CN105916877A - 长效胰岛素及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及为了延长胰岛素的血液半衰期的目的具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物及利用它的长效胰岛素，缀合物，及制备长效胰岛素的方法。

Description

长效胰岛素及其用途
技术领域
本发明涉及为了延长胰岛素的血液半衰期的目的具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物及利用它的长效胰岛素。
背景技术
一般而言，胰岛素是一种由人体的胰分泌的激素，它调节血液葡萄糖水平，而且在维持正常血液葡萄糖水平同时将血液中的过剩葡萄糖携带至细胞为细胞提供能量中发挥作用。然而，在糖尿病患者中，由于缺少胰岛素，对胰岛素的抗性，和β细胞功能丧失，胰岛素没有正确发挥功能，因而血液中的葡萄糖不能作为能量来源得以利用，血液葡萄糖水平升高，引起高血糖。最终，发生尿***，促成发生各种并发症。因此，胰岛素疗法对于具有异常胰岛素分泌(I型)或胰岛素抗性(II型)的患者是必需的，而且通过胰岛素施用能正常调节血液葡萄糖水平。然而，像其它蛋白质和肽激素一样，胰岛素具有很短的体内半衰期，因而具有反复施用的缺点。此类频繁施用对患者引起严重的疼痛和不适。出于这个原因，为了通过延长蛋白质的体内半衰期及降低施用频率来改善生活质量，已经关于蛋白质配制剂和化学缀合(脂肪酸缀合物，聚乙烯聚合物缀合物)进行了许多研究。商品化的长效胰岛素包括由Sanofi Aventis制造的甘精胰岛素(lantus，持续约20小时至22小时)，和由NovoNordisk制造的地特胰岛素(levemir，持续约18小时至22小时)和tresiba(德谷胰岛素，持续约40小时)。这些长效胰岛素配制剂不产生血液胰岛素浓度峰，因而它们适合作为基础胰岛素。然而，因为这些配制剂不具有足够长的半衰期，所以仍然存在每天注射一次或两次的缺点。因而，在实现显著降低施用频率以改善需要长期施用的糖尿病患者的便利的预定目标方面存在限制。
Authier F et al.,Biochem J.1998Jun 1；332(Pt 2):421-30；Duckworth WC etal.,Endocr Rev.1998Oct；19(5):608-24和Valera Mora ME et al.,J Am CollNutr.2003Dec；22(6):487-93；等报告了体内胰岛素清除过程。根据报告，50％或更多的胰岛素在肾中去除，其余在诸如肌肉，脂肪，肝，等靶部位中经受体介导的清除(RMC)过程去除。
在这点上，Lin S et al.,J Pharmacol Exp Ther,1998,286(2):959-66；BrangeJ et al.,Diabetes Care.1990Sep；13(9):923-54；和Ribel U et al.,Diabetes,1990,39:1033-9；等报告了降低体外活性以避免胰岛素的RMC，由此提高血液中的胰岛素水平。
在这些情况下，本发明人做出了很多努力来延长胰岛素的血液半衰期。结果，他们发现了具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，而且还确认了含有该胰岛素类似物的能够延长胰岛素的半衰期，提高胰岛素的生物利用度，和维持胰岛素的持久活性的配制剂也能延长胰岛素的血液半衰期，由此完成本发明。
发明概述
技术问题
本发明的一个目的是提供一种新颖的胰岛素类似物及其长效配制剂，该胰岛素类似物为了延长胰岛素的体内半衰期的目的具有降低的胰岛素受体结合亲和力。
具体而言，本发明的一个目的是提供一种胰岛素类似物，其具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力。
本发明的另一个目的是提供一种编码该胰岛素类似物的多核苷酸，一种包含该多核苷酸的表达载体，和一种包含该表达载体的转化体。
本发明的仍有另一个目的是提供一种长效胰岛素，其中能够延长半衰期的生物相容性物质连接至胰岛素类似物。
本发明的仍有另一个目的是提供一种用于制备长效胰岛素的方法，其包括：(a)分别制备(i)胰岛素类似物和(ii)选自下组的生物相容性物质：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物；并(b)将胰岛素类似物连接至生物相容性物质。
本发明的仍有另一个目的是提供下文化学式1的缀合物。
[化学式1]
X-La-F；
其中X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，
L为接头，
a为0或自然数，前提是当a为2或更高时每个L彼此独立，且
F为能够延长胰岛素类似物的体内半衰期的物质。
本发明的仍有另一个目的是提供一种长效胰岛素配制剂，其包含该缀合物，具有改善的体内持久性和稳定性。
本发明的仍有另一个目的是提供一种长效胰岛素配制剂，其包含该缀合物，用于治疗糖尿病。
本发明的仍有另一个目的是提供一种用于治疗胰岛素相关疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用该胰岛素类似物或该胰岛素类似物缀合物。
技术方案
为了实现上述目的，在一个方面，本发明提供一种胰岛素类似物，其具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力。
在本发明的一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物具有与天然胰岛素相比延长10％或更高的半衰期。
在本发明的另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物在天然胰岛素的至少一个氨基酸中具有突变或删除。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物特征在于胰岛素B链位置1至3，5，8，10，12，16，和23至30处和胰岛素A链位置1，2，5，8，10，12，14，16至19，和21处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代或删除的。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物特征在于胰岛素B链位置8和23至25处和胰岛素A链位置1，2，14，和19处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，替代所用氨基酸选自下组：丙氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和天冬氨酸。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，由于天然胰岛素A链或B链的至少一个氨基酸中的删除，该胰岛素类似物具有降低的胰岛素受体结合亲和力。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物包括下文式1代表的SEQ ID NO：37的A链和下文式2代表的SEQ ID NO：38的B链：
[式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa3-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa4-Cys-Asn(SEQ ID NO：37)
在上文式1中，
Xaa1为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa2为异亮氨酸或丙氨酸，
Xaa3为酪氨酸，谷氨酸，或天冬酰胺，且
Xaa4为酪氨酸或丙氨酸。
[式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa5-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：38)
在上文式2中，
Xaa5为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa6为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa7为苯丙氨酸或丙氨酸，且
Xaa8为苯丙氨酸或丙氨酸。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物包括：
(i)A链，其中，在式1中，Xaa1为丙氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(ii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为丙氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为谷氨酸或天冬酰胺，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iv)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为丙氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(v)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为丙氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vi)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为丙氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；或
(viii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为丙氨酸。
在另一个方面，本发明提供一种编码该胰岛素类似物的多核苷酸，一种包含该多核苷酸的表达载体，和一种包含该表达载体的转化体。
在仍有另一个方面，本发明提供一种长效胰岛素，其中能够延长半衰期的生物相容性物质连接至该胰岛素类似物。
在本发明的一个例示性实施方案中，该生物相容性物质选自下组：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物。
在本发明的另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过肽键彼此连接。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过选自下组的接头连接：聚乙二醇，脂肪酸，糖，聚合物，低分子量化合物，核苷酸，及其组合。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过***它们之间的接头连接，且该生物相容性物质为FcRn结合物质，其中该接头为肽接头或选自下组的非肽接头：聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，及其组合。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该FcRn结合物质为包含免疫球蛋白Fc区的多肽。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该非肽接头的每个末端分别连接至该生物相容性物质和该胰岛素类似物的胺基团或硫醇基团。
在仍有另一个方面，本发明提供一种用于制备长效胰岛素的方法，其包括：
(a)分别制备(i)胰岛素类似物和(ii)选自下组的生物相容性物质：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物；并
(b)将该胰岛素类似物连接至该生物相容性物质。
在仍有另一个方面，本发明提供下文化学式1的缀合物：
[化学式1]
X-La-F；
其中X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，
L为接头，
a为0或自然数，前提是当a为2或更高时每个L彼此独立，且
F为能够延长胰岛素类似物的体内半衰期的物质。
在本发明的一个例示性实施方案中，X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物在胰岛素A链或B链的至少一个氨基酸中具有突变或删除。
在本发明的另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物特征在于胰岛素B链位置1至3，5，8，10，12，16，和23至30处和胰岛素A链位置1，2，5，8，10，12，14，16至19，和21处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代或删除的。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该胰岛素类似物特征在于胰岛素B链位置8和23至25处和胰岛素A链位置1，2，14，和19处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，替代所用氨基酸选自下组：丙氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和天冬氨酸。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该能够延长胰岛素类似物体内半衰期的物质选自下组：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，L选自下组：肽，聚乙二醇，脂肪酸，糖，聚合物，低分子量化合物，核苷酸，及其组合。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，X和F经由共价化学键，非共价化学键，或其组合通过L连接。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，该聚合物为选自下组的非肽接头：聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，寡核苷酸，及其组合。
在本发明的仍有另一个例示性实施方案中，F为IgG Fc区。
在仍有另一个方面，本发明提供一种长效胰岛素配制剂，其包含该缀合物，用于治疗糖尿病，具有改善的体内持久性和稳定性。
在仍有另一个方面，本发明提供一种用于治疗胰岛素相关疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用该胰岛素类似物或该胰岛素类似物缀合物。
有益的效果
本发明的长效胰岛素具有与天然胰岛素相比显著延长的血液半衰期，因而本发明的长效胰岛素能改善需要胰岛素施用的患者的便利。
附图简述
图1显示胰岛素类似物通过蛋白质电泳的纯度分析的结果，是代表性胰岛素类似物，类似物No.7的结果(第1道：大小标志物，第2道：天然胰岛素，和第3道：胰岛素类似物(No.7))。
图2显示胰岛素类似物通过高压层析的纯度分析的结果，是代表性胰岛素类似物，类似物No.7的结果((A)RP-HPLC，(B)SE-HPLC)。
图3显示胰岛素类似物的肽图的结果，是代表性胰岛素类似物，类似物No.7的结果((A)天然胰岛素，(B)胰岛素类似物(No.7))。
图4显示胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物通过蛋白质电泳的纯度分析的结果，是代表性胰岛素类似物，类似物No.7的结果(第1道：大小标志物，第2道：胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物)。
图5显示胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物通过高压层析的纯度分析的结果，是代表性胰岛素类似物，类似物No.7的结果((A)RP-HPLC，(B)SE-HPLC，和(C)IE-HPLC)。
图6显示天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物在正常大鼠中的药动学分析的结果((A)天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物，(B)天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物(No.8)-免疫球蛋白Fc缀合物，和(C)天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物(No.9)-免疫球蛋白Fc缀合物)。○：天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物(21.7nmol/kg)，●：天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物(65.1nmol/kg)，□：胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物(21.7nmol/kg)，■：胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物(65.1nmol/kg)。
发明详述
为了实现本发明，在一个方面，提供了一种胰岛素类似物，其具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力。
如本文中使用的，术语“胰岛素类似物”指拥有与天然胰岛素相同的，控制体内血液葡萄糖水平的功能的物质。为了本发明的目的，胰岛素类似物优选是具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的物质。另外，由于降低的胰岛素受体结合亲和力，胰岛素类似物可以是具有比天然胰岛素延长10％或更高的半衰期的，但不限于此。
具体而言，胰岛素类似物可以是具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，其中胰岛素B链或A链的一个氨基酸是突变或删除的。例如，经以添加，删除，或替代的形式修饰天然胰岛素的部分氨基酸，胰岛素类似物可以是具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的。
同时，天然胰岛素是一种由胰分泌的激素，它一般用来促进葡萄糖的细胞内吸收及抑制脂解，由此控制体内血液葡萄糖水平。胰岛素原(它是没有能力控制血液葡萄糖水平的前体)形式的胰岛素经一定过程转变成具有能力控制血液葡萄糖水平的胰岛素。胰岛素具有两条多肽链，即具有21个氨基酸残基的A链和具有30个氨基酸残基的B链，而且它们通过两个二硫键连接到一起。天然胰岛素A链和B链每个可分别包含SEQ ID NO：39和40代表的氨基酸序列。
A链：
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn(SEQ ID NO：39)
B链：
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：40)
本发明实施例中使用的胰岛素类似物是通过遗传重组技术制备的。然而，本发明的胰岛素类似物不限于此，而是可以包括所有具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素。
具体而言，胰岛素类似物可包括倒转的胰岛素，胰岛素变体，胰岛素片段，胰岛素激动剂，胰岛素衍生物，等，而且制备方法可包括固相方法以及遗传重组技术，但不限于此。
胰岛素激动剂指结合至体内胰岛素受体以展现胰岛素的生物学活性的物质，不管胰岛素的结构。
胰岛素衍生物包括分别与天然胰岛素A链和B链的氨基酸序列具有同源性，氨基酸残基的一些基团以化学取代(例如α-甲基化，α-羟基化)，去除(例如脱氨)，或修饰(例如N-甲基化)形式改变，同时具有在身体中控制血液葡萄糖的功能的肽形式。
另外，胰岛素衍生物还可以包括甚至在与天然胰岛素的氨基酸序列的同源性缺失下，能通过结合至胰岛素受体来控制体内血液葡萄糖水平的肽模拟物和低分子量化合物或聚合物。
胰岛素片段指对胰岛素添加或删除一个或多个氨基酸得到的胰岛素形式，添加的氨基酸可以是自然界中不存在的(例如D型氨基酸)，而且这种类型的胰岛素片段拥有控制体内血液葡萄糖水平的功能。
胰岛素变体指其中一个或多个氨基酸不同于胰岛素且拥有控制体内血液葡萄糖水平的功能的肽。
制备本发明胰岛素激动剂，衍生物，片段，和变体的相应方法可以独立或组合使用。例如，其中一个或多个氨基酸不同于胰岛素，N端氨基酸残基脱氨基，且具有控制体内血液葡萄糖水平的功能的肽包括在本发明的范围中。
具体而言，胰岛素类似物可以是其中胰岛素B链位置1至3，5，8，10，12，16，和23至30处和胰岛素A链位置1，2，5，8，10，12，14，16至19，和21处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的胰岛素类似物；或更加具体而言，可以是其中胰岛素B链位置8和23至25处和胰岛素A链位置1，2，14，和19处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的胰岛素类似物。具体而言，胰岛素类似物可以是其中上文所述一个或多个氨基酸，2个或更多个氨基酸，3个或更多个氨基酸，4个或更多个氨基酸，5个或更多个氨基酸，6个或更多个氨基酸，7个或更多个氨基酸，8个或更多个氨基酸，9个或更多个氨基酸，10个或更多个氨基酸，11个或更多个氨基酸，12个或更多个氨基酸，13个或更多个氨基酸，14个或更多个氨基酸，15个或更多个氨基酸，16个或更多个氨基酸，17个或更多个氨基酸，18个或更多个氨基酸，19个或更多个氨基酸，20个或更多个氨基酸，21个或更多个氨基酸，22个或更多个氨基酸，23个或更多个氨基酸，24个或更多个氨基酸，25个或更多个氨基酸，26个或更多个氨基酸，或27个或更多个氨基酸是用其它氨基酸替代的胰岛素类似物，但不限于此。
上文所述位置处的氨基酸残基可以用丙氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和/或天冬氨酸替代。另外，由于胰岛素A链或B链中的一个或多个氨基酸中的删除具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物也属于本发明的范围，但是可以包括任何具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，没有限制。
依照本发明的胰岛素类似物包括任何由于在天然胰岛素A链和B链的氨基酸序列中引入氨基酸替代，添加，或翻译后修饰(例如甲基化，酰化，遍在蛋白化，和分子内共价键)具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的肽。对于氨基酸的替代或添加，在20种常见氨基酸以外，可以使用非典型或非天然发生氨基酸。非典型氨基酸的商业来源可以包括Sigma-Aldrich，ChemPep，和Genzyme pharmaceuticals。包含这些氨基酸的肽和典型肽的序列可以通过商业性肽合成公司合成或购买，例如美国肽公式，Bachem(美国)和Anygen(韩国)。
更加具体而言，胰岛素类似物可包括下文式1代表的SEQ ID NO：37的A链和下文式2代表的SEQ ID NO：38的B链。另外，胰岛素类似物可以是如下形式，其中A链和B链的序列通过二硫键连接到一起，但不限于此。
[式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa3-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa4-Cys-Asn(SEQ ID NO：37)
在上文式1中，
Xaa1为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa2为异亮氨酸或丙氨酸，
Xaa3为酪氨酸，谷氨酸，或天冬酰胺，且
Xaa4为酪氨酸或丙氨酸。
[式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa5-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：38)
在上文式2中，
Xaa5为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa6为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa7为苯丙氨酸或丙氨酸，且
Xaa8为苯丙氨酸或丙氨酸。
更加具体而言，胰岛素类似物可包括：
(i)A链，其中，在式1中，Xaa1为丙氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(ii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为丙氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为谷氨酸或天冬酰胺，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iv)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为丙氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(v)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为丙氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vi)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为丙氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；或
(viii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为丙氨酸，
但不限于此。
例如，那些与相应胰岛素类似物的序列具有70％或更高，具体而言80％或更高，更加具体而言90％或更高，和甚至更加具体而言95％或更高同源性，同时包含上文所述特征性氨基酸残基，且具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的肽包括在本发明的范围中。
如本文中使用的，术语“同源性”指就野生型蛋白质的氨基酸序列或编码它的多核苷酸序列而言的相似性水平，而且包括与本发明的氨基酸序列或多核苷酸序列具有上述百分比或更高相同序列的序列。这种同源性可以经肉眼比较来确定，或者可以经生物信息学算法来确定，它通过比对两种序列来分析同源性程度。两种氨基酸序列之间的同源性可以以百分比来指示。可使用有用的自动化算法，例如Wisconsin遗传学软件包(GeneticsComputer Group，Madison，WI，USA)的GAP，BESTFIT，和FASTA和TFASTA计算机软件模块。自动化比对算法包括Needleman和Wunsch，Pearson和Lipman，及Smith和Waterman的序列比对算法。算法和同源性的确定在软件中是自动化的，包括FASTP，BLAST，BLAST2，PSIBLAST，和CLUSTAL W。
在本发明的仍有另一个方面，提供了一种编码该胰岛素类似物的多核苷酸，一种包含该多核苷酸的表达载体，和一种包含该表达载体的转化体。
胰岛素类似物与上文所述相同。
多核苷酸是以单链或双链状态存在的脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)，而且意图包括基因组DNA，cDNA，和自其转录的RNA。作为基本构成单元，核苷酸不仅包括天然核苷酸，而且包括类似物，其中糖或碱基区域是经过修饰的(Scheit,NucleotideAnalogs,John Wiley,New York,1980；Uhlman and Peyman,Chemical Reviews,90:543-584,1990)。本发明的多核苷酸可以是通过标准分子生物学技术分离或制备的。例如，多核苷酸可以是经聚合酶链式反应(PCR)自天然胰岛素的基因序列(NM_000207.2，NCBI)扩增的，及使用自动化DNA合成仪通过标准合成技术制备的。在本发明中，术语多核苷酸可以与核酸互换使用。
编码胰岛素类似物的多核苷酸可以包括编码上文所述A链和B链氨基酸序列的多核苷酸，而且例子可以包括SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：21，SEQ ID NO：23，SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：33，和SEQ ID NO：35的多核苷酸，但不限于此。例如，在上文所述多核苷酸以外，那些与上述序列具有70％或更高，具体而言80％或更高，更加具体而言90％或更高，和甚至更加具体而言95％或更高同源性，同时具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的多核苷酸也包括在本发明的范围中。
依照本发明的重组载体可以构建成用于典型克隆或表达的载体，而且可以构建成用于真核细胞或原核细胞(作为宿主细胞)的载体。
如本文中使用的，术语“载体”指核酸构建物，作为能够在宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，它包含可操作连接的必需的调节因子，使得核酸***物能表达。本发明能制备包括编码调节因子的核酸的重组载体，而且本发明的胰岛素类似物可以经重组载体转化或转染入宿主细胞来获得。
在本发明中，编码胰岛素类似物的核酸可操作连接至启动子。如本文中使用的，术语“可操作连接”指核酸的表达调节序列(例如启动子，信号序列，核糖体结合区，转录终止序列，等)和不同核酸的序列之间的功能性连接，而且调节序列能通过连接来控制不同核酸的序列的转录和/或翻译。
如本文中使用的，术语“启动子”指编码区上游的非翻译核酸的序列，它包括聚合酶结合区且对于启动子下游的基因转录成mRNA具有起始活性，即位于mRNA转录起始区5’端，聚合酶结合以启动基因转录的DNA区。
例如，当本发明的载体是重组载体且采用原核细胞作为宿主细胞时，载体一般包括能够执行转录的强启动子(例如tac启动子，lac启动子，lacUV5启动子，lpp启动子，pLλ启动子，pRλ启动子，rac5启动子，amp启动子，recA启动子，SP6启动子，trp启动子，T7启动子，等)，核糖体结合区，和转录/翻译终止序列的序列。
另外，要在本发明中使用的载体可以通过操作本领域常用质粒(例如pSC101，pGV1106，pACYC177，ColE1，pKT230，pME290，pBR322，pUC8/9，pUC6，pBD9，pHC79，pIJ61，pLAFR1，pHV14，pGEX系列，pET系列，pPICZα系列，pUC19，等)，噬菌体(例如λgt4·λB，λ-Charon，λΔz1，M13，等)，或病毒(例如SV40，等)来构建。
另外，当本发明的载体是重组载体且采用真核细胞作为宿主细胞时，载体一般包括自哺乳动物细胞基因组衍生的启动子(例如金属硫蛋白启动子)或自哺乳动物病毒衍生的启动子(例如腺病毒晚期启动子，牛痘病毒7.5K启动子，SV40启动子，巨细胞病毒启动子，和HSV的tk启动子)，而且具有聚腺苷酸化序列(例如牛生长激素终止子和SV40衍生聚腺苷酸化序列)作为转录终止序列。
另外，本发明的重组载体包含选择标记，包括本领域常用的抗生素抗性基因。例如，可以使用对氨苄青霉素，庆大霉素，羧苄青霉素，氯霉素，链霉素，卡那霉素，遗传霉素，新霉素，和四环素具有抗性的基因。
为了便于容易纯化自重组载体收集的靶蛋白(即胰岛素类似物)，本发明的重组载体可以另外包含需要的其它序列。
载体中另外要包括的序列可以是用于蛋白质纯化的标签序列，例如谷胱甘肽S-转移酶(Pharmacia，USA)，麦芽糖结合蛋白(NEB，USA)，FLAG(IBI，USA)，六组氨酸(六个组氨酸)，等，但是靶蛋白纯化需要的序列的种类不限于此。
由重组载体表达的包含上文所述标签序列的融合蛋白可以经亲和层析来纯化。例如，当融合谷胱甘肽S-转移酶时，可使用谷胱甘肽作为该酶的底物，而当使用六组氨酸标签时，可以经Ni-NTA柱容易地收集期望的靶蛋白。
转化有载体的转化体可以使用包含编码胰岛素类似物的多核苷酸的重组载体来构建。
如本文中使用的，术语“转化”(其中将DNA导入宿主细胞，由此能够作为染色体外因子复制或完成染色体整合)指通过将外来DNA导入细胞来人为引起遗传变化的现象。
本发明中要使用的转化方法可以是任何用于转化的方法，而且可以依照本领域常规方法容易地实施转化。一般而言，转化方法可包括CaCl2沉淀法；Hanahan法，该方法使用二甲亚砜(DMSO)提高效率，二甲亚砜是CaCl2沉淀法中使用的还原性物质；电穿孔；磷酸钙沉淀法；胞质融合；使用碳化硅纤维的搅动法；农杆菌介导的转化；使用PEG的转化；硫酸葡聚糖法；Lipofectamine和干燥/抑制介导的转化；等。
用于包含编码依照本发明的胰岛素类似物的核酸的重组载体转化的方法不限于此，而且可以使用本领域常规用于转化或转染的任何方法，没有限制。
本发明的转化体可以通过将包含编码胰岛素类似物的核酸的重组载体导入宿主细胞来获得。
适合于本发明的宿主可以不受具体限制，只要宿主细胞能够表达本发明的核酸。宿主的例子可以包括埃希氏菌(Escherichia sp.)，诸如大肠埃希氏菌/大肠杆菌(E.coli)；芽孢杆菌(Bacillus sp.)，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；假单胞菌(Pseudomonas sp.)，诸如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)；酵母，诸如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)，啤酒糖酵母/酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，和粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；昆虫细胞，诸如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(SF9)；和动物细胞，诸如CHO，COS，BSC，等。优选地，使用大肠杆菌作为宿主细胞。
在本发明的仍有另一个方面，提供了一种配制剂，其能够延长胰岛素类似物的半衰期，提高生物利用度，或维持持久活性。
另外，本发明提供一种长效胰岛素，其特征在于能够延长半衰期的生物相容性物质连接至该胰岛素类似物。
另外，本发明提供一种缀合物，其具有下文化学式1。
[化学式1]
X-La-F；
其中X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，
L为接头，
a为0或自然数，前提是当a为2或更高时每个L彼此独立，且
F为能够延长胰岛素类似物的体内半衰期的物质。
胰岛素类似物与上文所述相同。
依照本发明的一个例示性实施方案，当使用胰岛素类似物来延长胰岛素的半衰期和提高胰岛素的生物利用度或应用于能够维持持久胰岛素活性的配制剂时，胰岛素类似物能展现与天然胰岛素相比半衰期和体内胰岛素活性方面的卓越改善。
特别是，在本发明的一个例示性实施方案中，当将能够延长体内半衰期的物质和胰岛素类似物连接到一起时，所得胰岛素类似物显示显著延长的体内半衰期。
能够延长胰岛素的半衰期，提高生物利用度，和维持持久活性的配制剂指包含直接与胰岛素类似物成共价键的载体的配制剂，或包含能够提高胰岛素类似物的体内活性的成分的配制剂。
如本文中使用的，术语“长效胰岛素”指其中能够延长半衰期的生物相容性物质连接至胰岛素类似物的物质。长效胰岛素具有与天然胰岛素相比延长半衰期的效果。
如本文中使用的，术语“生物相容性物质或能够延长半衰期的物质”指能连接至胰岛素类似物，由此延长胰岛素的半衰期的物质。如本文中使用的，术语能够延长半衰期的生物相容性物质可以与术语“载体”互换使用。
生物相容性物质或载体可包括任何物质，只要它们能连接至胰岛素类似物并延长胰岛素的半衰期，例如选自下组的物质：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物，但不限于此。生物相容性物质或载体可以经共价或非共价键连接至胰岛素类似物。
另外，将具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物连接至能延长体内半衰期的生物相容性物质或载体的方法可包括遗传重组技术，体外连接，等，但不限于任何具体连接方法。FcRn结合物质可以是免疫球蛋白Fc区，例如IgG Fc。
当使用聚乙二醇作为载体时，可包括Ambrx公司的重编码技术，它能够位置特异性附着聚乙二醇。也可以包括Neose Technologies公司的糖PEG化技术，它能够在聚糖的区域中特异性附着。另外，该方法可包括可释放PEG技术，它能够在身体中缓慢释放聚乙二醇，但是该方法不限于此。而且，也可以使用能够利用PEG提高生物利用度的方法。另外，也可以通过上述方法将诸如聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，和透明质酸等聚合物连接至胰岛素类似物。
当使用清蛋白作为载体时，可使用能够通过清蛋白或清蛋白片段和胰岛素类似物之间直接成共价键来提高体内稳定性的技术。另外，代替直接将清蛋白连接至胰岛素类似物，可以使用通过将能够结合清蛋白的物质(例如清蛋白特异性抗体或其抗体片段)连接至胰岛素类似物间接容许清蛋白连接至胰岛素类似物的技术，和将对清蛋白具有结合亲和力的特定肽/蛋白质(例如由Affibody AB经Albumod技术生成的清蛋白结合肽)连接至胰岛素类似物的技术，连接对清蛋白具有结合亲和力的脂肪酸诸如此类的技术，等，但是该方法不限于此。而且，可以使用任何能利用清蛋白改善体内稳定性的技术或连接方法，没有限制。
为了延长体内半衰期，使用抗体或其抗体片段作为载体的技术可包括在本发明的范围中。它可以是抗体或其包含FcRn结合区的抗体片段，或任何不包含FcRn结合区的抗体片段，诸如Fab，等。可包括CovX Research LLC利用催化性抗体的CovX-body技术。而且，利用免疫球蛋白Fc区延长体内半衰期的技术也可以包括在本发明的范围中。
当使用免疫球蛋白Fc区时，将Fc区连接至胰岛素类似物及其接头的方法可以是肽键和聚乙二醇诸如此类，但不限于此。而且，可使用任何化学连接方法。另外，Fc区和胰岛素类似物之间的连接比可以是1:1或1:2，但不限于此。
免疫球蛋白Fc区对于用作药物载体是安全的，因为它是体内代谢的生物可降解多肽。还有，免疫球蛋白Fc区具有与完整免疫球蛋白分子相比相对较低的分子量，因而它就制备，纯化，和缀合物的产率而言是有利的。免疫球蛋白Fc区不含Fab片段，由于依照抗体亚类的不同氨基酸序列，Fab片段是高度非同质的，因而可以预期免疫球蛋白Fc区可显著提高物质的同质性且在血液中抗原性较低。
如本文中使用的，术语“免疫球蛋白Fc区”指包含免疫球蛋白重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3)，不包含免疫球蛋白重和轻链可变区，重链恒定区1(CH1)和轻链恒定区1(CL1)的蛋白质。它可以在重链恒定区处进一步包含铰链区。还有，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含包含重链恒定区1(CH1)和/或轻链恒定区1(CL1)，不包含免疫球蛋白重和轻链可变区的Fc区的部分或整个，只要它具有与天然形式相比实质性相似或更好的效果。还有，它可以是在CH2和/或CH3的氨基酸序列的相对较长部分中具有删除的片段。
就是说，本发明的免疫球蛋白Fc区可以包含：1)CH1域，CH2域，CH3域，和CH4域，2)CH1域和CH2域，3)CH1域和CH3域，4)CH2域和CH3域，5)一个或多个域和免疫球蛋白铰链区(或部分铰链区)的组合，和6)重链恒定区每个域和轻链恒定区的二聚体。
而且，本发明的免疫球蛋白Fc区包括它的序列变体(突变体)，就像天然氨基酸序列一样。由于一个或多个氨基酸残基的删除，***，非保守或保守替代或其组合，氨基酸序列衍生物具有与天然氨基酸序列不同的序列。例如，在IgG Fc中，可以使用位置214至238，297至299，318至322，或327至331处已知在结合中重要的氨基酸残基作为修饰的合适靶点。
另外，其它各种种类的变体是可能的，包括删除能够形成二硫键的区域，删除天然Fc形式N端的数个氨基酸残基，或在天然Fc形式N端添加甲硫氨酸残基的变体。而且，为了去除效应器功能，补体结合位点，诸如C1q结合位点和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)位点中可发生删除。制备免疫球蛋白Fc区的此类序列衍生物的技术披露于WO 97/34631和WO 96/32478。
蛋白质和肽中一般不改变分子活性的氨基酸交换是本领域已知的(H.Neurath,R.L.Hill,The Proteins,Academic Press,New York,1979)。最常发生的交换是Ala/Ser，Val/Ile，Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Ser/Gly，Thy/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Asp/Asn，Leu/Ile，Leu/Val，Ala/Glu，Asp/Gly，双向。
需要时，可以通过磷酸化，硫酸化，丙烯化，糖基化，甲基化，法尼基化，乙酰化，酰胺化，诸如此类来修饰Fc区。
上述Fc衍生物是具有与本发明的Fc区相同的生物学活性或改善的针对热，pH，诸如此类的结构稳定性的衍生物。
另外，这些Fc区可以自天然形式(自人和其它动物，包括牛，山羊，猪，小鼠，家兔，仓鼠，大鼠，和豚鼠分离)获得，或者可以是自经转化动物细胞或微生物获得的其重组体或衍生物。在这里，它们可以是通过自人或动物生物体分离完整免疫球蛋白，并用蛋白水解酶处理它们自天然免疫球蛋白获得的。木瓜蛋白酶将天然免疫球蛋白消化成Fab和Fc区，而胃蛋白酶处理导致pF’c和F(ab)2生成。可以对这些片段进行大小排阻层析以分离Fc或pF’c。
优选地，人衍生的Fc区是自微生物获得的重组免疫球蛋白Fc区。
另外，免疫球蛋白Fc区可以是具有天然糖链，与天然形式相比延长的糖链或与天然形式相比缩短的糖链的形式，或者可以是去糖基化形式。免疫球蛋白Fc糖链的延长，缩短，或去除可以通过本领域常用方法来实现，诸如化学方法，酶方法和使用微生物的遗传工程方法。在这里，自Fc区去除糖链导致对补体(c1q)的结合亲和力急剧降低及抗体依赖性细胞介导的细胞毒性或补体依赖性细胞毒性降低或丧失，由此在体内不诱导不必要的免疫应答。在这点上，去糖基化或无糖基化形式的免疫球蛋白Fc区可能更加适合于本发明作为药物载体的目的。
如本文中使用的，术语“去糖基化”表示自Fc区酶促去除糖模块，而术语“无糖基化”表示由原核生物，优选大肠杆菌以未糖基化形式生成Fc区。
另一方面，免疫球蛋白Fc区可以衍生自人或其它动物，包括牛，山羊，猪，小鼠，家兔，仓鼠，大鼠，和豚鼠，优选人。另外，免疫球蛋白Fc区可以是自IgG，IgA，IgD，IgE，和IgM衍生的Fc区，或者是通过其组合体或其杂合体生成的。优选地，它衍生自IgG或IgM，它们是人血液中最丰富的蛋白质之一。最优选地，它衍生自IgG，已知它延长配体结合蛋白的半衰期。
另一方面，如本文中使用的，术语“组合”表示相同起源的单链免疫球蛋白Fc区的多肽连接至不同起源的单链多肽以形成二聚体或多聚体。就是说，二聚体或多聚体可以是自两个或更多个选自下组的片段形成的：IgG Fc，IgA Fc，IgM Fc，IgD Fc，和IgE Fc片段。
如本文中使用的，术语“杂合”表示单链免疫球蛋白Fc区中存在编码不同起源的两个或更多个免疫球蛋白Fc区的序列。在本发明中，各种类型的杂合体是可能的。就是说，域杂合体可以由一个至四个选自下组的域构成：IgG Fc，IgM Fc，IgA Fc，IgE Fc，和IgD Fc的CH1，CH2，CH3，和CH4，而且可以包括铰链区。
另一方面，IgG分成IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4亚类，而本发明包括它们的组合体和杂合体。优选IgG2和IgG4亚类，最优选罕见具有效应器功能诸如补体依赖性细胞毒性(CDC)的IgG4的Fc区。就是说，作为本发明的药物载体，最优选的免疫球蛋白Fc区是人IgG4衍生的非糖基化Fc区。人衍生的Fc区比非人衍生的Fc区更加优选，非人衍生的Fc区在人体中可能起抗原作用并引起不想要的免疫应答，诸如针对抗原的新抗体生成。
为了延长体内半衰期，将肽或蛋白质片段连接至胰岛素类似物的技术也可以包括在本发明的范围中。要使用的肽或蛋白质片段可以是特定氨基酸序列的重复单元的弹性蛋白样多肽(ELP)，而且Versartis公司利用人工多肽的Xten技术也包括在本发明的范围中。另外，还包括Zealandd利用多赖氨酸延长体内半衰期的结构诱导探针(SIP)技术和ProlorBiotech Inc.的CTP融合技术。而且，还可以包括运铁蛋白(已知它具有高体内稳定性)，纤连蛋白(它是***的构成成分)，它们的衍生物，等。要连接至胰岛素类似物的肽或蛋白质不限于上述，而是任何能延长胰岛素类似物的体内半衰期的肽或蛋白质可以包括在本发明的范围中。
另外，要用于延长体内半衰期的载体可以是非肽物质，诸如多糖或脂肪酸，等。
具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物和能延长胰岛素类似物的体内半衰期的载体可以经接头连接。
接头可以是肽接头或非肽接头，而且例如可以是选自下组的：聚乙二醇，脂肪酸，糖，聚合物，低分子量化合物，核苷酸，及其组合。
聚合物可以是选自下组的非肽接头：聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，寡核苷酸，及其组合，但不限于此。生物可降解聚合物可以包括诸如聚乳酸(PLA)和聚乳酸-乙醇酸(PLGA)等生物可降解聚合物。
本发明的非肽接头不仅可以包括上文所述那些，而且可以包括它们的本领域公知衍生物。而且本领域技术内能容易制备的那些也包括在本发明的范围中。
通过接头的连接可以是任何化学键，诸如共价化学键或非共价化学键，没有限制。
更加具体而言，在本发明中，非肽聚合物表示包含两个或更多个彼此连接的重复单元的生物相容性聚合物，其中重复单元通过除肽键以外的任何共价键连接。此类非肽聚合物可以具有两个末端或三个末端。
通过常规同框融合方法获得的融合蛋白中使用的肽接头具有在身体中容易受到蛋白水解酶切割的缺点，因而预期不能通过载体获得延长活性药物的血液半衰期的充足效果。然而，在本发明中，缀合物可以使用非肽接头来制备，就像肽接头一样。在非肽接头中，可以使用对蛋白水解酶具有抗性的聚合物来维持肽的血液半衰期与载体的血液半衰期相似。因此，可以使用任何非肽聚合物，没有限制，只要它是具有上述功能的聚合物，也就是对体内蛋白水解酶具有抗性的聚合物。非肽聚合物具有范围为1kDa至100kDa，优选1kDa至20kDa的分子量。
另外，本发明连接至免疫球蛋白Fc区的非肽聚合物可以是一种聚合物或多种不同聚合物的组合。
本发明中使用的非肽聚合物具有能够结合至免疫球蛋白Fc区和蛋白质药物的反应性基团。
非肽聚合物在两个末端均具有反应性基团，优选选自下组：反应性醛基团，丙醛基团，丁醛基团，马来酰亚胺基团和琥珀酰亚胺衍生物。琥珀酰亚胺衍生物可以是丙酸琥珀酰亚胺基酯，羟基琥珀酰亚胺基，琥珀酰亚胺基羧甲基，或碳酸琥珀酰亚胺基酯。特别是，当非肽聚合物在其两个末端均具有反应性醛基团时，它以最低限度非特异性反应在两个末端有效连接生理学活性多肽和免疫球蛋白。通过醛键通过还原性烷基化生成的终产物比通过酰胺键的连接稳定得多。醛反应性基团在低pH选择性结合至N端，而在高pH(诸如pH 9.0)结合至赖氨酸残基形成共价键。
非肽聚合物的两个末端处的反应性基团可以彼此相同或不同。例如，非肽聚合物可以拥有一个末端处的马来酰亚胺基团和另一个末端处的醛基团，丙醛基团，或丁醛基团。当使用在其两个末端均具有反应性羟基基团的聚乙二醇作为非肽聚合物时，可以通过已知化学反应将羟基基团活化成各种反应性基团，或者可以使用商品化的具有修饰的反应性基团的聚乙二醇来制备本发明的单链胰岛素类似物缀合物。
另外，当胰岛素类似物和生物相容性物质通过接头彼此连接时，非肽接头的每个末端可以分别连接至生物相容性物质和胰岛素类似物的胺基团或硫醇基团。
在一个更加例示性实施方案中，胰岛素类似物和生物相容性物质可以通过***它们之间的接头连接，而且生物相容性物质可以是FcRn结合物质，其中接头是肽接头或选自下组的非肽接头：聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，及其组合。
同时，能提高生物利用度或维持持久活性的配制剂可以包括利用PLGA，透明质酸，壳聚糖，等的微粒和纳米颗粒的持续释放配制剂。
另外，能提高生物利用度或维持持久活性的其它形式配制剂的例子可以包括植入物，吸入，和鼻用配制剂，和贴剂。
本发明的胰岛素类似物缀合物能维持常规胰岛素的体内活性(诸如能量代谢和糖代谢)，而且还延长胰岛素类似物的血液半衰期及显著提高该肽的体内功效的持久性。因此，缀合物在治疗糖尿病中是有用的。
在本发明的另一个例示性实施方案中，提供了一种用于制备长效胰岛素的方法，其包括(a)分别制备(i)胰岛素类似物和(ii)选自下组的生物相容性物质：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物；并(b)将该胰岛素类似物连接至该生物相容性物质。
胰岛素类似物，生物相容性物质，和长效胰岛素与上文所述相同。
在另一个方面，本发明提供一种长效胰岛素配制剂，其包含胰岛素类似物缀合物。长效胰岛素配制剂可以是具有升高的体内持久性和稳定性的长效胰岛素配制剂。长效配制剂可以是用于治疗糖尿病的药物配制剂，但不限于此。
包含本发明缀合物的药物组合物可以包含药学可接受载剂。对于口服施用，药学可接受载剂可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂，矫味剂，诸如此类。对于可注射制剂，药学可接受载剂可以包括缓冲剂，防腐剂，镇痛剂，增溶剂，等张剂，和稳定剂。对于表面施用的制剂，药学可接受载剂可以包括基质，赋形剂，润滑剂，防腐剂，等。本发明的药物组合物可以与上述药学可接受载剂组合配制成各种剂量形式。例如，对于口服施用，药物组合物可以配制成片剂，锭剂，胶囊剂，酏剂，悬浮液，糖浆剂，或糯米纸囊剂。对于可注射制剂，药物组合物可以配制成单剂安瓿或多剂容器。药物组合物还可以配制成溶液，悬浮液，片剂，丸剂，胶囊剂，和持续释放制剂。
另一方面，适合于配制剂的载剂，赋形剂，和稀释剂的例子包括乳糖，右旋糖/葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，***树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟基苯甲酸丙酯，滑石，硬脂酸镁，矿物油，等。
另外，药物配制剂可以进一步包含填充剂，抗凝结剂，润滑剂，湿润剂，矫味剂，消毒剂，等。
在仍有另一个方面，本发明提供一种用于治疗胰岛素相关疾病的方法，其包括对有此需要的受试者施用胰岛素类似物或胰岛素类似物缀合物。
依照本发明的缀合物在治疗糖尿病中是有用的。因此，可以通过施用包含它的药物组合物来治疗该疾病。
如本文中使用的，术语“施用”指通过某种合适方法将预定的物质导入患者。本发明的缀合物可以经任何常用路径来施用，只要它能够到达期望组织。可以实施腹膜内，静脉内，肌肉内，皮下，皮内，口服，表面，鼻内，肺内，和直肠内施用，但是本发明不限于此。然而，既然肽在口服施用后受到消化，那么用于口服施用的组合物的活性组分应当有包衣或配制成针对胃中的降解受到保护。优选地，本发明组合物可以以可注射形式施用。另外，药物组合物可以使用能够将活性组分运输入靶细胞的某种装置来施用。
而且，本发明的药物组合物可以根据数个相关因素来确定，包括要治疗的疾病的类型，施用路径，患者的年龄，性别，和重量，和疾病的严重程度，以及作为活性成分的药物的类型。既然本发明的药物组合物具有卓越的体内持久性和滴度，那么它具有大大降低本发明药物配制剂施用频率的优点。
实施例
下面，会参照实施例更为详细地描述本发明。然而，这些实施例仅仅出于例示目的，本发明不受这些实施例限制。
实施例1：单链胰岛素类似物表达载体的制备
为了使用天然胰岛素表达载体作为模板制备胰岛素类似物(它们每种在A链或B链中具有一个经修饰氨基酸)，合成正向和反向寡核苷酸(表2)，然后进行PCR以扩增每种类似物基因。
下面的表1中给出了A链或B链中经过修饰的氨基酸序列及类似物名称。就是说，类似物1代表A链的第1位甘氨酸用丙氨酸替代，而类似物4代表B链第8位甘氨酸用丙氨酸替代。
表1
类似物 经过修饰的序列
类似物1 A1G-＞A
类似物2 A2I-＞A
类似物3 A19Y-＞A
类似物4 B8G-＞A
类似物5 B23G-＞A
类似物6 B24F-＞A
类似物7 B25F-＞A
类似物8 A14Y-＞E
类似物9 A14Y-＞N
下面的表2中给出了用于胰岛素类似物扩增的引物。
表2
在95℃30秒，55℃30秒，和68℃6分，18个循环的条件下进行用于扩增胰岛素类似物的PCR反应。将在上述条件下获得的胰岛素类似物片段***pET22b载体(要作为细胞内包涵体表达)，并将所得表达载体命名为pET22b-胰岛素类似物1至9。表达载体包含处于T7启动子控制下的编码胰岛素类似物1至9的氨基酸序列的核酸，而且在宿主细胞中作为包涵体表达胰岛素类似物蛋白质。
下面的表3中给出了胰岛素类似物1至9的DNA序列和蛋白质序列。
表3
实施例2：重组胰岛素类似物融合肽的表达
在T7启动子控制下进行重组胰岛素类似物的表达。用每种重组胰岛素类似物表达载体转化大肠杆菌BL21-DE3(大肠杆菌B F-dcm ompT hsdS(rB-mB-)galλDE3；Novagen)。依照推荐的方案(Novagen)实施转化。收集经每种重组表达载体转化的单菌落，在含有氨苄青霉素(50μg/mL)的2X Luria Broth(LB)中接种，并于37℃温育15小时。以1:1(v/v)的比率混合重组株培养液和含有30％甘油的2X LB培养基。在每个冷冻管中分配1mL，并保存于-140℃，用作用于生产重组融合蛋白的细胞储液。
为了表达重组胰岛素类似物，融化1管每种细胞储液，在500mL 2X Luria Broth中接种，并于37℃摇动培养14小时至16小时。当OD600达到5.0或更高时，终止培养。使用该培养液作为种子培养液。将此种子培养液接种至装有17L发酵培养基的50L发酵罐(MSJ-U2，B.E.MARUBISHI，日本)，并开始初始分批发酵。培养条件维持于温度37℃，空气流速20L/min(1vvm)，搅动速度500rpm，和pH 6.70(使用30％氨溶液)。当培养液中的营养物耗尽时，通过添加补料溶液以补料-分批模式进行发酵。通过OD值来监测菌株的生长。当OD值超出100时，以终浓度500μM添加IPTG。添加后，再进行培养约23小时至25小时。终止培养后，通过离心收获重组株，并保存于-80℃直至使用。
实施例3：重组胰岛素类似物的回收和重折叠
为了将实施例2中表达的重组胰岛素类似物变成可溶性形式，破坏细胞，接着重折叠。在1L裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 9.0)，1mM EDTA(pH 8.0)，0.2M NaCl和0.5％Triton X-100)中重悬浮100g(湿重)细胞团粒。使用微流化处理仪M-110EH(AC TechnologyCorp，M1475C型)以操作压力15,000psi破坏细胞。将如此破坏的细胞裂解物于4℃以7,000rpm离心20分。丢弃上清液，并在3L清洗缓冲液(0.5％Triton X-100和50mM Tris-HCl(pH 8.0)，0.2M NaCl，1mM EDTA)中重悬浮团粒。于4℃以7,000rpm离心20分后，在蒸馏水中重悬浮细胞团粒，接着以相同方式离心。在400mL缓冲液(1M甘氨酸，3.78g半胱氨酸-HCl，pH10.6)中重悬浮如此获得的团粒，并于室温搅动1小时。为了回收如此重悬浮的重组胰岛素类似物，添加400mL 8M脲，并于40℃搅动1小时。为了溶解的重组胰岛素类似物重折叠，于4℃以7,000rpm进行离心30分，并收集上清液。使用蠕动泵以流速1000mL/hr对其添加7.2L蒸馏水，同时于4℃搅动16小时。
实施例4：阳离子结合层析纯化
将重折叠的样品加载到用含有45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的Source S(GE healthcare)柱上，然后用0％至100％含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液的线性梯度在10个柱体积中洗脱胰岛素类似物蛋白质。
实施例5：胰蛋白酶和羧肽酶B处理
使用脱盐柱自洗脱的样品去除盐，并用缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 8.0)交换缓冲液。就获得的样品蛋白质而言，添加对应于1000摩尔比的胰蛋白酶和对应于2000摩尔比的羧肽酶B，然后于16℃搅动16小时。为了终止反应，使用1M柠檬酸钠(pH 2.0)将pH降至3.5。
实施例6：阳离子结合层析纯化
将如此反应的样品加载到用含有45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液平衡的Source S(GE healthcare)柱上，然后用0％至100％含有0.5M氯化钾和45％乙醇的20mM柠檬酸钠(pH 2.0)缓冲液的线性梯度在10个柱体积中洗脱胰岛素类似物蛋白质。
实施例7：阴离子结合层析纯化
使用脱盐柱自洗脱的样品去除盐，并用缓冲液(10mM Tris-HCl，pH 7.5)交换缓冲液。为了自实施例6中获得的样品分离纯的胰岛素类似物，将样品加载到用10mM Tris(pH7.5)缓冲液平衡的阴离子交换柱(Source Q：GE healthcare)上，并用0％至100％含有0.5M氯化钾的10mM Tris(pH 7.5)缓冲液的线性梯度在10个柱体积中洗脱胰岛素类似物蛋白质。
通过蛋白质电泳(SDS-PAGE，图1)和高压层析(HPLC)(图2)分析如此纯化的胰岛素类似物的纯度，并通过肽图(图3)和每个峰的分子量分析来鉴定氨基酸修饰。
结果是，发现每种胰岛素类似物在其氨基酸序列中具有期望的修饰。
实施例8：胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物的制备
为了使用3.4K ALD2PEG(NOF，日本)PEG化胰岛素类似物β链的N端，将胰岛素类似物和PEG以1:4的摩尔比于4℃反应约2小时，胰岛素类似物浓度为5mg/mL。此时，在50mM柠檬酸钠(pH 6.0)和45％异丙醇中实施反应。添加3.0mM氰基硼氢钠作为还原剂，并容许反应。使用含有柠檬酸钠(pH 3.0)和45％乙醇，和KCl浓度梯度的缓冲液用SP-HP(GEHealthcare，美国)柱纯化反应溶液。
为了制备胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物，将经纯化的单PEG化胰岛素类似物和免疫球蛋白Fc片段以1:1至1:2的摩尔比于25℃反应13小时，总蛋白质浓度为约20mg/mL。此时，反应缓冲液条件是100mM HEPES(pH 8.2)，并对其添加20mM氰基硼氢钠作为还原剂。因此，PEG结合至Fc片段的N端。
终止反应后，将反应溶液加载到Q HP(GE Healthcare，美国)柱到上用Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液和NaCl浓度梯度分出并纯化未反应免疫球蛋白Fc片段和单PEG化胰岛素类似物。
此后，使用Source 15ISO(GE Healthcare，美国)作为第二个柱来去除剩余的免疫球蛋白Fc片段和其中两个或更多个胰岛素类似物连接至免疫球蛋白Fc片段的缀合物，由此获得胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc片段缀合物。此时，使用含有硫酸铵浓度梯度的Tris-HCl(pH 7.5)进行洗脱，并通过蛋白质电泳(SDS-PAGE，图4)和高压层析(HPLC)(图5)分析如此洗脱的胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物。
结果，发现缀合物具有几乎99％的纯度。
实施例9：天然胰岛素，胰岛素类似物，天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物，和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物之间胰岛素受体结合亲和力的比较
为了测量胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的胰岛素受体结合亲和力，使用表面等离振子共振(SPR，BIACORE 3000，GE healthcare)进行分析。在CM5芯片上通过胺偶联来固定化胰岛素受体，并对其独立应用天然胰岛素，胰岛素类似物，天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物，和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的5种或更多种稀释液。然后，检查每种物质的胰岛素受体结合亲和力。使用BIAevaluation软件计算每种物质的结合亲和力。此时，所使用的模型是带有基线位移的1:1Langmuir结合。
结果，与人胰岛素相比，胰岛素类似物(No.6)显示14.8％的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.7)显示9.9％的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.8)显示57.1％的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.9)显示78.8％的受体结合亲和力，天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物根据实验运行显示3.7％至5.9％的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.6)-免疫球蛋白Fc缀合物显示0.9％或更少的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物显示1.9％的受体结合亲和力，胰岛素类似物(No.8)-免疫球蛋白Fc缀合物显示1.8％的受体结合亲和力，而胰岛素类似物(No.9)-免疫球蛋白Fc缀合物显示3.3％的受体结合亲和力(表4)。如此，观察到本发明的胰岛素类似物具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力，而且胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物也具有显著降低的胰岛素受体结合亲和力。
表4：胰岛素受体结合亲和力的比较
实施例10：天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物之间体外功效的比较
为了评估胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的体外功效，使用小鼠衍生的已分化3T3-L1脂肪细胞来测试葡萄糖摄取或脂质合成。一周两次或三次在含有10％NBCS(新生小牛血清)的DMEM(Dulbeco氏改良Eagle氏培养基，Gibco，产品目录号12430)中传代培养3T3-L1细胞，并维持。在分化培养基(含有10％FBS的DMEM)中悬浮3T3-L1细胞，然后在48孔盘中以每孔5x 104个的密度接种，并培养48小时。为了脂肪细胞分化，将1μg/mL人胰岛素(Sigma，产品目录号I9278)，0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，Sigma，产品目录号I5879)，和1μM***(Sigma，产品目录号D4902)与分化培养基混合，并在去除先前的培养基后对每个孔添加250μL混合物。48小时后，用只补充有1μg/mL人胰岛素的分化培养基更换培养基。此后，在每48小时用补充有1μg/mL人胰岛素的分化培养基更换培养基的同时，检查脂肪细胞分化的诱导7天至9天。为了测试葡萄糖摄取，用无血清DMEM培养基清洗已分化的细胞一次，然后添加250μL以诱导血清耗尽4小时。使用无血清DMEM培养基进行人胰岛素10μM至0.01μM及天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物20μM至0.02μM的10倍连续稀释。将250μL每种如此制备的样品添加至细胞，并在5％CO2温箱中于37℃培养24小时。为了测量温育后培养基中葡萄糖的残留量，取200μL培养基并用D-PBS稀释5倍，接着是GOPOD测定法(GOPOD测定法试剂盒，Megazyme，产品目录号K-GLUC)。基于葡萄糖标准溶液的吸光度，换算培养基中剩余的葡萄糖的浓度，并计算天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的葡萄糖摄取的EC50值。
结果，与人胰岛素相比，天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物显示11.6％的葡萄糖摄取，胰岛素类似物(No.6)-免疫球蛋白Fc缀合物显示0.43％的葡萄糖摄取，胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物显示1.84％的葡萄糖摄取，胰岛素类似物(No.8)-免疫球蛋白Fc缀合物显示16.0％的葡萄糖摄取，胰岛素类似物(No.9)-免疫球蛋白Fc缀合物显示15.1％的葡萄糖摄取(表5)。
如此，观察到本发明的胰岛素类似物(No.6)-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物(No.7)-免疫球蛋白Fc缀合物具有与天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物相比显著降低的体外滴度，而胰岛素类似物(No.8)-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物(No.9)-免疫球蛋白Fc缀合物具有与天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物相似的体外滴度。
表5
实施例11：胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的药动学
为了检查胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的药动学，在已经适应实验室5天的正常大鼠(6周龄，雄性SD大鼠)中比较它们随时间的血液浓度。分别皮下注射21.7nmol/kg天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和65.1nmol/kg胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物。在0，1，4，8，24，48，72，96，120，144，168，192，和216小时时收集血液。在每个时间点，使用胰岛素ELISA试剂盒(ALPCO，USA)通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测量天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的血液浓度。然而，使用小鼠抗人IgG4-HRP缀合物(Alpha Diagnostic Intl，Inc，美国)作为检测抗体。
检查天然胰岛素-免疫球蛋白Fc缀合物和胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物的药动学的结果显示它们的血液浓度与它们的施用浓度成比例升高，而且具有低胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物-免疫球蛋白Fc缀合物显示与天然胰岛素-Fc缀合物相比高度延长的半衰期(图6)。
这些结果提示当本发明经过修饰具有降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物连接至免疫球蛋白Fc区以制备缀合物时，由于显著延长的体内血液半衰期，能作为稳定的胰岛素配制剂提供缀合物，从而有效用作糖尿病的治疗剂。
根据上文，本发明所属领域的技术人员会能够理解，本发明可以在不改变本发明的技术概念或必要特征的情况下体现为其它具体形式。在这点上，本文中公开的例示性实施方案仅仅出于例示目的，不应解读为限制本发明的范围。相反，本发明意图不仅涵盖例示性实施方案，而且涵盖所附权利要求书中限定的本发明的精神和范围内可包括的各种备选，修改，等同和其它实施方案。

Claims (32)

1.一种胰岛素类似物，其具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力。
2.权利要求1的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物具有与天然胰岛素相比延长10％或更高的半衰期。
3.权利要求1的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物在天然胰岛素的至少一个氨基酸中具有突变或删除。
4.权利要求3的胰岛素类似物，其中胰岛素B链位置1至3，5，8，10，12，16，和23至30处和胰岛素A链位置1，2，5，8，10，12，14，16至19，和21处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的或删除的。
5.权利要求4的胰岛素类似物，其中胰岛素B链位置8和23至25处和胰岛素A链位置1，2，14，和19处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的。
6.权利要求4的胰岛素类似物，其中替代所用氨基酸选自下组：丙氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和天冬氨酸。
7.权利要求4的胰岛素类似物，其中由于天然胰岛素A链或B链至少一个氨基酸中的删除，该胰岛素类似物具有降低的胰岛素受体结合亲和力。
8.权利要求1的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物包括下文式1代表的SEQ ID NO:37的A链和下文式2代表的SEQ ID NO:38的B链：
[式1]
Xaa1-Xaa2-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Xaa3-Gln-Leu-Glu-Asn-Xaa4-Cys-Asn(SEQ ID NO:37)
其中：
Xaa1为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa2为异亮氨酸或丙氨酸，
Xaa3为酪氨酸，谷氨酸，或天冬酰胺，且
Xaa4为酪氨酸或丙氨酸；且
[式2]
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Xaa5-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr(SEQ ID NO：38)其中：
Xaa5为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa6为甘氨酸或丙氨酸，
Xaa7为苯丙氨酸或丙氨酸，且
Xaa8为苯丙氨酸或丙氨酸。
9.权利要求8的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物包含：
(i)A链，其中，在式1中，Xaa1为丙氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(ii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为丙氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为谷氨酸或天冬酰胺，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(iv)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为丙氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(v)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为丙氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vi)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为丙氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；
(vii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为丙氨酸，且Xaa8为苯丙氨酸；或
(viii)A链，其中，在式1中，Xaa1为甘氨酸，Xaa2为异亮氨酸，Xaa3为酪氨酸，且Xaa4为酪氨酸；和B链，其中，在式2中，Xaa5为甘氨酸，Xaa6为甘氨酸，Xaa7为苯丙氨酸，且Xaa8为丙氨酸。
10.一种多核苷酸，其编码依照权利要求1至9任一项的胰岛素类似物。
11.一种表达载体，其包含权利要求10的多核苷酸。
12.一种转化体，其包含权利要求10的表达载体，除人以外。
13.一种长效胰岛素，其中能够延长半衰期的生物相容性物质连接至依照权利要求1至9任一项的胰岛素类似物。
14.权利要求13的长效胰岛素，其中该生物相容性物质选自下组：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物。
15.权利要求13的长效胰岛素，其中该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过肽键彼此连接。
16.权利要求13的长效胰岛素，其中该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过选自下组的接头连接：聚乙二醇，脂肪酸，糖，聚合物，低分子量化合物，核苷酸，及其组合。
17.权利要求13的长效胰岛素，其中该胰岛素类似物和该生物相容性物质通过***它们之间的接头连接，且该生物相容性物质是FcRn结合物质，其中该接头是肽接头或选自下组的非肽接头：聚乙二醇，聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，及其组合。
18.权利要求17的长效胰岛素，其中该FcRn结合物质是包含免疫球蛋白Fc区的多肽。
19.权利要求17的长效胰岛素，其中该非肽接头的每个末端分别连接至该生物相容性物质和该胰岛素类似物的胺基团或硫醇基团。
20.一种用于制备长效胰岛素的方法，其包括：
(a)分别制备(i)胰岛素类似物和(ii)选自下组的生物相容性物质：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***或其衍生物，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物；并
(b)将该胰岛素类似物连接至该生物相容性物质。
21.下文化学式1的缀合物：
[化学式1]
X-La-F；
其中X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，
L为接头，
a为0或自然数，前提是当a为2或更高时每个L彼此独立，且
F为能够延长胰岛素类似物的体内半衰期的物质。
22.权利要求21的缀合物，其中X为具有与天然胰岛素相比降低的胰岛素受体结合亲和力的胰岛素类似物，其中该胰岛素类似物在胰岛素A链或B链的至少一个氨基酸中具有突变或删除。
23.权利要求21的缀合物，其中，在该胰岛素类似物中，胰岛素B链位置1至3，5，8，10，12，16，和23至30处和胰岛素A链位置1，2，5，8，10，12，14，16至19，和21处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代或删除的。
24.权利要求23的缀合物，其中，在该胰岛素类似物中，胰岛素B链位置8和23至25处和胰岛素A链位置1，2，14，和19处的一个或多个氨基酸是用其它氨基酸替代的。
25.权利要求23的缀合物，其中替代所用氨基酸选自下组：丙氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，异亮氨酸，缬氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，赖氨酸，组氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，和天冬氨酸。
26.权利要求21的缀合物，其中该能够延长胰岛素类似物的体内半衰期的物质选自下组：聚乙二醇，脂肪酸，胆固醇，清蛋白及其片段，清蛋白结合物质，特定氨基酸序列的重复单元的多聚体，抗体，抗体片段，FcRn结合物质，体内***，核苷酸，纤连蛋白，运铁蛋白，糖，和聚合物。
27.权利要求21的缀合物，其中L选自下组：肽，聚乙二醇，脂肪酸，糖，聚合物，低分子量化合物，核苷酸，及其组合。
28.权利要求21的缀合物，其中X和F经由共价化学键，非共价化学键，或其组合通过L连接。
29.权利要求27的缀合物，其中该聚合物为选自下组的非肽接头：聚丙二醇，乙二醇-丙二醇共聚物，聚氧乙烯化多元醇，聚乙烯醇，多糖，葡聚糖，聚乙烯醚，生物可降解聚合物，脂质聚合物，几丁质，透明质酸，寡核苷酸，及其组合。
30.权利要求21的缀合物，其中F为IgG Fc区。
31.一种长效胰岛素配制剂，其具有改善的体内持久性和稳定性，包含依照权利要求21至30任一项的缀合物。
32.一种长效胰岛素配制剂，其用于治疗糖尿病，包含依照权利要求21至30任一项的缀合物。
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