量。在某些实施方案中,与抗原结合的双特异性抗HER2抗原结合构建体或包含该抗原结合部分的抗原结合分子具有<1μΜ、<100nM、<10nM、<1nM、<0.1nM、<0.01nM或<0.001nM(例如10~8M或更小,例如10~8M至10"13M,例如10"9M至10"13M)的解离常数(KD)。
“调蛋白”(HRG)当在本文中使用时是指由如美国专利第5,641,869号或Marchionni等人,Nature,362:312-318(1993)中所公开的调蛋白基因产物编码的多肽。调蛋白的实例包括调蛋白-α、调蛋白-β1、调蛋白-β2和调蛋白-β3(Holmes等人,Science,256:1205-1210(1992);和美国专利第5,641,869号);neu分化因子(NDF)(Peles等人,Cell 69:205-216(1992));乙酰胆碱受体诱导活性(ARIA)(Falls等人,Cell 72:801-815(1993));神经胶质生长因子(GGF)(Marchionni等人,Nature,362:312-318(1993));感觉和运动神经元衍生因子(SMDF)(Ho等人,J.Biol.Chem.270:14523-14532(1995));γ-调蛋白(Schaefer等人,Oncogene 15:1385-1394(1997))。所述术语包括天然序列HRG多肽的生物活性片段和/或氨基酸序列变体,例如其EGF样结构域片段(例如HRGβ1177-244)。
“HER活化”或“HER2活化”是指任何一种或多种HER受体或HER2受体的活化或磷酸化。通常,HER活化导致信号转导(例如,由HER受体的细胞内激酶结构域磷酸化HER受体或底物多肽中的酪氨酸残基引起的)。HER活化可通过HER配体与包含所关注HER受体的HER二聚体结合来介导。HER配体与HER二聚体结合可激活二聚体中一种或多种HER受体的激酶结构域,从而导致一种或多种HER受体中酪氨酸残基的磷酸化和/或其它底物多肽(例如Akt或MAPK细胞内激酶)中酪氨酸残基的磷酸化。
“人源化”形式的非人类(例如啮齿动物)抗体是嵌合抗体,其包含源自非人类免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下,人源化抗体是人类免疫球蛋白(接受者抗体),其中来自接受者高变区的残基被具有所需特异性、亲和力和能力的来自非人类物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的高变区的残基代替。在一些情形下,人类免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人类残基代替。此外,人源化抗体可包含在接受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体性能。一般来说,人源化抗体将包含基本上所有的至少一个并且通常两个可变结构域,其中所有或基本上所有的高变环对应于非人类免疫球蛋白的那些,并且所有或基本上所有的FR是人类免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体任选地还将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分,通常是人类免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986);Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988);和Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
双特异性抗HER2抗原结合构建体的Fc。
在一些实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体包含Fc,例如二聚体Fc。
术语“Fc结构域”或“Fc区”在本文中用于定义含有恒定区的至少一部分的免疫球蛋白重链的C末端区域。所述术语包括天然序列Fc区和变异Fc区。除非本文另有说明,否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号***,也称为EU索引,如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。如本文所用的二聚体Fc的“Fc多肽”是指形成二聚体Fc结构域的两个多肽之一,即能够稳定自缔合的包含免疫球蛋白重链的C末端恒定区的多肽。例如,二聚体IgG Fc的Fc多肽包含IgG CH2和IgG CH3恒定结构域序列。
Fc结构域包含CH3结构域或CH3和CH2结构域。所述CH3结构域包含两个CH3序列,一个来自二聚体Fc的两个Fc多肽中的每一个。所述CH2结构域包含两个CH2序列,一个来自二聚体Fc的两个Fc多肽中的每一个。
在一些方面,Fc包含至少一个或两个CH3序列。在一些方面,Fc在有或没有一个或多个接头的情况下与第一抗原结合多肽构建体和/或第二抗原结合多肽构建体偶联。在一些方面,Fc是人类Fc。在一些方面,Fc是人类IgG或IgG1 Fc。在一些方面,Fc是异源二聚体Fc。在一些方面,Fc包含至少一个或两个CH2序列。
在一些方面,Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰。在一些方面,Fc在至少一个CH2序列中包含一个或多个修饰。在一些方面,Fc是单一多肽。在一些方面,Fc是多个肽,例如两个多肽。
在一些方面,Fc是在2011年11月4日提交的专利申请PCT/CA2011/001238或2012年11月2日提交的PCT/CA2012/050780中描述的Fc,所述专利申请各自的全部公开内容特此出于所有目的通过引用整体并入本文。
修饰的CH3结构域
在一些方面,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体包含异源二聚体Fc,所述异源二聚体Fc包含已被不对称修饰的修饰的CH3结构域。异源二聚体Fc可包含两个重链恒定结构域多肽:第一Fc多肽和第二Fc多肽,它们可互换使用,条件是Fc包含一个第一Fc多肽和一个第二Fc多肽。通常,第一Fc多肽包含第一CH3序列并且第二Fc多肽包含第二CH3序列。
当两个CH3序列二聚化时,包含一个或多个以不对称方式引入的氨基酸修饰的两个CH3序列通常会产生异源二聚体Fc,而不是同源二聚体。如本文所用,“不对称氨基酸修饰”是指任何修饰,其中第一CH3序列上特定位置的氨基酸与第二CH3序列相同位置的氨基酸不同,并且第一和第二CH3序列优先配对形成异源二聚体,而不是同源二聚体。这种异源二聚化可以是每个序列上相同的相应氨基酸位置的两个氨基酸中仅一个的修饰的结果;或者在第一和第二CH3序列中的每一个上的相同相应位置处的每个序列上的两个氨基酸的修饰。异源二聚体Fc的第一和第二CH3序列可包含一个或多于一个不对称氨基酸修饰。
表2提供了人类IgG1 Fc序列的氨基酸序列,对应于全长人类IgG1重链的氨基酸231至447。CH3序列包含全长人类IgG1重链的氨基酸341-447。
通常,Fc可包括两个能够二聚化的连续重链序列(A和B)。在一些方面,Fc的一个或两个序列在以下位置包括一个或多个突变或修饰:L351、F405、Y407、T366、K392、T394、T350、S400和/或N390,使用EU编号。在一些方面,Fc包括表2中所示的变体序列。在一些方面,Fc包括变体1A-B的突变。在一些方面,Fc包括变体2A-B的突变。在一些方面,Fc包括变体3A-B的突变。在一些方面,Fc包括变体4A-B的突变。在一些方面,Fc包括变体5A-B的突变。
表2:IgG1 Fc序列
第一和第二CH3序列可包含如本文所述的氨基酸突变,关于全长人类IgG1重链的氨基酸231至447。在一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T394处具有氨基酸修饰。在一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列具有一个或多个选自L351Y、F405A和Y407V的氨基酸修饰,并且第二CH3序列具有一个或多个选自T366L、T366I、K392L、K392M和T394W的氨基酸修饰。
在一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰,并且第一或第二CH3序列中的一者在位置Q347处进一步包含氨基酸修饰,并且另一个CH3序列在位置K360处进一步包含氨基酸修饰。在另一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰,第一或第二CH3序列中的一者在位置Q347处进一步包含氨基酸修饰,并且另一个CH3序列在位置K360处进一步包含氨基酸修饰,并且所述CH3序列中的一者或两者进一步包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰,并且所述第一和第二CH3序列中的一者进一步包含D399R或D399K的氨基酸修饰,并且另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一者或多者。在另一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰,所述第一和第二CH3序列中的一者进一步包含D399R或D399K的氨基酸修饰,并且另一个CH3序列包含T411E、T411D、K409E、K409D、K392E和K392D中的一者或多者,并且所述CH3序列中的一者或两者进一步包含氨基酸修饰T350V。
在一个实施方案中,异源二聚体Fc包含修饰的CH3结构域,其中第一CH3序列在位置L351、F405和Y407处具有氨基酸修饰,并且第二CH3序列在位置T366、K392和T394处具有氨基酸修饰,其中所述CH3序列中的一者或两者还包含T350V的氨基酸修饰。
在一个实施方案中,异源二聚体Fc包括包含以下氨基酸修饰的修饰的CH3结构域,其中“A”表示对第一CH3序列的氨基酸修饰,并且“B”表示对第二CH3序列的氨基酸修饰:A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392M_T394W、A:L351Y_F405A_Y407V、B:T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392L_T394W、A:T350V_L351Y_F405A_Y407V、B:T350V_T366L_K392M_T394W、A:T350V_L351Y_S400E_F405A_Y407V和/或B:T350V_T366L_N390R_K392M_T394W。
一个或多个不对称氨基酸修饰可促进异源二聚体Fc的形成,其中异源二聚体CH3结构域具有与野生型同源二聚体CH3结构域相当的稳定性。在一个实施方案中,一个或多个不对称氨基酸修饰促进异源二聚体Fc结构域的形成,其中异源二聚体Fc结构域具有与野生型同源二聚体Fc结构域相当的稳定性。在一个实施方案中,一个或多个不对称氨基酸修饰促进异源二聚体Fc结构域的形成,其中异源二聚体Fc结构域具有在差示扫描量热研究中经由解链温度(Tm)观察到的稳定性,并且其中解链温度在相应的对称野生型同源二聚体Fc结构域所观察到的解链温度的4℃内。在一些方面,Fc在至少一个CH3序列中包含一个或多个修饰,其促进异源二聚体Fc的形成,其稳定性与野生型同源二聚体Fc相当。
示例性双特异性抗HER2抗原结合构建体
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体是美国专利申请公开第2016/0289335号或国际专利公开第WO2015/077891号中描述的双互补位抗体之一。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体是v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一(参见表3、表4、表5和序列表)。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的VH序列和VL序列。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的VH序列和VL序列,并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4结合臂的VH序列和VL序列。
在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的CDR序列。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的CDR序列,并且另一个抗原结合多肽构建体包含来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4结合臂的CDR序列。
本领域技术人员将理解,可将有限数目的氨基酸取代引入已知抗体的CDR序列或者VH或VL序列,而抗体不会失去其结合其靶标的能力。候选氨基酸取代可通过计算机建模或通过本领域已知的技术如丙氨酸扫描来鉴定,其中通过标准技术测试所得变体的结合活性。因此,在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链CDR1、CDR2和CDR3),其具有与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的一组CDR具有90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%的序列同一性,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含这些CDR序列的变体,所述CDR序列包含跨六个CDR的1至10个氨基酸取代(即,CDR可通过包括多达10个氨基酸取代而修饰,其中CDR的任何组合被修饰),例如,跨CDR序列1至7个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代、1至4个氨基酸取代、1至3个氨基酸取代、1至2个氨基酸取代或1个氨基酸取代,其中变体保留结合ECD2的能力。通常,此类氨基酸取代将是保守氨基酸取代。在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链CDR1、CDR2和CDR3),其与来自v10000的ECD2结合臂的一组CDR具有90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%的序列同一性,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的VH序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VH序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD2结合臂的VL序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VL序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v10000的ECD2结合臂的VH序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VH序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v10000的ECD2结合臂的VL序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VL序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD2的能力。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链CDR1、CDR2和CDR3),其与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4结合臂的一组CDR具有90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%的序列同一性,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含这些CDR序列的变体,所述CDR序列变体包含跨六个CDR的1至10个氨基酸取代(即,CDR可通过包括多达10个氨基酸取代而修饰,其中CDR的任何组合被修饰),例如,跨CDR 1至7个氨基酸取代、1至5个氨基酸取代、1至4个氨基酸取代、1至3个氨基酸取代、1至2个氨基酸取代或1个氨基酸取代,其中所述变体保留结合ECD4的能力。通常,此类氨基酸取代将是保守氨基酸取代。在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含一组CDR(即重链CDR1、CDR2和CDR3,以及轻链CDR1、CDR2和CDR3),其与来自v10000的ECD4结合臂的一组CDR具有90%或更高、95%或更高、98%或更高、99%或更高或100%的序列同一性,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4结合臂的VH序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VH序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903或v6717之一的ECD4结合臂的VL序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VL序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v10000的ECD4结合臂的VH序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VH序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的抗原结合多肽构建体之一包含与来自v10000的ECD4结合臂的VL序列具有至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%同一性的VL序列,其中抗原结合多肽构建体保留结合ECD4的能力。
表3:示例性双特异性抗HER2抗原结合构建体
*根据Kabat的Fab或可变结构域编号(Kabat等人,Sequences of proteins ofimmunological interest,第5版,US Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242,第647页,1991)
§根据Kabat中的EU索引的CH3编号(Edelman等人,1969,PNAS USA,63:78-85)
表4:变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903和v6717的ECD2结合臂的CDR序列
表5:变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6902、v6903和v6717的ECD4结合臂的CDR序列
HC CDR |
SEQ ID NO |
LC CDR |
SEQ ID NO |
H1:GFNIKDTY |
33 |
L1:QDVNTA |
67 |
H2:IYPTNGYT |
35 |
L2:SAS |
68 |
H3:SRWGGDGFYAMDY |
34 |
L3:QQHYTTPPT |
69 |
双特异性抗HER2抗原结合构建体的制备
本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体可使用重组方法和组合物产生,例如,如美国专利第4,816,567号或国际专利公开第WO2015/077891号中所述。
在一个实施方案中,提供了编码本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体的分离的核酸。此类核酸可编码包含双特异性抗HER2抗原结合构建体(例如,抗原结合构建体的轻链和/或重链)的VL的氨基酸序列和/或包含其VH的氨基酸序列。在另一个实施方案中,提供了一种或多种包含此类核酸的载体(例如,表达载体)。如本领域已知的,因为许多氨基酸由一个以上密码子编码,所以多个核酸可编码单个多肽序列。本文提供了双特异性抗HER2抗原结合构建体的每个多肽的示例性核酸;然而应理解,其它核酸可用于制备本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体。
在一个实施方案中,在多顺反子载体中提供核酸。在另一个实施方案中,提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中,宿主细胞包含以下各物(例如,已被以下各物转化):(1)包含编码包含双特异性抗HER2抗原结合构建体的VL的氨基酸序列和包含抗原结合多肽构建体的VH的序列的氨基酸序列的核酸的载体,或(2)包含编码包含编码抗原结合多肽构建体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码抗原结合多肽构建体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体。在一个实施方案中,宿主细胞是真核细胞,例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,或人胚胎肾(HEK)细胞,或淋巴样细胞(例如Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中,提供了一种制备双特异性抗HER2抗原结合构建体的方法,其中所述方法包括在适合于表达双特异性抗HER2抗原结合构建体的条件下培养包含编码如上文提供的双特异性抗HER2抗原结合构建体的核酸的宿主细胞,以及任选地从宿主细胞(或宿主细胞培养基)回收双特异性抗HER2抗原结合构建体。
对于双特异性抗HER2抗原结合构建体的重组生产,将编码双特异性抗HER2抗原结合构建体(例如,如上所述)的核酸分离并***到一种或多种载体中用于进一步克隆和/或在宿主细胞中表达。可使用常规程序(例如,通过使用能够特异性结合编码双特异性抗HER2抗原结合构建体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)容易地分离此类核酸并进行测序。
术语“基本上纯化的”是指本文所述的构建体或其变体,其可大体上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的蛋白质通常伴随或相互作用的组分,即天然细胞,或在重组产生的双特异性抗HER2抗原结合构建体的情况下的宿主细胞,其在某些实施方案中基本上不含细胞材料,包括具有小于约30%、小于约25%、小于约20%、小于约15%、小于约10%、小于约5%、小于约4%、小于约3%、小于约2%或小于约1%(按干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当双特异性抗HER2抗原结合构建体由宿主细胞重组产生时,在某些实施方案中蛋白质以约30%、约25%、约20%、约15%、约10%、约5%、约4%、约3%、约2%或约1%或更少的细胞干重存在。当双特异性抗HER2抗原结合构建体由宿主细胞重组产生时,在某些实施方案中,所述蛋白质以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或更少的细胞干重存在于培养基中。在某些实施方案中,通过本文所述方法产生的“基本上纯化的”双特异性抗HER2抗原结合构建体具有至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%的纯度水平,特别是至少约75%、80%、85%的纯度水平,更特别是至少约90%的纯度水平、至少约95%的纯度水平、至少约99%或更高的纯度水平,如通过适当方法如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳所测定。
用于克隆或表达双特异性抗HER2抗原结合构建体编码载体的合适宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。
“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指包含外源多核苷酸的细胞,无论用于***的方法如何,例如直接摄取、转导、f-交配或本领域已知的用于产生重组宿主细胞的其它方法。外源多核苷酸可作为非整合的载体例如质粒保持,或者可整合到宿主基因组中。
如本文所用,术语“真核生物”是指属于***发育域真核生物的生物,例如动物(包括但不限于哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括但不限于单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。
如本文所用,术语“原核生物”是指原核生物体。例如,非真核生物可属于真细菌(包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)等)***发育域,或古生菌(包括但不限于詹氏甲烷球菌(Methanococcusjannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐杆菌如沃氏富盐菌(Haloferax volcanii)和嗜盐杆菌种NRC-1、闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)、强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、掘越氏火球菌(Pyrococcushorikoshii)、敏捷气热菌(Aeuropyrum pernix)等)***发育域。
例如,双特异性抗HER2抗原结合构建体可在细菌中产生,特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。对于双特异性抗HER2抗原结合构建体片段和多肽在细菌中的表达,参见例如美国专利第5,648,237号、第5,789,199号和第5,840,523号。(还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.,2003),第245-254页,描述抗体片段在大肠杆菌中的表达。)表达后,双特异性抗HER2抗原结合构建体可以可溶性部分从细菌细胞糊中分离并且可进一步纯化。
除了原核生物之外,真核微生物如丝状真菌或酵母是适用于双特异性抗HER2抗原结合构建体编码载体的克隆或表达宿主,包括糖基化途径已“人源化”的真菌和酵母菌株,从而产生具有部分或完全人类糖基化模式的双特异性抗HER2抗原结合构建体。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004);和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
适用于表达糖基化双特异性抗HER2抗原结合构建体的宿主细胞也来源于多细胞生物(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株,它们可与昆虫细胞结合使用,特别是用于草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利第5,959,177号、第6,040,498号、第6,420,548号、第7,125,978号和第6,417,429号(描述了用于在转基因植物中生产抗原结合构建体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它实例是由SV40(COS-7)转化的猴肾CV1系;人胚胎肾系(293或293细胞,如例如Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述);幼仓鼠肾细胞(BHK);小鼠赛尔托利细胞(sertoli cell)(TM4细胞,如例如Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述);猴肾细胞(CV1);非洲绿猴肾细胞(VERO-76);人***细胞(HELA);犬肾细胞(MDCK;水牛大鼠肝细胞(BRL 3A);人肺细胞(W138);人肝细胞(Hep G2);小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562);TRI细胞,如例如Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述;MRC 5细胞;和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));以及骨髓瘤细胞系,例如Y0、NS0和Sp2/0。有关适用于抗原结合构建体生产的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,N.J.),第255-268页(2003)。
在一个实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体是通过以下方法在稳定的哺乳动物细胞中产生的,所述方法包括:以预定比率用编码双特异性抗HER2抗原结合构建体的核酸转染至少一种稳定的哺乳动物细胞;以及在所述至少一种哺乳动物细胞中表达所述核酸。在一些实施方案中,在瞬时转染实验中确定核酸的预定比率,以确定导致表达产物中双特异性抗HER2抗原结合构建体的最高百分比的输入核酸的相对比率。
在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体在稳定的哺乳动物细胞中产生,其中与单体重链或轻链多肽或其它抗体相比,所述至少一种稳定哺乳动物细胞的表达产物包含更大百分比的所需糖基化双特异性抗HER2抗原结合构建体。在一些实施方案中,糖基化双特异性抗HER2抗原结合构建体的鉴定通过液相色谱法和质谱法中的一种或两种进行。
如果需要,双特异性抗HER2抗原结合构建体可在表达后纯化或分离。可以本领域技术人员已知的多种方式分离或纯化蛋白质。标准纯化方法包括色谱技术,包括离子交换、疏水相互作用、亲和、大小或凝胶过滤,以及反相,在大气压或高压下使用例如FPLC和HPLC的***进行。纯化方法还包括电泳、免疫、沉淀、透析和色谱聚焦技术。超滤和渗滤技术,结合蛋白质浓缩,也是有用的。如本领域公知的,多种天然蛋白质结合Fc和抗体,并且这些蛋白质可用于纯化本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体。例如,细菌蛋白A和G与Fc区结合。同样,细菌蛋白L与一些抗体的Fab区结合。纯化通常可由特定的融合伴侣实现。例如,如果使用GST融合,则可使用谷胱甘肽树脂纯化抗体,如果使用His标签,则可使用Ni+2亲和色谱,或者如果使用flag标签,则可使用固定化的抗flag抗体。有关合适纯化技术的一般指导,参见例如完全通过引用并入的Protein Purification:Principles and Practice,第3版,Scopes,Springer-Verlag,NY,1994,完全通过引用并入。必要的纯化程度将根据双特异性抗HER2抗原结合构建体的使用而变化。在一些情形下,不需要纯化。
在某些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体使用阴离子交换色谱法纯化,包括但不限于在Q-sepharose、DEAE sepharose、poros HQ、poros DEAF、Toyopearl Q、Toyopearl QAE、Toyopearl DEAE、Resource/Source Q和DEAE、Fractogel Q和DEAE柱上的色谱法。
在具体实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体使用阳离子交换色谱法纯化,包括但不限于SP-sepharose、CM sepharose、poros HS、poros CM、ToyopearlSP、Toyopearl CM、Resource/Source S和CM、Fractogel S和CM柱及其等效物和类似物。
此外,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体可使用本领域已知的技术化学合成(例如参见Creighton,1983,Proteins:Structures and Molecular Principles,W.H.Freeman&Co.,N.Y以及Hunkapiller等人,Nature,310:105-111(1984))。例如,可通过使用肽合成仪合成对应于多肽片段的多肽。此外,如果需要,可将非经典氨基酸或化学氨基酸类似物作为取代或添加引入多肽序列中。非经典氨基酸包括但不限于常见氨基酸的D-异构体、2,4-二氨基丁酸、α-氨基异丁酸、4氨基丁酸、Abu、2-氨基丁酸、γ-Abu、ε-Ahx、6氨基己酸、Aib、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、半胱氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、苯丙氨酸、苯己基丙氨酸、β-丙氨酸、氟-氨基酸、设计氨基酸如β-甲基氨基酸、Cα-甲基氨基酸、Nα-甲基氨基酸和一般的氨基酸类似物。此外,氨基酸可以是D(右旋)或L(左旋)。
翻译后修饰:
在某些实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体在翻译期间或之后被差异修饰。
如本文所用,术语“修饰的”是指对给定多肽进行的任何改变,例如对多肽长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(修饰的)”术语是指所讨论的多肽任选地被修饰,即双特异性抗HER2抗原结合构建体的多肽可被修饰或未被修饰。
术语“翻译后修饰的”是指天然或非天然氨基酸在被并入多肽链后发生在这种氨基酸上的任何修饰。仅举例来说,所述术语涵盖共翻译体内修饰、共翻译体外修饰(例如在无细胞翻译***中)、翻译后体内修饰和翻译后体外修饰。
在一些实施方案中,修饰是以下中的至少一种:糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/阻断基团的衍生化、蛋白水解切割和与抗体分子或双特异性抗HER2抗原结合构建体或其它细胞配体的连接。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体通过已知技术进行化学修饰,包括但不限于通过溴化氰、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶、V8蛋白酶、NaBH4的特异性化学切割;乙酰化、甲酰化、氧化、还原;和在衣霉素存在下的代谢合成。
双特异性抗HER2抗原结合构建体的其它翻译后修饰包括例如N连接或O连接的碳水化合物链、N末端或C末端的加工)、化学部分与氨基酸骨架的附接、N连接或O连接的碳水化合物链的化学修饰,以及作为原核宿主细胞表达的结果的N末端甲硫氨酸残基的添加或删除。本文描述的双特异性抗HER2抗原结合构建体用可检测标记如酶标记、荧光标记、同位素标记或亲和标记修饰,以允许检测和分离蛋白质。在某些实施方案中,合适的酶标记的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶;合适的辅基复合物的实例包括链霉亲和素生物素和亲和素/生物素;合适的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白;发光材料的实例包括鲁米诺;生物发光材料的实例包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白;并且合适的放射性材料的实例包括碘、碳、硫、氚、铟、锝、铊、镓、钯、钼、氙、氟。
在具体实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体附接至与放射性金属离子缔合的大环螯合剂。
在一些实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体通过天然过程如翻译后加工,或通过本领域众所周知的化学修饰技术进行修饰。在某些实施方案中,相同类型的修饰可以相同或不同程度存在于给定多肽的几个位点处。在某些实施方案中,来自本文描述的双特异性抗HER2抗原结合构建体的多肽是分支的,例如,作为泛素化的结果,并且在一些实施方案中是环状的,具有或不具有分支。环状、分支和分支环状多肽是翻译后自然过程的结果或通过合成方法制成。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价附接、血红素部分的共价附接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价附接、脂质或脂质衍生物的共价附接、磷脂酰肌醇的共价附接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒酰化、硫酸化、转移RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加如精氨酸化,和泛素化。(参见例如PROTEINS--STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES,第2版,T.E.Creighton,W.H.Freemanand Company,New York(1993);POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OFPROTEINS,B.C.Johnson编辑,Academic Press,New York,第1-12页(1983);Seifter等人,Meth.Enzymol.182:626-646(1990);Rattan等人,Ann.N.Y.Acad.Sci.663:48-62(1992))。
抗体药物缀合物(ADC)
某些实施方案涉及使用抗体-药物缀合物(ADC)治疗BTC的方法,所述抗体-药物缀合物包含以低平均药物/抗体比(DAR)缀合至澳瑞他汀类似物的双特异性抗HER2抗原结合构建体。如本文所用,“低平均DAR”是指<3.9的平均DAR。在所述方法中特别有用的是平均DAR为约2.5或更小、例如介于约1.8和2.5之间的包含缀合至澳瑞他汀类似物的双特异性抗HER2抗原结合构建体的ADC。在某些实施方案中,ADC中包含的双特异性抗HER2抗原结合构建体是v10000。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC所包含的澳瑞他汀类似物可以是如国际专利申请公开第WO 2016/041082号中所述的澳瑞他汀类似物。在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC所包含的澳瑞他汀类似物是通式(I)的化合物:
其中R1选自:
在某些实施方案中,在式(I)的化合物中,R1是:
在某些实施方案中,在式(I)的化合物中,R1是:
在某些实施方案中,在式(I)的化合物中,R1是:
在某些实施方案中,式(I)的化合物选自:
通式(I)的化合物可通过标准合成有机化学方案从市售原材料制备。示例性合成方法在国际专利申请公开第WO 2016/041082号中提供。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含经由接头(L)缀合至澳瑞他汀类似物(毒素)的双特异性抗HER2抗原结合构建体,其中接头-毒素具有通式(II):
其中:
R1选自:
L是可切割接头,并且
表示接头-毒素与双特异性抗HER2抗原结合构建体的附接点。
在一些实施方案中,在通式(II)的接头-毒素中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(II)的接头-毒素中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(II)的接头-毒素中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(II)的接头-毒素中,L是含肽的接头。
在一些实施方案中,在通式(II)的接头-毒素中,L是蛋白酶可切割的接头。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含经由接头(L)缀合至澳瑞他汀类似物(毒素)的双特异性抗HER2抗原结合构建体并具有通式(III):
其中:
R1和L如关于通式(II)所定义;
n是平均药物/抗体比(DAR)并且小于3.9,并且
Ab是双特异性抗HER2抗原结合构建体。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,R1是:
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,L是含肽的接头。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,L是蛋白酶可切割的接头。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,n介于0.5和3.8之间。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,n介于约1.0和3.8之间、介于约1.0和3.5之间、介于约1.0和3.0之间、或介于约1.0和2.5之间。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,n介于约1.5和3.8之间、介于约1.5和3.5之间、介于约1.5和3.0之间、或介于约1.5和2.5之间。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,n介于约1.8和2.8之间、或介于约1.8和2.5之间。
在一些实施方案中,在通式(III)的ADC中,Ab是v10000。
还考虑了用于通式(III)的ADC的任何前述实施方案的组合,并且为了本公开的目的,每个组合形成单独的实施方案。
在本文所述的ADC中,双特异性抗HER2抗原结合构建体通过接头连接至澳瑞他汀类似物(毒素)。接头是能够将一种或多种毒素分子与抗体连接的双官能或多官能部分。双官能(或单价)接头将单一药物连接到抗体上的单个位点,而多官能(或多价)接头将多于一种毒素分子连接到抗体上的单个位点。能够将一种毒素分子连接到抗体上的多于一个位点的接头也可以被认为是多官能的。
接头与抗体的附接可通过多种方式实现,例如通过抗体上的表面赖氨酸、与抗体上氧化的碳水化合物的还原偶联,或通过减少链间二硫键释放的抗体上的半胱氨酸残基。或者,可通过修饰抗体以包括额外的半胱氨酸残基(参见例如美国专利第7,521,541号;第8,455,622号和第9,000,130号)或提供反应性柄的非天然氨基酸如硒代甲硫氨酸、对乙酰苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮甲基-L-苯丙氨酸(参见例如Hofer等人,Biochemistry,48:12047-12057(2009);Axup等人,PNAS,109:16101-16106(2012);Wu等人,PNAS,106:3000-3005(2009);Zimmerman等人,Bioconj.Chem.,25:351-361(2014))来实现接头与抗体的附接,以允许位点特异性缀合。
接头包括能够与抗体上的一个或多个目标基团反应的官能团,以及一个或多个能够与毒素上的目标基团反应的官能团。合适的官能团是本领域已知的并且包括例如描述于Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press)中的那些。
用于与游离半胱氨酸或硫醇反应的官能团的非限制性实例包括马来酰亚胺、卤代乙酰胺、卤代乙酰基、活化酯如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在这方面也有用的是“自稳定”马来酰亚胺,如Lyon等人,Nat.Biotechnol.,32:1059-1062(2014)中所述。
用于与抗体上的表面赖氨酸或毒素上的游离胺反应的官能团的非限制性实例包括活化酯如N-羟基琥珀酰胺(NHS)酯、磺基-NHS酯、亚氨基酯如Traut试剂、异硫氰酸酯、醛和酸酐如二亚乙基三胺五乙酸酐(DTPA)。其它实例包括琥珀酰亚胺基-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTU)和苯并***-1-基-氧三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP)。
能够与抗体或毒素上的亲电子基团(例如醛或酮羰基)反应的官能团的非限制性实例包括酰肼、肟、氨基、肼、缩氨基硫脲、羧酸肼和芳基酰肼。
其它接头包括具有允许桥接抗体上的两个链间半胱氨酸的官能团的接头,例如ThioBridgeTM接头(Badescu等人,Bioconjug.Chem.,25:1124-1136(2014))、二硫代马来酰亚胺(DTM)接头(Behrens等人,Mol.Pharm.,12:3986-3998(2015))、基于二硫代芳基(TCEP)哒嗪二酮的接头(Lee等人,Chem.Sci.,7:799-802(2016))、基于二溴哒嗪二酮的接头(Maruani等人,Nat.Commun.,6:6645(2015))和本领域已知的其它接头。
接头可包括各种接头组分。通常,接头将包含两个或更多个接头组分。示例性接头组分包括用于与抗体反应的官能团、用于与毒素反应的官能团、延伸段、肽组分、自分解基团(self-immolative group)、自消除基团、亲水部分等。各种接头组分是本领域已知的,其中一些描述如下。
某些有用的接头组分可从各种商业来源例如Pierce Biotechnology,Inc.(现为Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA)和Molecular Biosciences Inc.(Boulder,Colo.)获得,或者可根据本领域中所述的程序合成(参见例如Toki等人,J.Org.Chem.,67:1866-1872(2002);Dubowchik等人,Tetrahedron Letters,38:5257-60(1997);Walker,M.A.,J.Org.Chem.,60:5352-5355(1995);Frisch等人,Bioconjugate Chem.,7:180-186(1996);美国专利第6,214,345号和第7,553,816号,以及国际专利申请公开第WO 02/088172号)。
本文所述的ADC中采用的接头是可切割接头。可切割接头在细胞内条件下通常易于切割,例如通过溶酶体过程。实例包括蛋白酶敏感、酸敏感、还原敏感或光不稳定的接头。
合适的可切割接头包括例如包含肽组分的接头,所述肽组分包括两个或更多个氨基酸并且可被细胞内蛋白酶如溶酶体蛋白酶或内体蛋白酶切割。肽组分可包含天然存在的氨基酸残基和/或次要氨基酸和/或非天然存在的氨基酸类似物,例如瓜氨酸。肽组分可被设计和优化用于通过特定酶例如肿瘤相关蛋白酶、组织蛋白酶B、C或D或纤溶酶蛋白酶进行的酶促切割。
在某些实施方案中,ADC中包括的接头可以是含有二肽的接头,例如含有缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)的接头。包含在接头中的合适二肽的其它实例包括Val-Lys、Ala-Lys、Me-Val-Cit、Phe-homoLys、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys和Met-(D)Lys。可切割接头还可包括更长的肽组分,例如三肽、四肽或五肽。实例包括但不限于三肽Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys和(D)Ala-Phe-Lys,以及四肽Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu。
可切割接头的其它实例包括含二硫化物的接头,例如N-琥珀酰基-4-(2-吡啶基二硫基)丁酸酯(SPBD)和N-琥珀酰基-4-(2-吡啶基二硫基)-2-磺基丁酸酯(磺基-SPBD)。含二硫化物的接头可任选地包括额外的基团以提供邻近二硫键的空间位阻,以改善接头的细胞外稳定性,例如,包含偕位二甲基。其它合适的接头包括可在特定pH或在pH范围内水解的接头,例如腙接头。包含这些官能团的组合的接头也可以是有用的,例如,包含腙和二硫化物两者的接头是本领域已知的。
可切割接头的另一个实例是包含β-葡萄糖醛酸苷的接头,其可被β-葡萄糖醛酸酶切割,β-葡萄糖醛酸酶是一种存在于溶酶体和肿瘤间质中的酶(参见例如De Graaf等人,Curr.Pharm.Des.,8:1391-1403(2002))。
可切割接头还可任选地包含一种或多种额外组分,例如自分解和自消除基团、延伸段或亲水部分。
可用于接头的自分解和自消除基团包括例如对氨基苄氧羰基(PABC)和对氨基苄基醚(PABE)基团,以及甲基化乙二胺(MED)。自分解基团的其它实例包括但不限于在电子上与PABC或PABE基团相似的芳族化合物,例如杂环衍生物,例如美国专利第7,375,078号中所述的2-氨基咪唑-5-甲醇衍生物。其它实例包括在酰胺键水解时发生环化的基团,例如被取代和未被取代的4-氨基丁酸酰胺(Rodrigues等人,Chemistry Biology,2:223-227(1995))和2-氨基苯基丙酸酰胺(Amsberry等人,J.Org.Chem.,55:5867-5877(1990))。
可用于ADC的接头的延伸段包括例如亚烷基和基于脂肪酸、二酸、胺或二胺的延伸段,例如二甘醇酸酯、丙二酸酯、己酸酯和己酰胺。其它延伸段包括例如基于甘氨酸的延伸段、聚乙二醇(PEG)延伸段和单甲氧基聚乙二醇(mPEG)延伸段。PEG和mPEG延伸段也起到亲水部分的作用。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含的接头是具有通式(IV)的基于肽的接头:
其中:
Z是能够与双特异性抗HER2抗原结合构建体上的目标基团反应的官能团;
Str是延伸段;
AA1和AA2各自独立地是氨基酸,其中AA1-[AA2]m形成蛋白酶切割位点;
X是自分解基团;
D是与澳瑞他汀类似物的附接点;
s是0或1;
m是介于1和4之间的整数,并且
o是0、1或2。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,Z是:
在一些实施方案中,在通式(IV)中,Str选自:
其中:
R是H或C1-C6烷基;
p是介于2和10之间的整数,并且
q是介于1和10之间的整数。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,Str是:
其中p和q如上文所定义。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,Str是:
其中p是介于2和6之间的整数,并且
q是介于2和8之间的整数。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,AA1-[AA2]m选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit、Trp-Cit、Phe-Arg、Ala-Phe、Val-Ala、Met-Lys、Asn-Lys、Ile-Pro、Ile-Val、Asp-Val、His-Val、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Val-(D)Asp、NorVal-(D)Asp、Ala-(D)Asp、Me3Lys-Pro、PhenylGly-(D)Lys、Met-(D)Lys、Asn-(D)Lys、Pro-(D)Lys、Met-(D)Lys、Met-Cit-Val、Gly-Cit-Val、(D)Phe-Phe-Lys、(D)Ala-Phe-Lys、Gly-Phe-Leu-Gly和Ala-Leu-Ala-Leu。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,m是1(即AA1-[AA2]m是二肽)。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,AA1-[AA2]m是选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit和Trp-Cit的二肽。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,m是1、2或3。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,s是1。
在一些实施方案中,在通式(IV)中,o是0。
在一些实施方案中,在通式(IV)中:
Str是
其中p是介于2和6之间的整数,并且q是介于2和8之间的整数;
m是1并且AA1-[AA2]m是选自Val-Lys、Ala-Lys、Phe-Lys、Val-Cit、Phe-Cit、Leu-Cit、Ile-Cit和Trp-Cit的二肽;
s是1,并且
o是0。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC中包含的接头具有通式(V):
其中:
A-S-是与双特异性抗HER2抗原结合构建体的附接点;
Y是一种或多种额外的接头组分,或者不存在,并且
D是与澳瑞他汀类似物的附接点。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC中包含的接头具有通式(VI):
其中:
A-S-是与双特异性抗HER2抗原结合构建体的附接点;
Y是一种或多种额外的接头组分,或者不存在,并且
D是与澳瑞他汀类似物的附接点。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含经由具有通式(IV)、(V)或(VI)的接头以低平均DAR与v10000缀合的通式(I)的澳瑞他汀类似物。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含以低平均DAR与通式(II)的接头-毒素缀合的v10000,其中接头(L)具有通式(IV)、(V)或(VI)。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含v10000并具有如上所示的通式(III),其中接头(L)具有通式(IV)、(V)或(VI)。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含经由具有通式(IV)、(V)或(VI)的接头以低平均DAR缀合至v10000的澳瑞他汀类似物,其中所述澳瑞他汀类似物是化合物16、化合物17或化合物18。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含具有以下结构的接头-毒素:
其中A-S-是与双特异性抗HER2抗原结合构建体的附接点。
抗体药物缀合物的制备
用于本文所述方法的ADC可通过本领域已知的几种途径之一,采用本领域技术人员已知的有机化学反应、条件和试剂来制备(参见例如Bioconjugate Techniques(G.T.Hermanson,2013,Academic Press,以及本文提供的实施例)。例如,缀合可通过以下实现:(1)抗体的亲核基团或亲电基团与双官能接头反应经由共价键形成抗体-接头中间体Ab-L,接着与活化的澳瑞他汀类似物(D)反应,或(2)澳瑞他汀类似物的亲核基团或亲电基团与接头反应经由共价键形成接头-毒素D-L,接着与抗体的亲核基团或亲电基团反应。
如上所述,澳瑞他汀类似物可经由适当的接头与抗体上的各种基团缀合以提供ADC。例如,缀合可通过表面赖氨酸、通过氧化的碳水化合物或通过还原一个或多个链间二硫键而释放的半胱氨酸残基。或者,可修饰抗体以包括额外的半胱氨酸残基或提供反应性柄的非天然氨基酸,例如硒代甲硫氨酸、对乙酰苯丙氨酸、甲酰甘氨酸或对叠氮甲基-L-苯丙氨酸。此类修饰是本领域众所周知的(参见例如美国专利第7,521,541号;第8,455,622号和第9,000,130号;Hofer等人,Biochemistry,48:12047-12057(2009);Axup等人,PNAS,109:16101-16106(2012);Wu等人,PNAS,106:3000-3005(2009);Zimmerman等人,Bioconj.Chem.,25:351-361(2014))。
在某些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包含经由适当的接头缀合至双特异性抗HER2抗原结合构建体上的半胱氨酸残基的澳瑞他汀类似物,所述半胱氨酸残基已通过还原一个或多个链间二硫键而释放。
在本文所述的ADC中,双特异性抗HER2抗原结合构建体经由接头以低平均药物/抗体比(DAR)、特别是小于3.9但大于0.5、例如在某些实施方案中介于约1.5和约2.5之间的平均DAR缀合至毒素。
本领域已知各种方法以低平均DAR来制备ADC(参见例如综述:McCombs和Owen,TheAAPS Journal,17(2):339-351(2015)和其中的参考文献;Boutureira和Bernardes,Chem.Rev.,115:2174-2195(2015))。
例如,为了与半胱氨酸残基缀合,可进行抗体链间二硫键的部分还原,接着与接头-毒素缀合。部分还原可通过限制还原反应中使用的还原剂的量来实现(参见例如Lyon等人,Methods in Enzymology,502:123-138(2012)和其中的实施例,以及本文提供的实施例)。合适的还原剂是本领域已知的并且包括例如二硫苏糖醇(DTT)、三(2-羧基乙基)膦(TCEP)、2-巯基乙醇、半胱胺和许多水溶性膦。或者或另外,可使用较少当量的接头-毒素以获得低平均DAR。
或者,可使用工程化抗体,其中构成链间二硫键的一个或多个半胱氨酸残基被丝氨酸残基代替,导致用于缀合的可用半胱氨酸残基更少(参见McDonagh等人,ProteinEng.Des.Sel.PEDS,19(7):299-307)。然后可用还原剂处理工程化抗体并与接头-毒素缀合。
另一种方法是使用双硫醇接头,该接头桥连通常构成链间二硫键的两个半胱氨酸。如果所有四个链间二硫键都被还原并用双硫醇接头代替,则使用仅携带一个毒素分子的双硫醇接头将产生具有最大DAR4的ADC,用于全尺寸抗体。链间二硫键的部分还原和/或更少当量的接头可与双硫醇接头结合使用以进一步降低DAR。各种双硫醇接头是本领域已知的(参见例如Badescu等人,Bioconjug.Chem.,25(6):1124-1136(2014);Behrens等人,Mol.Pharm.,12:3986-3998(2015);Lee等人,Chem.Sci.,7:799-802(2016);Maruani等人,Nat.Commun.,6:6645(2015))。
也可采用半胱氨酸工程方法来生成具有低平均DAR的ADC。此类方法涉及将溶剂可及的半胱氨酸工程化到抗体中,以便为缀合提供位点特异性柄。许多用于引入半胱氨酸残基的适当位点已被鉴定为具有IgG结构,并且包括在Junutula等人,J.Immunol Methods,332(1-2):41-52(2008);Junutula等人,Nat.Biotechnol.,26(8),925-932(2008);以及美国专利第9,315,581号;第9,000,130号;第8,455,622号;第8,507,654号和第7,521,541号中所述的那些。
低平均DAR ADC也可通过赖氨酸缀合使用有限量的活化接头-毒素来制备。也可使用抗体N末端氨基酸的选择性反应。例如,N末端丝氨酸可用高碘酸盐氧化成醛,然后与接头-毒素反应(参见例如Thompson等人,Bioconjug.Chem.,26(10):2085-2096(2015))。类似地,N末端半胱氨酸残基可以选择性地与醛反应以得到噻唑烷酮(参见例如Bernardes等人,Nature Protocols,8:2079-2089)。
其它方法包括将抗体工程化以包含一个或多个非天然氨基酸,例如对乙酰苯丙氨酸(pAcPhe)或硒代半胱氨酸(Sec)。pAcPhe中的酮基可与包含末端烷氧基胺或酰肼的接头-毒素反应以形成肟或腙键(参见例如Axup等人,PNAS USA,109:16101-16106(2012))。含有Sec的抗体可与含有马来酰亚胺或碘乙酰胺的接头-毒素反应以形成硒醚缀合物(参见例如Hofer等人,Biochemistry,48:12047-12057(2009))。
抗体也可被工程化以包括由某些酶识别的肽标签,以允许酶催化缀合。例如,分选酶-A(SortA)识别序列LPXTG。该五肽可被工程化到抗体的N末端或C末端以允许SortA介导的缀合(参见例如美国专利申请公开第2016/0136298号;Kornberger和Skerra,mAbs,6(2):354-366(2014))。转谷氨酰胺酶也被用于通过使用在位置N297去糖基化的抗体(暴露Q295进行酶缀合)或通过工程化抗体以包括“谷氨酰胺标签”(LLQG)(Jeger等人,Angew.Chem.,49:9995-9997(2010);Strop等人,Chem.Biol.,20(2):161-167(2013))而产生DAR2 ADC。在另一种方法中,可通过将适当的共有序列工程化到抗体中并将工程化的抗体与甲酰基甘氨酸生成酶(FGE)共表达,将甲酰基甘氨酸残基引入抗体中。然后可将引入的甲酰甘氨酸的醛官能团用作用于缀合毒素的柄(参见例如Drake等人,Bioconjug.Chem.,25(7):1331-1341(2014))。
用于生成DAR2 ADC的另一种方法是将接头-毒素与糖基化抗体上的天然糖缀合。可实现与糖基化抗体的缀合,例如,通过末端糖残基的高碘酸盐氧化产生醛,然后可将其缀合到适当的接头-毒素,或者通过糖工程方法,其中天然糖被末端唾液酸残基修饰,然后可以将其氧化得到醛以与接头-毒素缀合(Zhou等人,Bioconjug.Chem.,25(3):510-520(2014))。
还已报道了使用UV交联将活性部分与抗体缀合。该方法使用核苷酸结合位点(NBS)对具有反应性硫醇部分的抗体进行位点特异性共价功能化。吲哚-3-丁酸(IBA)缀合的半胱氨酸形式被用于在NBS处将反应性硫醇部分与抗体进行位点特异性光交联。然后可使用硫醇部分来缀合具有硫醇反应性基团的接头-毒素(Alves等人,Bioconjug.Chem.,25(7):1198-1202(2014))。
或者,具有低平均DAR的ADC可使用色谱分离技术如疏水相互作用色谱(参见例如Hamblett等人,Clin.Cancer Res.,10:7063-7070(2004);Sun等人,Bioconj Chem.,28:1371-81(2017);美国专利申请公开第2014/0286968号),从含有DAR种类的混合物的ADC制剂分离。
具有低平均DAR的ADC也可通过向平均DAR≥3.9的ADC制剂中添加未缀合(即DAR0)抗体来产生。如本领域中已知的,大多数缀合方法产生包括各种DAR种类的ADC制剂,其中报告的DAR是各个DAR种类的平均值。在某些实施方案中,包括一定比例的DAR0种类的ADC可能是有利的。在一些实施方案中,用于本文所述方法的具有小于3.9的平均DAR的ADC包括至少5%的DAR0种类。在一些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包括至少10%的DAR0种类,例如至少15%的DAR0种类或至少20%的DAR0种类。在一些实施方案中,用于本文所述方法的ADC包括介于约5%和约50%之间的DAR0种类,例如介于约10%和约50%之间的DAR0种类、介于约10%和约40%之间、或介于约10%和约30%之间的DAR0种类。
ADC的平均DAR可通过标准技术如UV/VIS光谱分析、基于ELISA的技术、色谱技术如疏水相互作用色谱(HIC)、UV-MALDI质谱(MS)和MALDI-TOF MS来确定。此外,药物连接形式的分布(例如,DAR0、DAR1、DAR2等种类的分数)也可通过本领域已知的各种技术进行分析,包括MS(有或没有伴随的色谱分离步骤)、疏水相互作用色谱法、反相HPLC或等电聚焦凝胶电泳(IEF)(参见例如Sun等人,Bioconj Chem.,28:1371-81(2017);Wakankar等人,mAbs,3:161-172(2011))。
在某些实施方案中,ADC的平均DAR通过疏水相互作用色谱(HIC)技术确定。
在缀合之后,可通过本领域已知的纯化方法纯化ADC并将其与未缀合的反应物和/或任何缀合聚集体分离。此类方法包括但不限于尺寸排阻色谱(SEC)、疏水相互作用色谱(HIC)、离子交换色谱、色谱聚焦、超滤、离心超滤及其组合。
药物组合物
本文还提供了包含本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体的药物组合物。药物组合物包含双特异性抗HER2抗原结合构建体和药学上可接受的载体。
术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准或在美国药典或其它普遍认可的药典中列出用于动物,更特别地用于人类。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体,例如水和油,包括石油、动物、植物或合成来源的那些,例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。在一些方面,载体是自然界中未发现的人造载体。当静脉内施用药物组合物时,水可用作载体。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可用作液体载体,特别是用于可注射溶液。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙烯、二醇、水、乙醇等。如果需要,所述组合物还可含有少量润湿剂或乳化剂,或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂等形式。所述组合物可用传统的粘合剂和载体如甘油三酯配制成栓剂。口服制剂可包括标准载体,例如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。合适的药物载体的实例描述于E.W.Martin的"Remington'sPharmaceuticalSciences"中。此类组合物将含有治疗有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体,优选呈纯化形式,连同适量的载体,以提供适于向患者施用的形式。制剂应适合施用模式。
在某些实施方案中,包含双特异性抗HER2抗原结合构建体的组合物根据常规程序配制成适于静脉内施用于人类的药物组合物。通常,用于静脉内施用的组合物是无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时,所述组合物还可包括增溶剂和局部麻醉剂如利多卡因以缓解注射部位的疼痛。通常,所述成分以单位剂型单独提供或混合在一起提供,例如,作为指示活性剂量的密封容器如安瓿或小袋中的干燥冻干粉末或无水浓缩物。当组合物通过输注施用时,它可用含有无菌药用级水或盐水的输液瓶分配。当组合物通过注射施用时,可提供无菌注射用水或盐水的安瓿,以便可在施用之前将成分混合。
在某些实施方案中,本文所述的组合物被配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括与阴离子形成的盐,例如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐,以及与阳离子形成的盐,例如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。
治疗胆道癌(BTC)的方法
本文描述了治疗胆道癌(BTC)的方法,包括以有效治疗、预防或改善这种疾病或病症的量向患有BTC的受试者施用如本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC。在本文所述方法的具体实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体是v10000。在本文所述方法的其它具体实施方案中,ADC是连接到澳瑞他汀类似物的v10000。
“病症”或“疾病”是指将受益于用本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或方法治疗的任何疾患。这包括慢性和急性病症或疾病,包括使哺乳动物易患所讨论病症的病理状况。在本文描述的实施方案中,病症或疾病是下面更详细地描述的胆道癌。
术语“受试者”或“患者”是指作为治疗、观察或实验的对象的动物,在一些实施方案中是哺乳动物。动物可以是人类、非人类灵长类动物、伴侣动物(例如狗、猫等)、农场动物(例如牛、羊、猪、马等)或实验室动物(例如,大鼠、小鼠、豚鼠等)。
如本文所用,术语“哺乳动物”包括但不限于人类、非人类灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠科动物、牛科动物、马科动物和猪科动物。
“治疗”是指试图改变被治疗个体或细胞的自然过程的临床干预,并且可以在临床病理过程中进行。治疗的理想效果包括但不限于预防疾病复发、减轻症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展速率、改善或减轻疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于延迟疾病的发展或减缓疾病的进展。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于延迟BTC的发展。在一个实施方案中,本文描述的双特异性抗HER2抗原结合构建体、ADC和方法可影响BTC肿瘤/癌症生长的抑制。在另一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于减缓BTC的进展。
如本文所用,术语“有效量”是指所施用的双特异性抗HER2抗原结合构建体的量,其将实现所述方法的目标,例如在一定程度上缓解正在治疗的疾病、疾患或病症的一种或多种症状。可通过标准临床技术确定在治疗或抑制疾病或病症中有效的双特异性抗HER2抗原结合构建体的量。此外,可任选地采用体外测定来帮助确定最佳剂量范围。制剂中使用的精确剂量还取决于施用途径和BTC的严重程度,并且应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。有效剂量可从体外或动物模型测试***的剂量反应曲线中推断出来。
术语“一线疗法”、“一线治疗”或“主要疗法”是考虑到癌症的类型和阶段而被普遍接受为患者的初始治疗的治疗方案。术语“二线疗法”或“二线治疗”是如果一线疗法不能提供所需功效则通常施用的治疗方案。
术语“新辅助疗法”是指在进行主要治疗(通常是手术)之前,作为缩小肿瘤的第一步骤而给予的治疗。新辅助疗法的实例包括但不限于化学疗法、放射疗法和激素疗法。新辅助疗法可被视为一线疗法。
术语“辅助疗法”是指在一线治疗后给予的额外癌症治疗,以降低癌症复发的风险。辅助疗法可包括但不限于化学疗法、放射疗法、激素疗法、靶向疗法(通常靶向特定类型的癌细胞而非正常细胞的小分子药物或抗体)或生物疗法(例如疫苗、细胞因子、抗体或基因疗法)。
“晚期癌症”是已经发展到无法安全切除的程度或极不可能治愈或长期缓解的癌症。癌症通过在阻止其移除的结构附近生长或通过从它们开始的地方扩散、穿过组织线或身体的其它部位(如***或其它器官)而进展为晚期。晚期癌症可能是局部晚期,这意味着它们已经扩散到原发部位的器官之外,但尚未扩散到远处部位。晚期癌症也可能是转移性的,这意味着癌细胞已经从癌症开始的部位(原发部位)扩散到身体其它更远的部位(继发部位)。
“可切除”癌症是可通过手术治疗的癌症。“不可切除”的癌症是无法通过手术治疗的癌症,通常是因为癌症已经扩散到主要肿瘤周围的组织。根据扩散到周围组织的程度,某些癌症可能会被医生评估为“部分可切除”。
双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可根据已知方法施用于受试者。多种递送***是已知的并且可用于施用本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体制剂,例如封装在脂质体、微粒、微胶囊,能够表达化合物的重组细胞,受体介导的内吞作用(参见例如Wu和Wu,J.Biol.Chem.262:4429-4432(1987)),构建核酸作为逆转录病毒或其它载体的一部分等。引入方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外和口服途径。双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可通过任何适宜的途径施用,例如通过输注或推注,通过上皮或粘膜皮肤内层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收,并且可与其它生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。此外,在某些实施方案中,可能需要通过任何合适的途径,包括脑室内和鞘内注射,将本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体引入中枢神经***;脑室内注射可通过脑室内导管来促进,例如,附接到储液器,例如Ommaya储液器。也可采用肺部施用,例如通过使用吸入器或雾化器,以及含雾化剂的制剂。在具体实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可以静脉内(IV)施用。
在一个具体实施方案中,可能需要将本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC局部施用于需要治疗的区域;这可通过例如但不限于手术期间局部输注、局部应用例如手术后与伤口敷料联合、通过注射、借助于导管、借助于栓剂或借助于植入物来实现,所述植入物是多孔、无孔或凝胶状材料,包括膜如唾液酸膜或纤维。优选地,当施用蛋白质如双特异性抗HER2抗原结合构建体时,必须小心使用蛋白质不吸收的材料。
在另一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可在囊泡、特别是脂质体中递送(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990);Treat等人,Liposomes in theTherapy of Infectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编辑),Liss,New York,第353-365页(1989);Lopez-Berestein,同上,第317-327页;一般见同上)。
在又一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可在控释***中递送。在一个实施方案中,可使用泵(参见Langer,同上;Sefton,CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987);Buchwald等人,Surgery 88:507(1980);Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574(1989))。在另一个实施方案中,可使用聚合物材料(参见Medical Applications of Controlled Release,Langer和Wise(编辑),CRC Pres.,BocaRaton,Fla.(1974);Controlled Drug Bioavailability,Drug Product Design andPerformance,Smolen和Ball(编辑),Wiley,New York(1984);Ranger和Peppas,J.,Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23:61(1983);也参见Levy等人,Science 228:190(1985);During等人,Ann.Neurol.25:351(1989);Howard等人,J.Neurosurg.71:105(1989))。在又一个实施方案中,控释***可放置在治疗靶标附近,因此仅需要全身剂量的一部分(参见例如Goodson,in Medical Applications of Controlled Release,第2卷,第115-138页(1984))。
双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可单独施用或与其它类型的治疗(例如,放射疗法、化学疗法、激素疗法、免疫疗法和抗肿瘤剂)联合施用。通常,优选施用与患者的物种相同的物种来源或物种反应性(在抗体的情况下)的产品。因此,在一个实施方案中,将人类或人源化双特异性抗HER2抗原结合构建体、片段衍生物、类似物或核酸施用于人类患者以进行治疗或预防。
胆道癌(BTC,也称为“胆癌”)包括胆囊癌、壶腹癌、胆管癌和胆囊管腺癌。胆管癌(CCA)也可分为肝内CCA或肝外CCA。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗BTC的方法中。在一个实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗晚期不可切除BTC的方法中。在其它实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗胆囊癌、壶腹癌、胆管癌或胆囊管腺癌的方法中。在其它实施方案中,本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗肝内CCA或肝外CCA的方法中。
在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗具有显示HER2表达、扩增或活化的BTC的受试者。“显示HER2表达、扩增或活化”的BTC是在诊断测试中表达(包括过表达)HER2受体、具有扩增的HER2基因和/或以其它方式展现HER2受体活化或磷酸化的BTC。
“显示HER2活化”的BTC是在诊断测试中展现HER2受体活化或磷酸化的BTC。这种活化可直接地(例如通过ELISA测量HER2磷酸化)或间接地(例如通过基因表达谱分析)确定。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗具有显示HER2表达的BTC的受试者。
具有“HER2受体过表达或扩增”的BTC是与相同组织类型的非癌细胞相比具有显著更高水平的HER2受体蛋白或基因的BTC。这种过表达可能是由基因扩增或通过转录或翻译增加引起的。HER2受体过表达或扩增可在诊断或预后测定中通过评价细胞表面上存在的HER2蛋白水平升高(例如,经由免疫组织化学测定;IHC)来确定。在一个实施方案中,HER2过表达可通过IHC,例如使用
(Dako)分析。来自肿瘤活检的石蜡包埋的组织切片可进行IHC测定,并符合以下HER2蛋白染色强度标准:
评分0:未观察到染色或在小于10%的肿瘤细胞中观察到膜染色。
评分1+:在超过10%的肿瘤细胞中检测到微弱/几乎察觉不到的膜染色。细胞仅部分膜被染色。
评分2+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到弱至中等的完全膜染色。
评分3+:在超过10%的肿瘤细胞中观察到中等至强烈的完全膜染色。
HER2过表达评估的那些评分为0或1+的肿瘤可表征为未过表达HER2,而那些评分为2+或3+的肿瘤可表征为过表达HER2。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗具有显示出HER2过表达和/或扩增的BTC的受试者。
或者或另外,可测量细胞中HER2编码核酸的水平,例如经由原位杂交(ISH),包括荧光原位杂交(FISH;参见1998年10月公开的WO98/45479)和显色原位杂交(CISH;参见例如Tanner等人,Am.J.Pathol.157(5):1467-1472(2000);Bella等人,J.Clin.Oncol.26:(5月20日增刊;摘要22147)(2008)),southern印迹,聚合酶链反应(PCR)技术如定量实时PCR(qRT-PCR)或新一代测序(NGS)。使用这些方法评估HER2基因扩增通常报告为阳性(+)或阴性(-),例如对于HER2基因扩增型癌症为FISH+或对于HER2基因未扩增的癌症为FISH-。通过NGS对HER2基因扩增的评估也可关于HER2基因拷贝的数量进行报告。在正常细胞中,有两个HER2基因拷贝。因此,如果癌症具有两个以上的HER2基因拷贝,则可认为所述癌症是HER2基因扩增型癌症。
本文描述了治疗具有显示出HER2表达、扩增或活化的BTC的受试者的方法,包括向所述受试者提供有效量的本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗具有HER2 3+、基因扩增型BTC的受试者。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗HER2 2+、基因扩增型BTC。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗HER21+、基因扩增型BTC。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗评估为HER2 3+而无HER2基因扩增的BTC。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗评估为HER2 2+而无HER2基因扩增的BTC。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用于治疗评估为HER2 1+而无HER2基因扩增的BTC。
在一些实施方案中,接受治疗的受试者可能没有既往BTC治疗,并且双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC作为一线治疗施用。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可用作辅助或新辅助疗法以治疗患有可切除或部分可切除的癌症的受试者。在其它实施方案中,接受治疗的受试者可能已经接受过一种或多种既往BTC治疗,并且双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC作为二线治疗施用。一种或多种既往BTC治疗可包括选自以下的治疗:全身化疗,例如单独使用吉西他滨或联用基于铂的化疗剂、基于氟嘧啶的放化疗、无额外化疗的放疗、抗体(包括但不限于抗HER2靶向抗体)和研究性药剂(即目前正在进行临床试验但尚未获得FDA批准的药剂)。基于铂的化疗剂可包括顺铂或奥沙利铂。在一个实施方案中,全身化疗包括吉西他滨与顺铂,或吉西他滨与奥沙利铂。
可向患有BTC的受试者施用的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的示例性有效量可介于0.1mg/kg和100mg/kg受试者体重之间。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg体重施用。
在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体每周、每两周(Q2W)、每三周(Q3W)或每4周(Q4W)施用。双特异性抗HER2抗原结合构建体的每周给药的示例性有效量介于约1mg/kg至约30mg/kg之间的范围内。双特异性抗HER2抗原结合构建体每两周给药的示例性有效量介于约10mg/kg至约50mg/kg之间的范围内。双特异性抗HER2抗原结合构建体的每三周给药的示例性有效量介于约15mg/kg至约50mg/kg之间的范围内。双特异性抗HER2抗原结合构建体的每四周给药的示例性有效量介于约40mg/kg至约70mg/kg之间的范围内。
在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每周5、10或15mg/kg。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每周10mg/kg。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每两周20、25或30mg/kg。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每两周20mg/kg。在替代实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每三周20mg/kg。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每三周30mg/kg。在进一步的实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为每四周40mg/kg。在一些实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体的有效量为20、25或30mg/kg的初始剂量,接着是较低剂量的双特异性抗HER2抗原结合构建体。
如本领域已知的,ADC可以低于双特异性抗HER2抗原结合构建体所用剂量的剂量施用于受试者。在一些实施方案中,每周、每两周(Q2W)、每三周(Q3W)或每4周(Q4W)施用本文所述的ADC(即与澳瑞他汀类似物连接的双特异性抗HER2抗原结合构建体)。在一些实施方案中,可向患有BTC的受试者施用的ADC的有效量介于每周、每两周或每三周约1至约15mg/kg之间。
如上所述,在具体实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可以静脉内施用。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体可通过经120至150分钟于0.9%盐水中IV输注来施用。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体可通过经90分钟于0.9%盐水中IV输注来施用。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体可通过经60分钟于0.9%盐水中IV输注来施用。在相关实施方案中,输注速率不可超过每小时250mL生理盐水。
本文还提供了治疗患有BTC的受试者的方法,包括联合施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC与额外的抗肿瘤治疗。额外的抗肿瘤治疗可选自一种或多种BTC治疗,包括全身化疗,例如单独使用吉西他滨或联用基于铂的化疗剂、基于氟嘧啶的放化疗、无额外化疗的放疗和研究性药剂(即目前正在进行临床试验但尚未获得FDA批准的药剂)。在一个实施方案中,治疗患有BTC的受试者的方法包括与吉西他滨和顺铂联合或与吉西他滨和奥沙利铂联合施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC。在一个实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可与氟嘧啶药物和基于铂的药物联合施用。氟嘧啶药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶(5-FU)、卡培他滨或吉西他滨。基于铂的药物的实例包括但不限于顺铂或奥沙利铂。在其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可与5-FU、奥沙利铂和亚叶酸联合施用。在受试者具有为MSI-H/dMMR(高水平微卫星不稳定性/缺陷错配修复)的BTC的其它实施方案中,双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC可与免疫检查点抑制剂如抗PD1抗体派姆单抗(Keytruda
TM)或抗PD-L1抗体阿特珠单抗
联合施用。
如Simile等人,(2019)Medicina 55:42的表2中所述,BTC的额外抗肿瘤治疗是本领域已知的。本领域技术人员将能够鉴定这些治疗中的哪些可与本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC联合施用。
前述段落中描述的额外抗肿瘤治疗可与双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC同时施用,或者可顺序施用。
在一些实施方案中,向患有BTC的受试者提供有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体的结果是缩小病灶、抑制病灶的生长、增加病灶进展的时间、延长受试者的无病生存期、减少转移、增加受试者的无进展生存期、或增加受试者的总生存期或增加接受治疗的一组受试者的总生存期。在相关实施方案中,向受试者提供有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体的结果是受试者中的部分应答(PR)或稳定疾病(SD),如通过修订的实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)指南(1.1版)[Eur JCa 45:228-247,2009]所测量。在患有转移性疾病和CR或PR的受试者中,还可以测量应答持续时间。
如本文所用,术语“进行性疾病”(PD)是指一个或多个新病灶的出现和/或现有非目标病灶的明确进展。在总体肿瘤负荷显著增加到足以需要改变疗法的情况下,可根据“明确进展”宣称PD;在大多数情况下,一个或多个非目标病灶大小的适度增加不足以符合资格(尤其是在目标疾病中存在SD或PR的情况下)。
如本文所用,术语“部分应答”(PR)是指以基线总和直径为参考,目标病灶(包括任何目标***的短轴)的直径总和减少至少30%。
如本文所用,术语“完全应答”(CR)是指所有非目标病灶的消失、肿瘤标志物水平的正常化(如果肿瘤标志物经测量并且最初高于正常值上限,则对于患者必须正常化的那些被视为完全临床应答)。所有***必须<10mm(短轴)。
如本文所用,术语“稳定疾病”(SD)是指既未充分收缩以符合PR也未充分增加以符合PD,以自治疗开始以来的最小总和直径作为参考。
如本文所用,术语“客观应答率”(ORR)是根据RECIST v 1.1从治疗开始直至疾病进展/复发的接受任意量研究药物治疗并具有PR或CR的所有随机化患者的比例(取PD作为参考,自治疗开始以来记录的最小测量值)。
如本文所用,术语“总生存期”(OS)是指从随机化日期到因任何原因而死亡的日期的时间。
如本文所用,术语“无进展生存期”(PFS)是指患者在癌症没有进展或恶化的情况下保持存活。在一个实施方案中,PFS被定义为从研究中的随机化直到根据RECIST(1.1版)定义的客观进展的第一次射线照相记录或因任何原因而死亡的时间。在没有报告先前进展的情况下死亡的患者将被认为在其死亡当天已经进展。没有进展或失访的患者将在他们最后一次射线照相肿瘤评估的当天被审查。
如本文所用,术语“无病生存期”(DFS)是指癌症的初步治疗结束后患者存活而没有该癌症的任何体征或症状的时间长度。DFS也可称为“无复发生存期”(RFS)。
如本文所用,术语“进展时间”(TTP)是指从癌症的诊断或治疗开始直到癌症开始恶化或扩散到身体其它部位的时间长度。
如本文所用,术语“疾病控制率”(DCR)是指没有疾病进展及其速率。它是指分类为CR、PR或SD的具有最佳总体应答的患者组(明确排除PD患者),其中最佳总体应答是从治疗开始到PD为止记录的最佳应答。
如本文所用,术语“总体应答持续时间”(DOR)是指从满足完全或部分应答的测量标准的时间(以先记录的状态为准)直到客观记录到复发性或进行性疾病的第一个日期所测量的时段,以自治疗开始以来记录的最小测量结果作为参考。
在一些实施方案中,向患有BTC的受试者提供有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的结果是提高了一组受试者的疾病控制率(DCR)。DCR可用于测量具有抑瘤作用而非杀瘤作用的疗法的功效。DCR计算为在用双特异性抗HER2或ADC治疗后表现出CR、PR或SD的BTC患者的百分比。在一个实施方案中,向受试者施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC导致DCR大于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在其它实施方案中,向受试者施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC导致DCR大于20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
PFS(无进展生存期)和ORR(总应答率)也可用于确定双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的功效,并根据上述修订的RECIST 1.1指南进行测量。PFS定义为从随机化直到客观肿瘤进展或死亡的时间。ORR定义为对利用双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的疗法有部分或完全应答的BTC受试者的比例。ORR可用作药物杀肿瘤活性的量度。在一些实施方案中,向患有BTC的受试者提供有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的结果是增加了一组受试者的无进展生存期(PFS)。在一些实施方案中,向患有BTC的受试者提供有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的结果是提高了总应答率(ORR)。在一个实施方案中,向受试者施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC导致ORR大于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。在又一个实施方案中,向受试者施用有效量的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC导致ORR大于20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%。
总生存期、进展时间、应答持续时间(DOR)(也可用于确定双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的功效。
当双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC作为辅助或新辅助疗法施用时,还可测量无病生存期以确定疗法的功效。
药盒和制品
本文还描述了包含一种或多种双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的药盒。药盒的各个组分将包装在单独的容器中,并且与此类容器相关联的可以是管理药品或生物产品制造、使用或销售的政府机构规定形式的通知,该通知反映了获得该机构批准制造、使用或销售。药盒可任选地包含概述双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC的使用方法或施用方案的说明或说明书。
当药盒的一种或多种组分以溶液例如水溶液或无菌水溶液形式提供时,容器装置本身可以是吸入器、注射器、移液管、滴眼器或其它类似装置,溶液可从中施用于受试者或应用于药盒的其它组分并与药盒的其它组分混合。
药盒的组分也可以干燥或冻干的形式提供并且药盒可另外包含适于重构冻干组分的溶剂。不考虑容器的数量或类型,本文所述的药盒还可包含用于辅助将组合物施用于患者的仪器。这种仪器可以是吸入器、鼻喷雾装置、注射器、移液管、镊子、量匙、滴眼器或类似的医学认可的递送媒介物。
在本文所述的另一方面,提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断BTC的材料的制品。所述制品包括容器和在容器上或与容器相关联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多种材料如玻璃或塑料形成。容器装有组合物,该组合物本身或与另一种有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物组合并且可具有无菌进入口(例如,容器可为静脉内溶液袋或具有可被皮下注射针刺破的塞子的小瓶)。标签或包装插页表明所述组合物用于治疗所选疾患。此外,制品可包含(a)其中含有组合物的第一容器,其中所述组合物包含本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体或ADC;和(b)其中含有组合物的第二容器,其中所述组合物包含另外的细胞毒性剂或其它治疗剂。本文描述的该实施方案中的制品还可包括包装插页,表明所述组合物可用于治疗BTC。或者或另外,制品可进一步包括第二(或第三)容器,其包含药学上可接受的缓冲剂,例如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。从商业和用户的角度来看,它还可包括其它所需的材料,包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头和注射器。
多肽和多核苷酸
本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体包含至少一种多肽。还描述了编码本文所述多肽的多核苷酸。双特异性抗HER2抗原结合构建体通常是分离的。
如本文所用,“分离的”是指已从其天然细胞培养环境的组分中鉴定和分离和/或回收的试剂(例如,多肽或多核苷酸)。其自然环境的污染物组分是会干扰双特异性抗HER2抗原结合构建体的诊断或治疗用途的材料,并且可包括酶、激素和其它蛋白质或非蛋白质溶质。分离的也指已经合成产生的试剂,例如,经由人为干预。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指氨基酸残基的聚合物。即,针对多肽的描述同样适用于肽的描述和蛋白质的描述,反之亦然。所述术语适用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基是非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用,所述术语涵盖任何长度的氨基酸链,包括全长蛋白质,其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸,以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同的基本化学结构(即与氢、羧基、氨基和R基团结合的a碳)的化合物,例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架,但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。对氨基酸的提及包括例如天然存在的成蛋白质性的L-氨基酸;D-氨基酸,化学修饰的氨基酸如氨基酸变体和衍生物;天然存在的非成蛋白质性的氨基酸,如β-丙氨酸、鸟氨酸等;以及化学合成的化合物,其具有本领域已知的作为氨基酸特征的特性。非天然存在的氨基酸的实例包括但不限于α-甲基氨基酸(例如α-甲基丙氨酸)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(例如,2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸)、在侧链中具有额外亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸),以及侧链中的羧酸官能团被磺酸基团代替的氨基酸(例如半胱氨酸)。以多种不同的方式将非天然氨基酸(包括合成的非天然氨基酸、取代的氨基酸或一种或多种D-氨基酸)并入本文所述的蛋白质中可能是有利的。与含L-氨基酸的对应物相比,含D-氨基酸的肽等在体外或体内表现出增加的稳定性。因此,当希望或需要更大的细胞内稳定性时,并入D-氨基酸的肽等的构建可能特别有用。更具体地,D-肽等对内源性肽酶和蛋白酶具有抗性,从而提供改进的分子生物利用度,并在需要此类特性时延长体内寿命。此外,D-肽等不能有效地处理以将主要组织相容性复合体II类限制性呈递给T辅助细胞,因此不太可能在整个生物体中诱导体液免疫反应。
氨基酸在本文中可通过它们通常已知的三字母符号或通过IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样,核苷酸可用它们普遍接受的单字母代码来指代。
本文还描述了编码双特异性抗HER2抗原结合构建体的多肽的多核苷酸。术语“多核苷酸”或“核苷酸序列”旨在表示两个或更多个核苷酸分子的连续段。核苷酸序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成或合成来源,或其任何组合。
术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特别限制,否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸,其具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另有特别限制,否则所述术语还指寡核苷酸类似物,包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另有说明,否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体来说,简并密码子取代可通过生成其中一个或多个所选(或所有)密码子的第三个位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人,Nucleic AcidRes.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);Rossolini等人,Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
“保守修饰的变体”适用于氨基酸和核酸序列。关于特定的核酸序列,“保守修饰的变体”是指编码相同或基本相同的氨基酸序列的那些核酸,或者在核酸不编码氨基酸序列时是指基本相同的序列。由于遗传密码的简并性,大量功能相同的核酸编码任何给定的蛋白质。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在丙氨酸由密码子指定的每个位置处,密码子可改变为所描述的任何相应密码子而不改变所编码的多肽。此类核酸变异是“沉默变异”,它们是一种保守修饰的变异。本文编码多肽的每个核酸序列还描述了所述核酸的每个可能的沉默变异。本领域普通技术人员将认识到,核酸中的每个密码子(AUG和TGG除外,AUG通常是甲硫氨酸的唯一密码子,而TGG通常是色氨酸的唯一密码子)可被修饰以产生功能相同的分子。因此,编码多肽的核酸的每个沉默变异都隐含在每个描述的序列中。
对于氨基酸序列,本领域普通技术人员将认识到,对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加(其改变、添加或删除编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸)是“保守修饰的变体”,其中变异导致氨基酸的缺失、氨基酸的添加或氨基酸被化学上相似的氨基酸取代。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。此类保守修饰的变体是本文所述的多态性变体、种间同源物和等位基因的补充并且不排除这些。
提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域普通技术人员已知的。以下八组各自含有彼此保守取代的氨基酸:1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G);2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q);4)精氨酸(R)、赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V);6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T);以及[0139]8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton,Proteins:Structures andMolecular Properties(W H Freeman&Co.;第2版(1993年12月)。
在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中,术语“同一”或“同一性”百分比是指两个或更多个相同的序列或子序列。如果当在如使用以下序列比较算法(或本领域普通技术人员可用的其它算法)之一或通过手动比对和目视检查测量的比较窗口或指定区域上比较和比对最大对应性时,序列具有相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(即在指定区域上约60%同一性、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%或约95%同一性),则序列为“基本上同一”。该定义还涉及测试序列的互补序列。同一性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上,或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上,或者,如果未指定,则跨越多核苷酸或多肽的整个序列。编码本文所述多肽的多核苷酸,包括来自除人类以外物种的同源物,可通过包括以下步骤的方法获得:在严格杂交条件下用具有本文所述多核苷酸序列或其片段的标记探针筛选文库,以及分离包含所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组克隆。此类杂交技术是技术人员众所周知的。
对于序列比较,通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时,将测试和参考序列输入计算机,必要时指定子序列坐标,并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数,或者可指定替代参数。然后,序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用,“比较窗口”包括提及选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组中的多个连续位置中的任一个的区段,其中在两个序列最佳比对后,可将序列与具有相同数量连续位置的参考序列进行比较。用于比较的序列比对方法是本领域普通技术人员已知的。可进行用于比较的序列的最佳比对,包括但不限于通过Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2:482c的局部同源性算法,通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443的同源性比对算法,通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444的相似性方法搜索,通过这些算法的计算机化实现(威斯康星遗传学软件包(Wisconsin Genetics Software Package),Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA),或通过手动比对和目视检查(参见例如Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊))。
适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是BLAST和BLAST2.0算法,其分别描述于Altschul等人,(1997)Nuc.Acids Res.25:3389-3402,和Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410中。用于执行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心在万维网ncbi.nlm.nih.gov上公开获得。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)11、期望值(E)或10、M=5、N=-4以及两条链的比较。对于氨基酸序列,BLASTP程序默认使用字长3、和期望值(E)10以及BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915),比对(B)为50,期望值(E)为10,M=5,N=-4,以及两条链的比较。BLAST算法通常在关闭“低复杂度”过滤器的情况下执行。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性进行统计分析(参见例如Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5787)。BLAST算法提供的一种相似性度量是最小总和概率(P(N)),它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如,如果测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和概率小于约0.2,或小于约0.01,或小于约0.001,则认为所述核酸与参考序列相似。
短语“选择性(或特异性)杂交至”是指当序列存在于复杂混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中时,在严格杂交条件下,仅将分子与特定核苷酸序列结合、双链化或杂交。
短语“严格杂交条件”是指在本领域已知的低离子强度和高温条件下DNA、RNA或其它核酸或其组合的序列的杂交。通常,在严格条件下,探针将与复杂核酸混合物(包括但不限于总细胞或文库DNA或RNA)中的其靶序列杂交,但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件取决于序列,并且在不同情况下会有所不同。较长的序列在较高的温度下特异性杂交。有关核酸杂交的广泛指南见于Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Probes,“Overview ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid assays”(1993)。
如本文所用,术语“工程化(engineer/engineered/engineering)”被认为包括对肽骨架的任何操作或天然存在或重组多肽或其片段的翻译后修饰。工程化包括对氨基酸序列、糖基化模式或单个氨基酸的侧链基团的修饰,以及这些方法的组合。工程化蛋白通过标准分子生物学技术表达和生产。
“分离的核酸分子或多核苷酸”是指已从其天然环境中去除的核酸分子、DNA或RNA。例如,编码包含在载体中的多肽的重组多核苷酸被认为是分离的。分离的多核苷酸的其它实例包括保持在异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中纯化的(部分或基本上)多核苷酸。分离的多核苷酸包括包含在通常含有多核苷酸分子的细胞中的多核苷酸分子,但多核苷酸分子存在于染色体外或不同于其天然染色***置的染色***置处。分离的RNA分子包括体内或体外RNA转录物,以及正链和负链形式,以及双链形式。本文所述的分离的多核苷酸或核酸还包括合成产生的此类分子,例如,经由PCR或化学合成。此外,在某些实施方案中,多核苷酸或核酸包括调控元件如启动子、核糖体结合位点或转录终止子。
术语“聚合酶链反应”或“PCR”通常是指体外扩增所需核苷酸序列的方法,如例如在美国专利第4,683,195号中所描述的。一般而言,PCR方法涉及引物延伸合成的重复循环,其使用能够优先与模板核酸杂交的寡核苷酸引物。
对于具有与本发明的参考核苷酸序列至少例如95%“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸,意指多核苷酸的核苷酸序列与参考序列相同,不同之处在于参考核苷酸序列的每100个核苷酸,多核苷酸序列可包含多达五个点突变。换句话说,为了获得与参考核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的多核苷酸,参考序列中至多5%的核苷酸可被删除或被另一个核苷酸取代,或者参考序列中总核苷酸的至多5%的核苷酸数目可***参考序列中。参考序列的这些改变可能发生在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或这些末端位置之间的任何位置,单独散布在参考序列中的残基之间或散布在参考序列内的一个或多个连续组中。实际上,任何特定的多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同一性,可常规地使用已知的计算机程序,例如上文针对多肽(例如ALIGN-2)讨论的那些来确定。
如果多肽的衍生物或变体的氨基酸序列与来自原始肽的100个氨基酸序列具有至少50%同一性,则所述多肽的衍生物或变体被称为与所述肽具有“同源性”或“同源”。在某些实施方案中,衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的衍生物或变体至少75%相同。在某些实施方案中,衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的衍生物或变体至少85%相同。在某些实施方案中,衍生物的氨基酸序列与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少90%相同。在一些实施方案中,衍生物的氨基酸序列与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段至少95%相同。在某些实施方案中,衍生物或变体与具有与衍生物相同数目的氨基酸残基的肽或肽片段的衍生物或变体至少99%相同。
如本文所用,术语“修饰”是指对给定多肽做出的任何改变,例如对多肽长度、多肽的氨基酸序列、化学结构、共翻译修饰或翻译后修饰的改变。形式“(修饰的)”术语是指所讨论的多肽任选地被修饰,即所讨论的多肽可被修饰或未被修饰。
在一些方面,双特异性抗HER2抗原结合构建体包含与本文公开的表格或登录号中所示的相关氨基酸序列或其片段具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列。在一些方面,分离的双特异性抗HER2抗原结合构建体包含由与本文公开的表格或登录号中所示的相关氨基酸序列或其片段具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的多核苷酸编码的氨基酸序列。
应当理解,本公开不限于特定方案;本文描述的细胞系、构建体和试剂等可以变化。还应理解,本文所使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,而不旨在限制本公开的范围。
为了描述和公开例如出版物中描述的构建体和方法,本文提及的所有出版物和专利均通过引用并入本文,其可与本文描述的构建体结合使用。本文讨论的出版物仅关于其在本申请的申请日之前的公开内容而提供。本文中的任何内容均不应被解释为承认发明人无权因在先发明或任何其它原因而提前进行此类公开。
序列表
序列表
表6:变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6903、v6902和v6717的克隆编号
变体 |
H1克隆# |
H2克隆# |
L1克隆# |
L2克隆# |
5019 |
3057 |
720 |
1811 |
-- |
5020 |
719 |
3041 |
-- |
1811 |
7091 |
3057 |
5244 |
1811 |
-- |
10000 |
6586 |
5244 |
3382 |
-- |
6903 |
5065 |
3468 |
5037 |
3904 |
6902 |
5065 |
3468 |
5034 |
3904 |
6717 |
3317 |
720 |
-- |
-- |
表7:按克隆编号列出的变体v5019、v5020、v7091、v10000、v6903、v6902和v6717的序列
实施例
以下是用于制造和使用本文所述的双特异性抗HER2抗原结合构建体和ADC的具体实施方案的实施例。提供这些实施例仅用于说明目的,并不旨在以任何方式限制本公开的范围。已努力确保所用数字(例如,量、温度等)的准确性,但当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另外指明,否则可使用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法来制备和实施本文所述的构建体和方法。这些技术在文献中有充分的解释。参见例如T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman and Company,1993);A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.,目前新增);Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989);Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑,Academic Press,Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton,Pennsylvania:MackPublishing Company,1990);Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。
实施例1:变体10000(v10000)的描述和制备
v10000是一种人源化双特异性抗体,其识别人类HER2抗原的ECD的2个非重叠表位。v10000的IgG1样Fc区在每个CH3结构域中包含互补突变,这些突变赋予优先配对以生成异源二聚体分子并相应地不利于同源二聚体的形成。图1描绘了v10000形式的图示,其中重链A和轻链A'形成抗体的ECD2结合部分,并且重链B包含形成抗体的ECD4结合部分的scFv。变体10000包括包含以SEQ ID NO:36所示的序列的重链H1(对应于图1中的重链A)、包含以SEQ ID NO:63所示的序列的重链H2(对应于图1中的重链B),和包含以SEQ ID NO:24所示的序列的轻链L1(对应于轻链A')。v10000的制备方法在国际专利公开第WO 2015/077891号中进行了详细描述。
v10000是根据人体试验的相关法规要求制造的,并在生物相容性水性缓冲液中配制为15mg/mL,用于在环境温度下进行IV输注。v10000以含有300mg v10000的20mL缓冲液的小瓶供应。v10000小瓶被冷冻运输并储存在-20℃(+/-5℃)下直至准备使用。小瓶在使用前在环境温度下解冻。小瓶中的解冻溶液在环境温度下储存至多24小时,或在冷藏条件(2℃至8℃)下储存至多72小时,并在标示的有效期前使用。
实施例2:v10000在局部晚期(不可切除)和/或转移性HER2表达癌症患者中的I期
临床试验
这是一项正在进行的首次人体研究,旨在研究v10000单一疗法在局部晚期(不可切除)和/或转移性人表皮生长因子受体2(HER2)表达癌症患者中的安全性、耐受性、药代动力学(PK)和初步抗肿瘤活性。
所述研究的第1部分是3+3剂量递增,其中确定20mg/kg Q2W单一药剂作为推荐剂量(RD)。第2部分正在进行中,并且正在其他患者(包括HER2-高BTC患者)中评价v10000 RD。第1部分和第2部分中符合条件的患者必须在所有已知可带来临床益处的疗法后已出现疾病进展。根据RECIST v1.1 Q8W,通过研究人员审查评估肿瘤应答。
目标
临床试验第1部分的主要目标是确定v10000单一疗法的MTD(最大耐受剂量)、OBD(最佳生物剂量)或RD。临床试验第1部分的次要目标是(1)表征v10000的安全性和耐受性;(2)表征v10000的血清PK曲线;以及(3)探索v10000在符合条件的HER2表达癌症患者中的潜在抗肿瘤作用。
所述试验第2部分的主要目标是表征v10000单一疗法在特定肿瘤类型中的安全性和耐受性。临床试验第2部分的次要目标是(1)表征v10000单一疗法的血清PK曲线和(2)探索v10000在MTD、OBD或RD下在符合条件的选定表达HER2的局部晚期(不可切除)和/或转移性癌症患者中的潜在抗肿瘤作用。
患者
依照临床研究人员的看法,≥18岁且ECOG(Eastern Cooperative OncologyGroup)体能状态为0或1且预期寿命为至少3个月的男性或女性患者被纳入试验。
在第1部分,组别1-3包括患有任何局部晚期(不可切除)和/或转移性HER2表达(HER2 1+、2+或3+,根据IHC)癌症(包括但不限于乳腺癌、胃癌、卵巢癌、结直肠癌和非小细胞肺癌)的患者,其在接受所有已知可带来临床益处的疗法后有进展。组别4-6包括患有HER2 IHC 2+/FISH-乳腺癌或胃食管腺癌(GEA)的患者;患有HER2 IHC 3+或HER2 IHC 2+/FISH+乳腺癌或GEA的患者。组别4-6还包括患有任何其它HER2 IHC 3+或FISH+癌症的患者,其中癌症为HER2过表达(3+,根据IHC)或HER2-2+,并且FISH+乳腺癌必须在既往用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和T-DM1治疗后有进展;其中癌症为HER2过表达(3+,根据IHC)或HER2-2+,并且FISH+GEA必须在既往用曲妥珠单抗治疗后有进展;其中结直肠癌患者为KRAS野生型;或者其中NSCLC患者为ALK野生型、EGFR野生型和ROS1融合阴性,如通过标准方法所确定。组别7在选定地点招募,并且包括患有HER2 IHC 3+、HER2 IHC 2+/FISH+或HER2 IHC 2+/FISH-乳腺癌的患者。
在第2部分中,来自研究第1部分的使用在MTD、OBD或RD下施用的v10000的组别扩展包括在接受所有已知可带来临床益处的疗法后有进展的局部晚期(不可切除)和/或转移性癌症(除非没有资格接受特定疗法)如下:
组别1:HER2 IHC 2+/FISH-乳腺癌
组别2:HER2 IHC 3+或HER2 IHC 2+/FISH+乳腺癌
组别3:HER2 IHC 2+/FISH-GEA
组别4:HER2 IHC 3+或HER2 IHC 2+/FISH+GEA
组别5:任何其它HER2 IHC 3+或IHC 2+/FISH+癌症,包括以下:
组别5a:除GEA以外的HER2 IHC 3+或IHC 2+/FISH+GI(胃肠道)癌症,其中结直肠癌患者为KRAS野生型
组别5b:任何其它非乳腺癌或胃肠道癌的HER2 IHC 3+或IHC 2+/FISH+实体瘤类型,其中NSCLC患者必须具有通过标准方法确定的ALK野生型、EGFR野生型和ROS1融合阴性。卵巢癌患者必须是KRAS野生型。
第1部分和第2部分中患者的其它标准包括:(1)HER2 IHC 3+或IHC 2+/FISH+乳腺癌必须在既往用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗和T-DM1治疗后有进展;(2)HER2 IHC 3+或IHC 2+/FISH+GEA必须在既往用曲妥珠单抗治疗后有进展;(3)结直肠癌患者必须是Kirsten大鼠肉瘤(KRAS)野生型;并且(4)NSCLC患者必须具有通过标准方法确定的间变性淋巴瘤激酶(ALK)野生型、EGFR野生型和受体酪氨酸激酶(ROS1)融合阴性。
如果以下标准中的一项或多项适用,则患者被排除在研究之外:
1.在首次v10000给药前4周内使用实验疗法进行治疗
2.在v10000给药前4周内用其它未指定的癌症疗法进行治疗
3.在首次v10000给药或终生总剂量超过300mg/m2阿霉素或等效物前90天内用蒽环类药物治疗
4.在首次v10000给药前3周内用曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼或T-DM1治疗
5.未治疗的脑转移瘤(接受治疗的脑转移瘤患者停用类固醇并且在筛查时稳定至少1个月才符合条件)。所有乳腺癌患者都应在开始治疗前进行筛查。那些发现有未经治疗的脑转移瘤的患者可在适当疗法后重新筛查。
6.临床评估的软脑膜疾病(LMD)。如果在基线MRI上已通过射线照相报告LMD,但研究人员并未在临床上怀疑LMD,则如果他或她没有研究人员记录的LMD神经***症状,则该患者符合条件
7.首次v10000给药前3周内进行过大手术或放疗
8.孕妇或哺乳期妇女
9.对单克隆抗体或对药物制剂中的重组蛋白或赋形剂有危及生命的超敏反应史
10.在首次v10000给药前3年内有任何其它癌症,但对侧乳腺癌、经充分治疗的原位***或经充分治疗的皮肤基底细胞癌或鳞状细胞癌或任何其它已接受治愈性治疗的癌症除外,并获得主办者医学监察员批准。
11.急性或慢性不受控制的肾脏疾病、胰腺炎或肝脏疾病(根据研究人员评估,患有吉尔伯特综合征(Gilbert's Syndrome)、无症状胆结石、肝转移或稳定的慢性肝病的患者除外)
12.周围神经病变:>2级NCI-CTCAE 4.03版,2010年7月14日
13.有临床意义的间质性肺病
14.不遵守医疗方案的历史
15.不愿意或不能遵守协议
16.已知活动性乙型或丙型肝炎或已知感染人类免疫缺陷病毒(HIV)
17.在首次v10000给药2周内使用以相当于每天>15mg***的剂量施用的皮质类固醇,除非研究医学监察员另外批准。
18.QTc Fridericia(QTcF)>450ms。
19.有任何与既往癌症疗法相关的毒性,但尚未消退至≤1级,以下情况除外:脱发;神经病变(必须已消退至≤2级);和充血性心力衰竭(CHF),在发生时严重程度必须≤1级,并且必须完全消退。
20.患有临床上显著的心脏病,例如需要治疗的室性心律失常、不受控制的高血压或任何有症状的CHF病史。
21.在首次v10000给药前6个月内已知有心肌梗塞或不稳定型心绞痛。
治疗
在第1部分和第2部分中,v10000作为单一药剂(单一疗法)静脉内(IV)施用。v10000通过IV输注在0.9%生理盐水中经120至150分钟施用。如果特定患者的前2次施用剂量耐受良好,则该患者的输注持续时间可能已降至90分钟。如果接下来的2个剂量耐受良好,则输注持续时间可降至60分钟。输注速度不超过250mL 0.9%生理盐水/小时。(例如:如果将一剂v10000稀释到250mL袋装生理盐水中,则输注应经至少60分钟施用。如果将一剂v10000稀释到500mL袋中,则输注应经至少120分钟施用。)研究药物剂量是根据第1周期第1天的患者体重计算的。仅当根据第1周期第1天的评估体重发生10%变化时才重新计算剂量。
在第1部分中,剂量递增的剂量水平为5、10和15mg/kg,每周给药一次(QW)。还评估了每两周(Q2W)给药。Q2W给药的剂量水平为20、25或30mg/kg。Q2W给药可能使用了初始负荷剂量(不超过20、25或30mg/kg),接着按照SMC推荐的较低剂量水平施用v10000。此外,研究了每3周(Q3W)30mg/kg的剂量。
第2部分的剂量水平是第1部分中确定的MTD、OBD或RD。MTD定义为在治疗的前4周期间6名患者中不超过1名经历DLT的最高剂量水平。OBD定义为导致谷底(给药后7天)的v10000血清浓度比代表HER2-3+肿瘤组织学的细胞系的v10000的最大结合能力高至少10倍的v10000剂量。RD是不超过MTD的任何其它剂量。根据第1部分的结果,20mg/kg Q2W的RD用于治疗第2部分中的大多数患者。一些患者每周接受10mg/kg治疗。
患者参加最少2个周期,每个周期为3或4周,取决于患者入组的部分、组别或TG。只要没有证据表明根据RECIST 1.1版定义的临床进展、不可接受的毒性或进行性疾病证据,治疗就可以继续进行额外的周期。临床进展定义为与潜在癌症相关的先前存在的症状恶化或重新出现,或者出现不能归因于研究药物毒性或其它原因的新症状。在临床研究人员看来尽管有放射学进展但仍显示出持续临床益处的患者可能在与主办者医学监察员讨论并获得批准后继续接受治疗。对于第3部分,如果由于与v10000无关的毒性而停止化疗,则患者可能会继续接受v10000治疗。因任何原因停止v10000治疗的患者退出研究。
功效评估
根据使用修订的实体瘤疗效评价标准(RECIST)指南(1.1版)[Eur J Ca 45:228-247,2009]提出的新国际标准,基于疗效评估来评价抗肿瘤活性的措施。RECIST 1.1版标准中使用了肿瘤病灶最大直径(一维测量)和恶性***最短直径的变化。CR、PR、SD或进行性疾病(PD)的临床应答由研究人员在每次评估时确定。PD包括依照RECIST 1.1版的进行性疾病和依照研究人员的临床疾病进展。临床进展定义为与潜在癌症相关的先前存在的症状恶化或重新出现,或者出现不能归因于研究药物毒性或替代原因的新症状。
客观应答率(ORR)定义为在如RECIST 1.1版所定义的任何进展证据之前具有至少1次CR或PR总体肿瘤应答的患者百分比。如果患者根据RECIST 1.1版标准具有CR、PR或SD的肿瘤应答,则称其已实现疾病控制。v10000疗法开始后每8周评估一次疾病控制率。PFS时间定义为从第一剂v10000到根据RECIST 1.1版记录的疾病进展、临床进展或因任何原因而死亡的日期的时间。在分析时还存活且没有进展的患者将在他们最后一次CR、PR或SD肿瘤评估时被审查。
根据胸部、腹部和骨盆的CT和/或MRI扫描(对同一患者的每次扫描使用相同的方法)加上已知或疑似肿瘤受累的额外区域(例如,脑、四肢)评价肿瘤应答。
局部评价客观应答和肿瘤进展。收集所有受试者的扫描,以供主办者自行决定进行集中审查。局部评价用于所有治疗相关的决定。
对于一些患者,可集中计算肿瘤体积。
不良反应
AE(不良反应)被定义为在临床研究患者中施用与该治疗不一定有因果关系的医药产品发生的任何不良医学事件。因此,AE可以是任何与使用药物(研究性)产品在时间上相关的不利和非预期的迹象(包括异常实验室发现)、症状或疾病,无论它是否与药物(研究性)产品有关。这包括先前存在的状况或事件的恶化、并发疾病、药物相互作用或正在研究的适应症的显著恶化,这些在CRF的其它地方没有记录在特定的功效评估中。安全性评价是基于2010年7月14日的NCI-CTCAE 4.03版进行。
早期结果:
截至2018年6月,在一名胆囊癌患者中,v10000治疗导致目标病灶的最长直径总和(SLD)减小了大约40%。该患者后来表现出通过SOD(直径总和)测量的目标病灶减小了大约50%。
截至2018年11月,在一名CCA患者中,如通过SOD所测量,在用v10000治疗后观察到目标病灶减小了大约40%。
中期结果:
截至2019年4月22日,所有适应症的89名患者已在v10000的第1部分和第2部分(第1部分中23名和第2部分中66名)中纳入并使用单一药剂v10000治疗(表C)。所评价的肿瘤类型包括乳腺癌(n=42)、胃食管癌(n=20)、结直肠癌(n=11)、胆道癌(n=6)和其它癌症(n=10)。在BTC患者中,先前接受的全身治疗方案的中位数为4(范围1-8),包括一名患者的曲妥珠单抗。
在研究的第1部分和第2部分中,大多数AE的严重程度为1级或2级(表D)。v10000相关的3级AE包括疲劳(n=3,包括一个报告为SAE的事件)、腹泻(n=2)、关节痛(n=1)和低磷血症(n=1)。
BTC患者的初步功效数据呈现于表E、表F和图2。
表C.第1部分和第2部分中按癌症类型划分的关键人口统计学和基线特征
表D.第1部分和第2部分中按癌症类型划分的v10000相关不良事件汇总
表E.第1部分和第2部分中可测量疾病分析集中的最佳应答汇总
a可测量的疾病分析集—根据RECIST 1.1具有可测量疾病的安全性分析集中的所有患者;
b安全性分析集—所有接受至少一剂研究治疗的患者。
CI=置信区间,DCR=疾病控制率,NE=不可评价,ORR=总应答率,PFS=无进展生存期,PR=部分应答,SD=稳定疾病
表F.BTC患者的既往治疗方案和疾病应答
a所有BTC患者为HER2+(3+或FISH+);
b患者在接受8种全身治疗方案中的6种同时接受曲妥珠单抗;
c最终DOR等待额外疾病评估。
NA=不适用NE=不可评价,等待后续疾病评估
GBC=胆囊癌;CC=胆管癌
这些数据表明,v10000在HER2 3+或FISH+BTC患者中的疾病控制率为83.3%,并且ORR为66.7%。
实施例3:接头-毒素001的制备
如下所述制备接头-毒素001。接头-毒素001也可如国际专利申请公开第WO 2016/041082号中所述制备。
接头-毒素001
A.(2R,3R)-3-甲氧基-2-甲基-3-((S)-吡咯烷-2-基)丙酸乙酯(化合物1)
在0℃下向搅拌的(2R,3R)-3-((S)-1-(叔丁氧基羰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(Boc-Dap-OH,4.31g,15.0mmol)于无水乙醇(27.0mL)中的溶液中以逐滴方式加入亚硫酰氯(3.0mL)。使所得溶液升温至室温并通过HPLC-MS监测进展。18小时后,没有检测到剩余的原材料,并且将溶液减压浓缩至干。将所得油状物悬浮于甲苯(10mL)中并减压浓缩两次,然后悬浮于二***(5mL)中并减压浓缩两次,得到白色固体泡沫(3.78g,定量产率%)。MS m/z观测值=216.5(M+1)。
B.(3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酸(化合物3)
如国际专利申请公开第WO 2016/041082号中所述制备化合物2。
向搅拌的化合物2(6.965g,14.14mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液中加入三氟乙酸(5.0mL)。通过HPLC-MS监测反应完成,并且在40小时后没有原材料残留。将反应减压浓缩,与甲苯(2x 10mL)和二氯甲烷(2x 10mL)共蒸发,获得泡沫状白色固体(6.2g,定量产率,含残留TFA)。将该物质溶解在200mL热的1:3EtOAc:己烷中并使其冷却至室温。在冷却过程中,形成沉淀物以及一些小晶体。加入5mL EtOAc并再次加热悬浮液以完全溶解沉淀物。冷却至室温后形成更多晶体,并且将烧瓶置于-30℃过夜。第二天早晨倾析母液,并且晶体用2x 50mL己烷冲洗并在高真空下干燥。回收到5.67g结晶产物。MS m/z观测值=405.7(M+1)。
C.(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸乙酯(化合物4)
在室温下向搅拌的化合物3(6.711g,15.37mmol,1.025当量)于二氯甲烷(5.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(5.0mL)的混合物中的溶液中加入HATU(5.732g,15.07mmol,1.005当量)和N,N-二异丙基乙胺(7.84mL,3当量)。在室温下搅拌30分钟后,滴加化合物1(3.776g,15.00mmol,1.0当量)于二氯甲烷(1.0mL)和N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)的混合物中的溶液,用额外3mL的1:1二氯甲烷:N,N-二甲基甲酰胺冲洗残留化合物1。通过HPLC-MS监测反应并且在15分钟后没有观察到残留的化合物1。将反应减压浓缩,用乙酸乙酯(~125mL)稀释,并且有机相用1M HCl(2x 50mL)、1x dH
2O(1x 50mL)、饱和NaHCO
3(3x 50mL)、盐水(25mL)萃取。酸性和碱性水层均用25mL EtOAc洗涤。然后合并所有有机物并经MgSO
4干燥,过滤并浓缩,得到红色油状物。将残余物溶解在最少量的二氯甲烷(~10mL)中,上样到
SNAPUltra 360g硅胶柱(Isolera
TMFlash System;Biotage AB,Sweden)上进行纯化(20-100%EtOAc的己烷溶液,超过10倍柱体积)。合并含有纯产物的级分,回收到7.9g泡沫状白色固体。在
SNAP Ultra 100g硅胶柱上对不纯级分进行第二次纯化,并与纯产物合并以回收白色泡沫固体(8.390g,88.3%)。MS m/z观测值=634.7(M+1)。
D.(2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-(((苄氧基)羰基)氨基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酸(化合物5)
向搅拌的化合物4(8.390g,13.24mmol)于1,4-二噁烷(158mL)中的溶液中加入dH2O(39.7ml)和氢氧化锂一水合物(1M于H2O中,39.7mL,3当量)。将反应在4℃下搅拌并通过HPLC-MS监测原材料的消耗,这需要3天直至仅残留痕量化合物4。在反应过程中,除了所需材料之外,还形成了少量百分比的新产物,对应于甲醇的损失(β-消除,<2%)。通过加入1MHCl水溶液(50mL)将反应酸化并减压浓缩以除去二噁烷。剩余的反应混合物用乙酸乙酯(4x50mL)萃取,并且合并有机相,用盐水(15mL+2mL 2M HCl)洗涤,经MgSO4干燥,过滤并减压浓缩,得到浅色油状物。将油状物重新溶解在二***(~50mL)中并减压浓缩(3x)以促进残留二噁烷的去除,得到呈粘稠油状的标题产物(7.81g,97%产率,含一些残留的二噁烷和化合物4)。MS m/z观测值=606.7(M+1)。
E.((S)-1-(((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)(甲基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸苄酯(化合物7)
如国际专利申请公开第WO 2016/041082号中所述制备化合物6。
向搅拌的化合物5(7.12g,11.754mmol)于二氯甲烷(20mL)中的溶液中加入2,2,2-三氟-N-(4-氨磺酰基苯基)乙酰胺(化合物6,4.095g,1.3当量,溶解在3mL DMF中)、N,N-二甲基吡啶(1.867g,1.3当量)和N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)以生成浅黄色悬浮液。进一步添加5mL DMF没有使溶液澄清。以单份加入N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐(EDCI)(2.817g,1.25当量)并通过HPLC-MS监测反应。48小时后,反应不再进行,并且加入额外400mg EDCI。18小时后,没有观察到残留的原材料,并且将反应减压浓缩,得到黄色油状物。将油状物溶解在乙酸乙酯(~150mL)和1M HCl(20mL)中,并且有机相用冷的2M HCl(2x 10mL)、饱和NaHCO
3(1x 10mL)、盐水(20mL+5mL 2M HCl)洗涤。酸性和碱性水性级分用EtOAc(1x20mL)萃取,合并所有有机级分,经MgSO
4干燥并减压浓缩,得到油状粗固体(13g)。将残余物溶解在二氯甲烷(~10mL)中,上样到
SNAP Ultra 360g硅胶柱上并在10-100%EtOAc(2%AcOH)的己烷溶液梯度下纯化,超过12倍柱体积,在50%EtOAc下3倍柱体积达到稳定水平。合并含有纯产物的级分,减压浓缩,溶解并从甲苯(2x 10mL)和二***(2x 10mL)中浓缩,得到所需产物,7.1g白色泡沫固体。在Isolera
TM仪器上使用
SNAP Ultra 100g硅胶柱在较平缓的梯度条件下对不纯级分进行重复纯化。合并所有纯级分以回收呈白色泡沫固体的纯产物(8.60g,86%)。MS m/z观测值=856.7(M+1)。
F.(S)-2-氨基-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物7a)
将化合物7(3.71g,4.33mmol)溶解在圆底烧瓶中10%N,N-二甲基甲酰胺的乙酸乙酯(30mL)溶液中,所述烧瓶含有磁力搅拌器并配有三通气体管线接头。在减压下将容器抽真空两次并充入氮气。以单份加入10%钯/碳(0.461g,0.1当量),将三通接头安装到烧瓶上,将氢气球安装到接头上,并在减压下将容器抽真空两次并充入氢气。将反应搅拌2天,在此期间不时地给氢气球重新充气。大约48小时后,HPLC-MS分析表明没有原材料残留。反应用甲醇(20mL)稀释并通过硅藻土塞过滤。硅藻土用甲醇(2x 50mL)洗涤。合并所有滤液并减压浓缩,并且将所得油状物溶解并从二氯甲烷中浓缩。减压干燥后,分离出呈无色粉末的标题化合物(3.10g,99%)。MS m/z观测值=722.6(M+1)。
G.(S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N-((3R,4S,5S)-3-甲氧基-1-((S)-2-((1R,2R)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-3-((4-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)磺酰胺基)丙基)吡咯烷-1-基)-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物8)
向搅拌的N,N-(L)-二甲基缬氨酸(1.696g,9.35mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液中加入HATU(3.216g,8.46mmol)和二异丙基乙胺(3.10mL,17.8mmol)。5分钟后得到澄清的黄色溶液。再继续搅拌10分钟,然后以单份加入化合物7a(3.213g,4.45mmol)。再搅拌1小时后,HPLC-MS表明残留痕量化合物7a并且反应持续16小时。然后将反应减压浓缩,用乙酸乙酯(120mL)和40mL 1:1NaHCO
3(饱和):5%LiCl稀释并转移至分液漏斗。除去水层并且有机相用LiCl(1x 20mL)、NaHCO
3(饱和,2x 20mL)洗涤。合并水层并用EtOAc(3x 50mL)萃取。合并有机层并用盐水(1x 20mL)洗涤,经硫酸钠干燥,过滤并浓缩,得到充满DMF的油状物,将其经由旋转蒸发器浓缩以除去残留的DMF,得到7g粗制稻草色油状物。将油状物溶解在少量10%甲醇的二氯甲烷溶液(~11mL)中并上样到
SNAP Ultra 360g硅胶柱上进行纯化(2-20%MeOH的CH
2Cl
2溶液,超过15倍柱体积,产物在约10-13%洗脱)。合并含有所需产物的级分并减压浓缩,得到呈无色泡沫的标题化合物。合并不纯级分,蒸发并在Isolera
TM仪器上的
SNAP Ultra 100g硅胶柱上进行重复纯化,并与来自第一根柱的纯产物合并,得到无色泡沫固体(3.78g)。MS m/z观测值=850.6(M+1)。
H.(S)-N-((3R,4S,5R)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-((4-氨基苯基)磺酰胺基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺(化合物9)
向搅拌的化合物8(0.980g,1.154mmol)于1,4-二噁烷(15mL)中的溶液中加入水(3.5mL)和1M氢氧化锂一水合物(3当量,3.46mL)。将所得轻质悬浮液在4℃下搅拌并通过HPLC-MS监测原材料的消耗。当转化完成时(~5天),用3.46mL的1M HCl中和反应并减压浓缩以除去二噁烷。所得水相用60mL EtOAc和5mL盐水稀释,然后用乙酸乙酯(2x 30mL)萃取。合并有机级分,经Na2SO4干燥,过滤并蒸发,得到呈棕褐色固体的标题化合物(0.930g)。Rf=0.5(8%MeOH的CH2Cl2溶液)。MS m/z观测值=753.7(M+1)。
I.3-(2-(2-(2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸2,3,5,6-四氟苯酯(化合物15)
在干燥的50mL锥形烧瓶中,将3-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)丙酸(化合物14,1.000g,4.52mmol)和马来酸酐(0.443g,4.52mmol)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(5mL)中。将反应在室温下在N
2下搅拌6小时,此时将其冷却至0℃并滴加同三甲基吡啶(1.263mL,2.1eq)。在单独的干燥的50mL锥形烧瓶中,将四氟苯酚(3.002g,4eq)溶解在无水N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中。将烧瓶在冰浴中冷却至0℃并滴加三氟乙酸酐(2.548mL,4eq)。将该烧瓶搅拌15分钟,此时滴加同三甲基吡啶(2.407mL,4eq)。再搅拌烧瓶15分钟,然后经由注射器将内容物逐滴加入第一个烧瓶中。使反应升温至室温并在N
2下继续搅拌。反应通过HPLC-MS监测原材料的消耗。6天后,反应完成,化合物14全部消耗,仅留下化合物15和少量(~5%)的双TFP马来酰胺中间体。将反应物转移到分液漏斗中,用二***(75ml)稀释并用5%LiCl(1x 20mL)、1M HCl(2x 20mL)、饱和NaHCO
3(5x 20mL)和盐水(1x 20mL)洗涤。有机层经Na
2SO
4干燥,过滤并蒸发,得到含残留DMF的棕色粗油状物。将粗油状物溶解在8mL的1:1DMF:H
2O+0.1%TFA中,上样到60g
SNAP Ultra C18柱(Biotage AB,Uppsala,Sweden)并在线性30-100%的ACN/H
2O+0.1%TFA梯度下纯化,超过8倍柱体积。合并纯级分并用盐水(20mL)稀释,然后用3x 50mL Et
2O萃取。合并的有机物经MgSO
4干燥,过滤并蒸发以回收浅黄色油状物(1.34g,66%产率)。
J.((S)-1-(((S)-1-((4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5S)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)氨基)-1-氧代-5-脲基戊-2-基)氨基)-3-甲基-1-氧代丁-2-基)氨基甲酸叔丁酯(化合物12)
如国际专利申请公开第WO 2016/041082号中所述制备化合物11。
向空的25mL梨形烧瓶中加入化合物11(1.342g,3.58mmol,3.0当量)、1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(0.664g,3.46mmol,2.9当量)和7-羟基-氮杂苯并***(HOAT)(0.472g,3.46mmol,2.9当量)。在室温下在搅拌下经30分钟将这些固体溶解在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)和二氯甲烷(4.5mL)的混合物中。单独地,将化合物9(0.900g,1.20mmol)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)和二氯甲烷(1.8mL)的混合物中并加入到梨形烧瓶中,用二氯甲烷(1.0mL)冲洗。搅拌速率增加到1000rpm,产生涡旋。在加入化合物9后的2分钟内,将氯化铜(II)(0.514g,3.83mmol,3.2当量)以整份直接通过窄粉末漏斗加入到涡旋中心。最初的浅黄色溶液变成深棕色悬浮液,经10分钟变成深绿色悬浮液。通过HPLC-MS监测反应的完成,并且在30分钟和1小时(~95%完成)采集的样品之间没有观察到反应进程的变化。将反应在室温下搅拌过夜,然后将2-(2-氨基乙基氨基)乙醇(0.483mL,4.781mmol,4当量)、EtOAc(10mL)和dH
2O(5mL)加入到搅拌的悬浮液中,其经历颜色变为深蓝色。随着悬浮固体逐渐溶解到双相混合物中,将悬浮液剧烈搅拌4小时。将该混合物转移到分液漏斗中并用EtOAc(100mL)和盐水(10mL)稀释,并将水层用10%IpOH/EtOAc(4x50mL)萃取。合并有机层并用盐水(10mL)洗涤,经Na
2SO
4干燥并蒸发,得到淡蓝色的粗固体。将此粗固体溶解在甲醇(0.5mL)和二氯甲烷(6mL)的混合物中,并在
SNAP Ultra100g硅胶柱上纯化(2-20%MeOH的CH
2Cl
2溶液,超过10倍柱体积,接着是在20%MeOH下8倍柱体积达到稳定水平)。在~20%MeOH的CH
2Cl
2溶液的1-2倍柱体积后,产物以宽峰洗脱。合并含有所需物质的级分并减压浓缩,得到呈白色固体的标题化合物(1.105g,83%)。MS m/z观测值=555.9((M+2)/2),1109.8(M+1)。
K.(S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰胺基)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)-5-脲基戊酰胺(化合物13)
向化合物12(0.926g,0.834mmol)的溶液中加入二氯甲烷(10mL)和三氟乙酸(2.0mL)的混合物。反应通过HPLC-MS监测原材料的消耗(~45分钟)。在减压下将反应物与乙腈(2x 10mL)和二氯甲烷(2x 10mL)共蒸发以除去过量的三氟乙酸。将所得残余物溶解在最少量的二氯甲烷和甲醇(3:1,v/v,~2mL)中,并经由移液管滴加到搅拌的二***(200mL)和己烷(100mL)的溶液中,产生浅白色固体的悬浮液。过滤固体并真空干燥,得到白色粉末形式的作为三氟乙酸盐的标题化合物(1.04g,定量产率,含一些残留溶剂)。MS m/z观测值=505.8((M+2)/2)。
L.(S)-N-(4-(N-((2R,3R)-3-((S)-1-((3R,4S,5R)-4-((S)-2-((S)-2-(二甲基氨基)-3-甲基丁酰胺基)-N,3-二甲基丁酰胺基)-3-甲氧基-5-甲基庚酰基)吡咯烷-2-基)-3-甲氧基-2-甲基丙酰基)氨磺酰基)苯基)-2-((S)-1-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-14-异丙基-12-氧代-3,6,9-三氧杂-13-氮杂十五烷酰胺基)-5-脲基戊酰胺(接头-毒素001)
向搅拌的化合物13(0.722g,0.584mmol)于N,N-二甲基甲酰胺(4mL)中的溶液中加入化合物15(0.314g,1.2当量)和二异丙基乙胺(0.305mL,3.0当量)。2h时的HPLC-MS分析表明没有残留的原材料。将反应用TFA(300μL)酸化,然后用diH
2O+0.1%TFA(9mL)稀释。将所得溶液上样到120g
SNAP Ultra C18柱(Biotage,Uppsala,Sweden)上并在ACN/H
2O+0.1%TFA梯度下纯化:20-60%ACN超过10倍柱体积,60-100%ACN超过5倍柱体积。产物在40%ACN附近洗脱。通过LCMS鉴定的纯级分被合并并冻干。从冻干器回收白色粉末固体。以较高浓度(大约50mg/mL,在2:1H
2O/ACN中)重复冻干到小瓶中,以产生密度更大、絮凝更少的冻干固体(754.2mg,91%)。MS m/z观测值=647.4((M+2)/2),1292.8(M+1)。
实施例4:与接头-毒素001缀合的v10000的制备
抗体v10000(2.0g)于10mM醋酸钠、9%(w/v)蔗糖pH 4.5中的溶液(138.9mL)通过添加200mM Na2HPO4 pH 8.9(15.4mL)进行pH调节。添加DTPA溶液(44mL于PBS中,pH 7.4,终浓度1.0mM)后,通过添加10mM TCEP水溶液(1.68mL,1.05eq)起始链间二硫化物的还原。在37℃下90分钟后,将反应在冰上冷却,然后从20mM DMSO储备溶液加入过量的接头-毒素001(4.81mL;6eq)。90分钟后通过添加过量的20mM N-乙酰半胱氨酸溶液(4.81mL;6当量)淬灭缀合反应。
淬灭的抗体药物缀合物(ADC)溶液在Millipore Labscale
TM切向流过滤仪器上使用
XL超滤模块(
30kDa 0.005m
2;Millipore Sigma)用9-15倍体积的10mM醋酸钠、9%(w/v)蔗糖pH 4.5纯化。洗脱的ADC进行无菌过滤(0.22um)。小规模生产的ADC在40KDa MWCO Zeba
TM柱(ThermoFisher Scientific,Waltham,MA)上纯化,所述柱用PBS或10mM醋酸钠、9%(w/v)蔗糖pH 4.5预调节。
纯化后,参考从v10000生成的标准曲线,通过BCA测定来确定ADC的浓度。或者,通过测量280nm(ε=195065M-1cm-1)处的吸收来估计浓度。
通过非还原和还原SDS-PAGE评估ADC的样品。没有观察到多余的条带。
通过疏水相互作用色谱(HIC)分析抗体和ADC,以估计药物/抗体比(DAR)。在
HIC Ethyl柱(7.8x50mm,5μm)(Sepax Technologies Inc.,Newark,DE)上进行色谱分析,使用梯度为80%MPA/20%MPB至35%MPA/65%MPB,经13.5分钟的时期,流速为1mL/min(MPA=1.5M(NH
4)
2SO
4、25mM Na
xPO
4,并且MPB=75%25mM Na
xPO
4、25%异丙醇)。
ADC的平均药物/抗体比(DAR)可根据抗体还原过程中释放的二硫键数量而变化。产生具有特定平均DAR的ADC的单个缀合反应包含多种物质的混合物。对于与接头-毒素001缀合的v10000,产生了四种物质的混合物:未缀合抗体、DAR为2的ADC、DAR为4的ADC和DAR为6的ADC。
HIC的结果表明,包含与接头-毒素001缀合的v10000的ADC具有2.07的平均DAR。DAR0、DAR2、DAR4和DAR6种类对纯化ADC的平均DAR的单独贡献通过HPLC-HIC色谱图的积分来评估。HIC色谱图中的每个峰都通过制备型色谱法分离,并且峰的身份通过LC-MS进行验证。每个变体的单个DAR种类的含量%(通过HIC确定)显示在表G中。
表G:包含v10000和接头-毒素001的ADC的DAR分布
DAR |
面积% |
0 |
23 |
2 |
56 |
4 |
17 |
6 |
4 |