CN101490243A - 细胞生长培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在无饲养层和无血清的条件下培养灵长类胚胎干细胞的方法。

Description

细胞生长培养基
本发明涉及灵长类胚胎干细胞，优选人胚胎干细胞(human embryonicstem cells，hES)在无饲养层细胞和无血清的培养中的维持。
培养例如某些哺乳动物细胞的胚胎细胞已成为常规的方法，且允许某些细胞增殖的细胞培养条件也有详细说明。通常，哺乳动物细胞的细胞培养需要通常由塑料制成的无菌容器和生长培养基。例如，胚胎干细胞的生长需要饲养层细胞和血清两者的存在。饲养层细胞的功能还未明确了解。但据推测，饲养层细胞的作用可能是提供促有丝***信号，该信号刺激细胞增殖和/或保持细胞的未分化状态。饲养层细胞通常是经过处理(如丝裂霉素或辐射处理)以致不能增殖的成纤维细胞。通常，饲养层成纤维细胞是鼠源的，但也可来自其他物种。
术语“干细胞”是一群未分化细胞的总称，所述未分化细胞具有自我更新的能力，同时保留了形成分化的细胞和组织的多样化潜能。干细胞可以是全能的(totipotent)、多能的(pluripotent)或专能的(multipotent)。也存在丧失分化能力的衍生干细胞，被称为“无能(ullipotent)”干细胞。全能干细胞是能够形成在完整的生命体中发现的所有细胞和组织包括胚胎外组织(即胎盘)的细胞。全能干细胞包括极早期胚胎(8个细胞)，并能够形成完整的生命体。尽管多能干细胞不能形成完整的生命体，但多能干细胞是具有形成在完整生命体中发现的所有组织的能力的细胞。专能干细胞具有形成分化的细胞和组织的有限能力。通常，成体干细胞是专能干细胞，并且是能够形成某些细胞或组织并补充老化或受损的细胞/组织的前体干细胞或祖系限定干细胞(lineage restricted stem cells)。尽管对于此类“成体”干细胞，有些报道声称其比最初预料的具有更强的潜能，但它们通常不能形成生命体中发现的所有组织。
多能胚胎干细胞主要来自两种胚胎来源。分离于内细胞团的细胞称为胚胎干(ES)细胞。在实验小鼠中，类似的细胞可从原生殖细胞的培养物中获得，原生殖细胞分离自交配后8.5至12.5天的胚胎的肠系膜或生殖脊。它们被称为胚胎生殖细胞(EG细胞)。这些类型的多能细胞的每一种都具有类似的分化成其他细胞类型的发育潜能，但习性(如印记)中可能的差异又使这些细胞彼此不同。但术语“多能胚胎干细胞”包括来自内细胞团的细胞和原生殖细胞两者。
已证明，建立灵长类胚胎干细胞的体外培养物尚存疑难。WO96/22362中记载了确定允许建立培养的hES细胞的条件的指标。WO96/22362描述了允许灵长类ES细胞连续增殖的细胞系和生长条件，所述的灵长类ES细胞表现出了一系列与具多能特性的干细胞有关的特性或标志物。这些包括，但不限于，当维持于成纤维细胞饲养层中时，在培养物中维持至少20代；产生被称为拟胚体的成簇的细胞；当培养于悬浮液中时，能在单细胞层培养中分化成多种细胞类型；当注射入免疫缺陷小鼠中时，形成具有多种分化的细胞类型的异种移植畸胎瘤以及表达胚胎干细胞特异性标志物，特别是SSEA3、SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81、碱性磷酸酶以及Oct4。WO96/22362公开了在小鼠成纤维细胞饲养层细胞和血清存在的情况下，维持培养的灵长类ES细胞处于未分化状态的方法。
已有大量资料证明了胚胎干细胞，特别是人ES(hES)细胞在治疗型组织工程中潜在的效用。这些细胞的多能特性允许选择hES细胞并使hES细胞分化成任何细胞/组织类型。然而，当治疗中使用暴露于胎牛血清或鼠饲养层细胞的细胞时，存在诸如阮病毒或病毒的外源因子可能感染受体的潜在风险。因此，必须处理hES细胞的细胞培养，以使这种风险降至最低。无饲养层和无血清的条件的研发，将有助于降低这种风险。
此外，已分化成特定细胞类型衍生物的hES细胞，因为其在基因分型上相同、稳定且来源已知，故可用于鉴定新药物和现有药物的基因靶标。使用不同基因型的ES细胞系也在药物基因组学相关的方面为药物筛选和毒理学提供了可能的途径。
灵长类ES细胞的无血清培养条件的进展是已知的。例如，WO01/66697公开了灵长类ES细胞的无血清生长，其中，用成纤维细胞生长因子，通常是人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，4ng/ml)替代血清。细胞培养基包括补充了bFGF的KnockOut SRtm(在WO98/30679中进行了描述，其全部内容以参考的方式并入)。然而，细胞培养物包括经辐射的鼠成纤维细胞饲养细胞。
在WO2006/029198中公开了用于hES细胞生长的无血清和无饲养层培养方法的进展。这些生长条件使用浓度提高的bFGF(40-100ng/ml)、补充剂，并包括氨基酸、脂、维生素和葡萄糖，所述补充剂包括γ-氨基丁酸、哌啶酸和锂。WO2006/029198也公开了含有诸如纤连蛋白、玻璃粘连蛋白(vitronectin)和层粘连蛋白(laminin)等人蛋白的细胞培养基质的用途。
此外，Furue et al(In vitro Cell Dev.Biol.Animal 41：19-28，2005)公开了在白血病抑制因子(LIF)存在的情况下，小鼠胚胎干细胞的无血清和无饲养层生长。这在WO2005/063968中也有记载。
建立简单的细胞培养条件是有利的，其不需要加入诸如胎牛血清或鼠饲养层细胞等异型生物质材料，因为它们的使用可增加感染性因子(如，特别是牛产品的病毒和阮病毒，以及鼠饲养层细胞的鼠病毒)感染培养物中生长的哺乳动物细胞的可能性。本发明提供了可选择的简单细胞培养基，其能够在无血清和饲养层的条件下维持hES细胞。
本发明一方面提供了在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎干细胞的方法，其包括：在含有细胞培养基的细胞培养容器中形成灵长类胚胎干细胞制备物，以及维持灵长类胚胎干细胞的未分化状态。所述细胞培养基包含成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
本发明一方面提供了在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎干细胞的方法，其包括如下步骤：
i)在由基于蛋白质的细胞培养支持物包被的细胞培养容器中形成灵长类胚胎干细胞制备物，其中，将所述细胞培养于细胞培养基中，所述细胞培养基包含胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物，以及
ii)维持灵长类胚胎干细胞处于未分化状态。
本发明包括灵长类特别是人的多能胚胎干细胞，且还包括畸胎癌干细胞，也被称为胚胎性癌(EC)细胞。“多能胚胎干细胞”指来自内细胞团的细胞和原生殖细胞(EG)两者。也存在体细胞或胚胎外分化的细胞或更为限定的干细胞重编程回到与来自早期胚胎的ES细胞相似的多能状态的可能性。实现上述可能性的一种方式是，以体细胞核转移的方式，将来自此类分化细胞的核转移到去核的***，随后刺激该***作为胚芽发育至胚泡阶段，接着从胚泡中获得ES细胞系。细胞融合的实验也表明，EC和ES细胞的细胞质也能使体细胞或其他类型的细胞重编程回到ES样的状态。
在本发明优选的方法中，所述细胞具有稳定的核型。
在本发明另一个优选的方法中，抗坏血酸是抗坏血酸磷酸盐。
抗坏血酸和抗坏血酸磷酸盐的功能性衍生物在本领域内是已知的。例如，EP 1666484(其全部内容以参考的方式并入)描述了抗坏血酸的稳定衍生物，该衍生物显示对热或氧化的稳定性增加。
在本发明优选的方法中，所述灵长类胚胎干细胞是多能人胚胎干细胞。
在本发明优选的实施方案中，所述灵长类胚胎干细胞在整个细胞培养过程中保留了分化成至少内胚层、中胚层以及外胚层组织的特性。
在本发明另一个优选的方法中，成纤维细胞生长因子(FGF)选自bFGF/FGF-2、下文中的酸性FGF/FGF-1、bFGF、FGF-4、FGF-9、FGF-17或FGF-18。
在本发明优选的方法中，所述成纤维细胞生长因子是bFGF。优选地，提供的bFGF的浓度是1-50ng/ml；优选约10ng/ml。
优选地，成纤维细胞生长因子是重组的。
在本发明另外优选的方法中，提供的抗坏血酸磷酸盐的浓度是10-300μg/ml；优选约100μg/ml。
在本发明另外优选的方法中，提供的2-乙醇胺的浓度为0.05-2.0μg/ml；优选约0.6μg/ml。
在本发明另外优选的方法中，提供的油酸的浓度为3-15μg/ml；优选约9.5μg/ml。
在本发明另外优选的方法中，提供的肝素的浓度为10-500ng/ml；优选约100ng/ml；优选地，肝素为硫酸盐肝素(heparin sulphate salt)。
在本发明优选的方法中，所述蛋白质细胞培养支持物是基于胶原蛋白的。
在本发明优选的方法中，基于胶原蛋白的细胞培养支持物包含I型胶原蛋白；优选重组的I型胶原蛋白。
在本发明可选的优选方法中，所述细胞培养支持物包含重组的人蛋白，所述重组的人蛋白选自I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃粘连蛋白。
在本发明可选的优选方法中，所述细胞培养支持物包含至少两种重组蛋白，所述重组蛋白选自I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻璃粘连蛋白。
在本发明优选的方法中，所述细胞支持物包含重组的I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃粘连蛋白。
在本发明优选的方法中，所述细胞培养支持物为Matrigeltm。
在本发明优选的方法中，在向细胞培养容器中加入EDTA后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
在本发明可选的优选方法中，在加入胶原酶，优选加入胶原酶IV后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
在本发明可选的优选方法中，在加入分散酶后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
在本发明可选的优选方法中，在加入胰蛋白酶/EDTA，优选加入重组胰蛋白酶后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
在本发明另外优选的方法中，克隆所述灵长类胚胎干细胞。
在本发明优选的方法中，细胞培养基不包含缓冲剂HEPES。
本发明的另一方面提供了在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下将灵长类胚胎干细胞分化成至少一种细胞类型的方法，其包括如下步骤：
i)在由基于蛋白质的细胞培养支持物包被的细胞培养容器中形成胚胎干细胞制备物，其中将所述细胞培养于细胞培养基中，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素，以及
ii)加入诱导灵长类胚胎干细胞分化成至少一种细胞类型的试剂。
在本发明优选的方法中，灵长类胚胎干细胞为人多能胚胎干细胞。
在本发明优选的方法中，细胞类型为神经元。
在本发明可选的方法中，细胞类型为上皮细胞。
在本发明优选的方法中，所述基于蛋白质的细胞培养支持物为层粘连蛋白。
本发明另一方面提供了细胞培养物，其包含：基于蛋白质的细胞培养支持物上的灵长类胚胎干细胞以及细胞培养基，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
在本发明优选的实施方案中，灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
本发明的另外方面提供了细胞培养物，其包含：在基于蛋白质的细胞培养支持物上的灵长类胚胎干细胞以及细胞培养基，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素，其特征在于所述细胞培养物还包含至少一种诱导灵长类胚胎干细胞分化成至少一种细胞类型的试剂。
在本发明优选的实施方案中，灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
本发明另一方面提供了含有细胞培养基的细胞培养容器，所述细胞培养基含有：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
在本发明优选的实施方案中，所述细胞培养容器还含有灵长类胚胎干细胞；优选多能人胚胎干细胞。
在本发明另外的优选实施方案中，所述容器选自皮氏培养皿(petri-dish)、细胞培养瓶或长颈瓶、多孔板。“容器”可理解为任何适宜容纳灵长类胚胎干细胞培养物的装置。
本发明另一方面提供了包含细胞培养基的细胞培养基容器，所述细胞培养基含有：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
本发明另一方面提供了含有细胞培养基的细胞培养基容器，所述细胞培养基含有：胰岛素、运铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素。
在整个说明书的描述和权利要求书中，词语“包含(comprise)”和“含有(contain)”以及其变体，例如包含(comprising)和包含(comprises)，意指“包括但不限于”，且并非意图(且并未)排除其他部分(moieties)、添加剂、组分、整体或步骤。
在整个说明书的描述和权利要求书中，单数词包括复数词，除非另有说明。特别是，若使用了不定冠词，则说明书应该被理解为考虑到了复数以及单数，除非另有说明。
结合本发明的具体方面、实施方案或实施例描述的特性、整体、特征、化合物、化学部分或组群应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非存在矛盾。
仅通过实施例并参考下列附图，对本发明的实施方案进行描述。
图1显示bFGF对人胚胎干细胞增殖的影响；
图2显示bFGF和肝素对人胚胎干细胞增殖和形态的影响；
图3显示人胚胎干细胞标志物在无饲养层条件下培养的细胞中的表达；
图4显示人胚胎干细胞在各种培养基中的生长；
图5显示人胚胎干细胞系HUES在无饲养层条件下的生长曲线；以及
图6显示人胚胎干细胞系Shef1在无饲养层条件下的生长曲线；以及
表1显示了在无饲养层的条件下培养人胚胎干细胞的细胞培养基组分一览。
人胚胎干细胞无饲养层培养的材料和方法
表1限定了hESF9。Hesf5培养基与Hesf9培养基相同，但没有添加与牛血清白蛋白结合的油酸、抗坏血酸磷酸盐、bFGF以及硫酸肝素(heparin sulphate)。
A.试剂
1.人未分化的胚胎干细胞的T25长颈瓶
2.hESF9培养基：无HEPES的ESF基础培养基，其补充有9种因子：胰岛素、转铁蛋白、***钠、2-巯基乙醇、2-乙醇胺、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸、抗坏血酸磷酸盐、bFGF以及硫酸肝素。
3.EDTA溶液
4.I型胶原蛋白(Nitta Gelatine，Co.，Osaka，Japan)
B.步骤
1.用100μg/cm2的I型胶原蛋白包被T25(Corning)。
2.在无Ca2+和Mg2+的达尔伯克氏(Dulbecco’s)磷酸缓冲液溶液中用0.45mM至0.5mM的EDTA4Na(Sigma)分离ES细胞集落。(不应将细胞分离成单个细胞，EDTA的浓度依赖于细胞系)
3.用hESF9培养基收集细胞。
4.将细胞悬浮液以800rpm旋转3分钟使之下沉。
5.将细胞重悬浮于hESF9培养基中。
6.将细胞悬浮液以800rpm旋转3分钟使之下沉。
7.将细胞重悬浮于hESF9培养基中。
8.将细胞接种于由100μg/cm2的I型胶原蛋白包被的25cm2长颈瓶中，置于hESF9培养基中。
9.在含10％ CO2的湿润空气中于37℃孵育。
神经元分化方法
A.试剂
1.人未分化的胚胎干细胞的T25长颈瓶
2.hESF9培养基
2.hESF5培养基：无HEPES的ESF基础培养基，其补充有5种因子：胰岛素、转铁蛋白、***钠、2-巯基乙醇和2-乙醇胺。
3.EDTA溶液
4.层粘连蛋白(Sigma)
5.bFGF和肝素
B.步骤
1.用5μg/cm2的层粘连蛋白包被塑料培养皿。
2.用EDTA溶液收集未分化的ES细胞。
3.将该细胞接种于层粘连蛋白包被的培养皿上，置于补充有10ng/ml bFGF和100ng/ml肝素的hESF5中。
可选项：将细胞接种到层粘连蛋白包被的培养皿上，置于hESF9培养基中，第二天，将该培养基换成补充有10ng/ml bFGF和100ng/ml肝素的hESF5培养基。
4.在37℃下、含有5％ CO2的湿润空气中培养1天。
5.第二天，将10ng/ml bFGF加入培养物中。
6.第2～4培养日，将培养基换成hESF5培养基。
7.每2天，将培养基换成新鲜的hESF5培养基。
8.第7～10培养日，开始出现神经元细胞。
分化成上皮样细胞
A.试剂
1.人未分化的胚胎干细胞的T25长颈瓶
2.hESF9培养基
2.补充有FA-BSA的hESF5培养基：无HEPES的EFS基础培养基，其补充有5种因子：胰岛素、转铁蛋白、***钠、2-巯基乙醇、2-乙醇胺，以及0.5mg/ml无脂肪酸的牛血清白蛋白(FA-BSA)
3.EDTA溶液
4.层粘连蛋白(Sigma)
5.BMP4
B.步骤
1.用5μg/cm2的层粘连蛋白包被塑料培养皿。
2.用EDTA溶液收集未分化的ES细胞。
3.将细胞接种于层粘连蛋白包被的培养皿上，置于补充有FA-BSA和10ng/ml BMP4的hESF5中。
4.每2天，将培养基换成新鲜的补充有FA-BSA和10ng/ml BMP4的hESF5培养基。
8.从培养的第三天起，出现上皮样细胞。
表1  无饲养层和无血清生长的限定培养基(hESF9)
 
组分 浓度(mg/L) 组分 浓度(mg/L)
L-丙氨酸 2.225 维生素B12 0.34125
L-精氨酸 50 次黄嘌呤 1.02
L-精氨酸盐酸盐 94.75 油酸 9.4
L-天冬酰胺水合物 16.2525 亚油酸 0.021
L-天冬氨酸 8.325 硫辛酸 0.0525
L-半胱氨酸盐酸盐 7.88 腐胺二盐酸盐 0.04025
L-胱氨酸二盐酸盐 47.5725 胸腺嘧啶脱氧核苷 0.1825
L-谷氨酸 8.675 氯化钠 6599.75
L-谷氨酰胺 549.65 氯化钾 355.9
甘氨酸 19.375 氯化钙(无水) 108.305
L-组氨酸 23.165 四水硝酸钙 25
L-羟基脯氨酸 5 氯化镁(无水) 14.305
L-异亮氨酸 65.935 硫酸镁(无水) 61.055
L-亮氨酸 68.225 九水硝酸铁 0.05
L-赖氨酸盐酸盐 92.175 五水硫酸铜 0.000625
L-甲硫氨酸 19.87 七水硫酸亚铁 0.2085
L-苯基丙氨酸 37.99 七水硫酸锌 0.216
L-脯氨酸 13.625 ***钠 0.0034588
L-丝氨酸 31.125 磷酸二氢钠(无水) 54.35
L-苏氨酸 55.525 磷酸单氢二钠(无水) 235.51
L-色氨酸 9.76 丙酮酸钠 110
L-酪氨酸 42.36 2-巯基乙醇 0.7813
L-缬氨酸 54.825 2-乙醇胺 0.6108
谷胱甘肽 0.25 胰岛素 10
对氨基苯甲酸 0.25 脱铁转铁蛋白 5
生物素 0.05185 肝素钠 0.1
泛酸钙 2.1825 白蛋白 1000
氯化胆碱 6.24 葡萄糖(无水) 2500
叶酸 2.575 NaHCO3 2000
肌醇 16.85 酚红 6.56
烟酰胺 2.25925 成纤维细胞生长因子-2             0.01
盐酸吡哆醛 2
盐酸吡多辛 0.2655
抗坏血酸磷酸盐 100
核黄素 0.2595
盐酸噻胺 2.335

Claims (48)

1.在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎干细胞的方法，所述方法包含：在包含细胞培养基的细胞培养容器中形成灵长类胚胎干细胞制备物，以及维持灵长类胚胎干细胞处于未分化状态，所述细胞培养基含有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。
2.在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下维持灵长类胚胎干细胞的方法，其包含如下步骤：
i)在由基于蛋白质的细胞培养支持物包被的细胞培养容器中形成灵长类胚胎干细胞制备物，其中将所述细胞培养于细胞培养基中，所述细胞培养基包含胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物；以及
ii)维持灵长类胚胎干细胞处于未分化状态。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细胞具有稳定的核型。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中抗坏血酸为抗坏血酸磷酸盐。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细胞在整个细胞培养过程中保留了分化成至少内胚层、中胚层以及外胚层组织的特性。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中成纤维细胞生长因子(FGF)选自aFGF、bFGF、FGF-4、FGF-9、FGF-17或FGF-18。
8.如权利要求7所述的方法，其中以1-100ng/ml的浓度提供成纤维细胞生长因子。
9.如权利要求8所述的方法，其中以约10ng/ml的浓度提供成纤维细胞生长因子。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述成纤维细胞生长因子为bFGF。
11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中成纤维细胞生长因子是重组的。
12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中以0.01-0.2mg/ml的浓度提供抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。
13.如权利要求12所述的方法，其中以约0.1mg/ml的浓度提供抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中以0.1-1.0mg/ml的浓度提供2-乙醇胺。
15.如权利要求14所述的方法，其中以约0.6mg/ml的浓度提供2-乙醇胺。
16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中以3-15μg/ml的浓度提供油酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中以约9.5μg/ml的浓度提供油酸。
18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中以10-500ng/ml的浓度提供肝素。
19.如权利要求18的方法，其中以约100ng/ml的浓度提供肝素。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中肝素为肝素钠。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述蛋白质细胞培养支持物是基于胶原蛋白的。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述基于胶原蛋白的细胞培养支持物包含I型胶原蛋白。
23.如权利要求22所述的方法，其中I型胶原蛋白为重组的I型胶原蛋白。
24.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述细胞培养支持物包含选自I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃粘连蛋白的重组人蛋白。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞支持物包含至少两种选自IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃粘连蛋白的重组蛋白。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞支持物包含重组的IV型胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白以及玻璃粘连蛋白。
27.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述蛋白质细胞培养支持物为Matrigeltm。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，在向细胞培养容器中加入EDTA后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
29.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，在加入优选胶原酶IV的胶原酶后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
30.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，在加入分散酶后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
31.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其中，在加入胰蛋白酶/EDTA，优选加入重组胰蛋白酶后，将所述灵长类胚胎干细胞进行传代。
32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中克隆所述灵长类胚胎干细胞。
33.如权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基不包含缓冲剂HEPES。
34.将灵长类胚胎干细胞在无细胞饲养层和无血清的细胞培养条件下分化成至少一种细胞类型的方法，其包含如下步骤：
i)在由基于蛋白质的细胞培养支持物包被的细胞培养容器中形成灵长类胚胎干细胞制备物，其中将所述细胞培养于细胞培养基中，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素，以及
ii)加入诱导灵长类胚胎干细胞分化成至少一种细胞类型的试剂。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述灵长类胚胎干细胞为人多能胚胎干细胞。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述细胞类型为神经元。
37.如权利要求34或35所述的方法，其中所述细胞类型为上皮细胞。
38.如权利要求34-37中任一项所述的方法，其中所述基于蛋白质的细胞培养支持物为层粘连蛋白。
39.细胞培养物，其包含位于基于蛋白质的细胞培养支持物上的灵长类胚胎干细胞以及细胞培养基，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸或抗坏血酸磷酸盐或其衍生物。
40.如权利要求39所述的细胞培养物，其中所述灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
41.细胞培养物，其包含位于基于蛋白质的细胞培养支持物上的灵长类胚胎干细胞以及细胞培养基，所述细胞培养基包含：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素，所述细胞培养物还包含至少一种诱导灵长类胚胎干细胞分化成至少一种细胞类型的试剂。
42.如权利要求41所述的细胞培养物，其中所述灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
43.细胞培养容器，其包含细胞培养基，所述细胞培养基含有：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
44.如权利要求43的所述的细胞培养容器，其中所述细胞培养容器还包含灵长类胚胎干细胞。
45.如权利要求43或44所述的细胞培养容器，其中所述灵长类胚胎干细胞为多能人胚胎干细胞。
46.如权利要求43-45中任一项所述的细胞培养容器，其中所述容器选自皮氏培养皿、细胞培养瓶或长颈瓶、多孔板。
47.细胞培养基容器，其包含细胞培养基，所述细胞培养基含有：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子、肝素以及抗坏血酸，或抗坏血酸磷酸盐，或其衍生物。
48.细胞培养基容器，其包含细胞培养基，所述细胞培养基含有：胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、2-巯基乙醇、与无脂肪酸的牛血清白蛋白结合的油酸，且其中所述细胞培养基还补充有成纤维细胞生长因子和肝素。
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C06 Publication
PB01 Publication
C02 Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication