CN100465268C - 人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。该培养基配方为：N25-30mL，B2710-60mL，谷氨酰胺0.0146-0.73g，β-巯基乙醇5-10μl，非必需氨基酸中的一种或几种共计：3-30mL，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.2-0.8g；用DMEM/F12定容至1000mL，pH 7.2-7.8。该培养基成分确定，且无任何动物来源的成分，使用安全性高。用本发明人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基对人胚胎干细胞进行培养具有增殖快、凋亡率低、安全稳定、传代时间长的优点。本发明将在人胚胎干细胞的培养中发挥重要作用，以满足临床及医学研究中对人胚胎干细胞的需求，应用前景广阔。

Description

人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基

技术领域

本发明涉及细胞培养方法及其专用培养基，特别是涉及一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。

背景技术

干细胞是存在于发育阶段或成体阶段多细胞器官中的一群特殊细胞，它们最为显著的特征是具有无限的自我更新以及分化产生各种子代细胞的双重能力，统称为干性(stemness)。胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ES)由受精卵发育成囊胚的内细胞团中而来，是最原始的干细胞，具有分化上的全能性(totipotent)，可以分化成各种构成人体任何一种器官或组织的组成细胞。

第一株哺乳动物的胚胎干细胞系是从小鼠中分离出来的(Evans MJ，KaufmanMH.Nature，292(5819):154-156.1981；Martin GR.Proc Natl Acad Sci USA，78(12)：7634-7638.1981)。研究人员已经证明这些细胞能够整合入胚泡，参与正常的胚胎发育和组织器官的形成(Robertson E.Nature 323，445-448.1986；Stewart CL.Dev Biol 161，626-628.1994)，而且在特定的条件下还能够形成正常的鼠胎(NagyA.Proc Natl Acad Sci USA 90，8421-8428.1993；Eggan K.Nat Biotechnol20，455-459.2002)。美国威斯康星大学的Thomson教授率先实现了灵长类动物胚胎干细胞的分离和建系(Thomson JA.Proc Natl Acad Sci USA，92(17)：7844-7848.1995；Thomson JA.Biol Repord，55(2)：254-259.1996)。1998年Thomson教授又成功的建立了人的胚胎干细胞系(Thomson JA.Science，282(5391)：1145-1147)。到目前为止，由不同国家和地区建立的人胚胎干细胞株已达40多株，其中20多株已经商品化。

由于胚胎干细胞在体外可以分化成多种细胞，因而其在临床应用和基础研究中具有广阔的应用前景，例如细胞移植治疗和基因治疗。现在备受瞩目的“治疗性克隆”策略，是用核移植建系的方法建立与患者具有相同遗传背景的胚胎干细胞系，诱导使其分化出病人所需的细胞类型，最后再植回患者体内进行治疗。这种方法可以避免外源移植所导致的免疫排斥，它的实现将为许多目前难以治愈的疾病，如糖尿病、白血病以及心血管疾病等提供了一条新的治疗途径。另外，人胚胎干细胞的研究将有助于揭示人胚胎的发育过程，并为药物筛选、药理分析及毒性评估等提供了新的技术平台。

尽管人胚胎干细胞具有广阔的应用前景，但要实现这些应用，尤其是临床上的应用，仍需要解决一系列的重要问题，例如安全性与有效性。安全性指的是移植到病人体内的胚胎干细胞的分化产物必须满足以下条件：(1)不含有任何动物来源的、可能污染了动物病原体的成分。由于目前人胚胎干细胞的培养条件中或多或少都包含有来源于动物且组分不明确的添加物，使得人胚胎干细胞的临床应用面临着较大的风险；(2)不会在病人体内形成肿瘤；(3)不会在病人体内引发免疫排斥反应。有效性是指由人胚胎干细胞分化出来的细胞必须有着和正常人体细胞一样的性状和生理功能。只有达到了这些标准，移植到病人体内的细胞才能真正发挥治疗的功效。而这些问题的解决都将有赖于在人胚胎干细胞培养体系的进一步完善以及自我更新及定向分化的分子机制研究。

在人胚胎干细胞培养体系的研究方面，1998年Thomson建立人胚胎干细胞系时所用的培养基成分为：80％Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)，20％胎牛血清，1mM谷氨酰胺，0.1mM β-巯基乙醇，1％非必需氨基酸，并以MEF作为饲养层(Thomson JA.Science，282(5391)：1145-1147)。然而血清是一种复杂的蛋白质混合物，并且不同批次血清的质量难以控制，此外，以后的实验结果发现在最初建系所用的含有胎牛血清的培养基中，人胚胎干细胞形成克隆的能力非常低，而如果将培养基中的胎牛血清换成血清替代物(Knockout Serum Replacement，KSR)，胚胎干细胞的克隆形成率能提高好几倍；如果再加入4ng/mL的重组人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)，则能够进一步提高胚胎干细胞的克隆形成效率。这种在培养基中使用血清替代物替代胎牛血清，同时添加bFGF，并使用MEF细胞作为饲养层的培养条件，成为了目前常规的人胚胎干细胞的培养方法。

上述研究表明：人的胚胎干细胞无论是建系还是培养传代，都不能脱离作为饲养层的MEF细胞。然而，由于将MEF细胞制备为饲养层是一个繁琐的过程，不适用于人胚胎干细胞的大规模制备。为解决这个问题，2001年，美国Geron公司开发了一种无需饲养层的培养人胚胎干细胞的方法(Xu C.Nat Biotechnol，19(10):971-974.2001)。在他们的实验中，考虑到了人胚胎干细胞在存活和生长过程中对胞外基质及MEF所分泌因子的依赖性，将人胚胎干细胞接种于胞外基质Matrigel或laminin包被的培养皿中，并用MEF细胞的条件培养基进行培养，实现了对胚胎干细胞的扩增和未分化状态的维持。在这种条件下，经过长期培养的胚胎干细胞仍然保持正常的核型、各胚层分化潜能及在移植小鼠体内形成畸胎瘤的能力。Matrigel是BD公司生产的一种从小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物，此种肉瘤富含细胞外基质蛋白。Matrigel的主要成份是层粘蛋白(laminin)，还有胶原IV、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素糖蛋白，此外还含有一些微量的生长因子，例如表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、纤维母细胞生长因子(FGF)、组织纤溶酶原激活物(tPA)等。在室温下，Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物细胞基底膜类似。层粘蛋白laminin是Matrigel中最主要的成分，它是一种上皮细胞粘附糖蛋白，而且实验证明该组分也能很好的支持人胚胎干细胞的生长。MEF细胞条件培养基的基本配方完全等同于常规的人胚胎干细胞的培养基。这种条件培养基含有MEF细胞所分泌的各种因子，其中包括能够维持人胚胎干细胞自我更新的某些未知因子。

将人的胚胎干细胞培养在用MEF细胞制备的饲养层上，或使用MEF细胞的条件培养基将人的胚胎干细胞培养在Martrigel上是到目前为止最常用的两种培养人胚胎干细胞的方法。两种方法的共同特点都是依赖于MEF细胞所分泌的成分。然而，MEF是一种分离于小鼠胚胎的原代细胞，其中可能含有鼠源的成分，这使得人胚胎干细胞的临床应用受到了很大的限制。2005年1月在Nature Medicine上发表的一篇文章指出：目前用于培养人胚胎干细胞的MEF细胞和血清替代物这两种动物来源的成分中都含有一种常见的哺乳动物唾液酸—Neu5Gc，使得用传统方法建系和培养的人胚胎干细胞及其分化产物(如胚胎小体)均污染了大量的Neu5Gc，由于很多人的体内含有抗Neu5Gc的循环抗体，因此当把人的胚胎干细胞或分化产物移植入人体时，就很容易引发人体产生针对胚胎干细胞或其产物的免疫反应而导致移植失败(Martin MJ.Nat Med，11(2):228-232.2005)。要想早日实现人胚胎干细胞的临床应用，去除培养体系中动物来源的成份是一个急需解决的问题。

为了避免人胚胎干细胞被动物性病原污染，国内外的一些实验室尝试了各种培养体系来解决这一问题。例如，在Martrigel上用KSR搭配不同的因子组合、或用人来源的细胞作为饲养层，并用人血清培养人胚胎干细胞。BM Rao等人在2005年发表了一篇文章，对各种体系进行了归纳总结(BM Rao and PW Zandstra.Biotechnology，16:568-576.2005)。目前很多体系没有完全避免动物来源的成分。将Martrigel替换为laminin只能部分解决这一问题，而且不同批次生产的laminin的质量难以控制，会影响培养细胞的状态(Xu RH.Nat Methods，2:185-190.2005)。还有一些体系尽管用人源细胞来培养人的胚胎干细胞可以避免使用鼠源的MEF细胞，然而，因为这些人源细胞大多为原代分离细胞，不但操作复杂，而且组织来源也比较有限，不同批次制备的饲养层在质量上也不稳定。

最近Thomson教授开发出了一种成分确定，无任何动物来源的培养体系(Tenneille EL.Nat Biotechnology，24:185-187.2006)，在该体系中，用collagenIV，fibronectin，vitronectin，laminin的混合物作为包被培养皿的基质，培养基中加了bFGF，LiCl，GABA，pipecolic acid和TGFb五种生长因子，但是这个体系存在着一些问题，如用该体系培养的胚胎干细胞在4个月后发生了突变，核型变成了XXY(Klinefelter syndrome)。S.Ding教授等做了类似的研究，但是他们建立起来的培养体系的成分并不是完全确定，且仍然包含了某些动物来源的成分，因为他们使用的胞外基质仍然是来源于小鼠的matrigel(S.Yao.Proc Natl Acad Sci U S A，103(18):6907-6912.2006)。

因此，迫切需要一种成分确定，无任何动物来源的人胚胎干细胞的培养体系，以满足研究和临床应用中对该细胞的需求。

发明内容

本发明的目的是提供一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。

本发明所提供的用于培养胚胎干细胞的培养基(命名为NBF)，其配方为：N25-30mL，B27 10-60mL，谷氨酰胺(L-glutamine)0.0146-0.73g，β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol)5-10μl，非必需氨基酸(Non-essential AminoAcids)中的一种或几种，共计3-30mL，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20-200mg，小牛血清白蛋白(BSA)0.2-0.8g；用DMEM/F12(美国Invitrogen公司)定容至1000mL，pH7.2-7.8。

所述用于培养人胚胎干细胞的培养基的优选的配方为：N2 10mL，B27 20mL，谷氨酰胺0.146g，β-巯基乙醇7μl，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.5g，非必需氨基酸为丙氨酸(alanine)、天冬酰胺(asparagine)、天冬氨酸(aspartic acid)、谷氨酸(glutamic acid)、甘氨酸(glycine)、脯氨酸(proline)和丝氨酸(serine)中的一种或几种，共计10mL；用DMEM/F12定容至1000mL，pH 7.2。

其中，DMEM/F12、N2和B27可选用市售商品。

各种非必须氨基酸的配比可根据需要任意调整。

本发明的第二个目的是提供一种人胚胎干细胞的培养方法。

本发明所提供的人胚胎干细胞的培养方法，是将人胚胎干细胞细胞团接种于包被有人源基质的培养皿上，用上述人胚胎干细胞培养基(NBF)在36-37.5℃下培养，每天更换一次培养基，5-7天传代一次。

若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)胚胎干细胞克隆过于致密或面积过大；(2)胚胎干细胞出现明显的自发分化。

所述人源基质可为纤维粘连蛋白(fibronect in)或纤维粘连蛋白与选自细胞外粘连蛋白(vitronectin)和胶原蛋白IV(collagen IV)中至少一种的混合物。

所述纤维粘连蛋白用PBS稀释的终浓度为0.02-0.2mg/mL，细胞外粘连蛋白的终浓度为0.01-0.1mg/mL，胶原蛋白IV的终浓度为0.3-2mg/mL。

所述用人源基质对培养皿进行包被的方法为：将人源基质装入培养皿中，晃动，使人源基质覆盖均匀，然后将覆盖有人源基质的培养皿在4℃或37℃下至少放置2-24小时。

在上述包被方法中，若在37℃下包被，则至少需放置2小时；若短时间内不用，可以在4℃下包被，但至少包被12-24小时后才能使用，最长可放置一周。

所述使用包被有人源基质的培养皿对人胚胎干细胞进行培养前，用PBS将培养皿洗2-3遍；培养基使用前在室温下预热15-20分钟。

所述人胚胎干细胞细胞团的获得方法可包括以下步骤：

1)将人胚胎干细胞用0.5-2mg/mL胶原酶IV在36-38℃下孵育2-10分钟进行消化，在相差显微镜下观察经消化的细胞，若克隆边缘出现卷边，则可终止消化；否则延长消化时间，但要随时取出观察，以防止因消化过度导致克隆脱落；

2)用清洗经消化的人胚胎干细胞；

3)将人胚胎干细胞转移至新的无菌容器中，用滴管吹吸若干次，得到大小较为均一的人胚胎干细胞细胞团。

所述各种试剂使用前在室温下预热15-20分钟；步骤1)中胶原酶IV的浓度优选为1.0mg/mL，孵育温度优选为37℃；步骤2)中用PBS和/或DMEM/F12液对人胚胎干细胞进行清洗；步骤3)中转移及吹吸细胞的动作一定要温和。

本发明提供了一种人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基。该培养基成分确定，且无任何动物来源的成分，使用安全性高。用本发明人胚胎干细胞的培养方法及其专用培养基对人胚胎干细胞进行培养具有增殖快、凋亡率低、安全稳定、传代时间长的优点。此外，培养基中添加bFGF，用N2和B27代替胚胎干细胞常规培养方法所用培养基中的KSR，以及用纤维粘连蛋白或纤维粘连蛋白与选自细胞外粘连蛋白和胶原蛋白IV中至少一种的混合物作为细胞培养支持物，可以很好的维持人胚胎干细胞的未分化状态。本发明将在人胚胎干细胞的培养中发挥重要作用，以满足临床及医学研究中对人胚胎干细胞的需求，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为培养在不同培养基中的人胚胎干细胞的形态

图2为用不同人源基质培养的人胚胎干细胞的形态以及未分化状态的维持情况

图3为检测用本发明的培养方法及其专用培养基培养的人胚胎干细胞的凋亡率及长期培养细胞的核型分析结果

图4为用本发明的培养方法及其专用培养基培养的人胚胎干细胞的全能性检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所述百分比浓度如无特别说明均为质量百分比浓度。

实施例1、人胚胎干细胞专用培养基的获得

一、人胚胎干细胞的常规培养

试剂：

PBS：称取8g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na₂HPO₄和0.24g KH₂PO₄，加ddH₂O定容至1000mL，用HCl调节溶液pH值至7.4。

200mM谷氨酰胺储存液(200×)：称取0.292g谷氨酰胺，溶解于10mL PBS中，过滤除菌，分装冻存于-70℃冰箱。

2M β-巯基乙醇(20000×)：取1mL 14.3M的β-巯基乙醇，加6.15mL PBS稀释，过滤除菌。

人胚胎干细胞培养基(HESM)：20％血清替代物(Knock-out SerumReplacement，KSR)，1mM谷氨酰胺，0.1mMβ-巯基乙醇，1％非必需氨基酸(Non-essentialAminoAcids)(美国Gibco公司)，4ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，用ddH₂O定容至1000mL。

0.5mg/mL Dispase：称取Dispase 10mg粉末，溶解于20mL DMEM/F12(美国Invitrogen公司)中，过滤除菌。

1mg/mL胶原酶IV：称取胶原酶IV粉末20mg，溶解于20mL DMEM/F12(美国Invitrogen公司)中，过滤除菌。

MEF培养基：含10％胎牛血清的DMEM(美国Gibco公司)。

丝裂霉素C工作液：将2mg丝裂霉素C溶于200mL含10％胎牛血清的DMEM中，使其终浓度为10ug/mL，过滤除菌。

0.1％明胶：称取0.1g明胶粉末，溶解于100mL双蒸水中，高压灭菌。

1、饲养层(feeder)细胞的获得

用下述方法对小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)进行处理，以作为培养人胚胎干细胞的饲养层细胞：

1)取生长状态良好的贴壁MEF细胞，弃去MEF培养基，加入含10ug/mL丝裂霉素C的丝裂霉素C工作液；

2)在37℃下培养3个小时，培养期间用0.1％明胶处理将要接种MEF细胞的培养皿，室温放置2小时以上(或37℃放置30分钟以上)，用前吸掉明胶溶液即可；

3)取出MEF细胞，弃去含丝裂霉素C工作液，用PBS洗5遍，以便彻底洗掉残存的丝裂霉素(因为丝裂霉素是有丝***抑制剂，可能对胚胎干细胞有毒性)；

4)加入胰酶-EDTA(美国Gibco公司)进行消化，然后用MEF培养基终止反应；

5)1000转/分种离心5分钟，弃上清，用MEF培养基重悬细胞沉淀并计数；

6)按照1.6×10⁵个细胞/3.5cm培养皿的密度将经上述步骤处理的MEF细胞接种至包被有0.1％明胶的培养皿中，置于37℃培养箱中培养12-24小时，得到用于培养人胚胎干细胞的饲养层。

2、人胚胎干细胞的常规培养

在步骤1获得的MEF饲养层细胞上用人胚胎干细胞培养基(HESM)对人胚胎干细胞H1细胞系进行培养，具体培养方法包括以下步骤：

1)从4℃冰箱中取出培养所需试剂及培养基，室温预热15分钟左右；

2)取出人胚胎干细胞，吸去HESM，将细胞用PBS洗一遍；

3)加入0.5mg/mL Dispase(或1mg/mL胶原酶IV)进行消化(1mL/3.5cm培养皿)，置于37℃培养箱中孵育10-15分钟，然后取出细胞在相差显微镜下观察，若克隆边缘出现卷边，则可终止消化；否则放回培养箱，延长消化时间，但要随时取出观察，以防止因消化过度导致克隆脱落；

4)消化结束后，吸掉Dispase或胶原酶IV，用PBS和DMEM/F12分别洗一遍后，加入适量DMEM/F12(2mL/3.5cm培养皿)；

5)用无菌直头或弯头玻璃滴管轻柔地将所有人胚胎干细胞克隆从培养皿底部刮下，并转移至无菌的15mL锥形底离心管中，用滴管温和地吹吸若干次，使人胚胎干细胞克隆变成大小较为均一小的细胞团；

6)1000rpm离心3-4分钟，小心吸掉上清，用玻璃滴管吸新鲜的HESM培养基重悬沉淀；

7)取出步骤1获得的MEF饲养层细胞，用PBS洗三遍，将人胚胎干细胞的小团块接种于MEF饲养层细胞上，置于37℃细胞培养箱中培养12-24小时，人胚胎干细胞贴壁后可更换新鲜的HESM培养基。每天更换一次培养基，通常5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)MEF饲养层的放置时间达到两周；(2)胚胎干细胞克隆过于致密或面积过大；(3)胚胎干细胞出现明显的自发分化。

二、人胚胎干细胞的无饲养层培养

该方法是在胞外基质Matrigel上用MEF细胞的条件培养基对人胚胎干细胞进行培养，是目前最为常用的无饲养层(feeder-free)的人胚胎干细胞的培养方法。在该培养方法中，对人胚胎干细胞的换液、传代等基本操作方法都与步骤一中用MEF细胞作为饲养层的常规培养方法相同，仅仅是在培养获得的人胚胎干细胞克隆的形态上稍有差别：在MEF饲养层上，胚胎干细胞克隆更为致密，边缘非常整齐，而在Matrigel基质上，尽管胚胎干细胞本身仍然保持着个头较小、核质比大、核仁清晰的特点，但克隆显得比较铺展，边缘也不如在MEF饲养层上整齐。其中，MEF细胞条件培养基的制备方法与用Matrigel包被培养皿或培养孔的方法如下：

1、MEF细胞条件培养基的制备方法

MEF细胞条件培养基的制备方法包括以下步骤：

1)用0.1％明胶包被T25培养瓶或6cm培养皿；

2)用与常规培养方法相同的方法对MEF细胞用丝裂霉素C进行处理，再将经处理的MEF细胞按照1.3×10⁶个细胞/T25培养瓶的密度接种至包被有0.1％明胶的培养皿或培养瓶中；

3)接种第二天，将MEF培养基更换为不含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的人胚胎干细胞培养基(HESM)(每个T25培养瓶或6cm培养皿加5mL培养基)，置于37℃细胞培养箱中培养24小时；

4)培养结束后，将培养基从培养瓶或培养皿中取出并转移至一个50mL离心管中，保存于4℃冰箱中，同时再向细胞中加入新鲜HESM，置于37℃细胞培养箱中继续培养；

5)重复步骤4)，每天收集一次培养基，连续收集7天；

6)将每次收集的培养基混合在一起，3500rpm离心10分钟，除去混杂的死细胞及细胞碎片，向上清中添加4ng/mL bFGF即可使用；若短时间内不用，可暂时不加bFGF，分装保存于-20℃，待使用时再添加bFGF和谷胺酰氨。

2、Matrigel的包被方法

将胞外基质Matrigel包被于培养皿或培养孔中的方法包括以下步骤：

1)将购自BD公司的Matrigel于4℃放置12-24小时使其融化，然后进行分装，以避免每次使用时反复冻融，分装方法为：根据使用需要，在冰上用冷的枪头将等体积的Matrigel分装到无菌的1.5mL冰浴的离心管中，每管67μl，然后保存于-20或-70℃冰箱中；

2)使用时，从冰箱中取出装有Matrigel的1.5mL离心管，插于冰上；

3)加入2mL预冷的DMEM/F12培养基，在冰上用枪头反复吹吸使Matrigel融化并稀释于培养基中；

4)将稀释后的Matrigel加入培养皿或培养孔中，补加冷的DMEM/F12至一定体积(1mL/3.5cm培养皿)，使Matrigel包被的工作浓度为原液的1/30，晃动，使Matrigel覆盖均匀；

5)室温或37℃放置1小时以上(如果短时间内不用，可以在4℃下包被，但至少包被12-24小时后才能使用，最长可放置一周)，接种人胚胎干细胞前吸掉包被液即可使用。

三、本发明人胚胎干细胞培养方法及其专用培养基的确定

1、本发明人胚胎干细胞专用培养基的确定

为获得一种成分确定，无任何动物来源的培养基，现检测四种常用的细胞培养基：BITS、B27、N2B27(均购自美国Gibco公司)和MEF细胞条件培养基(MEF-CM)，以及添加有不同对干细胞的维持起正作用的细胞因子(名称及添加量见表1，BSA：牛血清白蛋白，ITS：胰岛素，转铁蛋白和硒盐，bFGF：碱性成纤维细胞生长因子，IGF：类胰岛素生长因子，PDGF：血小板源生长因子，EGF：表皮生长因子，TGFβ：转化生长因子)的四种培养基对人胚胎干细胞生长的影响。除培养基不同外，培养方法与步骤二所用培养方法相同，同时以步骤二培养在matrigel上用从小鼠成纤维细胞上收来的条件培养基培养的人胚胎干细胞作为阳性对照。培养10天后，在上述不同培养基上人胚胎干细胞的生长状况如表1所示(“-”表示培养皿中已经没有未分化克隆的存在，“+”表示培养皿中大概10％左右的克隆属于未分化克隆，“++”表示培养皿中大概40％左右的克隆属于未分化克隆，“+++”表示培养皿中大概70％左右的克隆属于未分化克隆，“++++”表示培养皿中大概100％左右的克隆属于未分化克隆)，在上述不同培养基上培养不同时间的部分人胚胎干细胞的生长状况如图1所示((A)培养在BITS中6天的细胞形态，(B)培养在BITS和100ng/mL bFGF中12天的细胞形态，(C)培养在B27中6天的细胞形态，(D)培养在B27和100ng/mL bFGF中24天的细胞形态，(E)培养在N2B27中18天的细胞形态，(F)培养在N2B27和40ng/mL bFGF中96天的细胞形态，(G)培养在MEF-CM中6天的细胞形态，(H)培养在N2B27和100ng/mL bFGF中5个月的细胞形态(放大倍数：×100))，在该试验所设计的大部分培养条件下，人胚胎干细胞在传到第4代的时候就开始出现分化现象(见图1中的图A-图E)，7代以后，培养皿里基本上不存在未分化的克隆，而且只有在培养基中加了N2B27和bFGF后才可以长时间的维持人胚胎干细胞的传代培养。然而当培养基中只加入40ng/mL的bFGF时，人胚胎干细胞只能维持16代的不分化状态(见图1中的图F)，到24代的时候，分化的克隆就非常多了。此外，当培养体系中的bFGF浓度增加到了100ng/mL时，可以保持人胚胎干细胞的未分化状态至少28代(见图1中的图H)，表明bFGF在高浓度的时候能够更好的维持人胚胎干细胞的未分化状态。在整个培养过程中，细胞克隆都保持了标准的克隆形态如核质比高，边界分明等。上述结果表明N2B27和bFGF可以用于人胚胎干细胞的长期培养并保持其正常形态，本发明用来培养人胚胎干细胞的培养基(NBF)的配方定为：N25-30mL，B2710-60mL，谷氨酰胺(L-glutamine)0.0146-0.73g，β-巯基乙醇(beta-mercaptoethanol)5-10μl，非必需氨基酸(Non-essential AminoAcids)中的一种或几种，共计3-30mL，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)20-200mg，小牛血清白蛋白(BSA)0.2-0.8g；用DMEM/F12(美国Invitrogen公司)定容至1000mL，pH7.2-7.8。其中，DMEM/F12、N2和B27可选用市售商品，各种非必须氨基酸的配比可任意调整。实际操作中具体浓度的本发明培养基配方见表2(N2的成分有：人转铁蛋白，重组人胰岛素，***，腐胺，***盐；B27的成分有：牛血清白蛋白，过氧化氢酶，超氧化物歧化酶，人转铁蛋白，重组人胰岛素，维生素H，半乳糖，皮质脂酮，乙醇胺，左旋肉碱，还原型谷胱甘肽，亚油酸，亚麻酸，***，腐胺，维他命A酯，硒，三碘甲腺原氨酸，维生素E，维生素E酯；剩下的成分中除去bFGF，八种非必需氨基酸，β—巯基乙醇均是DMEM/F12的成分)。

            表1 在不同培养基中人胚胎干细胞的生长状况

                  表2 NBF的培养基组分及使用浓度

注：该表所列的属于N2、B27各组分的浓度表示的是N21×和B27 1×的浓度，实际使用时采用N2 0.5-3×和B27 0.5-3×的浓度。

实施例2、人胚胎干细胞培养方法的确定及培养细胞的检测

一、人胚胎干细胞培养方法的确定

用本发明的培养基虽然可以长期培养人胚胎干细胞，但是并没有达到完全的成分确定和无任何动物来源，因为包被培养皿的matrigel来源于小鼠的骨肉瘤，因而为使该培养体系完全达到无任何动物来源，现用四种人源基质(fibronectin，collagen IV，vitronectin，laminin)及其不同组合包被培养皿，以检测在这些培养体系中人胚胎干细胞的状态，包被方法为：

1)将购自美国Sigma公司的人源基质fibronectin，collagen IV，vitronectin，laminin于4℃放置12-24小时使其融化，然后进行分装，以避免每次使用时反复冻融，分装方法参见常规的人胚胎干细胞的无饲养层培养方法；

2)使用时，从冰箱中取出装有人源基质的1.5mL离心管，插于冰上；

3)加入预冷的PBS，在冰上用枪头反复吹吸使人源基质融化并稀释于PBS中，使fibronecin的终浓度为0.02-0.2mg/mL，vitronectin的终浓度为0.01-0.1mg/mL，collagen IV的终浓度为0.3-2mg/mL，laminin的终浓度为0.02-0.2mg/mL，晃动，使人源基质覆盖均匀；

4)将四种人源基质fibronectin，collagen IV，vitronectin，laminin及其不同组合包被培养皿37℃放置2小时以上(如果短时间内不用，可以在4℃下包被，但至少包被12-24小时后才能使用，最长可放置一周)，接种人胚胎干细胞前吸掉包被液，用PBS洗2-3遍即可使用。

培养10天后的细胞的生长状态见表3所示(“-”表示培养皿中已经没有未分化克隆的存在，“+”表示培养皿中大概10％左右的克隆属于未分化克隆，“++”表示培养皿中大概40％左右的克隆属于未分化克隆，“+++”表示培养皿中大概70％左右的克隆属于未分化克隆，“++++”表示培养皿中大概100％左右的克隆属于未分化克隆)，培养在fibronectin上36天的细胞形态见图2中的图D，培养在vitronectin上6天的细胞形态见图2中的图A，培养在collagen IV上6天的细胞形态见图2中的图B，培养在laminin上24天的细胞形态见图2中的图C，用fibronectin，fibronectin和collagen IV，fibronectin和vitronectin这三种组合包被培养皿时，细胞表现出了干细胞克隆的经典形态。对培养在fibronectin上的细胞用免疫荧光的方法检测其干性基因Oct4和Tra-1-81的表达情况，以实施例1培养在matrigel上用从小鼠成纤维细胞上收来的条件培养基培养的人胚胎干细胞为对照，结果见图2中的图E(Oct4(上)，Tra-1-81(下)，放大倍数：×100)。用RT-PCR的方法检测培养细胞的干性基因(Oct4，Nanog，Sox2)和看家基因(GAPDH)的表达情况，结果见图2中的图F，结果干性基因(Oct4，Nanog，Sox2)和看家基因(GAPDH)的表达情况在阳性对照和培养在fibronectin上的细胞间表达水平类似。同时也检测了这些细胞是否具有分化全能性，体外分化的胚胎小体的形态见图4中的图A(放大倍数：×100)，表明在用上述人源基质包被的平皿上生长的胚胎细胞具有分化成各个胚层的能力。优化的包被组合为fibronectin，fibronectin和vitronectin，fibronectin和collagen，在上述基质上的胚胎细胞的各种特性和阳性对照细胞非常相似。

        表3 不同人源基质上人胚胎干细胞的生长状态

本发明在包被有人源基质的培养皿上用人胚胎干细胞培养基(NBF)对人胚胎干细胞进行培养的培养方法，包括以下步骤：

1)从4℃冰箱中取出培养所需试剂及培养基，室温预热15分钟左右；

2)取出人胚胎干细胞，吸去培养基，将细胞用PBS洗一遍；

3)加入1mg/mL胶原酶IV进行消化(1mL/3.5cm培养皿)，置于37℃培养箱中孵育5-7分钟，然后取出细胞在相差显微镜下观察，若克隆边缘出现卷边，则可终止消化；否则放回培养箱，延长消化时间，但要随时取出观察，以防止因消化过度导致克隆脱落；

4)消化结束后，吸掉胶原酶IV，用PBS和DMEM/F12分别洗一遍后，加入适量DMEM/F12(2mL/3.5cm培养皿)；

5)用无菌直头(或弯头玻璃滴管)轻柔地将所有人胚胎干细胞克隆从培养皿底部刮下，并转移至无菌的15mL锥形底离心管中，用滴管温和地吹吸若干次，使人胚胎干细胞克隆变成大小较为均一的细胞团；

6)1000rpm离心3-4分钟，小心吸掉上清，用玻璃滴管吸新鲜的NBF培养基重悬沉淀；

7)将人胚胎干细胞的小团块接种于包被有人源基质的培养皿上，置于37℃细胞培养箱中培养12-24小时，人胚胎干细胞贴壁后可更换新鲜的HESM培养基。每天更换一次培养基，通常5-7天传代一次。若出现以下情况之一时则需及时进行传代：(1)胚胎干细胞克隆过于致密或面积过大；(2)胚胎干细胞出现明显的自发分化。

二、检测人胚胎干细胞的未分化状态的维持情况

为进一步检测用本发明培养方法及专用培养基培养的人胚胎干细胞是否真的像形态上所表现出来的一样保持了细胞的未分化状态，使用细胞免疫荧光染色的方法进一步检测9代的H1细胞干性基因Oct4和Tra-1-81基因的表达情况，具体方法包括以下步骤：

1)取出细胞，弃培养基，用PBS洗两遍；

2)加入4％的多聚甲醛室温固定15分钟，或加入无水甲醇室温固定5-10分钟；

3)用PBS洗三遍，每遍5分钟；

4)用PBST(含0.2％Triton X100(体积百分比)的PBS溶液)溶液进行透化，室温放置10分钟；

5)用PBS洗一遍，5分钟；

6)加入含2-3％山羊血清或马血清的PBST，室温封闭30-60分钟；

7)弃封闭液，加入一抗(兔抗-Oct4、鼠抗-Tra-1-81，美国Chemicon公司)(按1:50-200用封闭液(含2-3％山羊血清或马血清的PBST)稀释)，4℃放置12-24小时(或37℃孵育2小时)；

8)用PBS洗三遍，每遍5分钟；

9)加入二抗(罗丹明标记山羊抗-兔IgG、罗丹明标记兔抗-鼠IgG，中国中山生物技术有限公司)(按1:50-150比例稀释于二抗稀释液(称取0.1g牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)，溶于100mL的PBS中，即为0.1％的BSA溶液))中，37℃避光放置1小时；

10)用PBS洗三遍，每遍5分钟；

11)加入终浓度为1mg/mL的DAPI溶液(美国Roche公司)，室温放置5分钟；

12)用PBS洗三遍，每遍5分钟；

13)加入500ul PBS(或PBS：甘油(1:1))，在荧光显微镜下观察拍照。

结果如图2中的图E所示(Oct4(上)，Tra-1-81(下)，放大倍数：×100；左边的图表明抗体阳性细胞克隆，右边的图表明和左边图相应的克隆细胞核染色)，表明在这种专用培养体系中培养的胚胎干细胞到第9代的时候细胞仍然保持着较好的未分化状态。

最后对9代的H1细胞和8代的H9细胞的干性基因Oct4，Nanog和Sox2基因的表达情况进行RT-PCR检测，以实施例1培养在matrigel上用从小鼠成纤维细胞上收来的条件培养基培养的人胚胎干细胞为阳性对照细胞，具体方法包括以下步骤：

1)用Trizol法提取培养细胞的RNA：a.弃培养基，用PBS洗一遍；b.每10cm2培养面积加入1mL Trizol，用枪头反复吹吸，直至液体无拉丝；c.将液体转移至1.5mL无RNA酶的离心管中，室温放置2-3分钟；d.每1mL Trizol加入0.2mL氯仿，烈振荡15秒；e室温放置2分钟；f.4℃、12000g离心15分钟；g.小心地将上清转移到一个新的1.5mL无RNA酶的离心管中，约550-600ul，向上清中加入等体积异丙醇，颠倒混匀；h.室温放置10分钟；i.4℃、12000g离心10分钟；j.弃上清，往沉淀中加入1mL 70％乙醇，颠倒悬起沉淀；k.4℃、7500g离心5分钟；l.弃尽上清，稍离心使残余液体聚至管底；m.用枪头小心吸出残余液体，室温放置，晾干沉淀；n.加入适量体积的DEPC水重溶沉淀；o.取1μl RNA液用DEPC水稀释10倍并测量OD₂₆₀值，计算浓度；其余RNA保存于—20℃冰箱中；

2)RNA的反转录：使用Promega公司的反转录试剂盒并按说明书进行操作反转录合成其cDNA；

3)多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)：以步骤2)获得的cDNA为模板，在上、下游引物的引导下进行PCR检测，25ul反应体系为：10×Ex Taq酶缓冲液2.5ul，4种dNTP混合物(每种浓度为1.25mM)2ul，上、下游引物(引物序列见表4)(20pmol/ul)各0.5ul，cDNA 1-3ul，Ex Taq 0.25ul，无菌双蒸水补充反应体系至25ul。PCR反应条件为：先94℃ 5min；然后94℃ 40sec，53-62℃ 40sec，72℃ 30-60sec，共35个循环；最后72℃ 10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果见图2中的图F(看家基因GAPDH基因作为实验的阳性对照)，表明9代的H1细胞和8代的H9细胞中的干性基因Oct4，Nanog和Sox2基因均获得表达。

上述检测结果表明用本发明方法及其专用培养体系进行培养，人胚胎干细胞可以长时间的培养并保持其未分化的特征，然而N2B27曾经被报道过用来诱导人胚胎干细胞向神经方向分化，因而还用RT-PCR的方法检测了所培养的人胚胎干细胞是否会表达一些早期的神经基因，如Sox1(GenBank号：Y13436)和Pax6(GenBank号：NM_001604)，以步骤二培养在matrigel上用从小鼠成纤维细胞上收来的条件培养基培养的人胚胎干细胞为阳性对照细胞，结果表明阳性对照和用本发明方法及其专用培养体系培养的人胚胎干细胞均不表达这些神经基因，但是如果用RA诱导其向神经方向分化，则可以表达神经基因。

表4 RT-PCR检测9代H1细胞和8代H9细胞的干性基因Oct4，Nanog和Sox2基因的引物序列

三、检测人胚胎干细胞的凋亡率及长期培养细胞的核型

很多报道指出，不合适的培养条件会使培养在其中的细胞凋亡率上升，从而使其增殖减慢。使用terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nickend-labeling(TUNEL)staining试剂盒(购自美国Sigma公司)分析了用本发明方法及其专用培养体系培养的8代H1细胞的凋亡率，以实施例1培养在matrigel上用从小鼠成纤维细胞上收来的条件培养基培养的人胚胎干细胞为对照，结果见图3中的图A(相同克隆的细胞核照片显示在左边。(放大倍数：×200))，与对照相比，用本发明方法及其专用培养体系培养的8代H1细胞表现出很低的阳性率。对用相同条件培养的的8代的H9细胞用Annexin V-fluorescein isothiocyanate(FITC)staining试剂盒(购自北京宝赛生物技术有限公司)进行检测，结果见图3中的图B(H9细胞表示在右边，阳性对照表示在左边)，用本发明方法及其专用培养体系培养的8代的H9细胞表现出很低的凋亡率(11.77％)。上述检测结果表明本发明的培养方法及其专用培养体系更适合人胚胎干细胞的培养，所培养的胚胎干细胞表现出了很低的凋亡率。同时检测了经过长期培养(10代)之后的胚胎干细胞的核型，结果见图3中的图C，10代的H1细胞仍具有正常的核型，表明用本发明的培养方法及其专用培养基可对胚胎干细胞进行长期传代培养。

四、人胚胎干细胞的全能性检测

为了进一步评价用本发明的培养方法及其专用培养体系培养的人胚胎干细胞的性质，现检测所培养人胚胎干细胞的全能性，首先对9代的H1细胞和9代的H9细胞进行体外诱导胚胎小体(EB)的形成及分化，具体方法包括以下步骤：

1)取出要诱导分化的人胚胎干细胞，弃培养基，用PBS洗一遍；

2)加入Dispase，置于37℃培养箱中消化，消化时间应比传代时有所延长，令胚胎干细胞克隆容易脱落；

3)取出细胞，用无菌玻璃滴管轻轻吹打，使所有克隆脱离培养皿底；

4)将细胞团转移至无菌15mL锥底离心管中，1000rpm离心3分钟；

5)弃上清，用分化培养基(胎牛血清150mL，谷氨酰胺0.146g，β-巯基乙醇50μl，非必需氨基酸10mL，用DMEM/F12定容至1000mL)轻轻重悬；

6)将细胞团接种于低贴附能力的培养皿中(如Petri-dish，因为EB在悬浮培养条件下容易形成)，放回37℃培养箱中；

7)每隔一天更换一次培养基，一般在4-5天后就能看到典型的近似圆球样的EB，培养时间根据需要而定，时间越长，EB中的细胞分化程度越高。

胚胎小体的观测结果见图4中的图A(放大倍数：×100)，结果9代的H1细胞和9代的H9细胞在分化培养基中均可以形成胚胎小体(EB)。EB形成7天以后，再使其贴壁继续分化7天，方法为：收集培养了分化一定天数后的EB，将其接种于经过fibronectin(5ng/μl)包被的培养皿中促进EB的贴壁，仍然使用分化培养基，每隔一天更换一次，能够逐渐观察到从EB周围生长出不同形态的分化细胞类型。然后用免疫荧光检测其三个胚层(外胚层，中胚层和内胚层)的基因GFAP，Actin和cytokeratin(CK)19基因，结果见图4中的图C(放大倍数：×200)，在分化的细胞中可以检测到表达glial fibrillary acidic protein(GFAP)的细胞(外胚层)；表达muscle actin的细胞(中胚层)；表达cytokeratin(CK)19的细胞(内胚层)。同时用半定量RT-PCR的方法检测了分化7天的细胞其各个胚层基因的表达情况，以进一步证实上述实验结果，具体方法为：以细胞总RNA经反转录获得的cDNA为模板，在上、下游引物(引物序列见表5)的引导下进行PCR扩增，结果见图4中的图B，用本发明培养体系培养的人胚胎H1和H9细胞与阳性对照具有相似的表达谱，其中检测的外胚层基因有NFH，Pax6；中胚层基因有cardiac actin，Thy1；内胚层基因有AFP；滋养外胚层基因有human chorionic gonadotrophin-α(hCG-α)。上述检测结果表明用本发明的培养方法及其专用培养体系长期培养的人胚胎干细胞仍然保持了其分化的全能性。

表5 用半定量RT-PCR方法检测分化7天的人胚胎干细胞其各个胚层基因的表达情况的引物序列

Claims (2)

1、用于培养胚胎干细胞的培养基，其配方为：N2 5-30mL，B27 10-60mL，谷氨酰胺0.0146-0.73g，β-巯基乙醇5-10μl，非必需氨基酸中的一种或几种共计:3-30mL，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.2-0.8g；用DMEM/F12定容至1000mL，pH7.2-7.8。

2、根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基的配方为：N2 10mL，B27 20mL，谷氨酰胺0.146g，β-巯基乙醇7μl，碱性成纤维细胞生长因子20-200mg，小牛血清白蛋白0.5g，非必需氨基酸为丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丝氨酸中的一种或几种，共计10mL；用DMEM/F12定容至1000mL，pH7.2。

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