CN105842451A - 基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法 - Google Patents

基于量子点荧光免疫检测dnmt1的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，包括以Fe3O4纳米颗粒为固相载体，制备出表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的免疫磁性颗粒，将DNMT1标准品或待测样品采用所述免疫磁性颗粒捕获并富集分离，然后向分离后所得的产物中加入被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，使抗体与待测抗原结合，采用多功能微孔板读数仪以270 nm激发下进行荧光检测，根据荧光强度与DNMT1标准品或待测样品浓度的关系建立回归方程。该方法步骤简单且由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。

Description

基于量子点荧光免疫检测 DNMT1 的方法
技术领域
本发明涉及检测技术领域，具体的说，涉及了一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。
背景技术
在检测领域中，常常需要对各类抗原或抗体进行定性或定量检测。现有技术中，已经以“双抗夹心”为基础衍生出多种免疫反应分析方法，如：放射免疫法、酶联免疫法、化学发光法、时间分辨荧光法和荧光免疫法等，可用于确定病原微生物，对人体的特异性蛋白定量检测从而对疾病进行辅助诊断或监测等等，用途非常广泛。这类免疫反应分析方法的通常作法是：将捕获抗体固定于固相载体，然后与抗原(目标蛋白)反应，洗涤后再与标记抗体反应，洗涤，加入底物检测光信号或直接检测荧光信号。虽然上述方法的自动化免去了人工洗涤的烦琐，但存在固相载体的分离效率较低、检测精度不高等缺点。
为了解决以上存在的问题，人们一直在寻求一种理想的技术解决方案。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，从而提供一种以纳米固相颗粒为载体，具有分离效率高、检测精度高且具有高度特异性的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：
提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为Fe3O4@McAb；
提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记作为QDs@PcAb；
将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；
然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；
根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。
需要说明的是，上述各步骤中，CB代表碳酸盐缓冲液、PBS代表磷酸盐缓冲溶液、PBST代表添加Tween-20非离子表面活性剂的磷酸盐缓冲溶液。
基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤。
基于上述，提供一种所述Fe3O4@McAb的步骤包括：
（1）清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min～5 min，然后进行磁分离弃上清得到第一沉淀物。其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液；
（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，磁分离、弃上清处理后采用MES缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物。其中，EDC代表(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺溶液、MES代表吗啉乙磺酸缓冲液、mg/mL代表毫克每毫升；
（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；
（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5h～2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；
（5）封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5h～1h，磁分离、弃上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3～4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb；其中BSA封闭液代表牛血清白蛋白封闭液；
（6）保存：在偶联产物Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用。
基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法中，采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤包括：
（1）将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的Fe3O4@McAb加入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；其中mmol/L代表毫摩尔每升；
（2）采用PBS缓冲液配制浓度为300 ng/mL～400 ng/mL的DNMT1标准品，并将其加入上述酶标板中，恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；其中ng/mL代表纳克每毫升；
（3）采用封闭液将DNMT1多克隆抗体稀释400～500倍，然后将其以每孔100 微升加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（4）用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000～5000倍，以每孔100 微升将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（5）将TMB显色剂A液和B液等体积混合，将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃避光温育反应15 min～20 min；显色反应后，向所述酶标板中加入H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测各孔的吸光度OD，其中，检测波长为450 nm。
基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤。
基于上述，基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供一种所述QDs@PcAb的步骤包括：
将pH为7.0～7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升～1 微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗体，每次加入上述物质后均需振荡混匀；其中、mg/mL代表毫克每毫升；
然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下涡旋反应1.5h～2h，反应结束后向所述PE管中加入含0.5%质量百分数BSA封闭液的PBS缓冲液，在18℃～25℃下涡旋反应20 min～30 min；
所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4℃保存，从而制得所述QDs@PcAb。
基于上述，所述基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法中，采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤包括：将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的QDs@PcAb加入到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min～90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功微孔板读数仪上测荧光强度。
基于上述，所述的一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，还包括将上述各步骤中各参数的优化的步骤，然后根据优化参数建立检测DNMT1的回归方程，其中，在DNMT1标准品浓度为5.0 ng/mL～1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Y=0.00775X+20.77161，其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMT1标准品浓度，相关系数r为0.9873；在DNMT1标准品浓度为0.1 ng/mL～5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.02779X+1.29858，其中Y代表lgRFU，X代表lgDNMT1，相关系数r为0.9877。
基于上述，所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，对DNMT1浓度的最低检测限为0.1 ng/mL。
本发明相对现有技术具有突出的实质性特点和显著的进步，具体的说，本发明将Fe3O4纳米颗粒的快速分离技术、免疫反应的高度特异性和量子点的高荧光强度有机结合起来，根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程，从而利用该方法计算样品中DNMT1的含量，方法步骤简单且由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。
附图说明
图1是本发明的Fe3O4@McAb的生物活性检测结果图。
图2是本发明QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性检测结果图。
图3是本发明不同稀释倍数的Fe3O4@McAb捕获抗原时与反应体系荧光强度关系图。
图4是本发明QDs@PcAb复合物浓度与反应体系荧光强度关系图。
图5是本发明免疫缓冲液种类与反应体系荧光强度关系图。
图6是本发明固相抗体捕获抗原作用时间与反应体系荧光强度关系图。
图7是本发明QDs@PcAb与抗原的作用时间对反应体系荧光强度关系图。
图8是本发明建立的低浓度DNMT1检测标准曲线示意图。
图9是本发明建立的高浓度DNMT1检测标准曲线示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。
本发明中所用的试剂种类如下：DNMT1抗原（OriGene），DNMT1单克隆抗体（北京博奥龙免疫技术有限公司），DNMT1多克隆抗体（ABclonal），Fe3O4纳米颗粒（自制），CdSe/ZnS量子点（武汉珈源量子点公司），人DNA甲基化转移酶3a ELISA试剂盒、人DNA甲基化转移酶3b ELISA试剂盒（上海康朗生物科技有限公司），HRP标记的山羊抗兔IgG，牛血清白蛋白（BSA，北京索莱宝科技有限公司），其他试剂均为分析纯，实验用水Milli-Q超纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm）。
本发明中所用的仪器如下：多功能微孔板读数仪（SpectraMax M2e，美国），电热恒温培养箱（DHG-9080型，上海精宏实验设备有限公司），数控超声波清洗仪（KQ-300DE型，昆山市超声仪器有限公司），可调微量加样器（Eppendorf，德国），XH-C型涡旋混匀仪（金坛市国旺实验仪器厂），低温离心机（Centrifuge 5424 R, Eppendorf）。
本发明提供一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：
提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒悬浮液，记作为Fe3O4@McAb；并采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性；
提供一种的被量子点标记的DNMT1多克隆抗体溶液，记作为QDs@PcAb；并采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性；
所述Fe3O4@McAb经CB缓冲液稀释后加入到黑色96孔板中，并向其中加入经PBS缓冲液稀释的DNMT1抗原进行恒温孕育50 min～60 min；然后向所述黑色96孔板中加入经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb 进行温育反应110 min～130 min，最后向所述黑色96孔板中加入PBST，在多功能微孔板读数仪上测定荧光强度；然后根据优化后的参数得到的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。其中，每次温育反应后均需对所述黑色96孔板进行磁分离和PBST洗板处理。建立检测DNMT1的回归方程，其中，在DNMT1标准品浓度为5.0 ng/mL～1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Y=0.00775X+20.77161，其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMT1标准品浓度，相关系数r为0.9873；在在DNMT1标准品浓度为0.1 ng/mL～5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.02779X+1.29858，其中Y代表lgRFU，X代表lgDNMT1，相关系数r为0.9877。
其中，提供一种所述Fe3O4@McAb的步骤包括：
（1）清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2 min～5 min，然后进行磁分离弃上清得到第一沉淀物，其中MES代表吗啉乙磺酸缓冲液；
（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11mg/mL NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，磁分离、弃上清处理后采用MES缓冲液对其洗涤3次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物，其中，EDC代表(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、NHS代表N-羟基琥珀酰亚胺溶液、MES代表吗啉乙磺酸缓冲液；
（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3次，磁分离得到第三沉淀物；
（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5h～2h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；
（5）封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5h～1h，磁分离、弃上清后采用PBST缓冲液清洗3次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb，其中BSA封闭液代表牛血清白蛋白封闭液；
（6）保存：在偶联产物Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用。
采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性，检测结果如图1所示，图中显示DNMT1空白对照组具有较高的背景值，但低于实验组吸光度，同时可证明在Fe3O4纳米颗粒表面成功修饰了DNMT1单克隆抗体且不影响抗体活性。具体检测步骤包括：
（1）将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的Fe3O4@McAb加入到酶标板中，每孔加入量为100 微升，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板拍干备用；
（2）采用PBS缓冲液配制浓度为300 ng/mL～400 ng/mL的DNMT1标准品，并将其加入上述酶标板中，每孔加入量为100 微升，恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（3）采用封闭液将DNMT1多克隆抗体稀释400～500倍，然后将其以每孔100 微升加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（4）用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000～5000倍，以每孔100 微升将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（5）将TMB显色剂A液和B液等体积混合，以每孔100 微升将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃避光温育反应15～20 min；显色反应后，向所述酶标板中每孔加入50 微升的浓度为2 mol/L H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测各孔的吸光度OD，其中，检测波长为450 nm。
其中，提供一种所述QDs@PcAb的步骤包括：
将pH为7.0～7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升～1 微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗体，每次加入上述物质后均需振荡混匀；
然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下涡旋反应1.5 h～2 h，反应结束后向所述PE管中加入含0.5%质量百分数BSA封闭液的PBS缓冲液，在18℃～25℃下涡旋反应20 min～30 min；
所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4℃保存，从而制得所述QDs@PcAb。
采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性，结果如图2所示，空白对照为DNMT1抗原空白，体系荧光强度随QDs@PcAb稀释比增大而降低，但均高于空白对照，说明QDs@PcAb偶联产物制备成功，且标记量子点后抗体的活性依然存在。具体检测步骤包括：将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的QDs@PcAb加入到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min～90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功能微孔板读数仪上测荧光强度。
由此可见，本发明提供的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法中对最终检测精度影响因素比较多，比如：Fe3O4@McAb稀释比、QDs@PcAb稀释比、免疫反应缓冲液种类、固相抗体捕获抗原作用时间、QDs@PcAb作用时间等。
下面就这些影响因素，对本发明提供的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法作进一步的阐述。
一、 Fe3O4@McAb 稀释比优化
为得到Fe3O4@McAb的最优用量，实验考察了不同稀释倍数的Fe3O4@McAb捕获抗原时对反应体系荧光强度的影响，结果如图3所示，反应体系荧光强度随稀释倍数的增大先增加后迅速降低，在Fe3O4@McAb稀释比为1：50时荧光强度达到最大，其原因是Fe3O4纳米颗粒对量子点的荧光有淬灭作用，当Fe3O4@McAb浓度过高时，Fe3O4纳米颗粒对量子点的荧光淬灭作用增强，此外Fe3O4纳米颗粒自身的黑色对荧光也有掩蔽作用。因此选择Fe3O4@McAb的最优稀释比为1：50。
二、 QDs@PcAb 稀释比优化
QDs@PcAb作为FLISA方法的荧光信号来源，其用量与方法灵敏度和线性范围等密切相关，因此实验考察了QDs@PcAb复合物浓度对反应体系荧光强度的影响，结果如图4所示，随QDs@PcAb复合物浓度的增加，反应体系荧光强度先增加后逐渐趋于稳定，在QDs@PcAb复合物稀释比为1：:30时荧光强度较高，且当继续增加QDs@PcAb复合物浓度时，体系荧光强度增加不明显，因此选择QDs@PcAb复合物的最佳稀释比为1：30。
三、免疫反应缓冲液种类优化
免疫缓冲液对反应体系的荧光强度也有一定的影响，实验选择常用的四种缓冲液浓度为0.01 mol/L、pH 7.4的PBS，浓度为0.01 mol/L、pH 7.4的PBST，浓度为0.01 mol/L、pH 7的BS，浓度为0.05 mol/L、pH 9.6的BC进行考察，结果如图5所示，体系荧光强度从大到小对应的缓冲液分别为PBST、PBS、BS和CB，原因是CB缓冲液pH较高，对量子点的稳定性可能造成一定的影响，PBST与PBS相比添加了表面活性剂Tween-20，其能够提高溶液中量子点的分散性，减少因量子点团聚而造成的荧光淬灭。因此选择最佳的免疫反应缓冲液为PBST。
四、固相抗体捕获抗原作用时间优化
实验对固相抗体捕获样品中待测抗原的作用时间进行考察，结果如图6所示，固相抗体与抗原作用时间为60 min时反应已达到平衡，体系荧光强度最高，因此选择最佳抗原作用时间为60 min。
五、 QDs@PcAb 作用时间优化
实验对量子点标记抗体QDs@PcAb与抗原的作用时间进行考察，结果见如7所示，随时间增加，体系荧光强度逐渐增大，120 min达到最大后下降，因此选择QDs@PcAb的作用时间为120 min。
六、标准曲线的建立
用PBS将DNMT1标准品配制成浓度范围为0.001 ng/mL ～1500 ng/mL的试样，按照优化后的最优实验条件进行检测，每个浓度平行测定3次，将样品孔荧光值记为RFU。实验中发现对于不同DNMT1浓度范围，荧光值与DNMT1浓度的关系不同，因此，采用分段的方法绘制标准曲线。
在DNMT1浓度为5.0 ng/mL～1500 ng/mL范围内，以DNMT1标准品浓度（CDNMT1）为横坐标，荧光值RFU为纵坐标绘制标准曲线如图8所示，在5.0～1500 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.00775X+20.77161（Y为RFU，X为CDNMT1），相关系数r为0.9873。
在DNMT1浓度为0.1 ng/mL ～5.0 ng/mL范围内，对DNMT1浓度以及相应的荧光值RFU取对数，以DNMT1标准品浓度的对数（lgC）为横坐标，荧光值RFU的对数（lgRFU）为纵坐标绘制标准曲线如图9所示，在0.1 ng/mL ～5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.02779X+1.29858（Y为lgRFU，X为lgCDNMT1），相关系数r为0.9877。
七、该方法检测条件的确立：
7.1检测限
取浓度分别为0.001 ng/mL、0.005 ng/mL、0.01 ng/mL、0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、5.0 ng/mL的8个低浓度区的DNMT1试样按照上述检测方法进行检测，结果见表7.1，同时检测6个DNMT1抗原空白的样品，X为16.131，SD为0.996，求出X+3SD的值为19.119，RFU(0.5)>19.119，因此该方法的检测限为0.1 ng/mL。
表7.1 低浓度DNMT1试样检测结果
7.2精密度
板内和板间精密度的测定结果见表7.2，对于高、中、低三个浓度的样品，板内精密度相对标准偏差（RSD）的范围为5.45%～11.29%，板间精密度RSD的范围为7.03%～11.25%因此该方法的检测限为0.1ng/mL板内加标回收率的范围为91.67%～106.50%，板间加标回收率的范围为92.18%～108.50%。
表7.2 板内和板间精密度（n=3）
7.3准确度
板内和板间的回收率的测定结果见表7.3，对于高、中、低三个浓度的标准品，板内加标回收率的范围为91.67%～106.50%，板间加标回收率的范围为92.18%～108.50%。
表7.3 板内和板间回收率
7.4特异性
由于FLISA将用于血清中DNMT1检测，血清成分复杂，要求FLISA对DNMT1具有较高的特异性，因此采用血清中与DNMT1结构相似的DNMT3a和DNMT3b对方法的特异性进行考察，将测得的样品荧光强度带入标准曲线Y=0.02779X+1.29858（Y为lgRFU，X为lgCDNMT1），计算得到相当于DNMT1的量，结果见表7.4，从表中可以看出DNMT3a和DNMT3b对FLISA的交叉反应率分别为4.0%和9.4%，交叉反应率低，表明FLISA法用于检测DNMT1特异性好。
表7.4 FLISA测定DNMT1的特异性
(8) 、该方法检测结果验证试验：
将实验中建立的FLISA回归曲线方程应用于血清样品中DNMT1含量的检测，并将检测结果与实验室建立的ELISA和MELISA进行比较，同时以商品ELISA试剂盒的检测结果对三种方法进行评价。此外，在血清样品中加入一定浓度的DNMT1标准品，用所建立的方法进行测定，计算加标回收率。
8.1血清样本收集与处理
血清样本均取自郑州大学第一附属医院呼吸与重症科室。所有血清样本均在患者晨起空腹状态下采集，抽取静脉血3mL，置于非抗凝管内，37℃水浴30min，3000r/min离心5min，分离血清存于干燥冻存管中密封，置于-80℃冰箱备用。弃去有溶血现象的血清样本。
8.2血清中DNMT1含量检测
取30例血清样品，用FLISA、ELISA和MELISA法检测血清中DNMT1含量，并与商品ELISA试剂盒检测结果进行对比。
8.3血清样品加标回收率和精密度
分别在血清样品中加入高、中、低（1000 ng/mL、500 ng/mL、50 ng/mL）三个浓度的DNMT1标准品，测定加标样品的荧光强度或吸光度，同时检测未加标血清的荧光强度或吸光度，每个样品平行测定3次，根据公式4.1计算加标回收率，同时计算相应的相对标准偏差。
表8.1 FLISA对血清中DNMT1含量的检测结果
用SPSS 21.0对以上检测结果进行统计分析，FLISA、ELISA以及商品ELISA试剂盒的检测结果均符合正态分布，分别将FLISA和商品ELISA试剂盒的检测结果、ELISA和商品ELISA试剂盒的检测结果进行配对样本t检验，结果前者t=1.913、P=0.233，后者t=0.256、P=0.927，两组数据P值均大于0.05，说明实验中建立的FLISA、ELISA方法与商品ELISA试剂盒对血清中DNMT1含量检测结果的差异无统计学意义。
因此，由该方法建立的回归方程对DNMT1检测的线性范围宽、检测限低、精密度、准确度高且具有良好的特异性。
最后应当说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制；尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解：依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者对部分技术特征进行等同替换；而不脱离本发明技术方案的精神，其均应涵盖在本发明请求保护的技术方案范围当中。

Claims (9)

1.一种基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，具体步骤包括：
提供一种表面被DNMT1单克隆抗体共价修饰的Fe3O4纳米免疫磁性颗粒，记为Fe3O4@McAb；
提供一种表面被量子点标记的DNMT1多克隆抗体，记为QDs@PcAb；
将经CB缓冲液稀释后的所述Fe3O4@McAb与经PBS缓冲液稀释后的DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应50 min～60 min，使得所述DNMT1标准样或待测目标物被Fe3O4@McAb捕获、富集分离；
然后将经PBST缓冲液稀释后的所述QDs@PcAb与被Fe3O4@McAb捕获、富集分离的所述DNMT1标准样或待测目标物进行温育反应110 min～130 min，使得所述QDs@PcAb与所述DNMT1标准样或待测目标物相结合；经PBST缓冲液稀释后，在多功能微孔板读数仪上测定270 nm激发下反应产物的荧光强度；
根据检测的荧光强度与所述DNMT1标准样或待测目标物浓度之间的关系，分段建立检测DNMT1的回归方程。
2.根据权利要求1所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，它还包括采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供一种所述Fe3O4@McAb的步骤包括：
（1）清洗：将Fe3O4纳米颗粒悬浮液经超声、磁分离弃上清处理后，采用浓度为0.01 mol/L～0.015 mol/L、pH为6.0的MES缓冲液对其平衡2min～5 min，然后进行磁分离、弃上清处理得到第一沉淀物；
（2）活化：向所述第一沉淀物中依次加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液和浓度为8 mg/mL～11 mg/mL的NHS溶液进行涡旋反应10 min～15 min，经磁分离、弃上清处理后，采用MES缓冲液对其洗涤3～4次，然后再进行磁分离、弃上清处理得到第二沉淀物；
（3）缓冲体系转换：采用PBS缓冲液对所述第二沉淀物洗涤3～4次次，磁分离得到第三沉淀物；
（4）偶联：向所述第三沉淀物中加入DNMT1单克隆抗体和PBS缓冲液进行涡旋反应1.5 h～2 h，经磁分离、弃上清处理后采用PBS缓冲液对其清洗2次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物；
（5）封闭：向所述第四沉淀物中加入BSA封闭液，进行涡旋反应0.5 h～1 h，磁分离、弃上清处理后，采用PBST缓冲液清洗3～4次，磁分离、弃上清得到第四沉淀物即Fe3O4@McAb；
(6)保存：在Fe3O4@McAb中加入PBS缓冲液，轻晃摇匀，4℃保存备用。
4.根据权利要求3所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，采用ELISA法检测提供的所述Fe3O4@McAb的生物活性的步骤包括：
（1）将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的Fe3O4@McAb加入到酶标板中，磁分离，采用PBST缓冲液清洗所述酶标板拍干备用；
（2）采用PBS缓冲液配制浓度为300 ng/mL～400 ng/mL的DNMT1标准品，并将其加入上述酶标板中，恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（3）采用封闭液将DNMT1多克隆抗体稀释400～500倍，然后将其以每孔100微升加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（4）用封闭液将HRP标记的山羊抗兔IgG稀释4000～5000倍，以每孔100 微升将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃恒温箱中温育80 min～90 min，然后进行磁分离处理并采用PBST缓冲液清洗所述酶标板；
（5）将TMB显色剂A液和B液等体积混合，将其加入到所述酶标板中，35℃～37℃避光温育反应15～20min；显色反应后，向所述酶标板中加入H2SO4终止液，并立即在酶标仪上检测各孔的吸光度OD，其中，检测波长为450 nm。
5.根据权利要求4所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，它还包括采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤。
6.根据权利要求5所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，提供一种所述QDs@PcAb的步骤包括：
将pH为7.0～7.4的硼酸盐缓冲液加入到PE管中，并依次向所述PE管中加入浓度为0.5 微摩尔每升～1 微摩尔每升的QDs和浓度为0.5 mg/mL～1 mg/mL的DNMT1多克隆抗体，每次加入上述物质后均需振荡混匀；
然后向所述PE管中加入浓度为8 mg/mL～10 mg/mL的EDC溶液，在18℃～25℃下涡旋反应1.5 h～2 h，反应结束后向所述PE管中加入含质量百分数为0.5%～1.0%的BSA封闭液的PBS缓冲液，在18℃～25℃下涡旋反应20 min～30 min；
所得反应产物经离心、超滤除去EDC后溶于BS缓冲液中，4℃保存，从而制得所述QDs@PcAb。
7.根据权利要求6所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，采用夹心法检测提供的所述QDs@PcAb的荧光强度及抗体活性的步骤包括：
将经浓度为45 mmol/L～50 mmol/L、pH为9.0～9.6的CB缓冲液稀释的QDs@PcAb加入到黑色96孔酶标板中，恒温温育80 min～90 min，然后进行磁分离并采用PBST缓冲液清洗所述黑色96孔酶标板，然后加入PBST在多功微孔板读数仪上测荧光强度。
8.根据权利要求7所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，它还包括将上述各步骤中各参数的优化的步骤，然后根据优化参数建立检测DNMT1的回归方程，其中，在DNMT1标准品浓度为5.0 ng/mL～1500 ng/mL范围内，所建立的回归方程为Y=0.00775X+20.77161，其中，Y代表荧光值RFU，X为DNMT1标准品浓度，相关系数r为0.9873；在DNMT1标准品浓度为0.1 ng/mL～5.0 ng/mL范围内，本方法检测DNMT1的回归方程为Y=0.02779X+1.29858，其中Y代表lgRFU，X代表lgDNMT1，相关系数r为0.9877。
9.根据权利要求8所述的基于量子点荧光免疫检测DNMT1的方法，其特征在于，该方法对DNMT1浓度的最低检测限为0.1 ng/mL。
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