EA036714B1 - Частичные агонисты инсулинового рецептора - Google Patents

Частичные агонисты инсулинового рецептора Download PDF

Info

Publication number
EA036714B1
EA036714B1 EA201791117A EA201791117A EA036714B1 EA 036714 B1 EA036714 B1 EA 036714B1 EA 201791117 A EA201791117 A EA 201791117A EA 201791117 A EA201791117 A EA 201791117A EA 036714 B1 EA036714 B1 EA 036714B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
insulin
linker
group
chain
moiety
Prior art date
Application number
EA201791117A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201791117A1 (ru
Inventor
Суннянь Линь
Линь Янь
Пэй Хо
Дмитрий Писсарницки
Даньцин Фэн
Рави Наргунд
Юйпин Чжу
Ахмет Кекедж
Кристина Б. Мадсен-Дугган
Чжи-цай Ши
Чжицай У
Инцзюнь Му
Original Assignee
Мерк Шарп И Доум Корп.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Мерк Шарп И Доум Корп. filed Critical Мерк Шарп И Доум Корп.
Publication of EA201791117A1 publication Critical patent/EA201791117A1/ru
Publication of EA036714B1 publication Critical patent/EA036714B1/ru

Links

Classifications

    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22Hormones
    • A61K38/28Insulins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/55Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound the modifying agent being also a pharmacologically or therapeutically active agent, i.e. the entire conjugate being a codrug, i.e. a dimer, oligomer or polymer of pharmacologically or therapeutically active compounds
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/62Insulins
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K2319/00Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Раскрыты димеры инсулинов и димеры аналогов инсулина, которые действуют на инсулиновый рецептор как частичные агонисты.

Description

Перекрестная ссылка на родственные заявки
Уровень техники изобретения (1) Область техники, к которой относится изобретение.
Изобретение относится к димерам инсулинов и димерам аналогов инсулина, которые действуют на инсулиновый рецептор как частичные агонисты.
(2) Описание предшествующего уровня техники.
Инсулин является основной терапией для пациентов с сахарным диабетом типа 1 (T1DM) и многих пациентов с сахарным диабетом типа 2 (T2DM), назначаемой почти одной трети пациентов в США из всех пользователей противодиабетических препаратов за последнее десятилетие. Мировой рынок инсулинов в 2013 году составил 20,4 миллиардов долларов США и растет быстрее, чем все другие противодиабетические средства вместе взятые. Тем не менее, проблемы современных методов лечения инсулином, включая узкий TI до гипогликемии и увеличение массы тела, ограничивают их более широкое применение и возможность для пациентов достичь идеального контроля гликемии.
В дополнение к секреции прандиального инсулина в ответ на питание поджелудочная железа высвобождает инсулин с базальной скоростью, определяемой в основном уровнями глюкозы в плазме, для поддержания соответствующей регуляции уровня глюкозы натощак. Это достигается главным образом за счет контроля высвобождения глюкозы в печени посредством гепатозащитного действия эндогенного инсулина. Современные аналоги инсулина включают быстродействующие и базальные инсулины, а также их смеси. Быстродействующие аналоги инсулина (RAA) разработаны для контроля гипергликемии после приема пищи, тогда как инсулины с большой продолжительностью действия регулируют базальные уровни глюкозы. Инсулины длительного действия используют все T1DM (в комбинации с прандиальными инъекциями) и большинство пациентов с T2DM начинают терапию инсулином с базального продукта. Потребление базального инсулина быстро растет, так как во всем мире увеличивается популяция больных диабетом (особенно T2DM).
Несмотря на постоянные усилия по разработке в течение последних нескольких десятилетий доступные инсулины длительного действия все еще не оптимизированы по сравнению с физиологическим базальным инсулином. Частично это объясняется тем, что основное внимание уделялось улучшению линейности ФК этих аналогов, но не устранению относительной избыточной инсулинизации периферических тканей, которая вносит вклад в повышение риска гипогликемии. В результате гипогликемия остается основным медицинским риском с огромной нагрузкой на пациентов и вызывает значительную заболеваемость и смертность.
Краткое изложение сущности изобретения
Изобретение предлагает соединения, содержащие до двух инсулиновых молекул, ковалентно связанных с образованием димера инсулиновых молекул, который может активировать инсулиновый рецептор с регулярной инсулиноподобной активностью, но со сниженной максимальной активностью. Эти соединения являются частичными агонистами инсулинового рецептора (IPRA): они ведут себя как другие аналоги инсулина, эффективно снижая глюкозу, но с более низким риском гипогликемии.
Предлагаются ковалентные инсулиновые димеры-частичные агонисты инсулинового рецептора, составленные в виде новых и способных к превращению базальных инсулинов (введение один раз в день), которые демонстрируют улучшенный терапевтический индекс (TI) по сравнению с базальными инсулинами современного стандарта оказания медицинской помощи (SOC). В одном варианте осуществления IPRA настоящего изобретения могут эффективно снижать уровень глюкозы со сниженным риском гипогликемии у минипига с диабетом и обладают свойствами базального инсулина, который вводят один раз в день (QD). Улучшенный TI может давать специалистам-практикам возможность более агрессивного дозирования IRPA настоящего изобретения для достижения целевых показателей контроля уровня глюкозы натощак. Строгий контроль уровня глюкозы натощак и НЬА1с с помощью IRPA может позволить им служить в качестве 1) применяемого отдельно инсулина длительного действия с улучшенным профилем эффективности и безопасности при T2DM и 2) улучшенного основного базального инсулина при T1DM (и иногда T2DM) для применения с дополнительными дозами прандиальных быстродействующих аналогов инсулина (RAA). Таким образом, настоящее изобретение предлагает следующие варианты осуществления.
Настоящее изобретение предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; и причем по меньшей мере один амино-конец полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи ковалентно связан с заместителем, при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь. В отдельных аспектах по меньшей мере амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи первого инсулина или аналога инсулина ковалентно связаны с заместителем.
- 1 036714
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера амино-конец каждого полипептида А-цепи и каждого полипептида В-цепи ковалентно связан с заместителем. В отдельных аспектах амино-конец полипептида А-цепи и полипептида В-цепи первого инсулина или аналога инсулина и амино-конец полипептида А-цепи и полипептида В-цепи второго инсулина или аналога инсулина ковалентно связаны с заместителем. В вариантах осуществления, в которых аминоконцы первого и второго инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны с заместителем, заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи первого инсулина или аналога инсулина может быть таким же, как заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи второго инсулина или аналога инсулина. В вариантах осуществления, в которых амино-концы первого и второго инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны с заместителем, заместитель на амино-концах полипептидов А-цепи и В-цепи первого инсулина или аналога инсулина может отличаться от заместителя на аминоконцах полипептидов А-цепи и В-цепи второго инсулина или аналога инсулина.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, RNH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX2X3EQCCX8SIC SLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) или X22VNQX25X26CGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Х3 представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X19 представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой лейцин или глицин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х35 представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из Х31 или Х32 представляет собой лизин.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктин-содержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где
- 2 036714 n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (C8) фрагмент, декандиоиловый (C10) фрагмент, додекандиоиловый (C12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, имеющий формулу
D1-L-D2, где D1 и D2 независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D1, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D2 при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; и причем первый и второй полипептиды инсулина или аналога инсулина включают в себя заместитель, прикрепленный к аминоконцу полипептида А-цепи и полипептида В-цепи.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D1 и D2 являются одинаковыми, или D1 и D2 различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает D1 и D2 посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов D1 и D2.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R/CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX2X3EQCCX8SIC SLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) или X22VNQX25X26CGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Х3 представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X19 представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой лейцин или глицин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х35 представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D1 и D2 независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, GO^-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктин-содержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
- 3 036714
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Также предлагаются композиции, содержащие любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновый димер и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид Ацепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; и, необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем, при условии, (1) что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь и (2) что, когда инсулин или аналог инсулина не представляет собой человеческий инсулин или аналог инсулина, и амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, то связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R/CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX2X3EQCCX8SIC SLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) или X22VNQX25X26CGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Х3 представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X19 представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой лейцин или глицин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х35 представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R неза- 4 036714 висимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктин-содержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.
В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Также предлагаются композиции, содержащие любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров и фармацевтически приемлемый носитель.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает частичный агонист инсулинового рецептора или инсулиновый димер, имеющий формулу
D1-L-D2, где D1 и D2 независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D1, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D2, при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; и, необязательно, причем по меньшей мере один из D1 или D2 включает в себя заместитель, прикрепленный к амино-концу полипептида А-цепи или полипептида В-цепи D1 или D2; при условии, (1) что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь, и (2) что, когда амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, то связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D1 и D2 являются одинаковыми, или D1 и D2 различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент ковалентно связывает D1 и D2 посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов D1 и D2
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, RNH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-C6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера D1 и D2 независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX2X3EQCCX8SIC SLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) или X22VNQX25X26CGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Х3 представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X19 представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой лейцин или глицин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х35 представляет собой аргинин или отсутствует; при
- 5 036714 условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора или инсулиновых димеров связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктин-содержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора или инсулинового димера связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.
В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает димер аналогов инсулина, содержащий первый гетеродимер аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; причем аналог инсулина выбирают из инсулина лизпро, инсулина аспарта и инсулина гларгина; и, необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем, при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-С6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора по меньшей мере один из первого и второго инсулина или аналога инсулина дополнительно конъюгирован с полиэтиленгликолем, фрагментом сахара или гетероциклом.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
- 6 036714
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктинсодержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.
В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает димер аналогов инсулина, имеющий формулу D1-L-D2, где D1 и D2 независимо представляют собой полипептид инсулина или аналога инсулина, причем каждый инсулиновый полипептид представляет собой гетеродимер, содержащий полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, связанные вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; L представляет собой связывающий фрагмент, причем один конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильной группе или около карбоксильной группы D1, а другой конец линкерного фрагмента прикреплен к аминокислотному остатку на карбоксильном конце или около карбоксильного конца D2, при условии, что L не включает в себя дисульфидную связь; причем аналог инсулина выбирают из инсулина лизпро, инсулина аспарта и инсулина гларгина; и, необязательно, причем по меньшей мере один из D1 или D2 включает в себя заместитель, прикрепленный к амино-концу полипептида Ацепи или полипептида В-цепи D1 или D2; при условии, что связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора D1 и D2 являются одинаковыми, или D1 и D2 различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно связывает D1 и D2 посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов D1 и D2
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-С6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктинсодержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.
В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Настоящее изобретение предлагает частичный агонист инсулинового рецептора, содержащий первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны
- 7 036714 вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который находится в диапазное между 20 и 70%, 40 и 70%, 50 и 70%, 40 и 60% или 20 и 40% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет по меньшей мере 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем аминоконец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет менее чем 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования; или первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина, причем каждый гетеродимер включает в себя полипептид А-цепи и полипептид В-цепи, причем полипептид А-цепи и полипептид В-цепи связаны вместе посредством межцепочечных дисульфидных связей; причем первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина ковалентно связаны вместе посредством связывающего фрагмента, соединяющего боковые цепи аминокислот на карбоксильных концах или около карбоксильных концов двух соответствующих полипептидов В-цепи; необязательно, причем амино-конец по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи первого инсулинового полипептида или второго инсулинового полипептида ковалентно связан с заместителем; и причем частичный агонист инсулинового рецептора имеет максимальный отклик по отношению к человеческому инсулиновому рецептору (IR), который составляет приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 или 70% от максимального отклика нативного человеческого инсулина по отношению к IR, определенного с помощью функционального анализа фосфорилирования.
В приведенных выше вариантах осуществления функциональный анализ фосфорилирования может представлять собой анализ фосфорилирования АКТ инсулинового рецептора (IR).
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент не включает в себя дисульфидную связь, и, когда амино-концы полипептида А-цепи и полипептида В-цепи не включают в себя заместитель, связывающий фрагмент не представляет собой оксалиловый (С2) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент или додекандиоиловый (С12) фрагмент.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора первый и второй гетеродимеры ин- 8 036714 сулинов или аналогов инсулина являются одинаковыми, или первый и второй гетеродимеры инсулинов или аналогов инсулина различаются.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент ковалентно связывает первый гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина и второй гетеродимер инсулинов или аналогов инсулина посредством ε-аминогруппы остатка лизина на карбоксильных концах или около карбоксильных концов их соответствующих полипептидов В-цепи.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора заместитель имеет общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, PEG, сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель выбирают из группы, состоящей из ацетила, фенилацетила, карбамоила, N-алкилкарбамоила, изобутила, метоксиацетила, глицина, аминоэтилглюкозы (AEG), AEG-С6, PEG1, PEG2, N-диметила и алкоксикарбонила.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора первый и второй инсулины или аналоги инсулина независимо представляют собой нативный человеческий инсулин, инсулин лизпро, инсулин аспарт, desB30 инсулин или инсулин гларгин.
В отдельных аспектах частичного агониста инсулинового рецептора каждый полипептид А-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность GX2X3EQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), и каждый полипептид В-цепи независимо содержит аминокислотную последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFX27YTX31X32 (SEQ ID NO: 4) или X22VNQX25X26CGX29X30LVEA LYLVCGERGFX27YTX31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Х3 представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; X19 представляет собой тирозин, 4метоксифенилаланин, аланин или 4-аминофенилаланин; Х23 представляет собой аспарагин или глицин; Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой лейцин или глицин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х29 представляет собой аланин, глицин или серин; Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х35 представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может быть двухвалентный, прямой или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный, необязательно замещенный С1-20 углеводородная цепь причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В еще одном аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой ацильный фрагмент, -C(O)RC(O)-, где R представляет собой алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь, содержащую амид цепь, содержащую триазол(ы) цепь, циклооктинсодержащий фрагмент, замещенную ацильную цепь или полиэтиленгликолевую (PEG) цепь.
В другом аспекте частичного агониста инсулинового рецептора связывающий фрагмент представляет собой С2-С20 ацильный фрагмент.
В отдельных аспектах связывающий фрагмент представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, включая, но без ограничения, оксалиловый (С2) фрагмент, сукциниловый (С4) фрагмент, адипоиловый (С6) фрагмент, субероиловый (С8) фрагмент, декандиоиловый (С10) фрагмент, додекандиоиловый (С12) фрагмент, тетрадекандиоиловый (С14) фрагмент или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает инсулиновый димер, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированные вместе посредством бифункционального линкера, выбранного из группы, состоящей из линкера 1, линкера 2, линкера 3, линкера 10, линкера 11, линкера 12, линкера 13, линкера 14, линкера 15, линкера 16, линкера 17, линкера 18, линкера 19, линкера 20, линкера 21, линкера 22, линкера 23, линкера 24, линкера 25, линкера 26, линкера 27, линкера 28, линкера 29, линкера 30, линкера 31, линкера 32, линкера 33, линкера 34, линкера 35, линкера 36, линкера 37, линкера 38, линкера 39, линкера 40, линкера 41, линкера 42, линкера 43, линкера 44,
- 9 036714 линкера 45, линкера 46, линкера 47, линкера 48, линкера 49 и линкера 50, при условии, что когда бифункциональный линкер представляет собой линкер 10, линкер 11, линкер 12, линкер 13 или линкер 14, по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей Nконцевой аминокислотой с заместителем, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем.
В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, RNH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды. В отдельных вариантах осуществления заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.
Настоящее изобретение дополнительно предлагает инсулиновый димер, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, конъюгированные вместе посредством первого линкера и второго линкера.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает димер аналогов инсулина, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру
---R--где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.
В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды. В отдельных вариантах осуществления заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-C6 алкильную группу или PEG2-группу.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение предлагает димер аналогов инсулина, содержащий первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид Вцепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру
N3---R---N3 где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.
В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды. В отдельных вариантах осуществления заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-С6 алкильную группу или PEG2-группу.
Изобретение дополнительно предлагает композиции, содержащие любой из частичных агонистов инсулинового рецептора, раскрытых в настоящем документе, и фармацевтически приемлемую соль.
Настоящее изобретение предлагает способ лечения диабета, содержащий введение индивидууму с
- 10 036714 диабетом терапевтически эффективного количества композиции, содержащей любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора. В отдельных аспектах диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.
Настоящее изобретение предлагает применение композиции для лечения диабета, содержащей любой из вышеупомянутых частичных агонистов инсулинового рецептора. В отдельных аспектах диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.
Настоящее изобретение предлагает применение любого из частичных агонистов инсулинового рецептора, раскрытых в настоящем документе, для производства лекарственного средства для лечения диабета. В отдельных аспектах диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.
Определения.
Инсулин, как используется в настоящем документе, данный термин обозначает активное начало поджелудочной железы, которое влияет на метаболизм углеводов в организме животного, и которое значимо при лечении сахарного диабета. Данный термин включает в себя синтетические и полученные биотехнологическим путем продукты, которые являются одинаковыми или схожими с природными инсулинами по структуре, применению и предполагаемому эффекту и значимы при лечении сахарного диабета. Данный термин представляет собой общий термин, который обозначает гетеродимер размером 51 аминокислоту, содержащий пептид А-цепи, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, и пептид В-цепи, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2, причем остатки цистеина в положениях 6 и 11 А-цепи связаны дисульфидной связью, остатки цистеина в положении 7 А-цепи и положении 7 В-цепи связаны дисульфидной связью, и остатки цистеина в положении 20 А-цепи и 19 В-цепи связаны дисульфидной связью.
Аналог инсулина - данный термин, как используется в настоящем документе, включает в себя любой гетеродимерный аналог или одноцепочечный аналог, который содержит одну или несколько модификаций нативного пептида А-цепи и/или пептида В-цепи. Модификации включают в себя, но без ограничения, замену какой-либо аминокислотой нативной аминокислоты в положении, выбранном из А4, А5, А8, А9, А10, А12, А13, А14, А15, А16, А17, А18, А19, А21, В1, В2, ВЗ, В4, В5, В9, В10, В13, В14, В15, В16, В17, В18, В20, В21, В22, В23, В26, В27, В28, В29 и В30; удаление любого или всех из положений В1-4 и В26-30; или конъюгацию, непосредственно или посредством полимерного или неполимерного линкера, одного или нескольких ацильных, полиэтилглициновых (PEG) или сахаридных фрагментов; или любую их комбинацию. Как проиллюстрировано N-связанными гликозилированными аналогами инсулина, раскрытыми в настоящем документе, данный термин также включает в себя любой инсулиновый гетеродимер и одноцепочечный аналог, который был модифицирован таким образом, что он имеет по меньшей мере один N-связанный сайт гликозилирования и, в частности, варианты осуществления, в которых N-связанный сайт гликозилирования связан с N-гликаном или занят им. Примеры аналогов инсулина включают, но без ограничения, гетеродимерные и одноцепочечные аналоги, раскрытые в опубликованных международных заявках WO 20100080606, WO 2009/099763 и WO 2010080609, раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки. Примеры одноцепочечных аналогов инсулина также включают, но без ограничения, раскрытые в опубликованных международных заявках WO 9634882, WO 95516708, WO 2005054291, WO 2006097521, WO 2007104734, WO 2007104736, WO 2007104737, WO 2007104738, WO 2007096332, WO 2009132129; патентах США № 5304473 и 6630348; и документе Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки.
Данный термин также включает в себя одноцепочечные и гетеродимерные полипептидные молекулы, которые имеют слабую или не имеют детектируемую активность в отношении инсулинового рецептора, но которые были модифицированы таким образом, что они включают в себя одну или несколько аминокислотных модификаций или замен для того, чтобы они имели активность в отношении инсулинового рецептора, которые имеют активностью по меньшей мере 1, 10, 50, 75 или 90% в отношении инсулинового рецептора по сравнению с нативным инсулином, и которые также включают в себя по меньшей мере один N-связанный сайт гликозилирования. В отдельных аспектах аналог инсулина является частичным агонистом, который имеет активность в отношении инсулинового рецептора менее чем 80% (или 70%) от нативного инсулина. Эти аналоги инсулина, которые обладают пониженной активностью в отношении инсулинового рецептора гормона роста и повышенную активность в отношении инсулинового рецептора, включают в себя как гетеродимеры, так и одноцепочечные аналоги.
Одноцепочечный инсулин или одноцепочечный аналог инсулина, как используется в настоящем документе, данный термин охватывает группу структурно-родственных белков, в которых пептид Ацепи или функциональный аналог и пептид В-цепи или функциональный аналог ковалентно связаны посредством пептида или полипептида размером 2-35 аминокислот или непептидного полимерного или неполимерного линкера, и которые имеют по меньшей мере 1, 10, 50, 75 или 90% от активности инсулина в отношении инсулинового рецептора по сравнению с нативным инсулином. Одноцепочечный инсулин или аналог инсулина также включает в себя три дисульфидные связи: первая дисульфидная связь расположена между остатками цистеина в положениях 6 и 11 А-цепи или ее функционального аналога,
- 11 036714 вторая дисульфидная связь расположена между остатками цистеина в положении 7 А-цепи или ее функционального аналога и в положение 7 В-цепи или ее функционального аналога, и третья дисульфидная связь расположена между остатками цистеина в положении 20 А-цепи или ее функционального аналога и в положении 19 В-цепи или ее функционального аналога.
Соединяющий пептид или С-пептид, как используется в настоящем документе, данный термин относится к соединительному фрагменту С полипептидной последовательности В-С-А одноцепочечной препроинсулиноподобной молекулы. В частности, в природной цепи инсулина С-пептид соединяет аминокислоту в положении 30 В-цепи и аминокислоту в положении 1 А-цепи. Данный термин может относиться к нативному инсулиновому С-пептиду, С-пептиду обезьяны и любому другому пептиду от 3 до 35 аминокислот, который соединяет В-цепь с А-цепью, и, таким образом, подразумевается, что он охватывает любой пептид, связывающий пептид В-цепи с пептидом А-цепи в одноцепочечном аналоге инсулина (смотри, например, опубликованные заявки США № 20090170750 и 20080057004 и WO 9634882) и в молекулах-предшественниках инсулина, таких как раскрытые в WO 9516708 и патенте США № 7105314.
Аминокислотная модификация, как используется в настоящем документе, данный термин относится к замене аминокислоты или дериватизации аминокислоты посредством присоединения к аминокислоте и/или удаления из аминокислоты химических групп, и включает в себя замену на любую из 20 аминокислот, обычно встречающихся в человеческих белках, а также атипичных или неприродных аминокислот. Коммерческие источники атипичных аминокислот включают Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), ChemPep Inc. (Miami, FL) и Genzyme Pharmaceuticals (Cambridge, MA). Атипичные аминокислоты могут быть приобретены у коммерческих поставщиков, синтезированы de novo или химически модифицированы или дериватизированы из природных аминокислот.
Аминокислотная замена, как используется в настоящем документе, относится к замещению одного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком.
Консервативная аминокислотная замена, как используется в настоящем документе, данный термин определен в настоящем документе как обмен в пределах одной из следующих пяти групп:
I) малые алифатические неполярные или слабо полярные остатки:
Ala, Ser, Thr, Pro, Gly;
II) полярные отрицательно заряженные остатки и их амиды: Asp, Asn, Glu, Gln, цистеиновая кислота и гомоцистеиновая кислота;
III) полярные положительно заряженные остатки: His, Arg, Lys; орнитин (Orn);
IV) большие алифатические неполярные остатки: Met, Leu, Ile, Val, Cys, норлейцин (Nle), гомоцистеин;
V) большие ароматические остатки: Phe, Tyr, Trp, ацетилфенилаланин.
Лечение, как используется в настоящем документе, термин лечить (или подвергать лечению, подвергаемый лечению, лечение и так далее) относится к введению IRPA настоящего раскрытия субъекту, нуждающемуся в этом, с целью облегчения, ослабления, изменения, улучшения, изменения к лучшему или воздействия на состояние (например, диабет), симптом или симптомы состояния (например, гипергликемию) или предрасположенность к состоянию. Например, как используется в настоящем документе, термин лечение диабета будет в общем относиться к поддержанию уровней глюкозы в крови вблизи нормальных уровней и может включать в себя повышение или понижение уровней глюкозы в крови в зависимости от конкретной ситуации.
Фармацевтически приемлемый носитель, как используется в настоящем документе, данный термин включает в себя любой из стандартных фармацевтических носителей, таких как фосфатный буферный солевой раствор, вода, эмульсии, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло, и различные типы смачивающих средств, подходящих для введения нуждающемуся индивидууму или нуждающимся индивидуумом. Данный термин также охватывает любое из средств, одобренных регулирующим органом Федерального правительства США или перечисленных в Фармакопее США для использования на животных, включая людей.
Фармацевтически приемлемая соль, как используется в настоящем документе, данный термин относится к солям соединений, которые сохраняют биологическую активность родительского соединения, и которые не являются биологически или иным образом нежелательными. Многие из соединений, раскрытых в настоящем документе, способны к образованию кислых и/или основных солей благодаря наличию аминогрупп и/или карбоксильных групп или аналогичных им групп.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения основания могут быть получены из неорганических и органических оснований. Соли, полученные из неорганических оснований, включают, только в качестве примера, соли натрия, калия, лития, аммония, кальция, цинка и магния. Соли, полученные из органических оснований, включают, но без ограничения, соли первичных, вторичных и третичных аминов.
Фармацевтически приемлемые соли присоединения кислоты могут быть получены из неорганических и органических кислот. Соли, полученные из неорганических кислот, включают соли соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, серной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты и тому подобные. Соли, полученные из органических кислот, включают соли уксусной кислоты, пропионовой ки- 12 036714 слоты, гликолевой кислоты, пировиноградной кислоты, щавелевой кислоты, яблочной кислоты, малоновой кислоты, янтарной кислоты, малеиновой кислоты, фумаровой кислоты, винной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, коричной кислоты, миндальной кислоты, метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, салициловой кислоты и тому подобные.
Эффективное или терапевтически эффективное количество, как используется в настоящем документе, относится к нетоксичному, но достаточному количеству аналога инсулина для обеспечения желаемого эффекта. Например, одним из желаемых эффектов будет предупреждение или лечение гипергликемии. Количество, которое является эффективным, будет изменяться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста и общего состояния индивидуума, способа введения и тому подобного. Таким образом, не всегда можно указать точное эффективное количество. Не всегда можно определить оптимальное эффективное количество перед введением индивидууму или индивидуумом, нуждающимся в этом. Однако подходящее эффективное количество в любом отдельном случае может быть определено средним специалистом в данной области техники с помощью обычных экспериментов.
Парентеральный, как используется в настоящем документе, данный термин означает не через пищеварительный канал, а каким-то другим путем, таким как интраназальный, ингаляционный, подкожный, внутримышечный, внутриспинальный или внутривенный.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 показывает эффект снижения уровня глюкозы димеров 24, 18, и 40 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 2А - результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении соединения А с RHI (хумулин). Соединение А вводили в дозе, составляющей 72 ед./кг, и в дозе, составляющей 300 ед./кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед./кг, и в дозе, составляющей 72 ед./кг;
фиг. 2В - результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении соединения В с RHI (хумулин). Соединение В вводили в дозе, составляющей 72 ед./кг, и в дозе, составляющей 300 ед./кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед./кг, и в дозе, составляющей 72 ед./кг;
фиг. 2С - результаты теста на переносимость инсулина (ITT) у мышей при сравнении димера 24 с RHI (хумулин). Димер 24 вводили в дозе, составляющей 72 ед./кг, и в дозе, составляющей 300 ед./кг, а хумулин вводили в дозе, составляющей 18 ед./кг, и в дозе, составляющей 72 ед./кг;
фиг. 2D - результаты димера 55 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 55 вводили в дозе, составляющей 120 нмоль/кг и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг;
фиг. 2Е - результаты димера 58 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 58 вводили в дозе, составляющей 60 нмоль/кг и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг;
фиг. 2F - результаты димера 60 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 60 вводили в дозе, составляющей 72 нмоль/кг, и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг;
фиг. 2G - результаты димера 67 в тесте на переносимость инсулина (ITT) у мышей. Димер 67 вводили в дозе, составляющей 120 нмоль/кг, и в дозе, составляющей 300 нмоль/кг;
фиг. 3 показывает, что инсулиновый димер соединение А деградировал до мономеров инсулина при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) без глутатиона (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации;
фиг. 4 показывает, что инсулиновый димер соединение А деградировал до мономеров инсулина при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) с глутатионом (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации;
фиг. 5 показывает, что димер 24 утратил некоторое количество полипептида А-цепи, но не деградировал до мономеров при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) без глутатиона (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации;
фиг. 6 показывает, что димер 24 утратил некоторое количество полипептида А-цепи, но не деградировал до мономеров при 2-часовой инкубации с мембранами клеток почек крысы (RKCM) с глутатионом (GSH). % от значений родительского соединения являются только полуколичественными из-за потенциальных различий в эффективности ионизации;
фиг. 7А - эффект снижения уровня глюкозы димеров 4, 5, 7, 8 и 9 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7В - эффект снижения уровня глюкозы димеров 18, 19, 20, 21 и 22 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7С - эффект снижения уровня глюкозы димеров 23, 24, 26, 27 и 28 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7D - эффект снижения уровня глюкозы димеров 29, 32, 37, 38 и 39 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7Е - эффект снижения уровня глюкозы димеров 40, 41, 43, 44 и 48 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
- 13 036714 фиг. 7F - эффект снижения уровня глюкозы димеров 55, 57, 58, 60 и 61 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7G - эффект снижения уровня глюкозы димеров 62, 64, 67, 69 и 71 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг;
фиг. 7Н - эффект снижения уровня глюкозы димеров 72, 77 и 78 по сравнению с RHI при введении минипигам с диабетом при 0,69 нмоль/кг.
Подробное описание изобретения
Изобретение предлагает соединения, содержащие две инсулиновые молекулы, ковалентно связанные с образованием ковалентно-связанного инсулинового димера, который может активировать инсулиновый рецептор с регулярной инсулиноподобной активностью и сниженной максимальной активностью. Эти соединения являются частичными агонистами инсулинового рецептора (IRPA): они ведут себя как другие аналоги инсулина, эффективно снижая глюкозу, но с более низким риском гипогликемии.
Инсулиновые димеры были раскрыты в документах Brandenburg et al. в патенте США № 3907763 (1973); Tatnell et al., Biochem J. 216: 687-694 (1983); Shuttler and Brandenburg, Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem, 363, 317-330, 1982; Weiland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 87: 1154-1158 (1990); Deppe et al., Naunyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. (1994) 350: 213-217; Brandenburg and Havenith в патенте США № 6908897(B2) (2005); Knudsen et al., PLOS ONE 7: e51972 (2012); DiMarchi et al в WO 2011/159895; DiMarchi et al. в WO 2014/052451; и Herrera et al., WO 2014141165. Совсем недавно инсулиновые димеры были описаны в документах Brant, Synthesis and Characterization of Insulin Receptor Partial Agonists as a Route to Improved Diabetes Therapy, Ph.D. Dissertation, Indiana University (апрель 2015 года) и Zaykov and DiMarchi, Poster P212, Exploration of the structural and mechanistic basis for partial agonism of insulin dimers, American Peptide Symposium, Orlando FL (20-25 июня (2015). Однако авторы настоящего изобретения обнаружили, что уровень инсулиновой активности и частичной агонистической активности димеров является функцией димерной структуры, последовательности аналога инсулина, длины димеризующего линкера и участка димеризации, который соединяет два инсулиновых полипептида. Авторы обнаружили, что инсулиновые димеры изобретения имеют пониженный риск развития гипогликемии при введении в высоких дозах, чем нативный инсулин или другие аналоги инсулина при введении в высоких дозах.
Настоящее изобретение предлагает ковалентно-связанные инсулиновые димеры-частичные агонисты, составленные в виде новых и способных к превращению базальных инсулинов (введение один раз в день), которые демонстрируют улучшенный терапевтический индекс (TI) по сравнению с базальными инсулинами современного стандарта оказания медицинской помощи (SOC). Эти молекулы могут эффективно снижать уровень глюкозы со сниженным риском гипогликемии у минипига с диабетом и обладают свойствами базального инсулина, который вводят один раз в день (QD). Улучшенный TI может давать специалистам-практикам возможность более агрессивного дозирования димера IRPA для достижения целевых показателей контроля уровня глюкозы натощак. Строгий контроль уровня глюкозы натощак и HbA1c может позволять этим молекулам служить в качестве 1) применяемого отдельно инсулина длительного действия с улучшенным профилем эффективности и безопасности при сахарном диабете типа 2 (T2DM) и 2) улучшенного основного базального инсулина при сахарном диабете типа 1 (T1DM) (и иногда T2DM) для применения с дополнительными дозами прандиальных быстродействующих аналогов инсулина (RAA).
Идеальный инсулин длительного действия обеспечивает непрерывный контроль уровня глюкозы натощак у больных диабетом с высокой стабильностью и воспроизводимостью ФК/ФД. Однако доступные в настоящее время базальные инсулины, даже с улучшенной стабильностью и воспроизводимостью ФК/ФД, по-прежнему имеют узкий терапевтический индекс, и случаи гипогликемии увеличиваются по мере приближения уровней глюкозы к целевой эугликемии. Это часто может приводить к недостаточной дозировке для предотвращения гипогликемии. Ожидается, что лечение с помощью IRPA настоящего изобретения изменит эту зависимость эффективность:гипогликемия посредством уменьшения скорости изменения снижения уровня глюкозы при повышении дозировки.
А и В-цепи инсулина.
В настоящем документе раскрыты димеры инсулинов или аналогов инсулина, которые обладают активностью агонистов инсулинового рецептора. Уровень инсулиновой активности димеров является функцией димерной структуры, последовательности аналога инсулина, длины димеризующего линкера и участка димеризации, который соединяет два инсулиновых полипептида. Инсулиновые полипептиды настоящего изобретения могут содержать последовательности нативных В и А-цепей человеческого инсулина (SEQ ID NO: 1 и 2, соответственно) или любых из их известных аналогов или производных, которые проявляют инсулиновую агонистическую активность при связывании друг с другом в гетеродуплекс. Такие аналоги включают, например, белки, которые имеют А-цепь и В-цепь, которые отличаются от Ацепи и В-цепи человеческого инсулина тем, что имеют одну или несколько аминокислотных делеций, одну или несколько аминокислотных замен и/или одну или несколько аминокислотных вставок, которые не уничтожают инсулиновую активность аналога инсулина.
Один тип аналога инсулина, мономерный аналог инсулина, хорошо известен в данной области техники. Это быстродействующие аналоги человеческого инсулина, включая, например, аналоги инсу- 14 036714 лина, в которых:
(а) аминоацильный остаток в положении В28 замещен на Asp, Lys, Leu, Val или Ala, и аминоацильный остаток в положении В29 представляет собой Lys или Pro;
(b) аминоацильные остатки в любом из положений В27 и В30 удалены или замещены на ненативную аминокислоту.
В одном варианте осуществления предлагается аналог инсулина, содержащий Asp, замещенный в положении В2 8 (например, инсулин аспарт (NOVOLOG); см. SEQ ID NO: 9) или Lys, замещенный в положении 28, и пролин, замещенный в положении В29, (например, инсулин лизпро (HUMALOG); см. SEQ ID NO: 6). Дополнительные мономерные аналоги инсулина раскрыты в документах Chance et al., патент США № 5514646; Chance et al., патентная заявка США сериальный № 08/255297; Brems et al., Protein Engineering, 5: 527-533 (1992); Brange et al., публикация ЕРО № 214826 (опубликована 18 марта 1987 года); и Brange et al., Current Opinion in Structural Biology, 1: 934-940 (1991). Эти раскрытия явным образом включены в настоящий документ посредством ссылки для описания мономерных аналогов инсулина.
Аналоги инсулина могут также содержать замены амидированных аминокислот на кислотные формы. Например, Asn может быть заменен на Asp или Glu. Аналогично, Gln может быть заменен на Asp или Glu. В частности, Asn(A18), Asn(A21) или Asp(B3) или любая комбинация этих остатков могут быть заменены на Asp или Glu. Кроме того, Gln(A15), или Gln(B4), или они оба, могут быть заменены или на Asp, или на Glu.
Как раскрыто в настоящем документе, предлагаются одноцепочечные аналоги инсулина, содержащие В-цепь и А-цепь человеческого инсулина, или их аналоги или производное, причем карбоксильный конец В-цепи связан с амино-концом А-цепи посредством связывающего фрагмента. В одном варианте осуществления А-цепь представляет собой аминокислотную последовательность GIVEQCCTSIC SLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), a B-цепь содержит аминокислотную последовательность FVNQHLCGSH LVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) или ее укороченную с карбоксильного конца последовательность, в которой удален В30, и аналоги этих последовательностей, причем каждая последовательность модифицирована таким образом, что она содержит от одной до пяти аминокислотных замен в положениях, соответствующих положениям нативного инсулина, выбранным из А5, А8, А9, А10, А14, А15, А17, А18, А21, В1, В2, В3, В4, В5, В9, В10, В13, В14, В20, В22, В23, В26, В27, В28, В29 и В30, при условии, что по меньшей мере один из В28 или В29 представляет собой лизин. В одном варианте осуществления аминокислотные замены представляют собой консервативные аминокислотные замены. Подходящие аминокислотные замены в этих положениях, которые не оказывают неблагоприятного воздействия на желаемую активность инсулина, известны специалистам в данной области техники, как продемонстрировано, например, в документе Mayer et al., Insulin Structure and Function, Biopolymers. 2007; 88(5): 687713, раскрытие которого включено в настоящий документ посредством ссылки.
В соответствии с одним вариантом осуществления пептиды аналога инсулина могут содержать Ацепь инсулина и В-цепь инсулина или их аналоги, причем А-цепь содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 70% (например, 70, 75, 80, 85, 90, 95%) по длине нативного пептида с GIVEQCCTSICSLYQLENYCN (SEQ ID NO: 1), а В-цепь содержит аминокислотную последовательность, которая имеет идентичность последовательности по меньшей мере 60% (например, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95%) по длине нативного пептида с FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT (SEQ ID NO: 2) или ее укороченной с карбоксильного конца последовательностью, в которой удален В30.
К амино-концу В-цепи или к карбоксильному концу А-цепи инсулиновых полипептидов настоящего изобретения могут быть добавлены дополнительные аминокислотные последовательности.
Например, ряд отрицательно заряженных аминокислот могут быть добавлены к амино-концу Вцепи, включая, например, пептид длиной от 1 до 12, от 1 до 10, от 1 до 8 или от 1 до 6 аминокислот, содержащий одну или несколько отрицательно заряженных аминокислот, включая, например, глутаминовую кислоту и аспарагиновую кислоту. В одном варианте осуществления аминоконцевое удлинение Вцепи содержит от 1 до 6 заряженных аминокислот. В соответствии с одним вариантом осуществления раскрытые инсулиновые полипептиды содержат на А-цепи С-концевой амид или сложный эфир вместо С-концевого карбоксилата.
В различных вариантах осуществления аналог инсулина имеет изоэлектрическую точку, которая смещена относительно человеческого инсулина. В некоторых вариантах осуществления смещение изоэлектрической точки достигается посредством присоединения одного или нескольких остатков аргинина, лизина или гистидина к N-концу пептида инсулиновой А-цепи и/или С-концу пептида инсулиновой Вцепи. Примеры таких инсулиновых полипептидов включают ArgA0-человеческий инсулин, ArgB^ArgB32человеческий инсулин, GlyA21ArgB31ArgB32-человеческий инсулин, ArgA0ArgB31ArgB32-человеческий инсулин и ArgA0GlyA21ArgB31ArgB32-человеческий инсулин. В качестве дополнительного примера, инсулин гларгин (LANTUS; смотри SEQ ID NO: 7 и 8) представляет собой типичный аналог инсулина длительного действия, в котором AsnA21 был замещен на глицин, а два остатка аргинина были ковалентно связаны с С-концом В-пептида. Эффект этих аминокислотных изменений заключается в смещении изоэлектрической точки молекулы, благодаря чему получают молекулу, которая растворима при кислых рН (напри- 15 036714 мер, рН 4-6,5), но нерастворима при физиологических рН. Когда раствор инсулина гларгина инъецируют в мышцу, рН раствора нейтрализуется, и инсулин гларгин образует микропреципитаты, которые медленно высвобождают инсулин гларгин в течение 24-часового периода после инъекции без выраженного инсулинового пика и, следовательно, с пониженным риском индуцирования гипогликемии. Этот профиль делает возможным обеспечения пациента базальным инсулином с помощью дозирования один раз в день. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналог инсулина содержит пептид А-цепи, в котором аминокислота в положении А21 представляет собой глицин, и пептид В-цепи, в котором аминокислоты в положении В31 и В32 представляют собой аргинин. Настоящее раскрытие охватывает все одиночные и множественные комбинации этих мутаций и любых других мутаций, которые описаны в настоящем документе (например, GlyA21-человеческий инсулин, GlyA21ArgB31-человеческuй инсулин, ArgB31ArgB32-человеческий инсулин, ArgB31-человеческuй инсулин).
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора одна или несколько амидированных аминокислот аналога инсулина заменена на кислую аминокислоту или другую аминокислоту. Например, аспарагин может быть заменен на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. Аналогично, глутамин может быть заменен на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. В частности, AsnA18, AsnA21 или AsnB3 или любая комбинация этих остатков могут быть заменены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. GlnA15, или GlnB4, или они оба, могут быть заменены на аспарагиновую кислоту или глутаминовую кислоту или другой остаток. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аналоги инсулина содержат аспарагиновую кислоту или другой остаток в положении А21, или аспарагиновую кислоту или другой остаток в положении В3, или и то, и другое.
Специалисту в данной области техники будет ясно, что можно заменить и другие аминокислоты в аналоге инсулина на другие аминокислоты при сохранении биологической активности молекулы. Например, без ограничения, следующие модификации также широко приняты в данной области техники: замена остатка гистидина в положении В10 на аспарагиновую кислоту (HisB10 на AspB10); замена остатка фенилаланина в положении В1 на аспарагиновую кислоту (PheB1 на AspB1); замена остатка треонина в положении В30 на аланин (ThrB30 на AlaB30); замена остатка тирозина в положении В26 на аланин (TyrB26 на AlaB26); и замена остатка серина в положении В9 на аспарагиновую кислоту (SerB9 на AspB9).
В различных вариантах осуществления аналог инсулина имеет длительный профиль действия. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления аналог инсулина может быть ацилирован жирной кислотой. Т.е. образуется амидная связь между аминогруппой на аналоге инсулина и группой карбоновой кислоты жирной кислоты. Аминогруппа может представлять собой α-аминогруппу N-концевой аминокислоты аналога инсулина, или может представлять собой ε-аминогруппу остатка лизина аналога инсулина. Аналог инсулина может быть ацилирован в одной или нескольких из трех аминогрупп, которые есть в человеческий инсулине дикого типа, может быть ацилирован по остатку лизина, который был введен в последовательность человеческого инсулина дикого типа. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аналог инсулина может быть ацилирован в положении А1, В1, или как в А1, так и в В1. В некоторых вариантах осуществления жирную кислоту выбирают из миристиновой кислоты (C14), пентадециловой кислоты (C15), пальмитиновой кислоты (C16), гептадециловой кислоты (C17) и стеариновой кислоты (C18).
Примеры аналогов инсулина можно найти, например, в опубликованных международных заявках WO 9634882, WO 95516708; WO 20100080606, WO 2009/099763 и WO 2010080609, патенте США № 6630348 и документе Kristensen et al., Biochem. J. 305: 981-986 (1995), раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки. В других вариантах осуществления гликозилированные in vitro или N-гликозилированные in vivo аналоги инсулина могут быть ацилированы и/или пегилированы.
В соответствии с одним вариантом осуществления предлагается аналог инсулина, в котором А-цепь инсулинового пептида содержит последовательность GIVEQCCX8SICSLYQLX17NX19CX23 (SEQ ID NO: 3), а В-цепь содержит последовательность X25LCGX29X30LVEALYLVCGERGFFYTX31X32 (SEQ ID NO: 4), причем
Х8 представляет собой треонин или гистидин;
X17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин;
X19 представляет собой тирозин, 4-метоксифенилаланин или 4-аминофенилаланин;
Х23 представляет собой аспарагин или глицин;
Х25 представляет собой гистидин или треонин;
X29 представляет собой аланин, глицин или серин;
Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту;
X31 представляет собой пролин или лизин; и
Х32 представляет собой пролин или лизин, при условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
- 16 036714
В другом варианте осуществления В-цепь содержит последовательность X22VNQX25LCGX29X30LVE
ALYLVCGERGFFYT-X31X32X33X34X35 (SEQ ID NO: 5), причем
Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин;
Х25 представляет собой гистидин или треонин;
Х29 представляет собой аланин, глицин или серин;
Х30 представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту;
X31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин;
Х32 представляет собой лизин или пролин;
Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует;
Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и
Х35 представляет собой аргинин или отсутствует, при условии, что по меньшей мере один из X31 или Х32 представляет собой лизин.
Связывающий фрагмент.
Инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, образуются между первым и вторым инсулиновыми полипептидами, причем каждый инсулиновый полипептид содержит А-цепь и В-цепь. Первый и второй инсулиновые полипептиды могут представлять собой двухцепочечные аналоги инсулина (т.е. такие, в которых А и В-цепи связаны только посредством межцепьевых дисульфидных связей между внутренними остатками цистеина), причем первый и второй инсулиновые полипептиды связаны друг с другом с образованием димера посредством ковалентной связи, бифункционального линкера или с помощью клик-химии катализируемого медью (I) азид-алкинового циклоприсоединения (CuAAC) или клик-химии без меди для связывания связывающих фрагментов на соответствующих В-цепях. В соответствии с одним вариантом осуществления первый и второй инсулиновые полипептиды связаны друг с другом посредством бифункционального линкера, соединяющего боковую цепь лизина В28 или В29 Вцепи первого инсулинового полипептида с боковой цепью аминокислоты В28 или В29 В-цепи второго инсулинового полипептида.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент может представлять собой необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. Связывающий фрагмент может представлять собой двухвалентную, прямую или разветвленную, насыщенную или ненасыщенную, необязательно замещенную С1-С20 углеводородную цепь, в которой одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент.
В одном варианте осуществления связывающий фрагмент содержит PEG-линкер, короткий линейный полимер из приблизительно 2-25 этиленгликолевых звеньев или из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 25 этиленгликолевых звеньев и, необязательно, одну или несколько аминокислот. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора PEG-линкер содержит структуру (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)io, (PEG)ii, (PEG)i2, (PEG)13, (PEG)u, (PEG)15, (PEG)16 или (PEG)25. PEG-линкер может представлять собой бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов. Структура бифункционального PEGлинкера, конъюгированного с ε-аминогруппой групп лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, может быть представлена следующей общей формулой
причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 25, и волнистая линия обозначает связь между линкером и ε-аминогруппой. Способы конъюгирования PEG с ε-аминогруппой лизина хорошо известны в данной области техники, смотри, например, Veronese, Biomaterials 22: 405-417 (2001).
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора связывающий фрагмент PEG, конъюгирующий ε-аминогруппу лизина в положении В29 или В28 первого инсулинового полипептида с ε-аминокислотой лизина в положении В29 или В28 второго инсулинового полипептида, представляет собой
- 17 036714
причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит ацильный фрагмент, содержащий 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 15 или 16 атомов углерода. В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора ацильный фрагмент представляет собой сукциниловый (4), адипоиловый (С6), субероиловый (С8) или гексадекандиоиловый (С16) фрагмент. Ацильный фрагмент может содержать бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с εаминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов. Структура бифункционального ацильного линкера, конъюгированного с ε-аминогруппой группы лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, может быть представлена следующей общей формулой
причем n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора ацильный связывающий фрагмент, конъюгирующий ε-аминогруппу лизина в положении В29 или В28 первого инсулинового полипептида с ε-аминокислотой лизина в положении В29 или В28 второго инсулинового полипептида, представляет собой
причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора бифункциональный ацильный линкер может дополнительно включать в себя одну или две аминокислоты на одном или обоих концах ацильного линкера. Например, в отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора аминокислота на одном или обоих концах линкера представляет собой γ-глутаминовую кислоту (γЕ), что может быть представлено следующей общей формулой
- 18 036714
причем n=0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12, и волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер с амид-содержащей алкильной цепью, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с εаминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, что может быть представлено следующей общей формулой
причем n=1 или 2, o=1, 2, 3, 4 или 5, и волнистые линии обозначают связь между линкером и εаминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру
причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер с амид-содержащей алкильной цепью, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с εаминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, что может быть представлено следующей общей формулой
причем n=1, 2, 3, 4 или 5, о=1 или 2, р=1, 2, 3, 4 или 5, и волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру
причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер с амид-содержащей алкильной цепью, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с εаминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, и который может быть представлен следующей общей формулой
причем n=1 или 2, о=1, 2 или 3, р=1 или 2, и волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В одном конкретном варианте осуществления связывающий фрагмент может иметь структуру
- 19 036714
причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В отдельных вариантах осуществления связывающий фрагмент содержит кольцевую структуру, которая обеспечивает жесткость связывающего фрагмента. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит бензильную группу или насыщенную или ненасыщенную алициклическую группу, содержащую 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода. В отдельных вариантах осуществления алициклическая группа содержит циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклопентил или циклооктил. В отдельных вариантах осуществления ненасыщенная алициклическая группа (циклоалкан) содержит циклопропенильную, циклобутенильную, циклопентенильную, циклогексенильную, циклогептенильную или циклооктенильную группу. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура может дополнительно содержать одну или несколько насыщенных или ненасыщенных алифатических боковых цепей. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура может дополнительно содержать одну или несколько алифатических боковых цепей, содержащих один или несколько гетероатомов. В отдельных вариантах осуществления гетероатом представляет собой О, S или N.
В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит гетероатом. В отдельных вариантах осуществления гетероатом может представлять собой О, S или N. В отдельных вариантах осуществления кольцевая структура содержит бензильную группу или насыщенную или ненасыщенную алициклическую группу, содержащую 3, 4, 5, 6, 7 или 8 атомов углерода, в которой один или несколько атомов углерода замещены гетероатомом, выбранным из N, О и S. Примеры кольцевых структур, которые включают в себя гетероатом, включают, но без ограничения, этиленоксид, этиленимин, триметилоксид, фуран, тетрагидрофуран, тиофен, пирролидин, пиран, пиперидин, имидазол, тиазол, диоксан, морфолин, пиримидин, триазол, тиетан, 1,3-диазетин, 2,3-дигидроазет, 1,2-оксатиолан, изоксазол, оксазол, силол, оксепан, тиепин, 3,4,5,6-тетрагидро-2Н-азепин, 1,4-тиазепин, азокан и тиокан.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,1-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу причем Rj и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем Ri и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 или С1-С6 алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, C(O)O-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)io, (PEG)n, (PEG)i2, (PEG)i3, (PEG)i4, (PEG)i5, (PEG)i6 или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,1-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем n и о независимо представляют собой 0, i, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
- 20 036714
причем R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 или С1-С6 алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С (О)-, С(О)О-, ОС (О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)% (PEGk (PEG)5, (PEG)& (PEG)7, (PEG)s, (PEG)& (PEG)10, (PEG)u, (PEG)i2, (PEG)i3, (PEG)14, (PEG)i5, (PEG)i6 или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем n и o независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную C1-C20 или С1-С6 алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -С(О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)n, (PEG)i2, (PEG)i3, (PEG)14, (PEG)i5, (PEG)i6 или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем n и o независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем m, n, и o независимо представляют собой 1 или 2; R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную C1C20 или С1-С6 алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -O-, -S-, -N(R)-, -C(O)-, C(O)O-, OC(O)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-,
- 21 036714
-N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)13, (PEG)m, (PEGb, (PEG)ie или (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу | ' П О причем m, n, и o независимо представляют собой 1 или 2; причем р и q независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
ΙΟ. ΉΉ1 \ И——[Г ¼ О причем m, n, и о независимо представляют собой 1 или 2; причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилциклогексан, имеющий следующую общую формулу
и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацилциклогексан, имеющий следующую общую формулу
и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу ~~ нГ т причем m и n независимо представляют собой 0, 1 или 2 при условии, что оба m и n не представляют собой 0; R1 и R2 могут быть одинаковыми или различными, причем R1 и R2 независимо представляют собой связь, насыщенную или ненасыщенную С1-С20 или С1-С6 алкильную цепь, причем одно или несколько метиленовых звеньев необязательно и независимо замещены на -О-, -S-, -N(R)-, -С (О)-, С(О)О-, ОС(О)-, -N(R)C(O)-, -C(O)N(R)-, -S(O)-, -S(O)2-, -N(R)SO2-, SO2N(R)-, гетероциклическую группу, арильную группу или гетероарильную группу, причем каждое вхождение R независимо представляет собой водород, подходящую защитную группу, ацильный фрагмент, арилалкильный фрагмент, алифатический фрагмент, арильный фрагмент, гетероарильный фрагмент или гетероалифатический фрагмент, поли(этиленгликолевую) (PEG) цепь (PEG)2, (PEG)3, (PEG)4, (PEG)5, (PEG)6, (PEG)7, (PEG)8, (PEG)9, (PEG)10, (PEG)11, (PEG)12, (PEG)i3, (PEG)14, (PEG)15, (PEG)16 или
- 22 036714 (PEG)2, и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилбензол, имеющий следующую общую формулу
причем m и n независимо представляют собой 1 или 2; причем р и q независимо представляют собой 0, 1, 2, 3, 4 или 5, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,1-диацил, имеющий следующую общую формулу
причем n представляет собой 1, 2, 3 или 4, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,1-диацил может иметь структуру, выбранную из
(1,1-диацил-С3; 1,2-диацил-С4; 1,1-диацил-С5; и 1,1-диацил-С6 соответственно), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,2-диацил, имеющий следующую общую формулу
причем n представляет собой 1, 2, 3 или 4, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,2-диацил может иметь структуру, выбранную из (1,2-диацил-С3; 1,2-диацил-С4;
11 , - и 1'
1,2-диацил-С5; и 1,2-диацил-С6, соответственно), причем волни стые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацил, имеющий следующую общую формулу
причем n представляет собой 1, 2 или 3, причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов. В конкретных вариантах осуществления 1,3-диацил может иметь структуру, выбранную из
- 23 036714 „ г, ОО ОО хКА АХ и АА (1,3-диацил-С4; 1,3-диацил-С5; и 1,3-диацил-С6, соответственно), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,4-диацил, имеющий следующую общую формулу (1,4-диацил-С6), причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом варианте осуществления связывающий фрагмент содержит бифункциональный линкер, который может быть ковалентно конъюгирован или связан с ε-аминогруппой остатков лизина в положении В29 или В28 первого и второго инсулиновых полипептидов, который может быть представлен как 1,3-диацилциклобутил, имеющий следующую общую формулу и причем волнистые линии обозначают связь между линкером и ε-аминогруппой лизина в положении В29 или В28 инсулиновых полипептидов.
В другом аспекте настоящего изобретения первый и второй инсулиновые полипептиды могут быть конъюгированы вместе с помощью катализируемого медью азид-алкинового циклоприсоединения Хьюсгена (CuAAc), в частности клик-химии CuAAC. В данном аспекте ε-аминогруппа лизина В28 или В29 первого инсулинового полипептида конъюгирована с линкерным фрагментом, имеющим проксимальный конец и дистальный конец, причем проксимальный конец линкерного фрагмента конъюгирован с εаминогруппой, а дистальный содержит азидную группу. В данном аспекте ε-аминогруппа лизина В28 или В29 второго инсулинового полипептида конъюгирована с линкерным фрагментом, имеющим проксимальный конец и дистальный конец, причем проксимальный конец линкерного фрагмента конъюгирован с ε-аминогруппой, а дистальный содержит алкиновую группу. В присутствии Cu2+ и восстанавливающего средства азидная и алкиновая группы будут образовывать непрерывный связывающий фрагмент, содержащий триазольный фрагмент. Для описания клик-химии CuAAC см. патент США № 8129542, который включен в настоящий документ во всей полноте.
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора первый инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу z Nj а второй инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу
В присутствии Cu2+ и восстанавливающего средства линкеры объединяются с образованием связывающего фрагмента, имеющего структуру о о .
В отдельных аспектах частичных агонистов инсулинового рецептора первый инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу
- 24 036714
причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10, а второй инсулиновый полипептид может иметь конъюгированный с ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу
причем n=1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В присутствии Cu2+ и восстанавливающего средства линкеры объединяются с образованием связывающего фрагмента, имеющего структуру
причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10.
В другом аспекте как первый инсулиновый полипептид, так и второй инсулиновый полипептид могут иметь конъюгированный с их соответствующей ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу
причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Конъюгация линкеров с образованием связывающего фрагмента может быть достигнута посредством предоставления молекулы (промежуточного или мостикового линкера), имеющей структуру
-------R--причем R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.
В другом аспекте как первый инсулиновый полипептид, так и второй инсулиновый полипептид могут иметь конъюгированный с их соответствующей ε-аминогруппой лизина В28 или В29 линкер, имеющий формулу
причем каждый n независимо представляет собой 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. Конъюгация линкеров с образованием связывающего фрагмента может быть достигнута посредством предоставления молекулы (промежуточного или мостикового линкера), имеющей структуру
Nj---R---N3 причем R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой С2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или С10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25.
В отдельных аспектах первый инсулиновый полимер конъюгирован по ε-аминогруппе лизина В28 или В29 с заканчивающимся азидом линкером, как указано выше, а второй инсулиновый полипептид конъюгирован по ε-аминогруппе лизина В28 или В29 с линкером, заканчивающимся циклооктиновым фрагментом, и линкеры конъюгируют с образованием линкерного фрагмента с помощью клик-химии циклоприсоединения без меди. См., например, патент США № 7807619, который включен в настоящий документ во всей полноте.
Следующая таблица показывает примеры линкеров, которые могут быть использованы для конст- 25 036714 руирования димеров настоящего изобретения. Показанные димеры содержат 2,5-диоксопирролидин-1ильные группы для конъюгирования с ε-аминогруппой лизина В29 или В29
Таблица линкеров
Линкер Название
1 О-у./ \ Ζ1 ^=о о Ζ-- C6+Nc6
2 ΖΙ ιζ ί \ °=\ О. /° о, '° 7 г / V / \ \/ ° \ / 'Ό C6N+C6+NC 6
3 IZ \=о О=К ζι I 1 о П П 2— о о / \ γΕ-08-γΕ
4 /1 0 0 Клик-1
5 .о Г о Клик-2
б 0 oz TZ о $ о ь ήΗ-ϊ Клик-3
7 Клик-4
- 26 036714
θ \ 1 ° \ Jt л Клик-5
9 Cr°= Клик-6
10 ог ° У о \ ,о Ζ-- о- С2
11 %/А ζ—4, </ ° У0 ο=ς 4 /° /—z С4
12 l\/\ Z---4% о7 ° о °Ч X ° ,/ ~'z о С6
13 0 н 1 / / 1 0 О се
- 27 036714
- 28 036714
- 29 036714
- 30 036714
25 Λ ζ° о / ϊ θ U О г\ \<Nx Лхх/χΛ JC J γΝχ'ΧΖ'γ ° Д16 Сб-аланин
26 Οχ/’) z—C ¢/ ° V ZX 7 /=o о \ z° Z~T C6- изолейцин
27 О=^6Э z ° \ ZI —/ /=° о X z0 ZT О=\Э C6-лейцин
28 о.-// Z-L с/ ° ZI —\ A° 2 О \ ,O z—У Сб-валин
29 ΓΊ I! O^x^xA^Z-x^x-^CU, Λ О у ]J N \ Ам'° 0 А/ / N Q 0 Дипропилф енол
30 0 О /—\ 0 о л > Ch s 1 N-0 4ί 0-NvJ 0 0 Транс- циклогекс ан-1,4- дикислота
31 О 0 ,—4 0 0 ^M-CJ^—^ 0 o' Цис- циклогекс ан-1,4- дикислота
- 31 036714
- 32 036714
39 „ О 0 „ О о 1,1- диацил-С5
40 О 1 g О о о П=1, 2, 3 ИЛИ 4 1,1- диацил-Сб
41 О Α-οχ Ч к ! 5 1,2- диацил-СЗ
42 о ° Ол ι у 1,2- диацил-С4
43 Ух ° шл р 1,2- диацил-С5
44 Ух ° См λ у 1,2- диацил-Сб
45 ο=χ ί о о=/ ° \ о 2-^° О=/ J 1,3- диацил-С4
- 33 036714
46 ί о о=/ ° X о ζ^Ο о=/ J 1,3- диацил-С5
47 О Ν Λ ? о / ° / 1,3- диацил-Сб
48 Г о Х₽О о Q=< Т 1,4- диацилциклобути л-С1
49 8 1,4- циклогекс ил-С1
50 о, / ° 0^0 о=/ Ύ 1, 4- циклогекс ил-С2
Конъюгация бифункционального линкера с ε-аминогруппой остатка лизина в положении В29 или В28 полипептида В-цепи двух молекул инсулинов или аналогов инсулина с образованием инсулинового димера, связанного посредством связывающего фрагмента, может быть схематически показана как
I инсулин 1 I | инсулин~Г~|
ΗΝ о
о
Бифункци онал ьны й ли н кер
NH2 nh2 но ° +2
I инсулин 2 I /О HN _______1_ | инсулин 2 |
N- гидрокси сукцинимид
Инсулиновый димер причем молекулы инсулин 1 и инсулин 2 могут быть одинаковыми или различными, и бифункциональный линкер и получаемый связывающий фрагмент после конъюгации могут иметь структуру любого линкера и получаемого связывающего фрагмента, раскрытых в настоящем документе.
Модификация инсулиновых полипептидов.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидов А-цепи или полипептидов В-цепи частичного агониста инсулинового рецептора модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу. Ацильная группа может быть ковалентно связана с аминокислотой инсулинового полипептида непосредственно или с аминокислотой инсулинового полипептида опосредованно через спейсер, причем спейсер расположен между аминокислотой инсулинового полипептида и ацильной группой. Инсулиновый полипептид может быть ацилирован в том же аминокислотном положении, в котором связан гидрофильный фрагмент, или в другом аминокислотном положении. Например, ацилирование может происходить в любом положении, включая любую аминокислоту полипептидов А- или Вцепи, а также положение в пределах связывающего фрагмента при условии, что активность, проявляемая неацилированным инсулиновым полипептидом, сохраняется после ацилирования. Неограничивающие примеры включают ацилирование в положении А1 А-цепи и положении В1 В-цепи.
В одном конкретном аспекте настоящего изобретения первый и/или второй инсулиновый полипептид (или его производное или конъюгат) модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу посредством непосредственного ацилирования амина, гидроксила или тиола боковой цепи аминокислоты инсулинового полипептида. В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй инсулиновый полипептид непосредственно ацилирован по амину, гидроксилу или тиолу боковой цепи аминокислоты. В связи с этим может быть предложен инсулиновый полипептид, который модифицирован посредством одной или нескольких аминокислотных замен в полипептидной последовательности Аили В-цепи, включая, например, в положениях A1, A14, А15, B1, B10 или В22 или в любом положении
- 34 036714 связывающего фрагмента, на аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи.
В некоторых вариантах осуществления спейсер между первым и/или вторым инсулиновым полипептидом и ацильной группой представляет собой аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи (или дипептид или трипептид, содержащий аминокислоту, содержащую амин, гидроксил или тиол в боковой цепи). В некоторых вариантах осуществления спейсер содержит гидрофильный бифункциональный спейсер. В одном конкретном варианте осуществления спейсер содержит аминополи(алкилокси)карбоксилат. В связи с этим спейсер может содержать, например, NH2(CH2CH2O)n(CH2) mCOOH, причем m представляет собой любое целое число от 1 до 6, a n представляет собой любое число от 2 до 12, в том числе, например, 8-амино-3,6-диоксаоктановую кислоту, которая коммерчески доступна от Peptides International, Inc. (Louisville, KY). В одном варианте осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит две или более реактивные группы, например аминогруппу, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофильный бифункциональный спейсер содержит тиольную группу и карбоксилат.
В некоторых вариантах осуществления спейсер между первым и/или вторым инсулиновым полипептидом и ацильной группой представляет собой гидрофобный бифункциональный спейсер. Гидрофобные бифункциональные спейсеры известны в данной области техники. См., например, документ Bioconjugate Techniques, G.Т. Hermanson (Academic Press, San Diego, CA, 1996), который включен посредством ссылки во всей полноте. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит две или более реактивные группы, например аминогруппу, гидроксильную, тиольную и карбоксильную группу или любые их комбинации. В некоторых вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит гидроксильную группу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит аминогруппу и карбоксилат. В других вариантах осуществления гидрофобный бифункциональный спейсер содержит тиольную группу и карбоксилат. Подходящие гидрофобный бифункциональный спейсеры, содержащие карбоксилат и гидроксильную группу или тиольную группу, известны в данной области техники и включают, например, 8гидроксиоктановую кислоту и 8-меркаптооктановую кислоту.
В соответствии с некоторыми вариантами осуществления бифункциональный спейсер может представлять собой синтетическую или природную аминокислоту, содержащую остов аминокислоты, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, 6-аминокапроновую кислоту, 5-аминовалериановую кислоту, 7-аминогептановую кислоту и 8-аминооктановую кислоту). В качестве альтернативы, спейсер может представлять собой дипептидный или трипептидный спейсер, имеющий пептидный остов, который имеет длину от 3 до 10 атомов (например, от 6 до 10 атомов). Каждая аминокислота дипептидного или трипептидного спейсера, прикрепленного к инсулиновому полипептиду, может быть независимо выбрана из группы, состоящей из природных и/или неприродных аминокислот, включая, например, любой из D или L изомеров природных аминокислот (Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Pro, Arg, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr) или любой D или L изомер неприродных аминокислот, выбранных из группы, состоящей из β-аланина (β-Ala), N-a-метилаланина (Ме-Ala), аминомасляной кислоты (Abu), αаминомасляной кислоты (γ-Abu), аминокапроновой кислоты (ε-Ahx), аминоизомасляной кислоты (Aib), аминометилпирролкарбоновой кислоты, аминопиперидинкарбоновой кислоты, аминосерина (Ams), аминотетрагидропиран-4-карбоновой кислоты, N-метокси-N-метиламида аргинина, β-аспарагиновой кислоты (β-Asp), азетидинкарбоновой кислоты, 3-(2-бензотиазолил)аланина, α-трет-бутилглицина, 2-амино-5уреидо-н-валериановой кислоты (цитруллина, Cit), β-циклогексилаланина (Cha), ацетамидометилцистеина, диаминомасляной кислоты (Dab), диаминопропионовой кислоты (Dpr), дигидроксифенилаланина (DOPA), диметилтиазолидина (DMTA), γ-глутаминовой кислоты (γ-Glu), гомосерина (Hse), гидроксипролина (Hyp), N-метокси-N-метиламида изолейцина, метилизолейцина (MeIle), изонипекотиновой кислоты (Isn), метиллейцина (MeLeu), метиллизина, диметиллизина, триметиллизина, метанопролина, метионинсульфоксида (Met(О)), метионинсульфона (Met(O2)), норлейцина (Nle), метилнорлейцина (Me-Nle), норвалина (Nva), орнитина (Orn), парааминобензойной кислоты (РАВА), пеницилламина (Pen), метилфенилаланина (MePhe), 4-хлорфенилаланина (Phe(4-Cl)), 4-фторфенилаланина (Phe(4-F)), 4нитрофенилаланина (Phe(4-NO2)), 4-цианофенилаланина ((Phe(4-CN)), фенилглицина (Phg), пиперидинилаланина, пиперидинилглицина, 3,4-дегидропролина, пирролидинилаланина, саркозина (Sar), селеноцистеина (Sec), О-бензилфосфосерина, 4-амино-3-гидрокси-6-метилгептановой кислоты (Sta), 4-амино-5циклогексил-3-гидроксипентановой кислоты (АСНРА), 4-амино-3-гидрокси-5-фенилпентановой кислоты (АНРРА), 1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-3-карбоновой кислоты (Tic), тетрагидропиранглицина, тиенилаланина (Thi), O-бензилфосфотирозина, О-фосфотирозина, метокситирозина, этокситирозина, О-(бисдиметиламинофосфоно)тирозина, тирозинсульфата тетрабутиламина, метилвалина (MeVal), 1-амино-1циклогексанкарбоновой кислоты (Асх), аминовалериановой кислоты, β-циклопропилаланина (Сра), пропаргилглицина (Prg), аллилглицина (Alg), 2-амино-2-циклогексилпропановой кислоты (2-Cha), трет- 35 036714 бутилглицина (Tbg), винилглицина (Vg), 1-амино-1-циклопропанкарбоновой кислоты (Аср), 1-амино-1циклопентанкарбоновой кислоты (Асре), алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты, 1-амино-1циклобутанкарбоновой кислоты (Acb). В некоторых вариантах осуществления дипептидный спейсер выбирают из группы, состоящей из Ala-Ala, β-Ala-e-Ala, Leu-Leu, Pro-Pro, γ-аминомасляная кислота-γаминомасляная кислота и γ-Glu-Y-Glu.
Первый и/или второй инсулиновый полипептид может быть модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу, посредством ацилирования длинноцепочечного алкана. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминогруппу, гидроксильную или тиольную группу (например октадециламин, тетрадеканол и гексадекантиол), которые реагируют с карбоксильной группой инсулинового полипептида или ее активированной формой. Карбоксильная группа инсулинового полипептида или ее активированная форма могут быть частью боковой цепи аминокислоты (например, глутаминовой кислоты, аспарагиновой кислоты) инсулинового полипептида или могут быть частью пептидного остова.
В некоторых вариантах осуществления первый и/или второй инсулиновый полипептид модифицирован таким образом, что он содержит ацильную группу посредством ацилирования длинноцепочечного алкана спейсером, который прикреплен к инсулиновому полипептиду. В конкретных аспектах длинноцепочечный алкан содержит аминогруппу, гидроксильную или тиольную группу, которые реагируют с карбоксильной группой спейсера или ее активированной формой. Подходящие спейсеры, содержащие карбоксильную группу или ее активированную форму, описаны в настоящем документе и включают, например, бифункциональные спейсеры, например аминокислоты, дипептиды, трипептиды, гидрофильные бифункциональные спейсеры и гидрофобные бифункциональные спейсеры. Как используется в настоящем документе, термин активированная форма карбоксильной группы относится к карбоксильной группе с общей формулой R(C=O)X, где X представляет собой уходящую группу, a R представляет собой инсулиновый полипептид или спейсер. Например, активированные формы карбоксильных групп могут включать, но без ограничения, ацилхлориды, ангидриды и сложные эфиры. В некоторых вариантах осуществления активированная карбоксильная группа представляет собой сложный эфир с Nгидроксисукцинимидной (NHS) уходящей группой.
В тех аспектах настоящего изобретения, в которых длинноцепочечный алкан ацилирован пептидом, инсулиновым полипептидом или спейсером, длинноцепочечный алкан может иметь любой размер и может содержать углеродную цепь любой длины. Длинноцепочечный алкан может быть линейным или разветвленным. В некоторых аспектах длинноцепочечный алкан представляет собой С430-алкан. Например, длинноцепочечный алкан может представлять собой любой алкан из С4 алкана, С6 алкана, С8 алкана, С10 алкана, C12 алкана, C14 алкана, C16 алкана, C18 алкана, С20 алкана, С22 алкана, С24 алкана, С26 алкана, С28 алкана или С30 алкана. В некоторых вариантах осуществления длинноцепочечный алкан содержит С8С20-алкан, например C14 алкан, С16 алкан или C18 алкан.
В некоторых вариантах осуществления аминогруппа, гидроксильная или тиольная группа первого и/или второго инсулинового полипептида ацилированы холестериновой кислотой. В одном конкретном варианте осуществления пептид связан с холестериновой кислотой посредством алкилированного дезамино-Cys-спейсера, т.е. спейсера на сонове алкилированной 3-меркаптопропионовой кислоты. Подходящие способы ацилирования пептидов по аминам, гидроксилам и тиолам известны в данной области техники. Смотри, например, Miller, Biochem. Biophys. Res. Commun 218: 377-382 (1996); Shimohigashi and Stammer, Int. J. Pept. Protein Res. 19: 54-62 (1982); и Previero et al., Biochim. Biophys. Acta 263: 7-13 (1972) (в отношении способов ацилирования по гидроксилу); и San and Silvius, J. Pept. Res. 66: 169-180 (2005) (в отношении способов ацилирования по тиолу); Bioconjugate Chem. Chemical Modifications of Proteins: History and Applications p. 1, 2-12 (1990); Hashimoto et al., Pharmacuetical Res. Synthesis of Palmitoyl Derivatives of Insulin and their Biological Activity Vol. 6, NO: 2 pp. 171-176 (1989).
Ацильная группа ацилированного пептида первого и/или второго инсулинового полипептида может иметь любой размер, например любую длину углеродной цепи, и может быть линейной или разветвленной. В некоторых конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения ацильная группа представляет собой С4-С30-жирную кислоту. Например, ацильная группа может представлять собой любую из С4 жирной кислоты, С6 жирной кислоты, С8 жирной кислоты, С10 жирной кислоты, C12 жирной кислоты, C14 жирной кислоты, C16 жирной кислоты, C18 жирной кислоты, С20 жирной кислоты, С22 жирной кислоты, С24 жирной кислоты, С26 жирной кислоты, С28 жирной кислоты или С30 жирной кислоты. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой С820-жирную кислоту, например C14 жирную кислоту или C16 жирную кислоту. В некоторых вариантах осуществления ацильная группа представляет собой мочевину.
В альтернативном варианте осуществления ацильная группа представляет собой желчную кислоту. Желчная кислота может представлять собой любую подходящую желчную кислоту, включая, но без ограничения, холевую кислоту, хенодезоксихолевую кислоту, дезоксихолевую кислоту, литохолевую кислоту, таурохолевую кислоту, гликохолевую кислоту и холестериновую кислоту.
Ацилированный первый и/или второй инсулиновый полипептид, описанный в настоящем докумен
- 36 036714 те, может быть дополнительно модифицирован таким образом, что он содержит гидрофильный фрагмент. В некоторых конкретных вариантах осуществления гидрофильный фрагмент может содержать полиэтиленгликолевую (PEG) цепь. Включение гидрофильного фрагмента может быть осуществлено любыми подходящими способами, такими как любой из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ацилированный одноцепочечный аналог содержит аминокислоту, выбранную из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe, и боковая цепь аминокислоты ковалентно связана с гидрофильным фрагментом (например, PEG). В одном варианте осуществления ацильная группа прикреплена к положению А1, А14, А15, В1, В2, В10 или В22 (в соответствии с нумерацией аминокислот А и В-цепей нативного инсулина), необязательно посредством спейсера, содержащего Cys, Lys, Orn, гомо-Cys или Ac-Phe.
В качестве альтернативы, ацилированный первый и/или второй инсулиновый полипептид содержит спейсер, причем спейсер является как ацилированным, так и модифицированным таким образом, что он содержит гидрофильный фрагмент. Неограничивающие примеры подходящих спейсеров включают спейсер, содержащий одну или несколько аминокислот, выбранных из группы, состоящей из Cys, Lys, Orn, гомо-Cys и Ac-Phe.
В некоторых вариантах осуществления амино-конец по меньшей мере одной N-концевой аминокислоты по меньшей мере одного из полипептидов А-цепи и полипептидов В-цепи частичного агониста инсулинового рецептора модифицирован таким образом, что он содержит заместитель. Заместитель может быть ковалентно связан с аминогруппой N-концевой аминокислоты непосредственно или с аминогруппой опосредованно через спейсер, причем спейсер расположен между аминогруппой N-концевой аминокислоты инсулинового полипептида и заместителем. Заместитель может представлять собой ацильный фрагмент, как рассмотрено выше. Заместитель может иметь общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу или PEG2-группу (структуры заместителей см. в примерах в настоящем документе). Карбамоилирование инсулина было раскрыто Oimoni et al., Nephron 46: 63-66 (1987), а инсулиновые димеры, содержащие карбамоильные группы на Т-конце, были раскрыты в опубликованной заявке РСТ № WO 2014052451 (например, MIU-90).
В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере одна N-концевая аминокислота конъюгирована по азоту N2 с заместителем, содержащим N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу или PEG2-группу.
В отдельных вариантах осуществления сахарид, ковалентно связанный с одним или несколькими амино-концами первого и второго инсулиновых полипептидов, может представлять собой моносахарид, см., например, димер 51. В некоторых вариантах осуществления сахарид содержит одну или несколько аминогрупп. В некоторых вариантах осуществления сахарид и аминогруппа разделены Cl-C6-алкильной группой, например Cl-C3-алкильной группой. В некоторых вариантах осуществления сахарид представляет собой аминоэтилглюкозу (AEG). В некоторых вариантах осуществления сахаридный лиганд находится в конфигурации D. В других вариантах осуществления сахаридный лиганд находится в конфигурации L. Ниже показаны структуры этих типичных сахаридов. Другие типичные сахариды будут очевидны для специалистов в данной области техники
AEG-α AEG-β.
Обычно сахариды могут быть непосредственно или опосредованно конъюгированы посредством линкера с амино-концом одного или нескольких из первого и второго инсулиновых полипептидов. В отдельных аспектах линкер представляет собой алкилдиоил, -С(О)(СН2)пС(О)-, где n=0-45, 0-20, 0-10 или 0-5.
Типичными заместителями, конъюгированными с N-концевой аминогруппой, могут быть
- 37 036714
причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и N-концевой аминогруппой. Заместитель может также представлять собой
(Ме2; N-диметил) причем волнистая линия обозначает связь между Ме2 и углеродом-α N-концевой аминокислоты.
Примеры инсулиновых димеров.
В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированы вместе посредством бифункционального линкера, выбранного из группы, состоящей из линкера 1, линкера 2, линкера 3, линкера 10, линкера 11, линкера 12, линкера 13, линкера 14, линкера 15, линкера 16, линкера 17, линкера 18, линкера 19, линкера 20, линкера 21, линкера 22, линкера 23, линкера 24, линкера 25, линкера 26, линкера 27, линкера 28, линкера 29, линкера 30, линкера 31, линкера 32, линкера 33, линкера 34, линкера 35, линкера 36, линкера 37, линкера 38, линкера 39, линкера 40, линкера 41, линкера 42, линкера 43, линкера 44, линкера 45, линкера 46, линкера 47, линкера 48, линкера 49 и линкера 50, при условии, что когда бифункциональный линкер представляет собой линкер 10, линкер 11, линкер 12, линкер 13 или линкер 14, по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-С6 алкильную группу или PEG2-группу.
В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгированный с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгированный со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, конъюгированы вместе посредством первого линкера и второго линкера. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил,
- 38 036714
N-алкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-С6 алкильную группу или PEG2-группу.
В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгирован с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгирован со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 5 и линкера 7, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру
Ξ=-R-== где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой C2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или C10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, Nалкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-С6 алкильную группу или PEG2-группу.
В отдельных вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает инсулиновые димеры, в которых первый В29 или В28 Lys молекулы первого инсулинового гетеродимера, содержащего первый полипептид А-цепи и первый полипептид В-цепи, конъюгирован с первым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, и второй В29 или В28 Lys второго инсулинового гетеродимера, содержащего второй полипептид А-цепи и второй полипептид В-цепи, конъюгирован со вторым линкером, выбранным из группы, состоящей из линкера 4, линкера 6, линкера 8 и линкера 9, причем первый и второй линкеры конъюгированы вместе посредством мостикового линкера, имеющего структуру
Nj---R---N3 где R представляет собой ковалентную связь, атом углерода, фенил, гетероатом или необязательно замещенную группу, выбранную из группы, состоящей из ацильной, алифатической, гетероалифатической, арильной, гетероарильной и гетероциклической. В отдельных аспектах R представляет собой C2, С3, С4, С6, С7, С8, С9 или C10 ацильную группу или PEG2, PEG3, PEG4, PEG5, PEG6, PEG7, PEG8, PEG9, PEG10, PEG11, PEG12, PEG13 или PEG25. В отдельных вариантах осуществления по меньшей мере один из первого или второго полипептидов А-цепи или В-цепи конъюгирован своей N-концевой аминокислотой с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или по меньшей мере N-концевые аминокислоты молекулы первого инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем, раскрытым в настоящем документе, или N-концевые аминокислоты как первого инсулинового гетеродимера, так и второго инсулинового гетеродимера конъюгированы с заместителем. В отдельных вариантах осуществления заместитель содержит N-гидроксисукцинимидный сложный эфир, связанный с группой, имеющей общую формулу RC(O)-, где R может представлять собой R'CH2, R'NH, R'O, и R' может представлять собой Н, линейную алкильную цепь, аминокислоту, пептид, полиэтиленгликоль (PEG), сахариды, т.е. в отдельных аспектах RC(O)- может представлять собой ацетил, фенилацетил, карбамоил, Nалкилкарбамоил или алкоксикарбонил. В отдельных аспектах заместитель представляет собой карбамоильную группу, ацетильную группу, глицин, метильную группу, метоксигруппу, диметильную группу, изобутильную группу, PEGI-группу, AEG-группу, AEG-С6 алкильную группу или PEG2-группу.
В других вариантах осуществления первый и второй инсулиновые гетеродимеры могут содержать любую из молекул инсулинов или аналогов инсулина, раскрытых в настоящем документе.
Настоящее изобретение предлагает также инсулиновые димеры, выбранные из
- 39 036714
N С 'ОН
- 40 036714
димера 8
- 41 036714
- 42 036714
- 43 036714
- 44 036714
димера 20
- 45 036714
- 46 036714 димера 24
димера 30
- 47 036714
димера 36
- 48 036714
димера 39;
- 49 036714
- 50 036714
димера 45
он димера 51
- 52 036714
димера 57
- 53 036714
димера 60
- 54 036714
- 55 036714
- 56 036714
димера 72
- 57 036714
димера 78
- 58 036714
димера 84
- 59 036714
димера 89
- 60 036714
димера 94
Причем дисульфидные связи между остатками Cys6 и Cys11 полипептида А-цепи и дисульфидные связи между Cys7 и Cys20 А-цепи с Cys7 и Cys19 полипептида В-цепи, соответственно, представлены с помощью сплошной линии между ними; причем связывающие фрагменты ковалентно связаны с εаминокислотой показанного остатка лизина, причем полипептид А-цепи для димеров 1-40, 42-52, 54-86 и 88-94 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; полипептид А-цепи для димера 56 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 11; полипептид В-цепи для димеров 1-17, 21-27, 36, 37, 39-40 и 42-52, 54-82, 84-86 и 88-94 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2; полипептид В-цепи для димеров 18 и 32-35 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6; полипептид В-цепи для димеров 19 и 83 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9; полипептид В-цепи для димеров 20, 28-31 и 38 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 10; и полипептид Ацепи и полипептид В-цепи для димеров 53 и 8 7 представляют собой SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, соответственно.
Фармацевтические композиции.
В соответствии с одним вариантом осуществления предлагается фармацевтическая композиция, содержащая любой из новых инсулиновых димеров, раскрытых в настоящем документе, предпочтительно с уровнем чистоты, составляющим по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%, и фармацев
- 61 036714 тически приемлемый разбавитель, носитель или вспомогоательное вещество. Такие композиции могут содержать инсулиновый димер, раскрытый в настоящем документе, в концентрации, составляющей по меньшей мере 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 мг/мл или больше. В одном варианте осуществления фармацевтические композиции содержат водные растворы, которые стерилизуют и, необязательно, хранят, помещая в различные упаковочные контейнеры. В других вариантах осуществления фармацевтические композиции содержат лиофилизованный порошок. Фармацевтические композиции могут быть также упакованы как часть набора, который включает в себя одноразовое устройство для введения композиции пациенту. Контейнеры или наборы могут быть помечены для хранения при комнатной температуре или при пониженной температуре.
Раскрытые инсулиновые димеры, как полагают, пригодны для любого применения, которое ранее было описано для инсулиновых пептидов. Соответственно, инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, можно использовать для лечения гипергликемии или лечения других метаболических заболеваний, которые являются результатом высокого уровня глюкозы в крови. Соответственно, настоящее изобретение охватывает фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, для применения при лечении пациента, страдающего от высоких уровней глюкозы в крови. В соответствии с одним вариантом осуществления пациент, подлежащий лечению с помощью инсулинового димера, раскрытого в настоящем документе, представляет собой одомашненное животное, а в другом варианте осуществления пациент, подлежащий лечению, представляет собой человека.
Один из способов лечения гипергликемии в соответствии с настоящим раскрытием содержит этапы введения раскрытых в настоящем документе инсулиновых димеров пациенту с помощью любого стандартного пути введения, включая парентеральный, в том числе внутривенно, внутрибрюшинно, подкожно или внутримышечно, интратекально, трансдермально, ректально, перорально, назально или с помощью ингаляции. В одном варианте осуществления композицию вводят подкожно или внутримышечно. В одном варианте осуществления композицию вводят парентерально, и инсулиновый полипептид или его производное пролекарство предварительно заправляют в шприц.
Инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, могут быть введены по отдельности или в комбинации с другими противодиабетическими средствами. Противодиабетические средства, известные в данной области техники или находящиеся в стадии разработки, включают нативный инсулин, нативный глюкагон и их функциональные аналоги, сульфонилмочевины, такие как толбутамид (Orinase), ацетогексамид (Dymelor), толазамид (Tolinase), хлорпропамид (Diabinese), глипизид (Glucotrol), глибурид (Diabeta, Micronase, Glynase), глимепирид (Amaryl) или гликлазид (Diamicron); меглитиниды, такие как репаглинид (Prandin) или натеглинид (Starlix); бигуаниды, такие как метформин (Glucophage) или фенформин; тиазолидиндионы, такие как розиглитазон (Avandia), пиоглитазон (Actos) или троглитазон (Rezulin), или другие ингибиторы PPARy; ингибиторы α-глюкозидазы, которые ингибируют расщепление углеводов, такие как миглитол (Glyset), акарбоза (Precose/Glucobay); экзенатид (Byetta) или прамлинтид; ингибиторы дипептидилпептидазы-4 (DPP-4), такие как вилдаглиптин или ситаглиптин; ингибиторы SGLT (натрийзависимого переносчика 1 глюкозы); или ингибиторы ФБФ-азы (фруктозо-1,6бисфосфатазы).
Фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе, могут быть составлены и введены пациентам с использованием стандартных фармацевтически приемлемых носителей и путей введения, известных специалистам в данной области техники. Соответственно, настоящее раскрытие также охватывает фармацевтические композиции, содержащие один или несколько из инсулиновых димеров, раскрытых в настоящем документе, или их фармацевтически приемлемую соль, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Например, фармацевтические композиции, содержащие инсулиновые димеры, раскрытые в настоящем документе могут, необязательно, содержать ионы цинка, консерванты (например, фенол, крезол, парабены), изотонизирующие средства (например, маннит, сорбит, лактозу, декстрозу, трегалозу, хлорид натрия, глицерин), буферные вещества, соли, кислоты и щелочи, а также другие вспомогательные вещества. Эти вещества могут в каждом случае присутствовать по отдельности или, в качестве альтернативы, в виде смесей. Г лицерин, декстроза, лактоза, сорбит и маннит обычно присутствуют в фармацевтическом препарате в концентрации, составляющей 100-250 мМ, NaCl в концентрации, составляющей вплоть до 150 мМ. Буферные вещества, такие как, например, фосфатный, ацетатный, цитратный, аргининовый, глицил-глициновый или TRIS (т.е. 2амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиоловый) буфер и соответствующие соли, присутствуют в концентрации, составляющей 5-250 мМ, обычно от приблизительно 10-100 мМ. Другие вспомогательные вещества могут представлять собой, кроме того, соли или аргинин.
В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит инсулиновый димер в концентрации 1 мг/мл при рН от приблизительно 4,0 до приблизительно 7,0 в фосфатной буферной системе. Фармацевтические композиции могут содержать инсулиновый димер в качестве единственного фармацевтически активного компонента, или инсулиновый димер может быть объединен с одним или несколькими дополнительными активными средствами.
Все терапевтические способы, фармацевтические композиции, наборы и другие аналогичные вари- 62 036714 анты осуществления, описанные в настоящем документе, предусматривают, что инсулиновые димеры включают в себя все их фармацевтически приемлемые соли.
В одном варианте осуществления предлагается набор с устройством для введения композиции инсулиновых димеров пациенту. Набор может дополнительно включать в себя множество контейнеров, например флаконов, пробирок, бутылей и тому подобных. Предпочтительно, наборы будут также включать в себя инструкцию по применению. В соответствии с одним вариантом осуществления устройство из набора представляет собой распыляющее аэрозоль устройство, причем композиция заправлена в аэрозольное устройство. В другом варианте осуществления набор содержит шприц и иглу, и в одном варианте осуществления композицию инсулиновых димеров предварительно заправляют в шприц.
Соединения настоящего изобретения могут быть получены с помощью стандартных способов синтеза, методов рекомбинантной ДНК или любых других способов получения пептидов и белков слияния. Хотя некоторые неприродные аминокислоты не могут быть экспрессированы с помощью стандартных методов рекомбинантной ДНК, методы их получения известны в данной области техники. Соединения настоящего изобретения, которые включают в себя непептидные части, могут быть синтезированный посредством стандартных реакций органической химии в дополнение к стандартным реакциям пептидной химии, когда это применимо.
Следующие примеры предназначены для облегчения дальнейшего понимания изобретения.
Примеры
Общие процедуры.
Все химические вещества были приобретены из коммерческих источников, если не указано иное. Реакции обычно проводили при температуре окружающей среды или при комнатной температуре, если не указано иное. Реакции, чувствительные к воздействию влаги или воздуха, проводили в атмосфере азота или аргона с использованием безводных растворителей и реагентов. Ход реакций контролировали с помощью аналитической тонкослойной хроматографии (ТСХ) и сверхэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (СВЭЖХ-МС). ТСХ проводили на пластинах для ТСХ Е. Merck, предварительно покрытых силикагелем 60F-254, толщина слоя 0,25 мм. Пластины визуализировали с использованием УФ 254 нм и/или подвергая воздействию молибдата церия-аммония (САМ) или окрашивающих растворов п-анисового альдегида с последующим обугливанием. Сверхэффективную жидкостную хроматографию (СВЭЖХ) проводили на системе Waters Acquity™ UPLC®.
СВЭЖХ-МС, способ А: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 1,0x50 мм с градиентом 10:90-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 2,0 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 215 нм; СВЭЖХ-МС;
способ В: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 60:40-100:0 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 100:0-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0, 05 об.% ТФУ в течение 40 с; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС;
способ С: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С18 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:80-90:10 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 90:10-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0, 05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС;
способ D: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 10:90-55:45 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 55:45-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0, 05 об.% ТФУ в течение 40 с; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС;
способ Е: колонка Waters Acquity™ UPLC® BEH300 С4 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 10:9050:50 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,3 мин и 50:50-70:30 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм; СВЭЖХ-МС;
способ F: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:8072,5:27,5 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 4,3 мин и 72,5:27,5-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0,05 об.% ТФУ в течение 0,5 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм и СВЭЖХ-МС;
способ G: колонка Waters Acquity™ UPLC® ВЕН С8 1,7 мкм 2,1x100 мм с градиентом 20:80-90:10 об./об. CH3CN/H2O+0,1 об.% ТФУ в течение 4,0 мин и 90:10-95:5 об./об. CH3CN/H2O+0, 1 об.% ТФУ в течение 0,4 мин; скорость потока 0,3 мл/мин, длина волны УФ 200-300 нм.
Масс-анализ проводили на Waters SQ Detector с ионизацией электрораспылением в режиме дектирования положительных ионов, причем диапазон сканирования отношения массы к заряду составлял 170-900, или на Waters Micromass® LCT Premier™ XE с ионизацией электрораспылением в режиме дектирования положительных ионов, причем диапазон сканирования отношения массы к заряду составлял 300-2000. Идентификацию получаемых инсулиновых конъюгатов или IRPA подтверждали посредством сравнения теоретического молекулярного веса с экспериментальным значением, которое было измерено с помощью СВЭЖХ-МС. Для определения, в частности, положений связей инсулиновые димеры подвергали обработке ДТТ (для a/b-цепи) или расщеплению Glu-C (с восстановлением и алкилированием или без них), и затем получаемые пептиды анализировали с помощью ЖХ-МС. На основании измеренных масс были определены положения связей.
Флэш-хроматографию проводили с использованием или аппарата Biotage Flash Chromatography
- 63 036714 (Dyax Corp.), или прибора CombiFlash® Rf (Teledyne Isco). Хроматографию с нормальными фазами проводили на силикагеле (20-70 мкм, размер пор 60 А) в предварительно заправленных картриджах указанного размера. Ионообменную хроматографию проводили на материале на основе силикагеля со связанным покрытием из гидрофильного анионного поли(2-сульфоэтиласпартамида) (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, размер пор 1000 А). Хроматографию с обращенной фазой проводили на С18-связанном силикагеле (20-60 мкм, размер пор 60-100 А) в предварительно заправленных картриджах указанного размера. Препаративную ВЭЖХ проводили в бинарной системе Gilson 333334 с использованием колонки Waters DELTA PAK С4 15 мкм, 300 А, 50x250 мм или колонки KROMASIL® C8 10 мкм, 100 А, 50x250 мм, скорость потока 85 мл/мин, с указанным градиентом. Растворы концентрировали на роторном испарителе при пониженном давлении или сушили вымораживанием на VirTis Freezemobile Freeze Dryer (SP Scientific).
Сокращения: ацетонитрил (AcCN), водный (водн.), Ν,Ν-диизопропилэтиламин или основание Хунига (DIPEA), Ν,Ν-диметилформамид (ДМФ), диметилсульфоксид (ДМСО), этилацетат (EtOAc), гидрохлорид N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимида (EDC), грамм(ы) (г), гидрат 1гидроксибензотриазола (HOBt), час(ы) (ч или час), масс-спектр (мс или МС), микрограмм(ы) (мкг), микролитр(ы) (мкл), микромоль (мкмоль), миллиграмм(ы) (мг), миллилитр(ы) (мл), миллимоль (ммоль), минута(ы) (мин), время удерживания (Rt), комнатная температура (rt), насыщенный (насыщ. или насыщ-й), насыщенный водн. раствор хлорида натрия (рассол), триэтиламин (ТЭА), трифторуксусная кислота (ТФУ) и тетрафторборат N, N, N', N'-тетраметил-O-(N-сукцинимидил) урония (TSTU).
Термин RHI относится к рекомбинантному человеческому инсулину и используется для того, чтобы показать, что инсулин имеет аминокислотную последовательность, характерную для нативного человеческого инсулина дикого типа. Как используется в настоящем документе в таблицах, данный термин показывает, что аминокислотная последовательность инсулина, содержащегося в димере, представляет собой последовательность нативного человеческого инсулина дикого типа.
Пример 1.
Описан синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноата (линкер 1; C6+NC6)
Этап 1. Бензил-6-((6-(бензилокси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат.
К смеси монобензилового сложного эфира адипиновой кислоты (600 мг, 2,54 ммоль) и 6(бензилокси)-6-оксогексан-1-аминия 4-метилбензолсульфоната (1,0 г, 2,54 ммоль) в ДМФ (12,71 мл) добавляли HOBt (584 мг, 3,81 ммоль), основание Хунига (888 мкл, 5,08 ммоль) и EDC (731 мг, 3,81 ммоль). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь распределяли между насыщ. NaHCO3 и EtOAc. Органическую фазу отделяли, промывали с помощью 1,0М HCl и рассола, сушили над Na2SO4 и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде полутвердого вещества и использовали на следующе этапе без дополнительной очистки. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=1,26 мин, m/z=440,3 [M+1].
Этап 2. 6-((5-Карбоксипентил)амино)-6-оксогексановая кислота.
Суспензию продукта этапа 1 (1,08 г, 2,457 ммоль) и катализатора Перлмана (20 вес.% на угле, 173 мг, 0,246 ммоль) в МеОН (50 мл) перемешивали при 50 psi H2 в течение ночи. Катализатор отфильтровывали и фильтрат подвергали хроматографии с обращенной фазой на фазе С8 (Kromasil, C8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), скорость потока=85 мл/мин, градиент В в А 5-30% в 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,40 мин, m/z=260,15 [M+1].
Этап 3. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-6-оксигексил)амино)6-оксогексаноат.
К раствору продукта этапа 2 (50 мг, 0,193 ммоль) в ДМФ (964 мкл) добавляли TSTU (116 мг, 0,386 ммоль). После охлаждения до 0°С к смеси добавляли триэтиламин (53,8 мкл, 0,386 ммоль). После перемешивания в течение 45 мин наблюдали образование желаемого соединения: СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,71 мин, m/z=453,4 [M+1]. Получаемый 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((6-((2,5-диоксопирролидин-1ил)окси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат использовали в виде 0,2М раствора в ДМФ без очистки.
Пример 2.
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноата (линкер 2; C6N+C6+NC6).
Этап 1. Дибензил-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат.
- 64 036714
К раствору 6-(бензилокси)-6-оксогексан-1-аминия 4-метилбензолсульфоната (2,693 г, 6,84 ммоль) и адипиновой кислоты (500 мг, 3,42 ммоль) в ДМФ (17,1 мл) добавляли основание Хунига (1,793 мл, 10,26 ммоль), HOBt (1,572 г, 10,26 ммоль) и EDC (1,968 г, 10,26 ммоль). После перемешивания в течение ночи реакционную смесь выливали в воду (500 мл) и перемешивали в течение 30 мин. Указанное в заголовке соединение собирали посредством фильтрации в виде твердого вещества и сушили посредством отсасывания воздуха. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=1,23 мин, m/z=553,5 [M+1].
Этап 2. Бис (2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат.
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 1, заменяя бензил-6-((6-(бензилокси)-6-оксигексил)амино)-6-оксогексаноат на дибензил-6,6'(адипоилбис(азанедиил))дигексаноат на этапе 2. СВЭЖХ-МС, способ A: Rt=0,74 мин, m/z=567,4 [M+1].
Пример 3.
Описан синтез (2S,2'S)-2,2'-(окстандиоилбис(азанедиил))бис(5-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)5-оксопентановой кислоты) (линкер 3; γ-Glu-суберик-γ-Glu)
Этап 1. (S)-5-(бензилокси)-4-(8-(((S)-1-(бензилокси)-4-карбокси-1-оксобутан-2-ил)амино)-8-оксооктанамидо)-5-оксопентановая кислота.
К раствору H-GLU-OBZL (1,00 г, 4,21 ммоль) в ДМФ (10,5 мл) добавляли триэтиламин (5,875 мл, 42,1 ммоль), а затем дисукцинимидилсуберат (776 мг, 2,107 ммоль). После перемешивания в течение 1 ч реакционную смесь концентрировали и получаемый остаток очищали на колонке С18 (ISCO, 44 г), поток=37 мл/мин; градиент AcCN в воде с 0,05% ТФУ: 2-20% за 20 мин с последующим удерживанием. После лиофилизации получали промежуточную бис-карбоновую кислоту. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=2,66 мин, m/z=613,3 [М+1].
Этап 2. Бис-N-гидроксисукцинимидный сложный эфир (S)-5-(бензилокси)-4-(8-(((S)-1-(бензилокси)-4-карбокси-1-оксобутан-2-ил) амино)-8-оксооктанамидо)-5-оксопентановой кислоты.
К суспензии продукта этапа 1 (455 мг, 0,743 ммоль) в ацетонитриле (7,4 мл) добавляли TSTU (492 мг, 1,634 ммоль) в виде твердого вещества, а затем триэтиламин (228 мкл, 1,634 ммоль), в этот момент суспензия растворялась. Реакционную смесь перемешивали в течение 1,5 ч и концентрировали на роторном испарителе при комнатной температуре. Продукт очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка Kromasil, С8 10 мкм, 100 А, размер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), поток=85 мл/мин, градиент В в А 10-80% за 30 мин. После лиофилизации фракций получали сложный эфир с бис-NHS. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=2,77 мин, m/z=807 [М+1].
Этап 3. (2S,2'S)-2,2'-(Окстандиоилбис(азанедиил))бис(5-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-5оксопентановая кислота).
Продукт этапа 2 (250 мг, 0,310 ммоль) гидрировали с использованием палладия на угле (66,0 мг, 0,031 ммоль) в качестве катализатора и ацетона, содержащего 0,1% ТФУ, в качестве растворителя (6,2 мл) при 1 атм водорода в течение ночи. Катализатор отфильтровывали и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения. Откачивали до высокого вакуума в течение ночи. СВЭЖХ-МС, способ С: Rt=3,61 мин, m/z=627,3 [М+1].
Пример 4.
Общий способ А. Синтез N6,B29-инсулиновых конъюгатов (аналогов).
В контейнере соответствующего размера растворяли инсулин или аналог инсулина при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе: 2:3 об./об. 0,1М Na2CO3:AcCN. После того как смесь становилась прозрачной, рН доводили до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном флаконе растворяли активированный сложноэфирный интермедиат (связывающий фрагмент) в органическом растворителе, например ДМСО, при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира (линкера) в течение некоторого периода времени добавляли к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не показывала, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала и что существенная часть реакционной смеси превратилась в В29-конъюгированный инсулин. Реакцию останавливали посредством добавления аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляли холодным Н2О (20x) при 0°С, и доводили его рН до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl).
- 65 036714
Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка Kromasil C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие указанный в заголовке конъюгат, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением указанного в заголовке продукта.
Пример 5.
Описан синтез N629B-5-азидопентаноил-desB30-инсулина (A:Y19A) (аналог 1).
В сцинтилляционном флаконе объемом 20 мл растворяли desB30 A:Y19A инсулин (112 мг, 0,020 ммоль) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе (2 мл, 2:3 об./об. 0,1М Na2CO3: AcCN). После того как смесь становилась прозрачной, рН доводили до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном сцинтилляционном флаконе объемом 8 мл растворяли 2,5-диоксопирролидин-1-ил 5-азидопентаноат (линкер 5; смотри пример 6) (4,79 мг, 0,020 ммоль) в ДМСО (500 мкл) при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира в течение некоторого периода времени добавляли к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не показывала, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала и что существенная часть реакционной смеси превратилась в В29конъюгированный инсулин. Реакцию останавливали посредством добавления аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляли холодной Н2О (20x) при 0°С и доводили его рН до конечного рН 2,5 с использованием 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А, 25-35% буфер В в буфере А в течение 20 мин; буфер А: 0,05% ТФУ в воде; буфер В: 0,05% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие аналог 1, объединяли и затем сушили вымораживанием. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,91 мин, m/z=1435,86 [(М+4)/4].
Пример 6.
-ацилированные аналог 2, аналог 3 и аналог 4 RHI были получены для использования при конструировании димеров с использованием клик-химии, и они были получены с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4, но с заменой на рекомбинантный человеческий инсулин и
(2,5-диоксопирролидин-1-илпент-4-иноат; линкер 4);
(2,5-диоксопирролидин-1-ил-азидопентаноат; линкер 5); или
(перфторфенил-1-(бицикло[6.1.0]нон-4-ин-9-ил)-3-оксо-2,7,10,13,16-пентаокса-4-азанонадекан-19оат) (линкер 6) для создания аналога 2, аналога 3 или аналога 4 соответственно. Аналоги были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, за исключением аналога 5, который был охарактеризован с использованием СВЭЖХ-МС, способ F
- 66 036714
Пример 7. Описан синтез N2,1A,N2,1B-6uc (карбамоил)-человеческого инсулина (аналог 5).
К суспензии RHI (1 г, 0,172 ммоль) в воде (50 мл) добавляли раствор двухосновного фосфата калия, (0,249 г, 1,429 ммоль) в воде (5,0 мл). После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 мин к полученной смеси добавляли цианат калия (0,279 г, 3,44 ммоль). Реакционную смесь оставляли перемешиваться в течение 16 ч. Для того чтобы остановить реакцию, непрореагировавший цианат калия удаляли с помощью TFF с использованием устройства для диафильтрации MWCO 3K и продукт выделяли в виде твердого вещества посредством лиофилизации. Продукт содержал приблизительно 10-35% А1/В1/В29-трис-мочевина-КН1, который, необязательно, мог быть удален с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С8 (колонка KROMASIL, С8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), скорость потока=85 мл/мин, градиент В в А 2634% в течение 30 мин). СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,29 мин, m/z=1474,6 (z=4). N-концевой заместитель имеет структуру
(карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 Nконцевой аминокислоты.
Пример 8.
Описан синтез N21A,N21B-бис(карбамоил)-desB30-человеческого инсулина (аналог 6).
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 7, заменяя RHI на desB30 инсулин. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,10 мин, m/z=1448,9 (z=4). Nконцевой заместитель имеет структуру
О
А
ΗζΝ Λ (карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 Nконцевой аминокислотой.
Пример 9.
Описан синтез N21A,N21B-бис (карбамоил)-инсулина лизпро (аналог 7).
Указанное в заголовке соединение получали с помощью процедуры, аналогичной описанной в примере 7, заменяя RHI на инсулин лизпро. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=4,07 мин, m/z=1473,6 (z=4). Nконцевой заместитель имеет структуру
О
Αί h2n + (карбамоил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 Nконцевой аминокислоты.
Пример 10.
Описан синтез N2-ацетил-человеческий инсулин (аналог 8).
К раствору RHI (400 мг, 0,069 ммоль) в ДМСО (4,6 мл) добавляли по каплям раствор 2,5диоксопирролидин-1 -илацетата / γ о
Υ о о (10,82 мг, 0,069 ммоль) в 100 мкл ДМСО. После перемешивания в течение 3 ч реакционную смесь разбавляли водой (95 мл), подкисляли до тех пор, пока рН не становился равен приблизительно 3, и затем диафильтровали через Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 3 или 10K MWCO для удаления
- 67 036714 большей части ДМСО. Получаемый раствор вначале подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, скорость потока 15 мл/мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl) с использованием градиента 10-40% буфера В в буфере А в течение 24 мин. Фракции, содержащие желаемый N2-ацетил-RHI объединяли и концентрировали, а затем подвергали хроматографии с обращенной фазой на (KROMASIL, C8 10 мкм 100 А, 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ, градиент 26-30% В в А). Положение модификации подтверждали с использованием анализа с помощью ДТТ. СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,5 мин и m/z=1463,5 (z=4). N-концевой заместитель имеет структуру
(ацетил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислоты.
Пример 11.
Описан синтез N2,N21B-бис(карбамоил)-N629B-ацилированного RHI.
Аналог 5, конъюгированный или с 2,5-диоксопирролидин-1-ил-азидопентаноатом (линкер 5) для создания аналога 9, или с 2,5-диоксопирролидин-1-илпент-4-иноатом (линкер 4) для создания аналога 10, получали с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4.
Пример 12.
Следующие N629B-ацилированные аналоги RHI (аналог 11, аналог 12 и аналог 13) были получены для использования при конструировании димеров с использованием клик-химии. Аналоги были получены с использованием общего способа А или процедуры, аналогичной описанной в примере 4, но с заменой на рекомбинантный человеческий инсулин (RHI) и соответствующий связывающий фрагмент, выбранный из
для создания аналога 11, аналога 12 или аналога 13 соответственно. Аналоги были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, за исключением аналога 12, который был охарактеризован с использованием СВЭЖХ-МС, способ F
Пример 13.
Общий способ В. Синтез димеров N6,29B, N6,29B-инсулинов в условиях органического основания.
В контейнере соответствующего размера инсулин или аналог инсулина суспендируют при комнатной температуре в органическом растворителе или смешанном водном (водн.)/органическом растворителях, например ДМСО, в присутствии основания, например ТЭА. Смесь оставляют осторожно перемешиваться до тех пор, пока инсулин полностью не растворится. К полученному раствору добавляют активированный сложноэфирный интермедиат (линкер) в растворе органических растворителей, таких как ДМСО или ДМФ. После этого хроматограмма СВЭЖХ показывает, что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер Nб29B,N6В29В'-инсулинов (или в димер N628B,N628B'-инсулина лизпро). Реак
- 68 036714 ционная смесь может быть подвергнута непосредственно очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN), или реакция может быть остановлена аккуратным разбавлением холодной кислой Н2О (20 x, рН приблизительно 3,0) при 0°С, и ее рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор может вначале быть сконцентрирован с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl). Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Концентрированный раствор затем подвергают очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый инсулиновый димер, объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N6,29B, №'-инсулинов.
Пример 14.
Общий способ С. Синтез димеров N6,29B,N6,29B -инсулинов в условиях водного основания.
В контейнере соответствующего размера растворяют инсулин или аналог инсулина при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе: 2:3 об./об. 0,1М Na2CO3: AcCN. После того как смесь становится прозрачной, рН доводят до значения 10,5-10,8 с использованием щелочного раствора, например 0,1н. NaOH. В отдельном флаконе активированный сложноэфирный интермедиат (линкер) растворяют в органическом растворителе, например ДМСО, при комнатной температуре. Аликвоты раствора активированного сложного эфира добавляют в течение некоторого периода времени к раствору, содержащему инсулин, до тех пор, пока хроматограмма СВЭЖХ не покажет, что большая часть немодифицированного инсулина прореагировала, и что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер N6B29,N6B29'-инсулинов (или димер n628B,N628B - инсулина лизпро). Реакцию останавливают добавлением аминного нуклеофила, например 2-аминоэтанола. Реакционный раствор перемешивают при rt в течение 30 мин. Получаемый раствор аккуратно разбавляют холодной Н2О (20 x) при 0°С, и его рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор вначале концентрируют с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl). Фракции, содержащие В29конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Получаемый раствор затем дополнительно очищают с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие указанный в заголовке инсулиновый димер, объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N6,29B, N629B'-инсулинов.
Пример 15.
Данный пример иллюстрирует синтез N6B29,N6B29'-(2,2'-(этан-1,2-диилбис(окси))диацетил)бис[человеческого инсулина] (димер 1).
Растворяли RHI (2,6 г, 0,448 ммоль) в смеси Na2CO3 (0,1М) (15,8 мл) и AcCN (10,5 мл) и добавляли 0,895 мл (0,179 ммоль) 0,2М раствора бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2,2'-(этан-1,2-диилбис(окси))диацетата (линкер 8) в ДМФ. Перемешивали реакционную смесь в течение 30 мин, добавляли дополнительную порцию 0,895 мл (0,179 ммоль) 0,2М раствора бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-2,2'-(этан-1,2диилбис(окси))диацетата в ДМФ и перемешивали реакционную смесь еще в течение 30 мин. Выливали реакционную смесь в 60 мл 20% AcCN/0,1% ТФУ/вода, доводили рН до 2,5 и диафильтровали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 10К MWCO для концентрирования до тех пор, пока получаемый объем не составлял приблизительно 10 мл. Получаемый раствор подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, градиент 10-80% буфера В в буфере А в течение 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl). Фракции, содержащие указанное в заголовке соединение, объединяли и концентрировали. Получаемый раствор затем подвергали хроматографии с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; градиент 27-35% AcCN с 0,05% ТФУ в воде с 0,05% ТФУ). СВЭЖХ-МС, способ Е: Rt=2,75 мин, m/z=1960,4 (z=6), 1680,4 (z=7)
- 69 036714
№ димер а Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина Б2 9 и Б2 9' Тип инсулина; N-концы Rt (мин) (М+6)/6 или (М+7) /7
инсулина
1 О О RHI; ΑΙ,ΑΓ, Б1,В1Г 2Г 75 1960,4
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 16.
Данный пример иллюстрирует синтез N2,1A, N2,1A', N2,1B, N2,1B'-тетракuс(карбамоил)-Nб,B29,N6,B29'(гександиоил)бис[человеческого инсулина] (димер 2).
Растворяли N2,1A,N2,1B-бис(карбαмоил)-RHI (150 мг, 0,025 ммоль) в ДМСО (1 мл), и добавляли триэтиламин (0,106 мл, 0,764 ммоль), а затем по каплям добавляли ди (N-сукцинимидил) адипат (линкер 12) (4,33 мг, 0,013 ммоль), растворенный в 100 мкл ДМСО. Перемешивали 1 ч и выливали реакционную смесь в 20 мл воды. Подкисляли до рН 2 и диафильтровали с использованием 10K Amicon Ultra 15. Продукт очищали с помощью ионообменной хроматографии с использованием градиента 10-40% растворителя В в растворителе А в течение 24 мин и повторно очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8, градиент В в А 26-36% в течение 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ Е: Rt=3,75 мин, m/z=1983,9, (z=6)___________________________________________________________________________
№ димера Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин ) (М+6) /6 или (М+7)/7
2 0 θ RHI; ΑΙ,ΑΓ, Bl, Bl'=карбамои л 3, 75 1983,9
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Примеры 17.
Табл. 3 показывает димеры, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов (линкеров) в соответствии или с общим способом В, или с общим способом С, как указано, с использованием RHI, DesB30 RHI, инсулина лизпро, инсулина аспарта, инсулина гларгина или соответствующего аналога. Например, для димеров с карбамоилированными N-концами использовали аналог 5 или аналог 6 (DesB30); для димеров с ацетилированным по А1 N-концами использовали аналог 8. Димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Инсулин и молекулы инсулина, связанные вместе с помощью связывающего фрагмента, являются одинаковыми для каждого из димеров, приведенных в табл. 3
- 70 036714
Таблица 3
№ димера Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; Nконцы инсулина Слое об поля Rt (мин ) (М+6) /6 или (М+7)/7
3 о о RHI; А1, Б1,А1 1 , В1 1=карбамоил в 4, 41 1988,745
4 о ^x^Q χι oJ 0 RHI; А1,В1,А1',В1 ' =Н с 3,76 1986, 88
5 о О RHI; ΑΙ,ΕΙ,ΑΙ',ΒΙ ' =Н С 3,74 1972,6
6 RHI; ΑΙ,ΕΙ,ΑΙ',ΒΙ '-И С 3,00 1754,2
- 71 036714
7 oXxc/X^XN/X^X40^ RHI; Al, Bl, А1 ’t Б1 ' =Н C 3, 07 1720,0
0 0 A^v4 О RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',ΒΙ 1 c 3,70 1950,65
9 О о RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ1 , El 1 c 3,70 1954,9
10 О о^_Х° RHI; Al,Bl,Al1 ,B1 1=карбамоил E 3, 97 1715,3
11 О о RHI; Al,Bl,Al1 rBl 1=карбамоил В 3, 93 1727,9
12 О RHI; Al, Bl, Al1, Bl ,=карбамоил Б 3,73 1978,8
- 72 036714
13 0 ZyxzxzxXy 0 RHI; Α1, А1'=ацетил , Β1,ΒΓ=Η Б 3,83 1973,8
14 о Ο RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ1,ΒΙ ’=карбамоил В 4, 10 1740,5
15 О RHI; Al,Bl,Al1, Bl *=H С 3,97 1716,0
16 о vV^^o, RHI; Al,Bl,Al1 ,Bl ’=карбамоил В 3,80 1752,4
17 0 ^ююУюАю s RHI; Al, Bl, Al1, Bl ’=карбамоил В 4,13 1778,7
18 о Инсулин лизпро; Al,Bl,Al1, Bl *=H С 3,74 1960,54
19 0 ^ysZszxA^ о Инсулин аспарт; Al,Bl,Al1, Bl ’=H С 3,74 1966,13
20 О 0 RHI desB30; Al,Bl,Al1 , Bl ’=H С 4,57 1926,04
21 о ,, о II Π η SJL____ ν. л Α RHI; Al, Bl, Al1, Bl ’=карбамоил В 4,48 1716,7
- 73 036714
22 9 Η О 1 о / RHI; Al, Bl, Α1 ' , Б1 ' =Η c 4,32 1974,06
23 ϊ Η ϋ ,—ΝΗ ΐ) RHI; Al, Bl, Α1' , Б1 ’=карбамоил Б 3, 38 1733,11
24 Ο 0 RHI; Al,Bl,Al',Bl ’=карбамоил В 3,59 1988,4
25 U Η /γ^ Η 0 RHI; Al,Bl, Al', Bl '=H C 4,31 1708,35
26 Η Η Ο Ο 1 γ Η ο RHI; Al, Bl, Al' , Bl ’=H C 4,00 1993,02
- 74 036714
27 ί Η ο ο if ο Η RHI; А1,Б1,А1Г,В1 г=карбамоил В 4,18 1732,48
28 0 0 RHI desE30; Al,El,Al', Bl г=карбамсил в 3, 86 1954,9
29 ίι η θ Алл Ν χ. χ. JI RHI desB30; Al,Bl,Alr,Bl С 3, 75 1940,76
30 Η Η Ά-—ри /N χγ/ Η ο RHI desB30; ΆΙ,ΒΙ,ΑΙ',ΒΙ с 3, 77 1959,02
31 μ η ο \ 0 __/ Αν /— Η 0 RHI desB30; Al,Bl,Al', Bl ' =H с 4,00 1959,4
32 0 ο Инсулин лизпро; А1,В1,А1Г,В1 *=карбамоил в 3,81 1988,42
- 75 036714
33 U Η 0 \ о I Инсулин лизпро; Al,Bl,Al1, Bl 1 =H C 3,70 1974,04
34 ? H 0 I 0 J H о Инсулин лизпро; Al, Bl, Al1 , El ' =H C 3,80 1992,89
35 9 H A /—N /— H О Инсулин лизпро; Al, El, Al ’, Bl ' =H C 3,76 1992,86
36 xz O^ zx О О RHI; Al,El,Al',Bl ' =H c 4,29 1717,28
37 0 О RHI; Al, El, Al ’ , Bl 1=карбамоил в 4, 01 1720, 6
- 76 036714
38 о о RHI desB30; Al,Bl,Al1 fBl ’=H C 3, 88 1944,96
39 О 0 RHI; Al, Bl, Al1 , Bl ’=H c 3, 87 1978,88
08 О Л° о-7 RHI; Al, Bl, Al1 , El ’=H D 3, 39 1697,36
76 о _,о^___ \ 7 A j RHI; Al, Bl, Al1 , Bl ’=H D 3, 50 1709,73
- 77 036714
S3 ΛιΓ^ о О Инсулин аспарт; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ' , El 1=карбамоил В 3, 50 1994,39
85 53 87 АЛЛ/ г АЛ Г rYl АЛ Г ΐ г } Г ϊ г 1 ί Ъ <4 RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ' , El 1 =H Инсулин гларгин; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',Bl ' =Н Инсулин гларгин; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',ΒΙ ’ =Н D D D 3,46 3, 37 3, 43 1829,31 1788,87 1902,16
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон- В29 Lys и В29' Lys, соответственно. амино группой
Пример 18.
Общий способ D. Синтез димеров N6,29B,N6,29B-инсулинов с использованием Си2+-катализируемой клик-химии.
В контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий содержащий ацетилен инсулиновый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и водн. триэтиламмоний-ацетатного буфера (рН 7,0, конечная концентрация 0,2 мМ). В другом контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий азидо-содержащий инсулиновый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при rt в смешанном растворителе из
- 78 036714
ДМСО и воды. Оба раствора объединяли, тщательно смешивали, дегазировали посредством осторожного барботирования с помощью N2. К полученному раствору добавляли свежеприготовленный аскорбат натрия или раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация составляет 0,5 мМ) и после тщательного смешивания раствор 10 мМ CuSO4 и трис[(1-бензил-1H-1,2,3-триαзол-4-ил)метил]αмина (т.е. лиганда ТВТА) в 55% ДМСО. После дегазирования посредством осторожного барботирования с помощью N2 и тщательного смешивания смесь хранили при rt с периодическим перемешиванием в течение ночи. Реакционную смесь аккуратно разбавляли смешанным растворителем (об./об. 7:3 AcCN/вода с 0,05% ТФУ) при 0°С, и рН доводили до 2,50 с использованием 0,1, 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением инсулиновых димеров.
Табл. 4 перечисляет димеры 40, 41, 45, 46, 47, 59, 57, 79, 80, 82 и 84, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов в соответствии с общим способом D. Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, или СВЭЖХМС, способ G, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt)
Таблица 4
№ димер а Остов первого инсулина Остов второго инсулин а (') Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В2 9 и В2 9' Rt (мин) (М+б) /6 ИЛИ (М+7)/7
- 79 036714
40 Диалог 3 Аналог 2 3,83 1970,38
41 Аналог 1 Аналог 2 о II о 3, 83 1933,34
45 Аналог 9 Аналог 2 ν. О п о 4,23 1985,30
46 Аналог 3 Аналог 10 n*n, о о 4,50 1985,43
47 Аналог 9 Аналог 10 IM О А^+чАА II 0 4,59 1714,34
75 Аналог 3 Аналог 2 N=n. /=^ о О 3,40 1696,35
57 Аналог 3 Аналог 12 ν=ν О γ-χ- А 3, 57 1975,90
79 Аналог 11 Аналог 13 7 η 3, 38 1993,39
80 Аналог 11 Аналог 2 А Ах Λ \ о о 3,37 1973,83
82 Аналог 11 Аналог 12 г А __/ / н /---У % ζ Ζ о у 3,34 1978,33
84 Аналог 3 Аналог 13 о Ν^Ν О 3,40 1990,54
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 19.
Общий способ Е. Синтез димеров N6,29B,N6,29B-инсулинов с использованием Си2+-катализируемой двойной клик-химии.
В контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий азидо-содержащий инсули
- 80 036714 новый интермедиат (аналог) при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и водн. триэтиламмоний-ацетатного буфера (рН 7,0, конечная концентрация 0,2 мМ). В другом контейнере соответствующего размера растворяли соответствующий бис-ацетиленсодержащий мостиковый или промежуточный линкер при слабом перемешивании при комнатной температуре в смешанном растворителе из ДМСО и воды. Оба раствора объединяли, тщательно смешивали, дегазировали посредством осторожного барботирования с помощью N2. К полученному раствору добавляли свежеприготовленный аскорбат натрия или раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация составляет 0,5 мМ) и после тщательного смешивания раствор 10 мМ CuSO4 и трис[(1-бензил-1Н-1,2,3триазол-4-ил)метил]амина (т.е. лиганда ТВТА) в 55% ДМСО. После дегазирования посредством осторожного барботирования с помощью N2 и тщательного смешивания смесь хранили при комнатной температуре с периодическим перемешиванием в течение ночи. Реакционную смесь аккуратно разбавляли смешанным растворителем (об./об. 7:3 AcCN/вода с 0,05% ТФУ) при 0°С, и рН доводили до 2,50 с использованием 0,1, 1,0н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор сначала концентрировали с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно сначала подвергали ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5M NaCl). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15. Затем получаемый раствор дополнительно очищали с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и сушили вымораживанием или заменяли буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением инсулиновых димеров.
Табл. 5 перечисляет димеры 42-44 и 54, которые были получены с использованием соответствующих интермедиатов в соответствии с общим способом Е. Бис-ацетиленовые мостиковые или промежуточные линкеры представляли собой
Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt)
Таблица 5
№ димера Остов первого инсулин а Остов второго инсулин а (') Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Rt (мин (М+6) /6 или (М+7)/7
- 81 036714
Пример 20.
Данный пример иллюстрирует синтез N2,1A, N2,1A', N2,1B, N2,1B'-тетракис(ацетил, или PEG1, или метоксиацетил)-димеров (димер 48, 55, 56, 69 и 70).
К раствору димера 40, 19 или 4 (21 мг, 1,777 мкмоль) в ДМСО (2 мл) при комнатной температуре добавляли ТЭА (3,96 мкл, 0,028 ммоль), а затем раствор 2,5-диоксопирролидин-1-илацетата (2,23 мг, 0,014 ммоль) в ДМСО (100 мкл) или другой соответствующий N-гидроксисукцинимидный активированный эфир (2,5-диоксопирролидин-1-илметоксиацетат или 2,5-диоксопuрролuдин-1-ил-PEG1-ацетат) в ДМСО (100 мкл). Через 3 ч реакционную смесь разбавляли с помощью 12 мл смеси вода/AcCN=7/3 с 0,1% ТФУ, и регулировали рН до тех пор, пока он не становился равен 2,5. Получаемый прозрачный раствор концентрировали с помощью Amicon Ultra 15 Centrifuge Filters с мембраной 10К MWCO. Получаемый раствор вначале подвергали ионообменной хроматографии (PolySULFOETHYL A, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, 15 мл/мин, градиент от 5% до 45% в течение 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% ацетонитрил в воде; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% ацетонитрил/0,5М NaCl в воде). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 10К MWCO. Получаемый раствор затем подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05% ТФУ в AcCN/H2O; буфер В: 0,05% AcCN; скорость потока 85 мл/мин). Желаемые фракции объединяли и сушили вымораживанием с получением димера 48, 55, 56, 69 или 70, как показано в табл. 6. Использовали СВЭЖХ-МС, способ F или G. N-концевые заместители имеют структуру
(метоксиацетил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 Nконцевой аминокислоты
- 82 036714
Таблица 6
№ димера Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин ) (М+б)/6 или (М+7)/7
48 n-n, о п о RHI; Al, Bl, А1' г В г=ацети л 4,71 1998,93
55 о о RHI; Al, Bl, А11г=ацети Л 3,61 1987,97
56 о О RHI; А1,В1,А1' ,E*=PEG1 3, 53 1729,22
69 О χ., 1 RHI; Al, Bl, Al',В'=ацети л 3, 55 1727,31
70 о °Х RHI; AlrEl,Al', В 1=метск сиацетил 3, 67 1744,71
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 21.
Табл. 7 показывает димеры 49, 50 и 51 и показывает ацильные группы, связанные с аминогруппами N2,a1, n2,b1, n2,A1' и N2,B1'. Эти димеры были получены из димера 40 с использованием процедур, аналогичных описанной для создания димера 48, но с заменой 2,5-диоксопирролидин-1-илацетата на соответствующие N-гидроксисукцинимидные активированные эфиры для получения димеров 49, 50 и 51. Активированные сложные эфиры представляли собой 2,5-диоксопирролидин-1-ил-Fmoc-глицинацетат
2,5-диоксопирролидин-1-ил-PEG2-ацетат
и 2,5-диоксопирролидин-1-ил-AEG-С6 ацетат, где AEG представляет собой аминоэтилглюкозу
Эти димеры были охарактеризованы с использованием или СВЭЖХ-МС, способ F (димеры 50 и 51), или СВЭЖХ-МС, способ G (димер 49), причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Димеры приведены в табл. 7.
N-концевые заместители имеют структуру
- 83 036714
Таблица 7
№ димера Структура димера, д емонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин) (M+6) / 6 или (M+7) / 7
49 №N о П <· RHI; ΑΙ,ΑΓ, Bl,В1т =глиц ин 3, 62 1722,06
50 n=n о п RHI; ΆΙ,ΆΓ, B1,B1'=PEG2 4,85 1764,16
51 Nsn, О RHI; Al,Al', Bl, Bl ’=AEM- C6 4,06 1880, 19
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 22.
Данный пример иллюстрирует синтез димера 52 с использованием клик-химии без меди.
К раствору аналога 3 (10 мг, 1,686 мкмоль) в 1,0 мл 3:2 об./об. H2O/AcCN при комнатной температуре добавляли раствор аналога 4 (10,5 мг, 1,686 мкмоль) в 1,0 мл 3:2 об./об. H2O/AcCN. После перемешивания при комнатной температуре в течение 2 ч реакционную смесь вначале подвергали ионообменной хроматографии (PolySULFOETHYL А, 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А, 15 мл/мин, градиент от 5 до 45% в 30 мин; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% ацетонитрил в воде; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% ацетонитрил/0,5М NaCl в воде). Фракции, содержащие желаемый продукт с желаемой чистотой, объединяли и концентрировали с использованием Amicon Ultra-15 с мембраной 3K или 10K MWCO. Получаемый раствор затем подвергали ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05% ТФУ в AcCN/H2O; буфер В: 0,05% AcCN; скорость потока 85 мл/мин). Желаемые фракции объединяли и сушили вымораживанием с получением димера 52. СВЭЖХ-МС, способ F: Rt=3,73 мин, m/z=1738,59 [(M+7)/7 +1]. Результаты приведены в табл. 8
- 84 036714
Пример 23.
Данный пример иллюстрирует синтез N2,1A,N2,1A',N2,1B,N2,1B'-тетракис(диметил или изобутил)димеров (димеры 60, 58, 65 и 67). Димер 40, 19 или 4 (100 мг, 8,46 мкмоль) растворяли (суспендировали) в воде (10 мл) и доводили рН до 4,0 с помощью раствора уксусной кислоты, затем добавляли формальдегид (0,013 мл, 0,169 ммоль) или изобутиральдегид (0,025 мл, 0,272 ммоль), за чем следовало добавление свежеприготовленного раствора цианоборгидрида натрия (10,63 мг, 0,169 ммоль) в воде (500 мкл). Образовывался преципитат. Смесь осторожно перемешивали. Через приблизительно 1 ч после завершения реакции смесь аккуратно подкисляли посредством добавления 1н. HCl по каплям до рН 2,9. Суспензия становилась прозрачным раствором. Смесь очищали посредством препаративной ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка С-8, 50x250 см, 85 мл/мин, градиент от 29 до 36% в течение 25 мин). (Вода с 0,1% ТФУ и MeCN с 0,05% ТФУ). Желаемые фракции лиофилизировали с получением димеров (19,9 мг, 1,506 мкмоль, выход 17,80%). СВЭЖХ-МС, способ D: Rt=3,31 мин, m/z=1989,44 [(М+6) /6+1].
N-концевые заместители имеют структуру
(изобутил), причем волнистая линия обозначает связь между заместителем и азотом N2 N-концевой аминокислоты, или
(N-диметил; Ме2), причем волнистая линия обозначает связь между азотом N2 и углеродом С2 Nконцевой аминокислоты. Димеры приведены в табл. 9
Таблица 9
диме ра Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин) (М+6)/6 или (М+7)/7
60 о п о RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',Bf=Me2 3, 31 1989,44
- 85 036714
58 О О RHI; А1,В1,А1,,=Ме2 3,42 1978,48
65 оА \=о RHI; Al, Bl,Al1 , E' = изобутил 4, 13 1997,04
67 о °ΰ RHI; Al,Bl,Al,,B,=Me2 3,42 1719,39
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 24.
Синтез димеров 61, 62, 63, 64, и 66 проводили следующим образом.
Описан синтез 2,5-диоксопирролидин-1-ил-6-((2-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-2-оксоэтил)амино)-6-оксогексаноата (С6-глициновый линкер; линкер 24)
Этап 1. Бензил(2,5-диоксопирролидин-1-ил)адипат.
К раствору 6-(бензилокси)-6-оксогексановой кислоты (5 г, 21,16 ммоль) в ДМФ (10 мл) при 0°С добавляли N-этил-N-изопропилпропан-2-амин (4,44 мл, 25,4 ммоль), а затем TSTU (7,01 г, 23,28 ммоль). Реакцию перемешивали при 0°С в течение 1 ч и при комнатной температуре в течение 1 ч. Смесь выливали в смесь вода со льдом/этиловый эфир (1/1, 100 мл). Смесь экстрагировали с помощью этилового эфира (3x50 мл), промывали с помощью воды (2x10 мл) и рассола (10 мл). Органический слой сушили над MgSO4, фильтровали через слой целита и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения в виде бесцветного сиропа (5,2 г, 15,6 ммоль, 74%). ЖХ-МС 2 мин: Rt=1,05 мин, m/z=334,1 [M+1].
Этап 2. ((Карбоксиметил)амино)-6-оксогексановая кислота.
К раствору глицина (225 мг, 3,0 ммоль) в ДМФ (2,5 мл) добавляли по каплям продукт этапа 1 (1,0 г, 3,0 ммоль) в ДМФ (2,5 мл), а затем ТЭА (418 мкл, 3,0 ммоль). Реакцию перемешивали при комнатной температуре в течение 18 ч. ДМФ удаляли при пониженном давлении. Неочищенный продукт очищали посредством С18 хроматографии с обращенной фазой (элюировали 0-40% AcCN/вода в 16 объемах колонки (CV)). Фракции, содержащие желаемый продукт, объединяли, концентрировали и лиофилизовали с получением интермедиата (6-(бензилокси)-6-оксогексаноил)глицина. К вышеуказанному интермедиату в воде (3 мл) добавляли Pd/C (10%, 160 мг, 0,15 ммоль). Реакцию перемешивали при комнатной температуре в атмосфере водорода из баллона в течение 18 ч. Смесь фильтровали через слой целита, промывали с помощью МеОН/вода (1/1, 10 мл). Фильтрат концентрировали и лиофилизовали с получением указанного в заголовке соединения (400 мг, 2,2 ммоль, 66%). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,28 мин, m/z=204,03 [M+1].
Этап 3. 2,5-Диоксопирролидин-1-ил-6-((2-((2,5-диоксопирролидин-1-ил)окси)-2-оксоэтил)амино)-6оксогексаноат.
К продукту этапа 2 (10 мг, 0,049 ммоль) в ДМФ (0,5 мл) при 0°С добавляли ТЭА (0,015 мл, 0,108 ммоль), а затем TSTU (31,1 мг, 0,103 ммоль). Реакцию нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 1 ч. ТСХ (EtOAc/MeOH/водα/AcCN: 2:1:1:1 (об.:об.:об.:об.)) демонстрировала образование желаемого продукта (Rf: 0,25), причем не оставалось исходного материала. Неочищенный материал использовали для конструирования димеров без очистки.
Линкер 25 (С6-аланин), линкер 26 (С6-изолейцин), линкер 27 (С6-лейцин) и линкер 28 (С6-валин), в которых аминокислота, содержащая С6-аминокислотный линкер, представляет собой аланин, изолейцин, лейцин и валин, соответственно, синтезировали аналогично показанному выше способу. Димеры конструировали с использованием вышеуказанных линкеров с использованием препаративного способа D. Результаты приведены в табл. 10
- 86 036714
Таблица 10
№ димер а Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29г Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин ) (М+6)/6 или (М+7)/7
61 о н ? \ 7| о RHI; Al, Bl, А11,В1’=карбамои л 3,90 1993,24
62 °=^_ IZ у=о °\ RHI; Al,Bl, А11,В1’=карбамои л 3,91 1995,62
63 О и О RHI; Al,Bl,А11,В1’=карбамои л 4,02 1714,70
64 О u О RHI; Al,Bl, А11,В1'=карбамои л 3,80 1716,61
66 — IZ RHI; Al,Bl,А11,В1’=карбамои л 3,73 1716,93
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно,
Пример 25.
Синтез димеров 73, 89, 90, 91, 92 и 93 проводили следующим образом.
Описан синтез бис-2,5-диоксопирролидин-1-ил-3,3'-(1,3-фенилен)дипропионата (дипропилфенил; линкер 29).
Этап 1. Бис-2,5-диоксопирролидин-1-ил-3,3'-(1,3-фенилен)дипропионат.
К раствору 3,3'-(1,3-фенилен)дипропионовой кислоты (21,8 мг, 0,098 ммоль) в ДМФ (0,6 мл) при 0°С добавляли ТЭА (29 мл, 0,206 ммоль), а затем TSTU (62,0 мг, 0,206 ммоль). Реакцию нагревали до комнатной температуры и перемешивали при этой температуре в течение 1 ч. ТСХ (EtOAc/MeOH/вода/AcCN: 2/1/1/1) демонстрировала образование желаемого продукта (Rf: 0,25), причем не оставалось исходного материала. СВЭЖХ-МС, способ В: Rt=3,47 мин, m/z=417,19 [M+1]. Продукт использовали без дополнительной очистки для конструирования димера 73 с использованием аналога 5 с использованием способа D.
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-бензол-1,3-дикарбоксилата (терефталат; линкер 34)
Этап 1. Бис (2,5-диоксопирролидин-1-ил)-бензол-1,3-дикарбоксилат.
При 0°С к раствору терефталевой кислоты (100 мг, 0,602 ммоль) в ТГФ (2 мл) добавляли 2-(2,5диоксопирролидин-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилизоурония тетрафторборат (371 мг, 1,234 ммоль), а затем Nэтил-N-изопропилпропан-2-амин (0,222 мл, 1,234 ммоль)). Через 30 мин удаляли ледяную баню. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Дополнительно добавляли 25 мл ТГФ и остав- 87 036714 ляли реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Продукт концентрировали вплоть до приблизительно 5 мл и часть использовали как есть без дополнительной очистки для конструирования димера с использованием RHI с использованием способа D. Оставшийся материал разбавляли этилацетатом (200 мл) и промывали с помощью рассола (10 мл), органический слой сушили с помощью Na2SO4, фильтровали и концентрировали.
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)изофталата (изофталат; линкер 35)
Этап 1. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)изофталат.
К изофталевой кислоте (54 мг, 0,325 ммоль) в ДМСО (1 мл) добавляли TSTU (215 мг, 0,715 ммоль), а затем ТЭА (0,137 мл, 0,975 ммоль). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,79 мин, m/z=721,28 [2M+1]. Продукт использовали без очистки для конструирования димера 90 с использованием аналога 5 и димера 91 с использованием RHI в способе Е.
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоата (гептандиоат; линкер 36)
Этап 1. Бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоат.
К 4-((трет-бутоксикарбонил)амино)гептандиоевой кислоте (16,5 мг, 0,06 ммоль) в ДМСО (0,5 мл) добавляли TSTU (39,7 мг, 0,132 ммоль), а затем ТЭА (0,025 мл, 0,180 ммоль). ЖХ-МС 2 мин: Rt=0,90 мин, m/z=470,34 [M+1]. Продукт использовали без очистки для конструирования димера 92 с использованием аналога 5 и димера 93 с использованием RHI в способе Е.
Результаты приведены в табл. 11
- 88 036714
Таблица 11
№ димер а Структура димера, демонстрирующая с вязывающий фра гмент между остатками лизина Б29 и Б29г Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин ) (M+6) /6 или (M+7)/7
73 4 о RHI; Ά1,Bl, А1г,В11=карбамои Л 3,55 1711,57
89 о Λ о RHI; А1,В1,А1Г,В1'=Н 3,43 1678,64
90 о о RHI; Al, Bl,Alr, Bl'=карбамои л 3,67 1703,20
91 О о RHI; Al,Bl,Alr,Bl'=H 3,52 1678,69
92 νη. RHI; Al, Bl,Alr, Bl '=карбамои л 3,56 1704,64
93 nh2 RHI; Al, Bl,Alr, Bl 1=H 3, 33 1680,18
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В2 9 Lys и В2 9' Lys, соответственно.
Пример 26.
Синтез димеров 71, 72, 77, 78, 81 и 87 проводили следующим образом. Описан синтез бис(2,5диоксопирролидин-1-ил)(1S,4S)-циклогексан-1,4-дикарбоксилата (линкер 30; транс-циклогексан-1,4дикислоты)
К раствору (1S,4S)-циклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты (200 мг, 1,162 ммоль) в DCM (11 мл) при 0°С добавляли TSTU (734 мг, 2,439 ммоль) и DIPEA (0,5 мл, 2,86 ммоль). Получаемую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Продукт был измельчен в реакционном растворе в виде белого твердого вещества; его отфильтровывали и промывали с помощью DCM (2x5 мл); и сушили под вакуумом для получения указанного в заголовке соединения. СВЭЖХ-МС, вычислено для C16H18N2O8, 366,11, наблюдали m/z: 367,16 (М+Н)+, (Rt: 3,20/5,00 мин). СВЭЖХ-МС, способ А. 1H ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 2,81-2,89 (м; 2Н); 2,80 (с; 8Н); 2,02-2,10 (м; 4Н); 1,57-1,63 (м; 4Н).
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-(1R,4R)-циклогексан-1,4-дикарбоксилата (линкер 31; цис-циклогексан-1,4-дикислота)
О О,
N-CI
О
К раствору (1R,4R)-циклогексан-1,4-дикарбоновой кислоты (200 мг, 1,162 ммоль) в DCM (11 мл) при 0°С добавляли TSTU (734 мг, 2,439 ммоль) и DIPEA (0,5 мл, 2,86 ммоль). Получаемую реакционную
- 89 036714 смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) для получения указанного в заголовке соединения.
СВЭЖХ-МС, вычислено для C16H18N2O8, 366,11, наблюдали m/z: 367,17 (М+Н)+, (Rt: 3,17/5,00 мин).
СВЭЖХ-МС, способ А. 1H ЯМР (500 МГц, ДМСО): δ 3,02-3,08 (м; 2 Н); 2,80 (с; 8Н); 1, 80-1, 90 (м; 8 Н).
Описан синтез 1-(трет-бутил)-3,5-бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)(3R,5S)-пиперидин-1,3,5-трикарбоксилата (линкер 32)
К раствору (3R,5S)-1-(трет-бутоксикарбонил)пиперидин-3,5-дикарбоновой кислоты (200 мг, 0,734 ммоль) в ДМФ (7 мл) при 0°С добавляли TSTU (485 мг, 1,611 ммоль) и DIPEA (0,3 мл, 1,718 ммоль). Получаемую реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Остаток очищали посредством хроматографии на силикагеле (0-100% EtOAc/гексаны) для получения указанного в заголовке соединения. СВЭЖХ-МС, вычислено для C20H25N3Oi0, 467,15, наблюдали m/е: 468, 30 (М+Н)+, (Rt: 0,98/2,00 мин). СВЭЖХ-МС, способ А.
Общий способ F. Синтез димеров N6,29B,N6,29В'-инсулинов в условиях органического основания.
В контейнере соответствующего размера суспендируют инсулин или аналог инсулина при комнатной температуре в органическом растворителе или смешанных водн./органическом растворителях, например ДМСО, в присутствии основания, например ТЭА или 1,1,3,3-тетраметилгуанидина (TMG). Смесь оставляют осторожно перемешиваться до тех пор, пока инсулин полностью не растворится. К полученному раствору добавляют активированный сложноэфирный интермедиат в растворе органических растворителей, таких как ДМСО или ДМФ. После СВЭЖХ хроматограмма показывает, что существенная часть реакционной смеси превратилась в димер N6,298, N6,B29B'-инсулинов (или димер ν6·28Β6·28Β'инсулина лизпро), реакционный раствор переносили с помощью автоматической пипетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую IPAc/MTBE (об./об. 4:1) (45 мл). Добавление осуществляли по каплям. Получаемую белую суспензию центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин при 4°С) для получения прозрачного супернатанта и белого осадка. Супернатант сливали и белый осадок сушили под вакуумом. Белый осадок, содержащий неочищенный интермедиат, затем растворяли в 2 мл ТФУ при 0°С и перемешивали в течение 10 мин при той же температуре. После завершения реакции снятия boc реакционный раствор переносили с помощью автоматической пипетки в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую МТВЕ (45 мл). Добавление осуществляли по каплям. Получаемую белую суспензию центрифугировали (3000 об/мин, 15 мин при 4°С) для получения прозрачного супернатанта и белого осадка. Супернатант сливали и белый осадок сушили под вакуумом и повторно растворяли в растворе CH3CN/H2O (об./об. 1:4). Реакционная смесь может быть непосредственно подвергнута очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN), или реакция может быть остановлена аккуратным разбавлением холодной кислой Н2О (20х, рН ~ 3,0) при 0°С, и ее рН доводят до конечного рН 2,5 с использованием 1н. HCl (и 0,1н. NaOH при необходимости). Раствор может вначале быть сконцентрирован с помощью ультрафильтрации или с помощью системы фильтрации в тангенциальном потоке (TFF), или с использованием Amicon Ultra-15 Centrifugal Units с мембраной 1K, 3K или 10K MWCO. Концентрированный раствор обычно вначале подвергают ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Фракции, содержащие В29-конъюгат с желаемой чистотой, объединяют и концентрируют с использованием системы TFF или Amicon Ultra-15.
Концентрированный раствор затем подвергают очистке с помощью ВЭЖХ с обращенной фазой (колонка Waters C4 250x50 мм, 10 мкм, 1000 А, или колонка KROMASIL C8 250x50 мм, 10 мкм, 100 А; буфер А: 0,05-0,1% ТФУ в деионизированной воде; буфер В: 0,05-0,1% ТФУ в AcCN). Фракции, содержащие желаемый инсулиновый димер объединяют и сушат вымораживанием или заменяют буфер с использованием системы TFF и/или Amicon Ultra-15 с получением димеров N6,29B, N629B'-инсулинов.
Табл. 12 перечисляет димеры 71, 72, 77, 78, 81 и 87, которые были получены с использованием соответствующего линкера в соответствии с общим способом В (димеры 77 и 78), общим способом С (димеры 71 и 72) или общим способом F (димеры 81 и 87). Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХ-МС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt)
- 90 036714
Таблица 12
№ димера Структура димера, демонстрирующая связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин ) (М+6) /6 или (М+7) /7
71 RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1'=Н 3, 05 1959,33 1679, 86
72 ϊ'·Όί RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1Г 3, 07 1959,33 1679, 86
81 77 78 86 Во Е29 Lys О О Η о Р у../ О /—У о у../ о о Sr н лнистая линия обозне и B29r Lys, соответс RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ',В1'=Н RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ’,В1'= карбамоил RHI; ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ ',В1г = карбамоил RHT: ΑΙ,ΒΙ,ΑΙ1,В1’= карбамоил чает связь с эпсилс твенно. 3, 37 3, 50 3, 52 3, 48 н-амин 1959,48 1679,74 1988,07 1704,29 1988,08 1704,35 1988,18 1704,24 огруппой
Пример 26.
Синтез димера 68 и димера 74 проводили следующим образом.
Описан синтез бис(2,5-диоксопирролидин-1-ил)-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексаноата (линкер 33; С6N-хлор-1,3,5-триазин-NC6)
Раствор 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина (80 мг, 0,434 ммоль) и метил-6-аминогексаноата (129 мг, 0,889 ммоль), соль HCl, в CH2Cl2 (1 мл) охлаждали до -30°С. Добавляли по каплям раствор DIPEA (0,379 мл, 2,169 ммоль) в CH2Cl2 (1 мл). Смесь перемешивали при -30°С-комнатной температуре в течение 5 ч. Затем добавляли CH2Cl2 (20 мл) и промывали с помощью водной HCl (1М) (2x10 мл), водного NaHCO3 (10 мл) и рассола (10 мл). Органический слой сушили над сульфатом натрия и фильтровали, концентрировали с помощью вакуума для получения диметил-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексаноата (135 мг, 0,336 ммоль).
К раствору диметил-6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексаноата (135 мг, 0,336 ммоль) в ТГФ (0,5 мл) и метанола (0,5 мл) добавляли водный (2М) LiOH (504 мкл, 1,008 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и затем концентрировали под вакуумом
- 91 036714 для получения сухого остатка. Растворяли остаток в воде и нейтрализовали с помощью водн. HCl. Собирали преципитат с помощью фильтрации и промывали его с помощью воды. Сушили твердое вещество под вакуумом для получения 6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексановой кислоты.
К раствору 6,6'-((6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)бис(азанедиил))дигексановой кислоты (108 мг, 0,289 ммоль) в ДМФ (2889 мкл) добавляли TSTU (174 мг, 0,578 ммоль), а затем триэтиламин (81 мкл, 0,578 ммоль). Перемешивали реакцию 1 ч. СВЭЖХ показывает образование желаемого материала, СВЭЖХ-МС, способ С: Rt=0,99 мин, m/z=568,2 [M+1]. Данный реагент (0,1М/ДМФ) использовали без дополнительной очистки.
Димеры были получены с использованием или общего способа В (димер 74), или общего способа С (димер 6). Эти димеры были охарактеризованы с использованием СВЭЖХ-МС, способ D, или СВЭЖХМС, способ Е, причем они продемонстрировали шестизарядные, т.е. [(М+6)/6], (или семизарядные, т.е. [(М+7)/7]) частицы родительского соединения при определенном времени удерживания (Rt). Димер 68 был сконструирован с использованием линкера 33 и RHI. Димер 74 был сконструирован с использованием линкера 33 и аналога 5. Результаты приведены в табл. 13
Пример 27.
Синтез димера 54 проводили следующим образом.
Растворяли A1-ТФУ-RHI (D. Liu et. al., Journal of Peptide Sci., 2012, 18, 336-341) (100 мг, 0,017 ммоль) в предварительной смеси, содержащей воду (5 мл) и двухосновный фосфат калия (24,49 мг, 0,141 ммоль) (рН получаемого раствора составляет приблизительно 4). Добавляли цианат калия (27,5 мг, 0,339 ммоль) и перемешивали в течение ночи. Продукт очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка KROMASIL, С8 10 мкМ, 100 А, размер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ), поток=85 мл/мин, градиент В в А 26-34% в течение 30 мин. СВЭЖХ-МС, способ F: Rt=4,48 мин, m/z=1486,9 [(М+4)/4+1].
Растворяли вышеуказанный продукт (60 мг, 10,09 мкмоль) в ДМСО (594 мкл) и добавляли триэтиламин (28,1 мкл, 0,202 ммоль), а затем раствор линкера дисукцинимидилсуберата (1,858 мг, 5,04 мкмоль), растворенного в 100 мкл ДМСО. Перемешивали в течение 3 ч. СВЭЖХ показывает завершение реакции. Добавляли всю реакционную смесь в гидроксид аммония (2105 мкл, 15,13 ммоль) (по каплям, ожидали экзотермию). Перемешивали осторожно в течение 2 ч и подтверждали снятие защиты группы ТФУ. Разбавляли смесь с помощью 20 мл воды и удаляли большую часть гидроксида аммония посредством диафильтрации с использованием пробирок 10K Amicon. Доводили рН до приблизительно 3 и удаляли соли посредством диафильтрации. Продукт очищали с помощью ионообменной хроматографии (колонка PolySULFOETHYL A, PolyLC Inc., 250x21 мм, 5 мкм, 1000 А; буфер А: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN; буфер В: 0,1% (об./об.) Н3РО4/25% AcCN/0,5 M NaCl). Продукт повторно очищали с помощью хроматографии с обращенной фазой на фазе С-8 (колонка KROMASIL, C8 10 мкМ, 100 А, размер 250x50 мм; растворитель А=вода/0,05% ТФУ, растворитель B=AcCN/0,05% ТФУ). Результат показан ниже. Результаты приведены в табл. 14
- 92 036714
Таблица 14
№ димера Структура димера, д емо нс трирующа я связывающий фрагмент между остатками лизина В29 и В29' Тип инсулина; N-концы инсулина Rt (мин) (М+б) /6 или (М+7) / 7
54 О о RHT; ΑΙ,ΆΙΧ Н, Bl, В1’=карбамои л 4,57 1974,45
Волнистая линия обозначает связь с эпсилон-аминогруппой В29 Lys и В29' Lys, соответственно.
Пример 28.
Анализы связывания с инсулиновым рецептором осуществляли следующим образом.
Анализ связывания с IR проводили в сцинтилляционном анализе сближения (SPA) в 384-луночном формате с использованием клеточных мембран, полученных от клеток СНО, сверхэкспрессирующих человеческий IR(B), выращенных в среде F12, содержащей 10% ФБС и антибиотики (G418, пенициллин/стрептавидин). Клеточные мембраны были получены в 50 мМ Tris-буфере, рН 7,8 содержащем 5 мМ MgCl2. Буфер для анализа содержал 50 мМ Tris-буфер, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ CaCl2, 5 мМ MgCl2, 0,1% БСА и ингибиторы протеаз (Complete-Mini-Roche). Клеточные мембраны добавляли к гранулам WGA PVT PEI SPA (конечная концентрация 5 мг/мл) с последующим добавлением молекул инсулинового димера в соответствующих концентрациях. После 5-15 мин инкубации при комнатной температуре добавляли 125Щ-инсулин в конечной концентрации 0,015 нМ для конечного общего объема 50 мкл. Смесь инкубировали при встряхивании при комнатной температуре в течение от 1 до 12 ч с последующим сцинтилляционным подсчетом для определения связывания 125Щ-инсулина с IR и воздействия титрирования молекул инсулинового димера на данное взаимодействие.
Пример 29.
Анализы АКТ-фосфорилирования инсулинового рецептора (IR) осуществляли следующим образом.
Анализ АКТ-фосфорилирования IR: активация инсулинового рецептора может быть оценена посредством измерения фосфорилирования белка Akt, ключевого этапа сигнального каскада инсулинового рецептора. Линии клеток СНО, сверхэкспрессирующих человеческий IR, использовали в наборе для анализа HTRF-сэндвич-ELISA (Cisbio, Phospho-AKT(Ser473) and Phospho-AKT(Thr308) Cellular Assay Kits). Клетки выращивали в среде F12, дополненной 10% ФБС, 400 мкг/мл G418 и 10 мМ HEPES. До анализа клетки инкубировали в бессывороточной среде в течение от 2 до 4 ч. В качестве альтернативы, клетки могут быть заранее заморожены и разделены на аликвоты в среде, содержащий 20% ДМСО, и использованы в анализе после оттаивания, осаждения и повторного суспензирования. Клетки высевали по 10000 клеток на лунку в 20 мкл бессывороточной среды F12 в 384-луночных планшетах. На каждом планшете исследуемых соединений проводили контроль с помощью хумулина и инсулина гларгина. Титруемые соединения добавляли к клеткам (2 мкл на лунку, конечные концентрации=1000 нМ, титровали вплоть до 0,512 пМ в разведениях 1:5) и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. Клетки лизировали с помощью 8 мкл приготовленного буфера для лизиса, предлагаемого в наборе CisBio, и инкубировали при 25°С в течение 1 ч. Разбавленные реагенты-антитела (анти-AKT-d2 и анти-pAKT-Eu3/криптат) были получены в соответствии с инструкциями набора, и затем по 10 мкл добавляли в каждую лунку клеточного лизата с последующей инкубацией при 25°С в течение от 3,5 до 5 ч. Планшет считывали с помощью планшетного ридера Envision (возбуждение=320 нм; излучение=665 нм) для определения агонистической активности IR pAkt в отношении как активности, так и максимального отклика для каждого соединения. В качестве альтернативы, соединения тестировали таким же образом в присутствии 1,6 нМ хумулина, для того чтобы определить, насколько каждое соединение было в состоянии конкурировать с полной агонистической активностью инсулина.
Пример 30.
Табл. 15 показывает биологическую активность инсулиновых димеров in vitro по отношению к инсулиновому рецептору (IR). Активность измеряли или посредством конкурентных анализов лигандов, как описано в примере 28, или посредством функциональных анализов Akt-фосфорилирования, как описано в примере 29
- 93 036714
Таблица 15
№ димера Связывание с IR 1С50 (нМ) IR pAkt %Мах № димера Связывание с IR 1С5о (нН) IR pAkt %Мах
1 1, 50 50, 5 43 2,02 35
2 3, 77 33 44 1,18 33
3 1, 38 59, 5 45 4,00 38
4 1, 62 47, 5 46 0,38 25
5 2, 42 43 47 4,56 30
6 1, 00 83 48 5, 09 35
7 3, 19 60 49 5, 16 58
8 7, 15 47,5 50 3, 61 39
9 3, 29 42 51 0,59 27
10 3, 59 34 52 3,93 67
11 1, 37 32 54 0,49 26
12 13, 1 41 55 2,02 28
13 2, 51 36 56 2,94 33
14 4, 42 38 57 2,02 26
15 2, 53 49 58 0, 61 34
16 4,76 59 0,97 53
17 5, 27 62 60 1,81 60
18 5, 23 36 61 20,3 33
19 1, 40 25 62 5, 01 32
20 0, 62 36 63 26, 7 41
21 1, 88 41 64 15, 7 34
22 1, 85 41,5 65 3,05 42
23 2, 48 39 66 34,5 33
24 4,29 29, 3 67 0,54 24
25 1, 82 46 68 4,81 34
26 3, 74 44 69 4,99 18
27 3, 98 31 70 14,8 21
28 1, 96 25 71 2,28 45
29 1, 18 30 72 2,35 42
30 1,79 30 73 37,8 35
31 1, 36 31 74 73,8 33
32 21, 6 33 75 1,85 52
33 2, 41 38 76 1,87 35
34 0, 57 67 77 42, 1 23
35 1, 17 66 78 167 22
36 0, 53 28 79 1,47 42
37 3, 52 42 80 5,48 39
38 2, 18 45 81 0, 3 40
39 3, 17 45 82 1,73 50
40 2, 03 41 83 558 21
41 0, 64 35 84 2,19 50
42 2, 97 49
Пример 31.
В данном примере сравнивали эффекты in vivo нескольких частичных агонистов инсулинового рецептора настоящего изобретения с соединением А (инсулиновый димер MIU-90, раскрытый в опубликованной заявке РСТ № WO 2014052451) и соединением В (В29,В29'-субероил(инсулин)2), раскрытым в документе Deppe et al., Nauyn-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 350: 213-217 (1994), но с использованием RHI вместо бычьего инсулина в интраперитонеальном тесте на переносимость инсулина (IP-ITT), выполняемом на взрослых самцах тощих мышей C57BL/6NTac.
Группы из N=6-8 животных на группу рандомизировали по весу (в среднем приблизительно 30 г). За два дня до исследования мышей подготавливали к дозированию с помощью интраперитонеальной инъекции 0,9%-ного раствора хлорида натрия при объеме дозирования 5 мл/кг. На утро исследования пищу удаляли за два или четыре часа до исследования. Концентрацию глюкозы в крови определяли при Т=0 мин (исходный уровень) с использованием глюкометра. Затем мышам дозировали носитель, димер 24, димер 55, димер 58, димер 60, димер 67, соединение А, соединение В или хумулин (RHI) в количестве 5 мл/кг посредством интраперитонеальной инъекции (для используемых доз см. табл. 16). Уровни глюкозы в крови определяли из хвостовых кровопусканий от 30 до 360 мин после дозирования
- 94 036714
Таблица 16
Соединение Дозы
А 72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
в 72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 24 72 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 55 120 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 58 60 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 60 120 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Димер 67 60 нмоль/кг 300 нмоль/кг
Хумулин 18 нмоль/кг 72 нмоль/кг
Результаты показаны на фиг. 2А, 2В, 2С, 2D, 2Е, 2F и 2G. Результаты демонстрируют, что профиль глюкозы для димера 24, димера 55, димера 58, димера 60 и димера 67 оказался, по существу, одинаковым при обеих протестированных дозах, тогда как повышение дозировки соединений А и В вызывало повышение снижающей глюкозу активности, что указывает на меньший потенциальный риск гипергликемии для димеров по сравнению с RHI или соединениями А и В.
Пример 32.
Эффект снижения уровня глюкозы димеров 24, 18 и 40 сравнивали с RHI у миниатюрных юкатанских свиней с диабетом (минипиги D) следующим образом.
Юкатанских минипигов делали диабетиками типа 1 с помощью аллоксановых инъекций в соответствии с проприетарным протоколом, разработанным Sinclair Research Center (Auxvasse, МО). Индуцирование считали успешным, если базальные уровни глюкозы превышали 150 мг/дл. В этих экспериментах были использованы минипиги D с уровнями глюкозы в плазме, составляющими приблизительно 300 мг/дл.
В этих исследованиях были использованы самцы юкатанских минипигов, снабженные двумя портами сосудистого доступа (VAP) в яремной вене. В день исследования после голодания в течение ночи минипигов помещали в подвески, и получали доступ к VAP для инфузии и забора образцов. При t=0 мин и после сбора двух базовых образцов крови для измерения глюкозы в плазме (t=-30 мин и t=0 мин) минипигам вводили хумулин (рекомбинантный человеческий инсулин, RHI) или IRPA в виде одного в/в болюса в количестве 0,69 нмоль/кг. Хумулин и IRPA составляли в количестве 69 нмоль/мл в буфере, содержащем глицерин, 16 мг/мл; метакрезол, 1,6 мг/мл; фенол, 0,65 мг/мл; безводный фосфат натрия, двухосновный, 3,8 мг/мл; рН доводили до 7,4 с помощью HCl. После дозирования отбор проб продолжали в течение 480 минут; временные точки для сбора образцов составляли -30, 0, 8, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 420, 480 мин. Кровь собирали в пробирки с К3-ЭДТА с добавлением 10 мкг/мл апротинина и хранили на льду до обработки, которую проводили в пределах 30 мин от сбора. После центрифугирования при 3000 об/мин, 4°С, в течение 8 мин, плазму собирали и разделяли на аликвоты для измерения глюкозы с использованием химического анализатора Beckman Coulter AU480 и для измерения уровней соединения.
Фиг. 1 показывает, что при концентрации 0,69 нмоль/кг RHI снижал уровни глюкозы в сыворотке ниже 50 мг/дл, тогда как инсулиновые димеры этого не делали. Этот результат показывает, что инсулиновые димеры представляют меньший риск развития гипогликемии, чем RHI.
Пример 33.
Эффект снижения уровня глюкозы димеров 4, 5, 7, 8, 9, 18-29, 32, 37-41, 43, 44, 48, 55, 57, 58, 60, 61, 62, 64, 67, 69, 71, 72, 77 и 78 сравнивали с RHI у миниатюрных юкатанских свиней с диабетом (минипиги D) следующим образом.
Юкатанских минипигов делали диабетиками типа 1 с помощью аллоксановых инъекций в соответствии с проприетарным протоколом, разработанным Sinclair Research Center (Auxvasse, МО). Индуцирование считали успешным, если базальные уровни глюкозы превышали 150 мг/дл. В этих исследованиях были использованы минипиги D с уровнями глюкозы в плазме, составляющими приблизительно 300-400 мг/дл, и снабженные двумя портами сосудистого доступа (VAP) в яремной вене.
В день исследования после голодания в течение ночи минипигов помещали в подвески и получали доступ к VAP для инфузии и забора образцов. При t=0 мин и после сбора двух базовых образцов крови для измерения глюкозы в плазме (t=-30 мин и t=0 мин) минипигам вводили хумулин (рекомбинантный человеческий инсулин, RHI) или другой димер в виде одного в/в болюса в количестве 0,69 нмоль/кг (0,35 нмоль/кг для соединения #78). Хумулин и димеры составляли в количестве 69 нмоль/мл в буфере, содержащем глицерин, 16 мг/мл; метакрезол, 1,6 мг/мл; фенол, 0,65 мг/мл; безводный фосфат натрия,
- 95 036714 двухосновный, 3,8 мг/мл, рН доводили до 7,4 с помощью HCl. После дозирования отбор проб продолжали в течение 480 мин; временные точки для сбора образцов составляли -30, 0, 8, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330, 360, 420 и 480 мин. Кровь собирали в пробирки с К3-ЭДТА с добавлением 10 мкг/мл апротинина и хранили на льду до обработки, которую проводили в пределах 30 мин от сбора. После центрифугирования при 3000 об/мин, 4°С, в течение 8 мин плазму собирали и разделяли на аликвоты для измерения глюкозы с использованием химического анализатора Beckman Coulter AU480. Результаты показаны на фиг. 7А-7Н. Эти фигуры показывают, что при концентрации 0,69 нмоль/кг RHI снижал уровни глюкозы в сыворотке ниже 50 мг/дл, тогда как инсулиновые димеры этого не делали. Этот результат показывает, что инсулиновые димеры представляют меньший риск развития гипогликемии, чем RHI.
Пример 34.
Этот эксперимент сравнивал стабильность дисульфидного связывающего фрагмента соединения А с субероиловым (С8) связывающим фрагментом димера 24.
мкМ соединения А и димера 24 по отдельности инкубировали в мембранах клеток почек крысы (RKCM) с 5 мМ глутатиона (GSH) или без него. Получали образцы в момент времени 0 и в момент времени 2 ч и реакцию останавливали с помощью 1 об. 10% МеОН в AcCN с 0,1% муравьиной кислоты. Затем образцы с остановленной реакцией центрифугировали и замораживали до анализа. Затем образцы оттаивали и анализировали с использованием системы Thermo Orbi Velos. Целевой анализ MetID проводили на экстрагированных ионных хроматограммах (XIC) с использованием 3 изотопов от 2 зарядовых состояний при окне 10 м.д.
Метаболиты соединения А были детектированы в RKCM как без GSH, так и с GSH. Как показано на фиг. 3, мономер составлял приблизительно 1% от родительского соединения (исходного раствора соединения А) к 2 часам инкубации. Как показано на фиг. 4, мономер составлял приблизительно 6,5% от родительского соединения (исходного раствора соединения А) к 2 ч инкубации. Эти результаты показывают, что дисульфидная связь разрушается со временем. Метаболиты не наблюдались в контроле при 0 ч для соединения А или в исходных растворах.
Димер 24 производил метаболиты, которые были детектированы в RKCM, однако, хотя наблюдали утрату полипептида А-цепи из-за разрыва дисульфидных связей между полипептидом А-цепи и полипептидом В-цепи, мономеры не были детектированы. Фиг. 5 показывает, что без GSH утрата полипептида А-цепи составляла менее чем 1% от родительского соединения (исходного раствора димера 24). Фиг. 6 показывает, что с GSH утрата полипептида А-цепи составляла менее чем 1% от родительского соединения (исходного раствора димера 24). Метаболиты не наблюдались в контроле при 0 ч для димера 24 или в исходных растворах. Новая процедура с кислыми условиями хорошо останавливала дисульфидный обмен.
Таблица последовательностей
SEQ ID NO: Описание Последовательность
1 Инсулин Homo sapiens, А-цепь GIVEQCCTSIC8LYQLENYCN
2 Инсулин Homo sapiens, В-цепь FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT
3 Искусственная последовательность, A-цепь инсулина Х2 представляет собой изолейцин или треонин; Хз представляет собой валин, глицин или лейцин; Х8 представляет собой треонин или гистидин; Х17 представляет собой глутаминовую кислоту или глутамин; Х1$> представляет собой тирозин, 4метоксифенилаланин, аланин или 4аминофенилаланин; Х^з представляет собой аспарагин или глицин; GX2X3EQCCX θ ΞIС S L YQLX17NX i3CX2 s
4 Искусственная последовательность, GXiXsEQCCX а SIС 8 L YQLXi?NX iaCX2 3
- 96 036714
В-цепь инсулина Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х2д представляет собой аланин, глицин или серин; Хзо представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; Х31 представляет собой пролин или лизин; и Х32 представляет собой пролин или лизин, при условии, что по меньшей мере один из Х31 или Х32 представляет собой лизин
5 Х22 представляет собой фенилаланин или дезаминофенилаланин; Х25 представляет собой гистидин или треонин; Х26 представляет собой глицин или лейцин; Х27 представляет собой фенилаланин или аспарагиновую кислоту; Х2д представляет собой аланин, глицин или серин; Х3о представляет собой гистидин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гомоцистеиновую кислоту или цистеиновую кислоту; Х31 представляет собой аспарагиновую кислоту, пролин или лизин; Х32 представляет собой лизин или пролин; Х33 представляет собой треонин, аланин или отсутствует; Х34 представляет собой аргинин или отсутствует; и Х3& представляет собой аргинин или отсутствует; при условии, что по меньшей мере один из Х31 или Х32 представляет собой лизин X22VNQX25X26CGX25X3oLVEALYLVCGERG FX27YTXb1X32X33X^Xb5
6 Искусственная последовательность, В-цепь инсулина лизпро FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTKPT
7 Искусственная последовательность, A-цепь инсулина гларгина GIVEQCCTSICSLYQLENYCG
8 Искусственная последовательность, В-цепь инсулина гларгина FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RR
9 Искусственная последовательность, В-цепь инсулина аспарта FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTDKT
10 Искусственная последовательность, B:des30 FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPK
11 Искусственная последовательность, A: Y19A GIVEQCCTSICSLYQLENACN
- 97 036714
При том что изобретение описано в настоящем документе со ссылкой на проиллюстрированные варианты осуществления, следует понимать, что изобретение не ограничено ими. Специалистам со средней квалификацией в данной области техники и имеющим доступ к идеям настоящего документа будут ясны дополнительные модификации и варианты осуществления в пределах объема изобретения. Таким образом, изобретение ограничено только прилагаемой к настоящему документу формулой изобретения.

Claims (8)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Соединение, имеющее активность частичного агониста инсулинового рецептора (IRPA), выбранное из группы, состоящей из
    - 98 036714
    - 99 036714
    - 100 036714
    причем дисульфидные связи между остатками Cys6 и Cys11 полипептида А-цепи и дисульфидные связи между Cys7 и Cys20 А-цепи до Cys7 и Cys19 полипептида В-цепи, соответственно, представлены с помощью сплошной линии между ними, причем связывающие фрагменты ковалентно связаны с εаминокислотой показанного остатка лизина, где полипептид А-цепи для димеров 13, 18, 19, 20, 24, 28, 32, 54, 55, 56, 58, 65 и 83 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1; полипептид В-цепи для димеров 13, 24, 54, 55, 56 и 58 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2; полипептид В-цепи для димеров 18 и 32 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 6; полипептид В-цепи для димеров 19, 65 и 83 имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 9; и полипептид В-цепи для димеров 20 и 28 имеет аминокислотную последовательность, показанную в
    - 101 036714
    SEQ ID NO: 10.
  2. 2. Композиция для лечения диабета, содержащая одно или более соединений по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.
  3. 3. Способ лечения диабета, включающий введение индивидууму с диабетом терапевтически эффективного количества композиции по п.2.
  4. 4. Способ по п.3, в котором диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.
  5. 5. Соединение, имеющее активность частичного агониста инсулинового рецептора, имеющее фор- мулу
    где дисульфидные связи между остатками Cys6 и Cysn полипептида А-цепи и дисульфидные связи между Cys? и Cys20 А-цепи до Cys? и Cys19 полипептида В-цепи, соответственно, представлены сплошной линией между ними, причем связывающие фрагменты ковалентно связаны с ε-аминокислотой показанного остатка лизина, где полипептид А-цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 1, и полипептид В-цепи имеет аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Композиция для лечения диабета, содержащая соединение по п.5 и фармацевтически приемлемый носитель.
  7. 7. Способ лечения диабета, включающий введение индивидууму с диабетом терапевтически эффективного количества композиции по п.6.
  8. 8. Способ по п.7, где диабет представляет собой диабет типа 1, диабет типа 2 или гестационный диабет.
EA201791117A 2014-11-21 2015-11-19 Частичные агонисты инсулинового рецептора EA036714B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462082857P 2014-11-21 2014-11-21
US201562242503P 2015-10-16 2015-10-16
PCT/US2015/061445 WO2016081670A2 (en) 2014-11-21 2015-11-19 Insulin receptor partial agonists

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201791117A1 EA201791117A1 (ru) 2017-11-30
EA036714B1 true EA036714B1 (ru) 2020-12-10

Family

ID=54838417

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201791117A EA036714B1 (ru) 2014-11-21 2015-11-19 Частичные агонисты инсулинового рецептора

Country Status (27)

Country Link
US (4) US20170355743A1 (ru)
EP (4) EP3666792A3 (ru)
JP (5) JP6484337B2 (ru)
KR (2) KR102101136B1 (ru)
CN (2) CN112494656B (ru)
AR (1) AR102712A1 (ru)
AU (3) AU2015349890B2 (ru)
BR (2) BR122024000898A2 (ru)
CA (2) CA3014641C (ru)
CL (3) CL2017001288A1 (ru)
CO (1) CO2017004976A2 (ru)
CR (1) CR20170208A (ru)
DO (1) DOP2017000124A (ru)
EA (1) EA036714B1 (ru)
ES (1) ES2946247T3 (ru)
GT (1) GT201700104A (ru)
IL (1) IL252257A0 (ru)
MX (3) MX2017006651A (ru)
NI (1) NI201700060A (ru)
PE (1) PE20170957A1 (ru)
PH (1) PH12017500935A1 (ru)
SG (4) SG10201809427SA (ru)
SV (1) SV2017005445A (ru)
TN (1) TN2017000178A1 (ru)
TW (1) TW201625673A (ru)
WO (1) WO2016081670A2 (ru)
ZA (1) ZA201703238B (ru)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS63190B1 (sr) 2014-08-04 2022-06-30 Nuevolution As Opciono fuzionisani derivati pirimidina zamenjeni heterociklilom korisni za lečenje zapaljenskih, metaboličkih, onkoloških i autoimunskih bolesti
US20170355743A1 (en) * 2014-11-21 2017-12-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
AR105616A1 (es) 2015-05-07 2017-10-25 Lilly Co Eli Proteínas de fusión
US10953076B2 (en) 2016-05-24 2021-03-23 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists and GLP-1 analogues
WO2017205309A1 (en) 2016-05-25 2017-11-30 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
WO2018077851A1 (en) * 2016-10-24 2018-05-03 Novo Nordisk A/S Bioassay for insulin formulations
MA49896A (fr) 2017-08-17 2020-06-24 Novo Nordisk As Nouveaux analogues d'insuline acylés et leurs utilisations
CA3108282A1 (en) 2018-08-02 2020-02-06 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US20220193250A1 (en) 2018-08-02 2022-06-23 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US12018087B2 (en) 2018-08-02 2024-06-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle-targeting complexes comprising an anti-transferrin receptor antibody linked to an oligonucleotide and methods of delivering oligonucleotide to a subject
US11168141B2 (en) 2018-08-02 2021-11-09 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11911484B2 (en) 2018-08-02 2024-02-27 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
CN112898172B (zh) * 2019-12-04 2022-05-31 中国科学院大连化学物理研究所 可被羧肽酶酶解的双亲和功能团化合物的合成方法
EP4076657A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Nuevolution A/S Compounds active towards nuclear receptors
US11780843B2 (en) 2020-03-31 2023-10-10 Nuevolution A/S Compounds active towards nuclear receptors
EP4126875A1 (en) 2020-03-31 2023-02-08 Nuevolution A/S Compounds active towards nuclear receptors
WO2022046747A1 (en) * 2020-08-26 2022-03-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists
JP2023540746A (ja) * 2020-09-03 2023-09-26 ダイン セラピューティクス,インコーポレーテッド タンパク質-オリゴヌクレオチド複合体の調製方法
EP4210729A2 (en) * 2020-09-09 2023-07-19 Merck Sharp & Dohme LLC Insulin receptor partial agonists
US11633498B2 (en) 2021-07-09 2023-04-25 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating myotonic dystrophy
US11638761B2 (en) 2021-07-09 2023-05-02 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating Facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11672872B2 (en) 2021-07-09 2023-06-13 Dyne Therapeutics, Inc. Anti-transferrin receptor antibody and uses thereof
US11771776B2 (en) 2021-07-09 2023-10-03 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating dystrophinopathies
US11969475B2 (en) 2021-07-09 2024-04-30 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and uses thereof for treating facioscapulohumeral muscular dystrophy
US11931421B2 (en) 2022-04-15 2024-03-19 Dyne Therapeutics, Inc. Muscle targeting complexes and formulations for treating myotonic dystrophy

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050456A2 (de) * 1999-02-24 2000-08-31 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Kovalent verbrückte insulindimere
WO2013063572A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Case Western Reserve University Ultra-concentrated rapid-acting insulin analogue formulations
WO2014052451A2 (en) * 2012-09-26 2014-04-03 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1381273A (en) * 1971-01-28 1975-01-22 Nat Res Dev Insulin derivatives
US3907763A (en) 1972-03-01 1975-09-23 Bayer Ag Insulin derivatives crosslinked by a dicarboxylic acid moiety
PH25772A (en) 1985-08-30 1991-10-18 Novo Industri As Insulin analogues, process for their preparation
US5514646A (en) 1989-02-09 1996-05-07 Chance; Ronald E. Insulin analogs modified at position 29 of the B chain
US5304473A (en) 1991-06-11 1994-04-19 Eli Lilly And Company A-C-B proinsulin, method of manufacturing and using same, and intermediates in insulin production
WO1995016708A1 (en) 1993-12-17 1995-06-22 Novo Nordisk A/S Proinsulin-like compounds
IL118127A0 (en) 1995-05-05 1996-09-12 Lilly Co Eli Single chain insulin with high bioactivity
AU4672699A (en) * 1998-06-08 1999-12-30 Theravance, Inc. Novel sodium channel drugs and uses
KR100449454B1 (ko) 2000-10-02 2004-09-21 이현철 단일사슬 인슐린 유도체의 유전자를 포함하는 당뇨병치료용 벡터
US6852694B2 (en) 2001-02-21 2005-02-08 Medtronic Minimed, Inc. Stabilized insulin formulations
US7105314B2 (en) 2001-04-02 2006-09-12 Novo Nordisk A/S Method for making human insulin precursors
US7375234B2 (en) 2002-05-30 2008-05-20 The Scripps Research Institute Copper-catalysed ligation of azides and acetylenes
KR100507796B1 (ko) 2003-04-03 2005-08-17 한미약품 주식회사 생체내 반감기가 증가된 peg-생리활성 폴리펩티드 동종이량체 결합체 및 이의 제조방법
EP1692168B1 (en) 2003-12-03 2011-07-20 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin
WO2006045710A2 (en) 2004-10-27 2006-05-04 Novo Nordisk A/S Insulin receptor binding peptides with non-insulin gene activation profiles and uses thereof
US7807619B2 (en) 2004-11-01 2010-10-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for modification of biomolecules
WO2006097521A1 (en) 2005-03-18 2006-09-21 Novo Nordisk A/S Pegylated single-chain insulin
EP1991575A1 (en) 2006-02-21 2008-11-19 Novo Nordisk A/S Single-chain insulin analogues and pharmaceutical formulations thereof
WO2007104734A1 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
WO2007104737A1 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
WO2007104736A2 (en) 2006-03-13 2007-09-20 Novo Nordisk A/S Acylated single chain insulin
US20090099065A1 (en) 2006-03-13 2009-04-16 Novo Nordisk A/S Acylated Single Chain Insulin
EP2054437A2 (en) 2006-08-07 2009-05-06 Teva Biopharmaceuticals USA, Inc. Albumin-insulin fusion proteins
WO2008145721A2 (en) * 2007-06-01 2008-12-04 Novo Nordisk A/S N-terminal modification of polypeptides for protection against degradation by aminopeptidases
CA2713348C (en) 2008-01-30 2018-10-09 Indiana University Research And Technology Corporation Ester-based peptide prodrugs
RU2010147076A (ru) 2008-04-22 2012-05-27 Кейз Вестерн Ризев Юнивесити (Us) Аналоги инсулина специфичные к изоформам
TWI394580B (zh) * 2008-04-28 2013-05-01 Halozyme Inc 超快起作用胰島素組成物
KR101820024B1 (ko) * 2008-10-17 2018-01-18 사노피-아벤티스 도이칠란트 게엠베하 인슐린과 glp-1 효능제의 병용물
AU2009335715B2 (en) 2008-12-19 2016-09-15 Indiana University Research And Technology Corporation Amide-based insulin prodrugs
CA2747490C (en) 2008-12-19 2017-02-14 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analogs
WO2011059895A1 (en) 2009-11-11 2011-05-19 Quest Diagnostics Investments Incorporated Hexa mutations
EP2582719B1 (en) 2010-06-16 2016-08-10 Indiana University Research and Technology Corporation Single chain insulin agonists exhibiting high activity at the insulin receptor
US8255297B2 (en) 2010-07-20 2012-08-28 Facebook, Inc. Creation, redemption, and accounting in a virtual currency system
US20140315797A1 (en) * 2010-10-15 2014-10-23 Peter Madsen Novel N-Terminally Modified Insulin Derivatives
US20160067212A1 (en) 2013-03-15 2016-03-10 Universite De Geneve Use of insulin signaling antagonists, optionally in combination of transfection of non-beta cells, for inducing insulin production
CN105792852B (zh) * 2013-10-04 2019-12-10 默沙东公司 葡萄糖响应性的胰岛素缀合物
EP3068443B1 (en) * 2013-11-12 2019-04-10 Centre for Probe Development and Commercialization Residualizing linkers and uses thereof
BR112016016578A2 (pt) 2014-01-20 2017-10-03 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Insulina de ação prolongada e uso daanálogo de insulina, polinucleotídeo, vetor de expressão, transformante, insulina de ação prolongada bem como seu método de preparação e formulação da mesma, conjugado, e uso do mesmo mesma
US20170355743A1 (en) 2014-11-21 2017-12-14 Merck Sharp & Dohme Corp. Insulin receptor partial agonists

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000050456A2 (de) * 1999-02-24 2000-08-31 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Kovalent verbrückte insulindimere
WO2013063572A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Case Western Reserve University Ultra-concentrated rapid-acting insulin analogue formulations
WO2014052451A2 (en) * 2012-09-26 2014-04-03 Indiana University Research And Technology Corporation Insulin analog dimers

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEPPE, C. ET AL.: "Structure-activity relationship of covalently dimerized insulin derivatives: correlation of partial agonist efficacy with cross-linkage at lysine B29", NAUNYN-SCHMIEDEBERG'S ARCHIVES OF PHARMACOLOGY, SPRINGER, DE, vol. 350, no. 2, 1 August 1994 (1994-08-01), DE, pages 213 - 217, XP000925874, ISSN: 0028-1298 *
JOHN Harold et al.: N-Terminal acetylation protects glucagon-like peptide GLP-1-(7-34)-amide from DPP-IV-mediated degradation retaining cAMP- and insulin-releasing capacity. European Journal of Medical Research, 2008, v. 13, pp. 73-78, реферат, с. 75-77 *
JOHN P. MAYER, FAMING ZHANG, RICHARD D. DIMARCHI: "Insulin Structure and Function", BIOPOLYMERS, JOHN WILEY & SONS, INC., US, vol. 88, no. 5, 1 January 2007 (2007-01-01), US, pages 687 - 713, XP008152505, ISSN: 0006-3525, DOI: 10.1002/bip.20734 *
SCHUETTLER, A. & BRANDENBURG, D.: "Preparation and Properties of Covalently Linked Insulin Dimers", HOPPE-SEYLER'S ZEITSCHRIFT FUER PHYSIOLOGISCHE CHEMIE., WALTER DE GRUYTER, BERLIN, DE, vol. 363, no. 3, 1 March 1982 (1982-03-01), DE, pages 317 - 330, XP000925886, ISSN: 0018-4888 *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2019014734A (ja) 2019-01-31
EA201791117A1 (ru) 2017-11-30
CR20170208A (es) 2017-07-17
WO2016081670A2 (en) 2016-05-26
AU2018211207A1 (en) 2018-08-16
AU2018211208A1 (en) 2018-08-16
TN2017000178A1 (en) 2018-10-19
CA3014641A1 (en) 2016-05-26
US20180291078A1 (en) 2018-10-11
BR122024000903A2 (pt) 2024-02-27
IL252257A0 (en) 2017-07-31
CN112494656B (zh) 2024-01-30
SV2017005445A (es) 2018-04-04
EP3666792A2 (en) 2020-06-17
CL2019001143A1 (es) 2019-07-19
SG10201809457YA (en) 2018-11-29
BR112017010481A8 (pt) 2023-04-11
AU2018211208B2 (en) 2020-09-10
AU2015349890B2 (en) 2018-08-30
KR20170084300A (ko) 2017-07-19
ES2946247T3 (es) 2023-07-14
WO2016081670A3 (en) 2016-08-04
MX2017006651A (es) 2017-08-21
MX2020014120A (es) 2021-03-25
SG10201809428UA (en) 2018-11-29
JP2019014735A (ja) 2019-01-31
KR20190069622A (ko) 2019-06-19
CA2966765A1 (en) 2016-05-26
KR102101136B1 (ko) 2020-04-14
CA2966765C (en) 2020-04-14
EP3660041B1 (en) 2023-04-19
CA3014641C (en) 2020-08-18
JP2018501203A (ja) 2018-01-18
EP3666792A3 (en) 2020-07-29
BR112017010481A2 (pt) 2018-04-03
EP3660041A1 (en) 2020-06-03
CN108064173B (zh) 2021-05-18
AR102712A1 (es) 2017-03-22
EP3660040A2 (en) 2020-06-03
US10800827B2 (en) 2020-10-13
US10183981B2 (en) 2019-01-22
JP6703068B2 (ja) 2020-06-03
SG10201809427SA (en) 2018-11-29
EP3660040A3 (en) 2020-07-29
US20170107268A1 (en) 2017-04-20
ZA201703238B (en) 2018-05-30
PE20170957A1 (es) 2017-07-13
MX2020014121A (es) 2021-03-25
US10017556B2 (en) 2018-07-10
JP6484337B2 (ja) 2019-03-13
AU2018211207B2 (en) 2020-04-09
PH12017500935A1 (en) 2017-11-27
TW201625673A (zh) 2016-07-16
DOP2017000124A (es) 2017-08-15
SG11201704064TA (en) 2017-06-29
JP6931033B2 (ja) 2021-09-01
NI201700060A (es) 2017-07-18
US20190092833A1 (en) 2019-03-28
EP3221343B1 (en) 2020-09-16
JP6943825B2 (ja) 2021-10-06
JP2020097572A (ja) 2020-06-25
GT201700104A (es) 2018-11-27
JP2019011357A (ja) 2019-01-24
CN112494656A (zh) 2021-03-16
BR122024000898A2 (pt) 2024-02-27
EP3221343A2 (en) 2017-09-27
CL2019001144A1 (es) 2019-07-19
US20170355743A1 (en) 2017-12-14
CL2017001288A1 (es) 2017-12-15
CO2017004976A2 (es) 2017-10-10
KR102049647B1 (ko) 2019-11-29
CN108064173A (zh) 2018-05-22
AU2015349890A1 (en) 2017-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10800827B2 (en) Insulin receptor partial agonists
US20190142906A1 (en) Insulin receptor partial agonists and glp-1 analogues
US10689430B2 (en) Insulin receptor partial agonists
EA041034B1 (ru) Частичные агонисты инсулинового рецептора
WO2022055877A2 (en) Insulin receptor partial agonists
BR112017010481B1 (pt) Composto útil como agonista parcial de receptor de insulina, composição, e, uso de uma composição