CN115103903A

CN115103903A - 用于人诱导型多能干细胞的具成本效益的培养基和操作方案

Info

Publication number: CN115103903A
Application number: CN202080078684.0A
Authority: CN
Inventors: P·布里奇
Original assignee: Northwestern University
Current assignee: Northwestern University
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-09-23
Also published as: EP4031652A4; WO2021055841A1; US20210087525A1; EP4031652A1; IL291473A; KR20220142994A; BR112022005225A2; JP2022548776A; AU2020351221A1

Abstract

提供了新型培养基配方，其经彻底优化以支持在低接种密度条件下的高生长速率，要求最少的培养基更换，并且成本低廉，而同时保持分化重现性。该配方能够支持人诱导型多能干细胞(hiPSC)生成和>100次传代的培养两者。适合于制备100升的培养基的B8补充物等份试样的生成对于任何具有基本设备的研究实验室来说是简单的，其中整瓶培养基花费～$12USD/升。用该制剂，周末自由式hiPSC细胞培养方法是可能的。

Description

用于人诱导型多能干细胞的具成本效益的培养基和操作方案

交叉引用

本申请要求2019年9月19日提交的美国临时申请号62/902,561(其通过提及而以其整体合并入本文)的权益。

政府权利

本发明是按照由美国国立卫生研究院所授予的合同HL 121177在政府支持下完成的。政府在本发明中具有一定的权利。

对序列表的参考

本申请包含序列表，其已经以ASCII形式通过电子方式提交并且通过提及而以其整体特此合并。创建于2020年9月1日的所述ASCII副本被命名为47460-108_ST25.txt，并且大小为16,452个字节。

技术领域

提供了在对于维持多能细胞状态和细胞增殖(特别是人诱导型多能干细胞(hiPSC)的多能细胞状态和细胞增殖)来说必需的成分和浓度方面经优化的细胞培养基。

技术背景

人诱导型多能干细胞(hiPSC)是功能上永生的，并且可以无限制地增殖，而同时保持分化为(假设地)人体内所有～220个细胞谱系的潜力。hiPSC生成已成为是常规的，这归因于CD71⁺血液前成红细胞(Chou等人,2015；Chou等人,2011；Tan等人,2014)或髓样细胞(Eminli等人,2009；Staerk等人,2010)的扩增以及商业的基于仙台病毒的重编程因子表达(Fujie等人,2014；Fusaki等人,2009)的简单性。该简易性已导致增加的对于hiPSC衍生细胞横跨许多领域(包括再生医学、疾病建模、药物发现和药物基因组学)的潜在应用的热情。

但是，这些应用需要大量hiPSC或源自大量患者的hiPSC系的培养，并且三个主要的限制变得明显：1.大规模多能细胞培养的成本，这对于高患者数目计划来说是难以承受的；2.关于每日培养基更换的耗时的要求，这对于工业实验室来说是特别成问题的；3.分化效能的细胞系间可变性，这高度依赖于多能培养一致性和方法学。

发明概述

人诱导型多能干细胞(hiPSC)培养已成为是常规的，然而多能细胞培养基成本、频繁的培养基更换和分化的重现性仍然是限制性的，从而限制了用于大规模计划的潜力。在此，我们描述了新型hiPSC培养基(B8)的配制，其是培养基成分和浓度的竭尽优化的结果，其中建立了每种组分对于多能状态和细胞增殖的必要性和相对贡献。B8消除了商业培养基的成本的97％。B8配方特别地对于在低接种密度下的快速生长和稳固性进行了优化。

我们证实了在B8中29个hiPSC系的衍生以及长期多能性维持，而同时保持了核型稳定性。该配方也允许周末自由式给料日程规划，而无需牺牲生长速率或分化能力。因此，该简单的、具成本效益的B8培养基将会使得大的hiPSC疾病建模计划成为可能，例如在药物基因组学和对于再生医学所需要的大规模细胞生产中进行的那些。人诱导型多能干细胞(hiPSC)培养已成为是常规的，然而多能细胞培养基成本、频繁的培养基更换和分化的重现性仍然是限制性的，从而限制了用于大规模计划的潜力。在此，我们描述了新型hiPSC培养基(B8)的配制，其是培养基成分和浓度的竭尽优化的结果，其中建立了每个组分对于多能状态和细胞增殖的必要性和相对贡献。

其他方法、特点和/或优点在检查下面的附图和详细描述后是或将会变得是显而易见的。所意欲的是，所有这样的另外的方法、特点和优点都包括在本说明书之内，并且通过所附的权利要求书来进行保护。

序列简述

SEQ ID NO:1是人FGF1的氨基酸序列：MFNLPPGNYK KPKLLYCSNG GHFLRILPDGTVDGTRDRSD QHIQLQLSAE SVGEVYIKST ETGQYLAMDT DGLLYGSQTP NEECLFLERL EENHYNTYISKKHAEKNWFV GLKKNGSCKR GPRTHYGQKA ILFLPLPVSS D。

SEQ ID NO:2是人FGF1-4X的氨基酸序列：MFNLPPGNYK KPKLLYCSNG GHFLRILPDGTVDGTRDRSD PHIQLQLIAE SVGEVYIKST ETGQYLAMDT DGLLYGSQTP NEECLFLERL EENGYNTYISKKHAEKNWFV GLNKNGSCKR GPRTHYGQKA ILFLPLPVSS D。

SEQ ID NO:3是人FGF2的氨基酸序列：MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPKRLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDECFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS。

SEQ ID NO:4的人FGF2 K128N的氨基酸序列：MAAGSITTLP ALPEDGGSGAFPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGRLLASKCVTDE CFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALNRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS。

SEQ ID NO:5是人FGF2-G3 R31L,V52T,E54D,H69F,L92Y,S94I,C96N,S109E,T121P的氨基酸序列：MAAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFF LRIHPDGRVDGTRDKSDPFI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEEN NYNTYRSRKYPSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS。

SEQ ID NO:6是用于生成关于FGF1-4X的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCATGTTCAACTTACCCCCCGGCAACTACAAGAAGCCGAAGCTGCTGTATTGCAGCAATGGCGGCCACTTTCTGCGCATTTTACCGGATGGTACCGTTGATGGTACCCGTGATCGTTCAGATCCGCACATCCAGTTACAGCTGATCGCAGAAAGCGTGGGTGAAGTGTACATCAAGAGCACCGAAACCGGCCAGTATCTGGCAATGGATACCGATGGCCTGCTGTATGGTTCACAAACCCCGAACGAAGAATGCCTGTTCCTGGAACGCCTGGAAGAAAACGGCTACAACACCTACATCAGCAAGAAGCACGCGGAGAAGAACTGGTTTGTTGGCCTGAACAAGAACGGCAGCTGCAAACGTGGTCCTCGTACCCATTATGGCCAGAAAGCGATTCTGTTTCTGCCGTTACCGGTTAGCAGCGATGAATTC。

SEQ ID NO:7是用于生成关于FGF2-K128N的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCATGGCAGCAGGTAGCATTACTACTTTACCGGCGCTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGATCCTAAACGCCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTGTTCGCGAAAAATCAGATCCGCACATCAAGCTGCAGTTACAGGCGGAAGAACGTGGCGTTGTGAGCATCAAGGGCGTTTGTGCAAACCGCTATTTAGCGATGAAAGAAGACGGCCGCCTGTTAGCGAGCAAGTGTGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTCGAACGCCTGGAAAGCAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACACCAGCTGGTATGTTGCGTTAAACCGTACCGGCCAGTACAAATTAGGCAGCAAAACCGGCCCGGGTCAGAAAGCGATTCTGTTTCTGCCTATGAGCGCGAAGAGCTGAGAATTC。

SEQ ID NO:8是用于生成关于FGF2-G3的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCATGGCAGCAGGTTCGATCACTACATTACCGGCACTGCCGGAAGATGGTGGTTCAGGTGCATTTCCTCCTGGCCACTTCAAAGACCCTAAACTGCTGTACTGCAAGAATGGCGGCTTCTTTCTGCGCATTCACCCGGATGGCCGTGTTGATGGTACTCGCGATAAATCAGATCCGTTCATCAAGCTGCAGCTGCAAGCGGAAGAACGTGGCGTGGTGAGCATTAAGGGCGTTTGTGCAAACCGTTATTTAGCGATGAAGGAAGACGGCCGCCTGTACGCGATCAAGAACGTGACCGACGAATGCTTCTTCTTTGAACGCCTGGAAGAAAACAACTACAACACCTACCGCAGCCGCAAGTACCCGAGCTGGTATGTTGCGTTAAAGCGTACCGGCCAGTATAAATTAGGCAGCAAAACCGGTCCGGGCCAGAAGGCGATTCTGTTTCTGCCTATGAGCGCGAAGTCAGAATTC。

SEQ ID NO:9是用于生成关于NRG1的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCATGAGCCACCTTGTGAAATGCGCCGAGAAGGAGAAGACCTTTTGCGTGAATGGCGGCGAATGCTTCATGGTGAAGGATCTGTCAAATCCGAGCCGCTACCTGTGCAAATGCCCGAACGAGTTTACCGGCGATCGTTGCCAGAATTACGTTATGGCGAGCTTCTACAAGCACCTGGGCATCGAGTTCATGGAAGCGGAGTAAGAATTC。

SEQ ID NO:10是用于生成关于TGFB1的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGTGCTGCGTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATTATGTGGGCCGCAAACCGAAAGTGGAACAGCTGAGCAACATGATTGTGCGCAGCTGCAAATGCAGCTGAGAATTC。

SEQ ID NO:11是用于生成关于TGFB1m的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTAGCAGCACCGAAAAAAACTGCTGCGTGCGCCAGCTGTATATTGATTTTCGCAAAGATCTGGGCTGGAAATGGATTCATGAACCGAAAGGCTATCATGCGAACTTTTGCCTGGGCCCGTGCCCGTATATTTGGAGCCTGGATACCCAGTATAGCAAAGTGCTGGCGCTGTATAACCAGCATAACCCGGGCGCGAGCGCGGCGCCGAGCTGCGTGCCGCAGGCGCTGGAACCGCTGCCGATTGTGTATT。

SEQ ID NO:12是用于生成关于TGFB3的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGTGCTGCGTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTG。

SEQ ID NO:13是用于生成关于TGFB3m的生长因子质粒的核苷酸序列：

GGATCCGCGCTGGATACCAACTATTGCTTTCGCAACCTGGAAGAAAACTGCTGCGTGCGCCCGCTGTATATTGATTTTCGCCAGGATCTGGGCTGGAAATGGGTGCATGAACCGAAAGGCTATTATGCGAACTTTTGCAGCGGCCCGTGCCCGTATCTGCGCAGCGCGGATACCACCCATAGCACCGTGCTGGGCCTGTATAACACCCTGAACCCGGAAGCGAGCGCGAGCCCGAGCTGCGTGCCGCAGGATCTGGAACCGCTGACCATTCTGTATTATGTGGGCCGCACCCCGAAAGTGGAACAGCTGAGCAACATGGTGGTGAAAAGCTGCAAATGCAGCTGAAGGGAATTC。

SEQ ID NO:14是具有K128N置换的FGF2序列：AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPKRLYCKNGGFF LRIHPDGRVD GVREKSDPHI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDECFFFERLESN NYNTYRSRKY TSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS。

SEQ ID NO:15是FGF2-G3序列：AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK LLYCKNGGFFLRIHPDGRVD GTRDKSDPFI KLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LYAIKNVTDE CFFFERLEENNYNTYRSRKY PSWYVALKRT GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS。

SEQ ID NO:16是TGFB3氨基酸序列：ALDTNYCFRN LEENCCVRPL YIDFRQDLGWKWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILY YVGRTPKVEQLSNMVVKSCK CS。

SEQ ID NO:17是NRG1的截短版本：SHLVKCAEKE KTFCVNGGEC FMVKDLSNPSRYLCKCPNEF TGDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE。

附图简述

图1.基质浓度的优化和培养基配方的比较。a，hiPSC在

或

(Trevigen)的稀释物上的相对生长，

等价于

(Gibco^TM)。

图2A-F.用短期生长测定法中基础人多能干细胞培养基成分的优化。将结果标准化至初始培养基组分浓度，其用深灰色条来显示，优化通过使用短期6-天生长测定法来完成。经优化的组分浓度用斜细线来显示。(A)重组人IGF1 LR3(n＝3)和重组人胰岛素(n＝18-22)浓度对于相对生长的效应的比较。(B)L-抗坏血酸2-磷酸酯(n＝19-27)。(C)转铁蛋白(n＝2-20)。(D)***钠(n＝3-20)。(E)FGF2-K128N(n＝3-12)。(F)TGFb1(n＝20-25)。n＝完全实验重复，非配对Student’s T-检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005，****p≤0.0001，n.s.＝不显著。

图3A-H.在短期测定法中另外的人多能干细胞培养基成分的优化。E8培养基组分浓度用深灰色条来显示，优化通过使用简单的6-天生长测定法来完成。经优化的组分浓度用斜细线来显示。(A)重组转铁蛋白(10μg/ml)在传代后第一个24小时期间在具有或没有通过使用Y27632(10μM)的ROCK1/2抑制的情况下支持克隆生长的适宜性的比较(n＝3)。(B)在传代后第一个24小时期间对于相对生长仅两种常见的ROCK1/2抑制剂的比较(n>5)。(C)添加非必需氨基酸(NEAA)和化学成分确知的脂质对于相对生长的效应的比较(n＝5)。(D)无脂肪酸的白蛋白(n＝4)。(E)碳酸氢钠(n＝5)。(F)pH(n＝9)。(G)摩尔渗透压浓度(n＝8)。(H)FGF2-G3(n＝3)。n＝完全实验重复，非配对Student’s T-检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005，****P≤0.0001，n.s.＝不显著。

图4A-B.用于生成重组生长因子的质粒。(A)FGF2-K128N，其显现了用于纯化的双重6xHis位点和凝血酶切割位点。(B)用于生成经修饰的FGF2质粒的氨基酸序列。

图5A-P.用长期生长测定法进行的B8培养基成分的优化。将结果标准化至初始培养基组分浓度，其用深灰色条来显示，优化通过使用长期5-传代、4-天生长测定法来完成。(A)重组人胰岛素浓度对于相对生长的效应的比较(n＝10)。(B)L-抗坏血酸2-磷酸酯(n＝10)。(C)重组转铁蛋白(n＝10)。(D)***钠(n＝5)。(E)内部制备的FGF2-G3(n＝6)。(G)NODAL(n＝5)。(H)激活蛋白A(n＝5)。(I)在9次传代后内部制备的TGFb3，相比于商业TGFb1而言(n＝9)。(J)向40ng/ml FGF2-G3添加NRG1(n>5)。(K)最终的B8配方。n＝完全实验重复，非配对Student’sT-检验，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.005，****P≤0.0001，n.s.＝不显著。

图6.用于生成生长因子质粒的DNA序列。注意：FGF2-G3和TGFb3显示出发挥功能，而无需切割N-末端6xHis标签/融合蛋白，因此还去除了C-末端终止密码子以通读至另外的6xHis标签从而增强纯化效率。

图7A-E.B8被证明适合于hiPSC生成和培养。(A)显现了在29个在B8中进行衍生化的hiPSC系之中多能性标志物的维持，通过流式细胞术评估的。(B)在各种各样的B8-衍生的hiPSC系中多能标志物的表达。(C)四种来自血液的在B8中进行衍生化的hiPSC系的示例性G-显带核型分析。(D)在B8中以低接种密度的hiPSC生长，相比于E8而言(n＝8)。(E)在培养基已在37℃下储存2或7天后磷酸-ERK的刺激的评估，其中比较了内部生成的FGF2-G3与商业FGF2(Peprotech)。使hiPSC在FGF2方面饥饿24小时，然后在进行收集以用于Western印迹之前将其用所示的培养基处理1小时。总ERK用作加样对照。

图8A-H.与单层分化仍然相容的周末自由式传代日程规划的优化。(A)最佳的4-天培养基更换日程规划的建立。(B)具有培养基更换的7-天传代的日程规划。(C)仅7-天传代的日程规划。(D)当使用具有或没有0.5mg/ml白蛋白的添加的两种7-天周末自由式传代日程规划时，生长的比较(n＝2)。(E)向7-天传代和培养基更换日程规划添加变化水平的白蛋白(mg/ml)的比较(n＝4)。(F)当使用7-天传代和培养基更换日程规划时，心脏分化效率(n＝5)。(G)当使用7-天传代和培养基更换日程规划时，内皮分化效率(n＝6)。(H)当使用7-天传代和培养基更换日程规划时，上皮分化效率(n＝5)。

发明详述

在本文中证实了新型培养基配方(B8)，其经彻底优化以支持在低接种密度条件下的高生长速率，要求最少的培养基更换，并且成本低廉，而同时保持分化重现性。该配方能够支持hiPSC生成和>100次传代的培养两者。适合于制备100升的培养基的B8补充物等份试样的生成对于任何具有基本设备的研究实验室来说是简单的，其中整瓶培养基花费～$12USD/升。

提供了完全的操作方案，其包括关于以三个简单步骤的重组蛋白质产生的详细指导。该操作方案通过在实验室中生成三种由大肠杆菌(E.coli)表达的、经密码子优化的重组蛋白质来而成为可能：具有经改善的热稳定性的成纤维细胞生长因子2(FGF2)的经改造的形式(FGF2-G3)；转化生长因子β3(TGFβ3)-一种能够在大肠杆菌中进行表达的更有效力的TGFβ；和包含EGF-样结构域的神经调节蛋白1(NRG1)的衍生物。所有用于蛋白质产生的质粒都是通过Addgene可得的。随着这些操作方案的商品化，我们相信可能的是实质性地增加用hiPSC可取得的，这是由于近乎消除了多能细胞培养成本并且使得与细胞培养相关的劳动最少化。

对于hiPSC培养，仅五种组分是必需的：胰岛素，***钠，FGF2，DMEM/F12(图2)，和第五种组分TGFβ1的重要性仅在长期测定法中是明显的(图2和5)。其他三种组分(抗坏血酸2-磷酸酯、转铁蛋白和NRG1)对于hiPSC生长来说是可有可无的，虽然去除其导致降低的生长速率。

在所述培养基的开发中的许多令人惊奇的结果。例如，添加白蛋白既没有正面效应也没有负面效应(图3D)，尽管它是许多学术和商业培养基配方的常见成分。激活蛋白A不是合适的，无论具有还是没有TGFβ1(图5)，尽管它被包括在各种各样的其他商购可得的配方中。我们确实显示，在非常低的剂量下，激活蛋白A可以支持生长，虽然以比TGFβ1低的程度。

用一些商业培养基的主要问题是：虽然周末自由式更换日程规划是可行的，但是hiPSC的生长慢得多并且建议使细胞生长为低密度集落。这些低密度集落不与随后的单层分化操作方案相容，如用大多数谱系其已变成平常事那样。特别地用于快速单层生长的B8培养基的优化，连同热稳定的FGF2-G3的掺入一起，克服了这些问题中的许多，而同时保持了与常见的分化操作方案的相容性。

生长因子FGF2和TGFβ1占总培养基成本的超过80％。质粒的优化和硫氧还蛋白融合蛋白的生成(在需要时)消除了许多的与内含体相关联的复杂性和否则需要的因而发生的重折叠过程。典型的1升大肠杆菌培养物(其需要两天和基本的实验室技能)通常将会提供80mg的FGF2-G3，其足够用于800升的B8。类似地，500ml的TGFβ3或NRG1培养物通常将会提供足够用于数年工作的蛋白质(～800,000升的B8培养基)。另外，可以将这些组分的浓度降低75％，而对于生长速率没有实质性影响(均以5μg/ml)(图5)，并且基于这些节省，已开发出了为低成本而进行优化的B8的制剂(图8)。

特别地，为了人诱导型多能干细胞的生长，所述细胞培养基包含：细胞培养基础培养基；成纤维细胞生长因子2；胰岛素；和硒源。所述细胞培养基不需要包含转化生长因子β1(TGFβ1)、激活蛋白A或白蛋白。即，所述细胞培养基可以实质上不包含转化生长因子β1(TGFβ1)、激活蛋白A或白蛋白。所述细胞培养基可以包含痕量的转化生长因子β1(TGFβ1)、激活蛋白A或白蛋白。所述细胞培养基可以包含可测量的量的转化生长因子β1(TGFβ1)、激活蛋白A或白蛋白，但是不以足以影响细胞生长、分化或健康的浓度。

在一些方面，在所述培养基中可以使用胰岛素或IGF1。重组形式的胰岛素，IGF1，任何衍生物或变体(其对生产具成本效益而对功能没有任何损害)可以替换胰岛素或IGF1。类似地，硒源可以包括硒盐、L-硒代甲硫氨酸、硒代半胱氨酸、甲基硒代半胱氨酸或类似的化合物。

在一些方面，所述细胞培养基还可以包含TGFβ3、NRG1、转铁蛋白、抗坏血酸或其组合。所述细胞培养基还可以包含thiazovivin。所述细胞培养基可以以7.1的pH或者以310mOsm/l的摩尔渗透压浓度为特征。所述细胞培养基还可以以处于2438μg/ml的量的碳酸氢钠为特征。

在一些方面，所述细胞培养基础培养基为DMEM/F12。在一些方面，所述FGF2为被定义为SEQ ID NO:4、5或15的重组蛋白质，或者其混合物。在一些方面，所述FGF2为重组蛋白质FGF2-G3(SEQ ID NO:15)。在一些方面，所述***盐为***钠。在一些方面，所述TGFβ3为SEQ ID NO:16的重组蛋白质，NRG1为SEQ ID NO:17的重组蛋白质。在一些方面，所述细胞培养基包含：在DMEM/F12培养基中配制的40ng/ml FGF2-G3、20μg/ml胰岛素、20ng/ml***钠。作为备选方案，所述细胞培养基可以包含：在DMEM/F12培养基中配制的40ng/mlFGF2-G3(SEQ ID NO:15)、20μg/ml胰岛素、20ng/ml***钠、20μg/ml转铁蛋白、0.1ng/mlTGFβ3(SEQ ID NO:16)、0.1ng/ml NRG1(SEQ ID NO:17)、200μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯、2438μg/ml碳酸氢钠。

在本文中还提供了用于制备细胞培养基的试剂盒，所述试剂盒包含：编码FGF2-G3、TGFβ3和NRG1的质粒；和关于制备FGF2-G3、TGFβ3和NRG1蛋白质和制备细胞培养基的说明书。所述试剂盒可以进一步包含培养基、***钠、胰岛素、转铁蛋白、抗坏血酸2-磷酸酯、碳酸氢钠或thiazovivin。

在本文中还提供了使培养中的人诱导型多能干细胞(hiPSC)生长和传代的方法，所述方法包括：获得细胞培养基，其包含在DMEM/F12培养基中配制的FGF2-G3(SEQ ID NO:15)、胰岛素、***钠、转铁蛋白、TGFβ3(SEQ ID NO:16)、NRG1(SEQ ID NO:17)、抗坏血酸2-磷酸酯、碳酸氢钠；制备包被有基质的平板；向所述基质添加hiPSC，第0天；在第1天更换细胞培养基；在第3.5天使细胞传代，或者使细胞生长连续7天；条件是该3.5天传代或该7-天细胞生长周期中的至少一天将不会需要更换细胞培养基。

基础培养基

在本文中所描述的培养基提出使用DMEM/F12作为基础培养基。但是，可以将任何合适的基础培养基与在本文中所描述的胰岛素、抗坏血酸、转铁蛋白、***盐、FGF2、TGFβ和NRG1相组合。事实上，Chen等人显示了在DMEM/F12和相对地简单的MEMα之间的相当的结果。也可以将任何其他基础的成分确知的培养基与在本文中所描述的胰岛素、抗坏血酸、转铁蛋白、***盐、FGF2、TGFβ和NRG1相组合地进行使用。

现有技术培养基的缺陷

对于培养人多能干细胞来说所需要的培养基条件在过去15年中已稳步进展，其中重大突破来自发现了关于高浓度FGF2的必要性(Xu等人,2005)；使用TGFβ1(Amit等人,2004)；和用包含21种组分的TeSR配方(Ludwig和Thomson,2007；Ludwig等人,2006a；Ludwig等人,2006b)消除了KnockOut血清替代物(KSR)，随后为第一种稳固的化学成分确知的配方，E8(Beers等人,2012；Chen等人,2011)，其由仅仅8种主要组分组成。已经描述了许多备选的化学成分不确知的多能制剂，包括：CDM-BSA(Hannan等人,2013；Vallier等人,2005；Vallier等人,2009)、DC-HAIF(Singh等人,2012；Wang等人,2007)、hESF9T(Furue等人,2008；Yamasaki等人,2014)、FTDA(Breckwoldt等人,2017；Frank等人,2012；Piccini等人,2015)和iDEAL(Marinho等人,2015)(图S1A)。

可得的制剂中的每一种由三种主要信号传导组分的核心组成：1)胰岛素或IGF1，其结合INSR和IGF1R以向PI3K/AKT途径传导信号，从而促进存活和生长；2)FGF2和/或NRG1，其分别结合FGFR1/FGFR4或ERBB3/ERBB4，从而激活PI3K/AKT/mTOR和MAPK/ERK途径；和3)TGFβ1、NODAL或激活蛋白A，其结合TGFBR1/2和/或ACVR2A/2B/1B/1C以激活TGFβ信号传导途径。在多能培养基制剂中较不经常使用NODAL，这是由于在人多能干细胞(hPSC)中NODAL拮抗剂LEFTY1/2的表达(Besser,2004；Sato等人,2003)导致对于高的体外浓度的要求(Chen等人,2011)。另外，已经描述了众多的无生长因子的配方，其使用小分子来替代在hPSC培养中的一些或所有生长因子(Burton等人,2010；Desbordes等人,2008；Kumagai等人,2013；Tsutsui等人,2011)，但是，这些还未被成功转化为常见用法。最近，证实了一种无生长因子的配方AKIT(Yasuda等人,2018)，其组合了GSK3B(1-氮杂坎帕罗酮(1-azakenpaulone))、DYRK1(ID-8)和钙依赖磷酸酶/NFAT(他克莫司/FK506)的抑制剂，虽然增殖和集落生长大为降低，以及生长的细胞系间可变性增加。最后，超过15种商业多能培养基也是可得的，其中配方是专有的并且未对研究者公开。这些培养基对于大多数hiPSC实验室来说代表了主要成本，并且相当大地限制了研究努力。这些培养基配方中的一些被提出去支持hiPSC生长，而无需每日培养基更换或者是“周末自由式的”，这可能通过使用硫酸肝素来稳定FGF2(其否则在37℃下快速降解)(Chen等人,2012；Furue等人,2008)和包括作为多面性的抗氧化剂起作用的牛血清白蛋白(BSA)。

实施例

某些实施方案在下面以实施例的形式进行描述。虽然相当详细地描述了实施方案，但是意图不是将所附的权利要求书的范围限制或以任何方式限定至这样的细节或任何具体的实施方案。在所述实施例自始至终使用下面的实验程序。

实验程序：

人诱导型多能细胞培养

将所有多能和重编程细胞培养物在37℃下在具有5％CO₂和5％O₂的Heracell^TMVIOS 160i直热式加湿培养箱(Thermo Scientific^TM)中进行维持。将分化培养物在5％CO₂和大气(～21％)O₂下进行维持。所有培养物(多能和分化)用2ml培养基/9.6cm²表面积或等价物来进行维持。所有培养基在4℃下进行使用并且在添加至细胞之前不温热至37℃，这是由于担心FGF2的热稳定性(Chen等人,2012)。我们未从使用冷的培养基中发现可检测的对于细胞生长的效应。通过使用MycoAlert^TM PLUS试剂盒(Lonza)和384-孔Varioskan^TM LUX(Thermo Scientific^TM)平板阅读器，所有培养物都常规地就支原体进行测试。E8培养基如先前所描述的那样(Burridge等人,2015；Chen等人,2011)在内部制备，并且由DMEM/F12(

10-092-CM)、20μg/ml大肠杆菌衍生的重组人胰岛素(Gibco^TM，A11382IJ)、64μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸三钠盐(Wako，321-44823)、10μg/ml稻(Oryza sativa)衍生的重组人转铁蛋白(Optiferrin，InVitria，777TRF029-10G)、14ng/ml***钠(Sigma，S5261)、100ng/ml重组人FGF2-K128N(内部制备的，参见下面)、2ng/ml重组人TGFβ1(112个氨基酸，HEK293-衍生的，Peprotech，100-21)组成。在1:800稀释的生长因子减少的

上，将细胞常规地维持在E8培养基中(参见下面)。给E8补充以10μM Y27632二盐酸化物(LCLabs，Y-5301)(此后称为E8Y)，用于在传代后第一个24小时。对于标准培养物，在取得～70-80％汇合后，使用在DPBS(没有Ca²⁺和Mg²⁺，

)中的0.5mM EDTA(InvitrogenUltraPure)每4天将细胞以1:20的比例进行传代。在第20次和第100次传代之间使用细胞系。所测试的其他培养基组分为：Human Long R3 IGF1(Sigma，91590C)、thiazovivin(LCLabs，T-9753)、重组人TGFβ3(Cell Guidance Systems，GFH109)、碳酸氢钠(Sigma)、NEAA(Gibco^TM)、CD脂质(Gibco^TM)、无脂肪酸的白蛋白(GenDEPOT，A0100)。pH用10N HCl或1NNaOH(两者都来自Sigma)进行调节，并且使用SevenCompact^TM pH计(MettlerToledo)进行测量。摩尔渗透压浓度用氯化钠(Sigma)或细胞培养用水

进行调节，并且用渗透压计(Advanced Instruments)进行测量。

优化

自始至终的我们的标准条件是：在6-孔平板或等价物的每个孔中2ml的在2mlDMEM(

10-017-CV)中稀释的1:800减少的生长因子

(

354230)。还测试了

(Gibco^TM)和

(Trevigen)。制备平板并且将其在培养箱中在37℃下保持直至一个月。

FGF2-K128N生成

对具有K128N置换(斜体/加有下划线)的全长(154个氨基酸)FGF2序列(SEQ IDNO:14)AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK RLYCKNGGFF LRIHPDGRVDGVREKSDPHIKLQLQAEERG VVSIKGVCAN RYLAMKEDGR LLASKCVTDECFFFERLESN NYNTYRSRKY

GQYKLGSKTGPGQKAILFLP MSAKS进行密码子优化以用于大肠杆菌，其中在序列的起点(5’)处添加BamHI位点，和在末端(3’)处添加EcoRI位点。该序列在BioXp3200(Synthetic Genomics)上合成。然后，***片段用BamHI和/EcoRI(Anza，Invitrogen)进行消化，并且用T4 DNA连接酶(Anza)连接入pET-28a表达载体(Novagen/MilliporeSigma)中并且克隆到One Shot^TM BL21 Star^TM(DE3)化学感受态大肠杆菌(Invitrogen)中。将大肠杆菌在-80℃下储存于25％甘油(Ultrapure，Invitrogen)中。通过在细菌管(

Falcon)中接种10ml的补充有50μg/ml硫酸卡那霉素(FisherBioReagents)的Terrific Broth(Fisher BioReagents)来制备引子培养物，并且将其在37℃(对于NRG1)或30℃(对于FGF2或TGFβ3)下在

培养箱-摇床(NewBrunswick^TM)中以220rpm温育过夜。蛋白质表达通过使用2800ml带挡板的摇瓶(BBV2800，Fisherbrand^TM)如下来进行：将全部10ml引子培养物添加至500ml的补充有50μg/ml硫酸卡那霉素的MagicMedia^TM(K6815，Invitrogen^TM)，并且如上面那样在37℃(对于NRG1)或30℃(对于FGF2或TGFβ3)下温育24小时。将培养物收获到2×250ml离心瓶(

3120-0250)中，并且在4℃下在具有SW 32Ti转子的Optimia^TM XPN-100超速离心机(BeckmanCoulter)中以5,000×g离心20分钟。小心地倾倒出上清液，并且将粒状沉淀进行称重并储存于-80℃以用于下游处理。将细胞粒状沉淀重悬浮在B-PER裂解缓冲液(ThermoScientific^TM，78248)中，其中使用5ml的B-PER完全试剂/克细菌细胞粒状沉淀。将细胞在室温下在温和摇动下温育15分钟。然后，将包含裂解物的瓶子在4℃下在超速离心机中以16,000×g离心20分钟。收集上清液并且弃去细胞碎片。遵循制造商的建议，通过使用3mlHisPur^TM Ni-NTA旋转纯化试剂盒(Thermo Scientific^TM，88229)来完成纯化。为了提高蛋白质与树脂床的结合效率，将样品在4℃下温育30分钟。收集四次流出物，每10分钟一次。遵循制造商的再生操作方案，重复使用柱子。通过使用Quant-iT^TM

蛋白质检定试剂盒(Invitrogen，Q3321)在Qubit 3荧光计上评价蛋白质浓度。不切割6xHis标签，因为先前已证实它不干扰FGF2功能(Soleyman等人,2016)。标准的1升培养物产生80mg的FGF2。

FGF2-G3生成

对具有R31L、V52T、E54D、H59F、L92Y、S94I、C96N、S109E和T121P置换(斜体)的具有154个氨基酸的序列(SEQ ID NO:15)：AAGSITTLP ALPEDGGSGA FPPGHFKDPK

LRIHPDGRVD

KLQLQAEERG VVSIKGVCANRYLAMKEDGR

NYNTYRSRKY

GQYKLGSKTG PGQKAILFLP MSAKS进行密码子优化以用于大肠杆菌，并且如上面那样来生成。类似地生成FGF1-4X。

TGFβ3生成

对具有112个氨基酸的序列(SEQ ID NO:16)：ALDTNYCFRN LEENCCVRPLYIDFRQDLGW KWVHEPKGYY ANFCSGPCPY LRSADTTHST VLGLYNTLNP EASASPCCVP QDLEPLTILYYVGRTPKVEQ LSNMVVKSCK CS进行密码子优化以用于大肠杆菌，并且如上面那样来生成，连接入pET-32a表达载体中，并且克隆到One Shot^TM BL21 Star^TM(DE3)中。pET-32a的使用导致产生硫氧还蛋白-TGFBβ3融合蛋白，其阻止蛋白质表达成内含体。不需要切割硫氧还蛋白以使TGFBβ3具有活性。类似地生成TGFβ1、TGFβ1m(C77S)和TGFβ3m(C77S)。

NRG1生成

对具有65个氨基酸的序列(SEQ ID NO:17)：SHLVKCAEKE KTFCVNGGEC FMVKDLSNPSRYLCKCPNEF TGDRCQNYVM ASFYKHLGIE FMEAE(其是仅仅包含EGF结构域的NRG1的截短版本)进行密码子优化以用于大肠杆菌，并且如上面那样来生成，连接入pET-32a表达载体中，并且克隆到One Shot^TM BL21 Star^TM(DE3)中。pET-32a的使用导致产生硫氧还蛋白-NRG1融合蛋白，其阻止蛋白质表达成内含体。发现需要通过使用凝血酶CleanCleave^TM试剂盒(MilliporeSigma)来切割硫氧还蛋白，随后重新纯化，其中保持上清液。

培养基变量优化操作方案

在37℃下用TrypLE(Gibco^TM，12604-013)使hiPSC系19-3解离3分钟，并且将细胞重悬浮在DMEM/F12中，转移至15ml锥形管(Falcon)，并且以200×g离心3分钟(SorvallST40)。将粒状沉淀重悬浮在DMEM/F12中，稀释至1×10⁵个细胞/ml，并且在包被有

(1:800)的12-孔平板(Greiner)中在待测试的培养基连同2μM thiazovivin中每个孔铺板10,000个细胞，持续第一个24小时。每天更换培养基，并且让细胞生长6天。使用低于正常接种密度的这种来允许发现仅在更极端的条件下才可检测到的因素并且因此提供关于所述制剂的稳固性的数据。

Western印迹

将贮备裂解缓冲液制备为150mM NaCl、20mM Tris pH 7.5、1mM EDTA、1mM EGTA和1％Triton X-100，并且储存于4℃。制备新鲜的完全裂解缓冲液，其具有1×蛋白酶抑制剂(Roche，5892791001)、1×磷酸酶抑制剂混合物2(P5726，Sigma)、1×磷酸酶抑制剂混合物3(Sigma，P0044)、2mM PMSF(Sigma，P7626)和1％SDS溶液(Fisher Scientific，BP2436200)的最终浓度。通过使用没有FGF2的B8来使hiPSC饥饿24小时，然后用包含相应的FGF2的培养基将其处理1小时。然后去除培养基，并且将细胞用DPBS洗涤一次，用在DPBS中的0.5mMEDTA进行收获，并且转移到管中。通过以500×g离心3分钟来使样品形成粒状沉淀，并且弃去上清液。将粒状沉淀重悬浮在150μl完全裂解缓冲液中并且在冰上温育30分钟。通过在4℃下以10,000×g离心10分钟来收集清澈的裂解物。用Qubit蛋白质检定试剂盒(Invitrogen，Q33211)和Qubit 4荧光计来测量蛋白质浓度。在使用之前，将裂解物储存于-80℃。按照制造商的说明书用NuPAGE^TM LDS样品缓冲液(Invitrogen，B0007)和NuPAGE^TM还原剂(Invitrogen，B0009)来制备10μg的样品，并且在NuPAGE^TM 10％Bis-Tris凝胶(Invitrogen，NP0302BOX)和Mini Gel Tank***(Invitrogen，A25977)上用Bolt MES SDS走样缓冲液(Invitrogen，B000202)在100V下走样1小时。使用SeeBlue Plus2预染蛋白质标准参照物(Invitrogen，LC5925)作为梯状标准参照物。然后，将凝胶在Mini Trans-BlotCell***(Bio-Rad，1703930)中在240mA下转移到PVDF转移膜(Thermo Scientific^TM，88518)上1小时30分钟。用在1％TBST(Fisher Scientific，BP2471-1，BP337-100)中的5％BSA(GenDEPOT，A0100)将膜封闭过夜。将所有一抗和二抗都用在1％TBST中的5％BSA进行稀释。如下来进行洗涤：短时漂洗，随后为5次长时洗涤(每次5分钟)。将一抗(Cell SignalingTechnology，9101，9102)和二抗(92632211，LI-COR)都在室温下温育1小时。用Odyssey CLx(LI-COR)对印迹进行成像。将印迹用Restore^TM PLUS Western印迹剥离缓冲液(ThermoScientific^TM，46430)在室温下剥离15分钟，用1％TBST进行漂洗，并且用5％BSA再封闭30分钟。

人诱导型多能干细胞衍生化

操作方案由西北大学机构审查委员会(Northwestern UniversityInstitutional Review Boards)批准。在书面知情同意下，从每位志愿者取～9ml的外周血并且储存于4℃，将样品转移至充满

(Sigma)的Leucosep管(Greiner)。使1×10⁶个分离的外周血单核细胞(PMBC)在经组织培养物处理的24-孔平板(Greiner)中在2ml的补充有10ng/ml IL3、50ng/ml SCF(KITLG)、40ng/ml IGF1(所有都来自Peprotech)、2U/ml EPO(Calbiochem)、1μM***(Sigma)的SFEM II(Stem CellTechnologies)中进行生长(Chou等人,2015)。每隔一天更换50％培养基。在12天的生长后，将6×10⁴个细胞转移至24-孔平板的孔，在500μL的补充有稀释至制造商建议的5％(1:20)的CytoTune^TM-iPS 2.0仙台病毒重编程试剂盒病毒颗粒因子(Gibco^TM)(Fujie等人,2014；Fusaki等人,2009)的具有生长因子的SFEM II中。以5:5:3(KOS:MYC:KLF4)的MOI分别用3.5μL、3.5μL和2.2μL的hKOS(0.85×10⁸CIU/ml)、hMYC(0.85×10⁸CIU/ml)和hKLF4(0.82×10⁸CIU/ml)处理细胞。在24小时后通过离心(300×g，4分钟)将100％培养基更换为2ml新鲜的具有生长因子的SFEM II，并且将细胞转移至包被有1:800

的6-孔平板(Greiner)的一个孔中。每隔一天温和地更换50％培养基。在转导后第8天，将100％的培养基更换为B8培养基。每天更换培养基。在第17天，将独个集落挑拣入包被有

的12-孔平板中(一个集落/孔)。

多能细胞流式细胞术

在37℃下用TrypLE^TM Express(Gibco^TM)使hiPSC解离3分钟，并且将1×10⁶个细胞转移至流式细胞术管(Falcon，352008)。将细胞在冰上在DPBS中的0.5％无脂肪酸的白蛋白之中染色30分钟，其中使用1:20小鼠IgG₃ SSEA4-488克隆MC-813-70(R&D Systems，FAB1435F，批次YKM0409121)和1:20小鼠IgM TRA-1-60-488克隆TRA-1-60(BDBiosciences，560173，批次5261629)；然后进行洗涤。使用同种型对照即小鼠IgG₃-488克隆J606(BD Biosciences，563636，批次7128849)和小鼠IgM-488克隆G155-228(BDBioscience，562409，批次7128848)来建立设门。所有细胞都通过使用CytoFLEX(BeckmanCoulter)用CytExpert 2.2软件来进行分析。

免疫荧光染色

用0.5mM EDTA使hiPSC解离，并且将其铺板到经

处理的Nunc Lab-TekII 8-腔式载玻片上在B8培养基中三天(B8T，对于第一个24小时)。将细胞固定，进行透化，并且按照制造商的说明书用PSC 4-标志物免疫细胞化学试剂盒(Life Technologies，A24881，批次1610720)关于OCT4、SSEA4、SOX2、TRA-1-60进行染色。将细胞洗涤三次并且用具有DAPI的ProLong^TM Diamond抗褪色浸片剂(Invitrogen)进行封固。用Ti-E倒置荧光显微镜(Nikon Instruments)和Zyla sCMOS照相机(Andor)对载玻片进行成像，其中使用NIS-Elements 4.4Advanced软件。

群体倍增水平评估

按照下面的公式来计算群体倍增水平(PDL)：

PDL＝3.32[log₁₀(n/n₀)]

其中n＝细胞数目，和n₀＝接种的细胞数目

心脏分化

按照具有稍微修改的先前所描述的操作方案(Burridge等人,2015；Burridge等人,2014)来进行向心肌细胞的分化。简而言之，如上面那样使用0.5mM EDTA以1:20比例使hiPSC进行分传，并且使其在B8培养基中生长4天，从而达到～75％汇合。在分化开始(第0天)之时，将B8培养基更换为CDM3(化学成分确知的培养基，三种组分)(Burridge等人,2014)，其由RPMI 1640(

10-040-CM)、500μg/ml无脂肪酸的牛血清白蛋白(GenDEPOT)和200μg/ml L-抗坏血酸2-磷酸酯(Wako)组成。对于第一个24小时，给CDM3培养基补充以6μM的糖原合酶激酶3-β抑制剂CHIR99021(LC Labs，C-6556)。在第1天将培养基更换为CDM3，和在第2天将培养基更换为补充有2μM的Wnt抑制剂Wnt-C59(Biorbyt，orb181132)的CDM3。然后，在第4天并且每隔一天将培养基更换为CDM3。从第7天开始注意到收缩细胞。在分化的第14天，将心肌细胞在37℃下使用DPBS解离20分钟，随后为在37℃下使用在DPBS中稀释的1:200Liberase TH(Roche)20分钟，以300g离心5分钟，并且通过100μm细胞滤过器(Falcon)进行过滤。

内皮分化

按照先前所描述的操作方案的改编版本(Patsch等人,2015)，使hiPSC生长至大约50-70％汇合并且进行分化。在分化的第5天，将内皮细胞在37℃下用

(Gibco^TM)解离5分钟，以300g离心5分钟，并且进行分析。

上皮分化

如上面那样使用0.5mM EDTA以1:20比例使hiPSC进行分传，并且使其在B8T培养基中生长1天，从而在分化开始之时达到～15％汇合。表面外胚层分化按照先前所描述的操作方案的改编版本(Li等人,2015；Qu等人,2016)来进行。在分化的第4天，将上皮细胞在37℃下用Accutase(Gibco^TM)解离5分钟，以300g离心5分钟，并且进行分析。

经分化的细胞流式细胞术

将心肌细胞如上面所描述的那样用Liberase TH进行解离，转移至流式细胞术管，并且用4％PFA(Electron Microscopy Services)在室温下固定15分钟，然后用0.1％Triton X-100(Fisher BioReagents)在室温下透化15分钟，用DPBS洗涤一次，并且在室温下使用1:33小鼠单克隆IgG₁ TNNT2-647克隆13-11(BD Biosciences，565744，批次7248637)染色30分钟并且再次洗涤。使用同种型对照即小鼠IgG₁-647克隆MOPC-21(BDBiosciences，565571，批次8107668)来建立设门。将内皮细胞如上面所描述的那样用

进行解离，转移至流式细胞术管，并且在冰上用1:100小鼠IgG2a CD31-647克隆M89D3(BD Bioscience，558094，批次8145771)染色30分钟，然后用DPBS洗涤一次。使用同种型对照即小鼠IgG₁-647克隆MOPC-21(BD Biosciences，565571，批次8107668)来建立设门。将上皮细胞如上面所描述的那样用

进行解离，转移至流式细胞术管，用4％PFA(Electron Microscopy Services)在室温下固定10分钟，然后用在DPBS中的0.1％皂苷(Sigma)在室温下透化15分钟。将细胞在洗涤缓冲液(具有5％FBS、0.1％NaN₃、0.1％皂苷的DPBS)中洗涤一次，在室温下用1:200小鼠IgG₁-KRT18-647克隆DA-7(BioLegend，628404，批次B208126)染色30分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤两次。使用同种型对照即小鼠IgG₁-647克隆MOPC-21(BD Biosciences，565571，批次8107668)来建立设门。所有细胞都通过使用CytoFLEX(Beckman Coulter)用CytExpert 2.2软件来进行分析。

统计学方法

将数据在Excel或R中进行分析，并且在GraphPad Prism 8中进行绘图。详细的统计学信息包括在相应的附图图例中。数据呈现为平均值±SEM。通过非配对双尾Student’st-检验来进行比较，其中显著差异被定义为P<0.05(*)、P<0.01(**)、P<0.005(***)和P<0.0001(****)。未使用统计学方法来预先确定样本大小。所述实验不是随机化的，并且在实验和结果评估期间调研者对于分配并不是不知情的。

实施例1：用短期测定法来进行培养基成分的优化

作为第一步，确定在其上生长hiPSC的基质的浓度。虽然层粘连蛋白-511(Rodin等人,2010)、层粘连蛋白-521(Rodin等人,2014)、玻连蛋白(Braam等人,2008)和Synthemax^TM-II(Melkoumian等人,2010)适合于hiPSC培养(Burridge等人,2014)，但是没有一个是适当地具成本效益的，并且在玻连蛋白或Synthemax-II的情况下，也不适合于随后的分化(Burridge等人,2014)。

(虽然是一种成分不确定的产品(Hughes等人,2010))是一种具成本效益且经常使用的基质，具有以50μg/cm²使用它的大量数据(Ludwig等人,2006a)。通过比较两种相似的商业产品，

和

(Trevigen/Gibco^TM)，我们发现两者都以低至10μg/cm²(1:1000稀释度)的浓度进行使用(图1)并且随后对于所有未来实验都以保守的1:800稀释度进行使用。

在确定了无论是经解离的细胞的自动细胞计数(6-孔)还是小型存活测定法(即96-孔)均不是合适地稳固之后，建立了在由Ludwig等人和Chen等人所使用的那种之上建模的多能生长测定法。该生长测定法可以概括如下：

在开发该测定法平台期间，我们发现相对生长的精确测量是关于多能状态的度量(例如，NANOG表达)的合适替代者。当细胞开始自发地分化时，例如当从该配方中省略TGFβ1时，可容易地检测到因而发生的生长减缓。

就性能和成本效益评估了商购可得的细胞培养基的每种组分。所述商购可得的细胞培养基包含：

评估了关于六种主要的hiPSC培养基组分中的每一种的浓度范围(图2A-F)。在该阶段期间，我们确立了胰岛素是必需的并且仅可以用非常高水平的IGF1 LR3(≥1μg/ml)来替代，虽然这不是具成本效益的(图2A)。胰岛素的效应是剂量依赖性的，直至20μg/ml。抗坏血酸2-磷酸酯不是必需的，如先前所证实的(Prowse等人,2010)，但是较高的水平(≥200μg/ml)提高生长(图2B)。值得注意的是，该抗坏血酸2-磷酸酯水平与在心脏分化培养基CDM3中所优化的水平相似(Burridge等人,2014)。转铁蛋白对于该培养基配方也不是必需的，但是以剂量依赖性方式改善生长，其中20μg/ml展现出最佳生长，而同时保持成本效益(图2C)。硒源显示出是必需的，虽然2-200ng/ml的***钠浓度未显著地影响生长，并且在≥200ng/ml时***钠变得具有毒性(图2D)。在该简单的一次传代生长测定法中，FGF2-K128N在≥40ng/ml时是最佳的(图2E)，和TGFβ1在≥0.5ng/ml时是足够的(图2F)。

实施例2：另外的培养基组分的优化

现在参考图3，在实施例1的短期测定法中评价另外的培养基成分。图3A暗示，在传代后至少第一个24小时包括ROCK1/2抑制剂是最佳的。

在第一个24小时期间添加2μM thiazovivin相对于10μM Y27632而言稍微地(虽然不是显著地)改善了生长，并且是高至～5×的具成本效益的选择(图3B)。

一些近期的hiPSC生长配方已提出，高水平(2×)的非必需氨基酸(NEAA)和/或低水平(0.1×)的化学成分确知的脂质的添加提高生长(图3C)。在我们的测定法中，NEAA未增加生长，并且脂质的添加根本就是抑制性的，除了最低水平(图3C)。

用牛血清白蛋白(BSA)(一种常见的hPSC培养基组分)进行的补充对于生长不具有正面或负面效应，并且被排除以保持化学成分确知的配方(图3D)。

相比于来自其他制造商的DMEM/F12而言，

的DMEM/F12基础培养基包含更高水平的碳酸氢钠(～29mM或2438mg/l)。近期已证实，用20mM的另外的碳酸氢钠对Gibco^TM DMEM/F12(其包含14mM的碳酸氢钠)进行的补充通过抑制培养基的酸中毒而有利于hiPSC生长速率(Liu等人,2018)。但是，根据图3E，标准的29mM的碳酸氢钠是最佳的。

还评价了pH和摩尔渗透压浓度对于生长的效应。发现pH 7.1(图3F)和310mOsm/l的摩尔渗透压浓度(图3G)促进最高的生长速率。所有我们的实验都针对5％O₂和5％CO₂进行了优化，而没有来自高的N₂使用或者来自由一些人(Ludwig等人,2006b)所提出的10％CO₂(其需要较高的碳酸氢钠水平)的显著的成本增加。

FGF2

在最初的研究中，提供了商业重组人FGF2。该成分占培养基成本的>60％。然后，评估了另外的FGF2变体。通过使用在纯化期间不被切割的双重6xHis标签，将具有大肠杆菌-优化的密码子使用(以便提高产量)和K128N点突变(以便改善热稳定性)的FGF2序列(Chen等人,2012)***到重组蛋白质产生质粒(pET-28a)中(图4)。随后，我们生成了两种另外的热稳定的FGF2变体：FGF1-4X(Chen等人,2012)和FGF2-G3(Dvorak等人,2018)。我们发现，具有九个点突变的FGF2-G3比FGF2-K128N更有效力，其中在5ng/ml下显示出与在100ng/ml下的FGF2-K128N相似的对于生长速率的效应(图3H)。

实施例3：使用长期测定法来进行培养基组分的优化

我们最初的长期实验提供了初步优化，然而我们从先前的实验中意识到，一些变量，例如TGFβ1的消除，具有最小的短期效应并且将会在长期实验中仅具有可检测的负面效应。因此，用下述测定法操作方案评价了长期测定法的有效性：

每个实验独立地重复至少5次。这些实验再次确证了胰岛素(20μg/ml；图5A)、抗坏血酸2-磷酸酯(200μg/ml；图5B)、转铁蛋白(20μg/ml；图5C)、***钠(20ng/ml；图5D)和FGF2-G3(40ng/ml；图5E)的浓度。

由于TGFβ1现在是最昂贵的组分(总成本的～20％)，因而我们发现这可以以比先前所提出的低的浓度(0.1ng/ml)来进行使用，甚至在长期测定法中(图5F)。我们发现，其他激活蛋白/NODAL/TGFβ1信号传导源例如NODAL被要求处于成本惊人地高的水平(100ng/ml)(图5G)，并且激活蛋白A不适合于将生长保持至与TGFβ1相同的水平(图5H)。与TGFβ1相组合的激活蛋白A也对于生长具有负面效应(图5I)。TGFβ1是两个TGFB1基因产物的同二聚体，并且因此重组蛋白质通常在哺乳动物细胞中产生，从而使得用于基础研究实验室的产生变得复杂。这些哺乳动物细胞提供对于生物学活性来说至关重要的翻译后修饰，例如在大肠杆菌中不存在的糖基化、磷酸化、蛋白酶解加工和二硫键形成。为了克服这个问题，我们生成了由于点突变而不能形成二聚体的TGFβ1的形式(TGFβ1m)。预测该单体蛋白质的效力比TGFβ1低～20倍，但是可以容易地在大肠杆菌中大量产生(Kim等人,2015)。我们最初的实验证实，具有大肠杆菌-优化的密码子使用的TGFB1序列以内含体进行表达。为了克服这个问题，我们将该序列***到被设计用于产生硫氧还蛋白融合蛋白的蛋白质产生质粒(pET-32a)中，从而允许表达在细胞质中。还已证实，TGFβ3比TGFβ1更有效力(Huang等人,2014)。通过比较TGFβ1、TGFβ1m、TGFβ3和TGFβ3m，我们发现TGFβ3提供了能够在大肠杆菌中产生并且适合于以0.1ng/ml进行使用的最佳组合(图5J-L)，并且因此被选择用于最终的配方。

最后，我们所研究的两种hESC培养基制剂，DC-HAIF和iDEAL，包含FGF2和神经调节蛋白1(NRG1)两者。我们发现，用所有受试水平的NRG1进行的补充相对于单独的FGF2-G3而言提高生长>15％(图5M-N)，虽然NRG1在FGF2不存在下不能够支持生长(图5O)。类似地，我们使用pET-32a(其阻止产生为内含体)生成了重组NRG1蛋白，随后通过使用凝血酶进行切割以形成有活性的蛋白质(图5P和图6)。

源自这些长期测定法优化的本发明的一种最终B8培养基制剂为：

实施例4：B8用于hiPSC生成的适宜性的证实

确证了B9培养基用于生成hiPSC系的适宜性。通过使用已建立的操作方案但是使用B8，我们从26名患者中生成了hiPSC系。从所有供者都成功地生成了细胞系，并且它们通过了关于多能性的标准测定法，包括关于SSEA4和TRA-1-60的流式细胞术(图7A)，关于SSEA4、POU5F1、SOX2和TRA-1-60的免疫荧光染色(图7B)，和核型稳定性(图7C)。然后，我们比较了该B8配方与商购可得的E8配方，并且发现横跨经常使用的分传比与B8相似的生长(图7D)。已证实，与商业FGF2不同，热稳定的FGF2变体例如FGF2-G3能够在FGF-饥饿的细胞中诱导pERK，甚至在培养基已事先在37℃下储存了延长的时间段后(Chen等人,2012；Dvorak等人,2018)。为了确证我们的FGF2-G3表现类似，我们进行了相当的测定法并且确证FGF2-G3在37℃下在7天后是稳定的，而商业FGF2在37℃下2天后就不能刺激pERK了。由于常见的“周末自由式”培养基配方例如StemFlax已回到使用白蛋白并且可能包含肝素(这两者都不是化学成分确知的)，因此我们还在该测定法中评估了这些组分的功能并且发现两者都改善FGF2-G3的稳定性(图7E)。

实施例5：B8用于周末自由式培养的适宜性的证实

随着了解横跨各种各样的亚最佳条件B8都支持hiPSC生长(图7D)，我们建立了该配方的适宜性以跳过培养基更换日。我们建立了具有和没有thiazovivin的培养基更换日的矩阵(图8A)，并且显示每日B8培养基更换(顶行)令人惊讶地对于生长速率是最不适合的。没有培养基更换的B8T处理是包含thiazovivin的操作方案中最不有效的(底行)，而B8T和随后B8(深灰色条)是在生长速率和延长的对于thiazovivin的暴露之间的合适折中。用关于各种跳过培养基更换的时间线的影响的知识，我们设计了由每3.5天使细胞传代组成的7-天日程规划，其将会允许跳过周末的培养基更换，目前的hiPSC培养操作方案的一种主要告诫(图8B和8C)。我们的数据证实，在第一个24小时后进行培养基更换的3.5-天日程规划是合适于长期的，而没有培养基更换(即，仅传代)是不合适的(图8D)。另外，用0.5mg/ml的白蛋白对培养基进行的补充未挽救该缺陷(图8D)。用各种剂量的白蛋白或肝素进行的进一步实验进一步确证，这些在B8中不具有累加效应(图8E)。跳过培养基更换的主要告诫之一是分化效率和重现性减小。我们使用我们的现有的心脏分化(Burridge等人,2014)、内皮分化(Patsch等人,2015)和上皮分化(Li等人,2015；Qu等人,2016)操作方案来证实，B8以与每日培养基更换或我们的7-天操作方案相似地高的水平支持分化(图8F和8G)。

当将在任何培养基中培养细胞延长的时间段时，应当考虑其他因素。例如，我们知道在培养基中的L-谷氨酰胺在37℃下是不稳定的并且浓度在四天中降低大约三分之一。我们还知道，细胞产生氨，从而降低培养基的pH，虽然这通过HEPES和碳酸氢钠而部分地得到缓冲。最后，hiPSC释放自分泌或旁分泌因子到培养基中，其可能诱导分化，并且尚未将这些因子随时间的增加与营养物的使用和代谢废物的产生解偶联。

使用“大约”以提供数值范围终点的灵活性，通过假定给定值可以“稍高于”或“稍低于”终点而不影响所希望的结果。

在本文中使用术语“包括”、“包含”或“具有”及其变化形式意指涵盖其后所列出的要素及其等价物以及另外的要素。被叙述为“包括”、“包含”或“具有”某些要素的实施方案也被考虑为“基本上由那些某些要素组成”和“由那些某些要素组成”。如在本文中所使用的，“和/或”是指并且涵盖相关联的所列出的条目中的一个或多个条目的任何和所有可能组合，以及当以备选进行解释(“或”)时缺乏组合。

如在本文中所使用的，过渡性短语“基本上由......组成”(及其语法变体)待被解释为涵盖所记述的材料或步骤“和不重大地影响所要求保护的发明的基本和新颖特征的那些”。参考Herz,537F.2d 549,551-52,190U.S.P.Q.461,463(CCPA 1976)(原文中强调)；还参见MPEP§2111.03。因此，术语“基本上由......组成”不应当被解释为等价于“包含”。此外，本公开内容考虑了，在一些实施方案中，可以排除或省略任何特征或特征组合。

为了举例说明，如果本说明书陈述到一种复合物包含组分A、B和C，那么特别地意欲的是，可以单一地或以任何组合地省略或放弃A、B或C中的任一个或者其组合。值的范围的叙述仅意欲充当单一地提及落在所述范围内的每个分开的值的简略表达方法，除非另有说明，并且将每个分开的值合并入本说明书中，如同它被独个地述及。例如，如果将浓度范围叙述为1％至50％，那么意欲的是在本说明书中明确地列举诸如2％至40％、10％至30％或者1％至3％等的值。这些仅是特别地意欲的例子，并且在所列举的最低值和最高值之间(包括所述最低值和最高值)的数值的所有可能组合将会被认为在本公开内容中明确地陈述。除非另有定义，所有技术术语具有与由本公开内容所属于的领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。

如上面所陈述的，虽然已经通过实施方案的描述举例说明了本申请，并且虽然已经相当详细地描述了实施方案，但是意图不是将所附的权利要求书的范围限制或以任何方式限定至这样的细节。另外的优点和修改对于本领域技术人员来说将会容易地出现，其中具有本申请的益处。因此，在其更宽泛的方面，本申请并不局限于所显示的特定细节和举例说明性的实例。可以偏离这样的细节和实例，而不背离总的发明构思的精神或范围。

序列表

<110> NORTHWESTERN UNIVERSITY

<120> 用于人诱导型多能干细胞的具成本效益的培养基和操作方案

<130> 47460-109

<150> 62/902,561

<151> 2019-09-19

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<211> 141

<212> PRT

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<223> 合成的

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

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<223> 合成的

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tcagatccgc acatccagtt acagctgatc gcagaaagcg tgggtgaagt gtacatcaag 180

agcaccgaaa ccggccagta tctggcaatg gataccgatg gcctgctgta tggttcacaa 240

accccgaacg aagaatgcct gttcctggaa cgcctggaag aaaacggcta caacacctac 300

atcagcaaga agcacgcgga gaagaactgg tttgttggcc tgaacaagaa cggcagctgc 360

aaacgtggtc ctcgtaccca ttatggccag aaagcgattc tgtttctgcc gttaccggtt 420

agcagcgatg aattc 435

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gcaaaccgct atttagcgat gaaagaagac ggccgcctgt tagcgagcaa gtgtgtgacc 300

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<210> 13

<211> 354

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

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<212> PRT

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<220>

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Ala Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Asp Gly Gly

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<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的

<400> 16

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<213> 人工序列

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<223> 合成的

<400> 17

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35 40 45

Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu Ala

50 55 60

Glu

65

Claims

1.用于人诱导型多能干细胞的生长的细胞培养基，其包含：

细胞培养基础培养基；

成纤维细胞生长因子2；

胰岛素或IGF1；

硒源。

2.权利要求1的细胞培养基，其实质上不包含转化生长因子β1(TGFβ1)、激活蛋白A或白蛋白。

3.权利要求1的细胞培养基，其进一步包含TGFβ3、NRG1、转铁蛋白、抗坏血酸或其组合。

4.权利要求1的细胞培养基，其进一步包含thiazovivin。

5.权利要求1的细胞培养基，其进一步以7.1的pH为特征。

6.权利要求1的细胞培养基，其进一步以310mOsm/l的摩尔渗透压浓度为特征。

7.权利要求1的细胞培养基，其进一步以处于2438μg/ml的量的碳酸氢钠为特征。

8.权利要求1的细胞培养基，其中所述细胞培养基础培养基为DMEM/F12。

9.权利要求1的细胞培养基，其中所述FGF2为从由SEQ ID NO:4、5或15组成的组中选择的重组蛋白质。

10.权利要求1的细胞培养基，其中所述***盐为***钠。

11.权利要求3的细胞培养基，其中所述TGFβ3为SEQ ID NO:16的重组蛋白质，或者所述NRG1为SEQ ID NO:17的重组蛋白质。

12.权利要求1的细胞培养基，其中所述培养基包含：在DMEM/F12培养基中配制的40ng/ml FGF2-G3、20μg/ml胰岛素、20ng/ml***钠。

13.权利要求12的细胞培养基，其包含在DMEM/F12培养基中配制的40ng/ml FGF2-G3(SEQ ID NO:15)、20μg/ml胰岛素、20ng/ml***钠、20μg/ml转铁蛋白、0.1ng/ml TGFβ3(SEQ ID NO:16)、0.1ng/mlNRG1(SEQ ID NO:17)、200μg/ml抗坏血酸2-磷酸酯、2438μg/ml碳酸氢钠。

14.培养基，其基本上由下列各项组成：细胞培养基础培养基；成纤维细胞生长因子2-G3；胰岛素或IGF1；硒源；TGFβ3；NRG1；转铁蛋白；和抗坏血酸。

15.培养基，其由下列各项组成：细胞培养基础培养基；成纤维细胞生长因子2-G3；胰岛素或IGF1；硒源；TGFβ3；NRG1；转铁蛋白；和抗坏血酸。

16.用于制备细胞培养基的试剂盒，所述试剂盒包含：

编码FGF2-G3、TGFβ3和NRG1的质粒；

关于制备FGF2-G3、TGFβ3和NRG1蛋白质和制备细胞培养基的说明书。

17.权利要求16的试剂盒，其进一步包含下列各项中的一种或多种：培养基、***钠、胰岛素或IGF1、转铁蛋白、抗坏血酸2-磷酸酯、碳酸氢钠或thiazovivin。

18.使培养中的人诱导型多能干细胞(hiPSC)生长和传代的方法，所述方法包括：

获得细胞培养基，其包含在DMEM/F12培养基中配制的FGF2-G3(SEQ ID NO:15)、胰岛素或IGF1、***钠、转铁蛋白、TGFβ3(SEQ ID NO:16)、NRG1(SEQ ID NO:17)、抗坏血酸2-磷酸酯、碳酸氢钠；

制备包被有基质的平板；

向所述基质添加hiPSC，第0天；

在第1天更换细胞培养基；

在第3.5天使细胞传代，或者使细胞生长连续7天；

其中该3.5天传代或该7-天细胞生长周期中的至少一天将不会需要更换细胞培养基。