CN111537483B - 检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法，属于有害物质检测技术领域。本发明检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器，由5’端被荧光基团标记的可特异性识别冈田酸的核酸适配体和氧化石墨烯自组装形成。使用本发明的荧光核酸适配体传感器检测冈田酸的操作步骤简单明了，成本低，特异性好，检测范围在0.5‑200ng/mL之间，灵敏度高。

Description

检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该 传感器检测冈田酸的方法
技术领域
本发明属于有害物质检测技术领域，具体涉及一种检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法。
背景技术
冈田酸是贝类中的一种低分子量的腹泻性贝类毒素，可引发误食者恶心、呕吐、腹泻；对细胞质内蛋白磷酸酶的活性有强烈的抑制作用，影响正常的细胞活动；甚至对人类细胞具有直接的毒害作用，干扰DNA的修复过程，改变基因的表达，诱导肿瘤形成。冈田酸具有脂溶性和热稳定性，在加工过程中很难通过常见的加工技术将其去除，甚至可能因贝类脱水及酯化态毒素向游离态的转化，从而导致毒素的毒性增强。因此有必要检测快速灵敏的冈田酸检测方法。
目前，测定冈田酸的方法有小鼠生物法、免疫测定法和高效液相色谱法。小鼠生物法检测贝类组织中腹泻性贝类毒素最普遍、常用的方法，该方法的优点是技术容易掌握,不需要使用专门仪器。其主要缺陷是操作繁琐,缺乏特异性。免疫学检测方法简单、快速、成本低且可进行大规模筛选，然而该类方法均建立在抗原和抗体特异性结合的基础之上，冈田酸全抗原及抗体均为蛋白质分子，在高温、强酸、强碱等极端检测环境下极易失活变性。色谱法目前应用最广，但耗时较长且需要进行样品前处理，其步骤繁琐，难以大规模使用及满足现场检测要求。
核酸适配体(aptamer)是一类新型的识别分子，其分子量较低(15-50碱基)，没有免疫原性和毒性，它是指经体外筛选技术SELEX(指数富集配体***进化)筛选出的能特异结合蛋白质或者其他小分子物质的寡核苷酸片段。它与抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。由于它的易合成、易储存和易修饰等优点，在诊断治疗、药物分子设计及分析检测中具有广泛的应用前景。
发明内容
针对现有技术中检测试剂易失活、检测样品需要前处理、步骤繁琐、灵敏度低、仪器设备要求高、难以大规模使用及满足现场检测要求的问题，本发明的目的在于提供一种以氧化石墨烯为荧光猝灭剂的荧光适配体传感器，以及使用该传感器对冈田酸进行检测的方法。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种检测冈田酸的荧光适配体传感器，所述传感器由5’端被荧光基团标记的可识别冈田酸的核酸适配体和氧化石墨烯自组装形成；
其中，
冈田酸的核酸适配体为Aptamer，所述Aptamer的序列如下：
5′-ATTTGACCATGTCGAGGGAGACGCGCAGTCGCTACCACCT-3′(SEQ ID NO.1)；
所述氧化石墨烯用作荧光猝灭剂。
所述的荧光基团为FAM、Cy3、Cy5、Alexa Fluor 430或Alexa Fluor 488中的一种。
在上述方案的基础上，所述检测冈田酸的荧光适配体传感器的制备方法，步骤如下：
浓度为1μM的冈田酸适配体在95℃下加热5min冷却至室温，将20μL冈田酸适配体加入到20μL的浓度为5～25μg/mL的氧化石墨烯中，震荡摇匀在室温下孵育10min，以使冈田酸适配体与氧化石墨烯充分结合，形成冈田酸适配体-氧化石墨烯复合物即为检测冈田酸的荧光适配体传感器。
在上述方案的基础上，所述氧化石墨烯的浓度为20μg/mL。
在上述方案的基础上，使用上述方法制备的荧光适配体传感器检测冈田酸的方法，步骤如下：
将上述方法制备的溶液与10μL待测样品震荡充分混合，稀释至1mL，于室温下孵育1h，以使传感器与待测样品充分混合，用荧光分光光度计扫描反应后的溶液在490nm激发波长下的荧光发射光谱，测定荧光强度，将测得的荧光强度导入标准曲线，计算获得待测样品中冈田酸的浓度。
本发明技术方案的优点：
本发明方法具有操作简便，无需对待测样本进行复杂的前处理，检测成本低；
本发明可用于食品中冈田酸检测，实现对冈田酸的定性和定量分析。
附图说明
图1是本发明方法的检测原理示意图；
图2是不同浓度冈田酸的检测结果；
图3是不同海洋毒素的检测结果图。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例
本发明利用的核酸适配体特异性作用于冈田酸。
本发明的检测原理如附图1所示，冈田酸适配体自身具有很强的荧光，当其与氧化石墨烯混合后，冈田酸适配体被氧化石墨烯吸附，由于荧光共振能量转移作用，冈田酸适配体的荧光被氧化石墨烯猝灭，形成一个低背景信号环境。当加入冈田酸孵育后，出现了显著的荧光恢复，冈田酸适配体从氧化石墨烯表面解吸下来与冈田酸形成复合物，通过检测荧光强度用于对冈田酸进行定性定量分析。
1.冈田酸适配体与氧化石墨烯自组装形成荧光适配体传感器
1)浓度为1μM的冈田酸适配体在95℃下加热5min冷却至室温；
2)500μg/mL的氧化石墨烯的悬浮液用超纯水稀释至250μg/mL的浓度，于200W下超声1h，放置于4℃备用；
3)将20μL冈田酸适配体分别加入到20μL的浓度为20μg/mL的氧化石墨烯中，震荡摇匀在室温下孵育10min，以使冈田酸适配体与氧化石墨烯充分结合；
所述冈田酸适配体Aptamer的序列为：5′-FAM-ATT TGA CCA TGT CGA GGG AGACGC GCA GTC GCT ACC ACC T-3′(SEQ ID NO.1)。
2.样品检测
1)样品预处理：将贝类样本洗净沥水后用匀浆器研磨，准确称取2g样本，用18mL甲醇分两次进行毒素提取，准确移取1mL提取液，加入125μL 2.5mol/L NaOH混匀后密封，于76℃下孵育40min。待溶液冷却至室温，加入125μL 2.5mol/L HCl溶液中和，氮吹近干，再加入1mL PBS缓冲溶液复溶，涡旋混匀，待测。
2)将1中制备的荧光适配体传感器溶液与10μL待测样品震荡充分混合，稀释至1mL，于室温下孵育1h，以使传感器与待测样品充分混合。
荧光适配体传感器的灵敏性和特异性
灵敏度如图2所示，该荧光适配体传感器的检测范围在0.5-200ng/mL之间，检测下限达到0.1ng/mL。
采用大田软海绵酸、河豚毒素和石房蛤毒素三种干扰的海洋毒素和冈田酸一起来验证该荧光适配体传感器的特异性，各毒素的浓度均为100ng/mL。特异性结果如图3所示：由荧光恢复值可以看出冈田酸的数值明显高于其他海洋毒素，因此，该适配体传感器对冈田酸具有很高的特异性。
氧化石墨烯浓度的对检测平台背景的影响
将20μL 1μM的冈田酸适配体分别加入到20μL的浓度分别为0，5，10，15，20，25μg/mL的氧化石墨烯中，震荡摇匀在室温下孵育10min，以使冈田酸适配体与氧化石墨烯充分结合，测定最中的荧光强度。结果显示，随氧化石墨烯浓度的增加，荧光值越来越小，当氧化石墨烯浓度达到25μg/mL时，荧光强度的减弱趋于稳定。因此，氧化石墨烯的最佳浓度为20μg/mL。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 检测冈田酸的荧光核酸适配体传感器、其制备方法与使用该传感器检测冈田酸的方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Okadaic acid aptamer)
<400> 1
atttgaccat gtcgagggag acgcgcagtc gctaccacct 40

Claims (2)

1.使用荧光适配体传感器检测冈田酸的方法，其特征在于，步骤如下：
将检测冈田酸的荧光适配体传感器溶液与10μL待测样品震荡充分混合，稀释至1mL，于室温下孵育1h，以使传感器与待测样品充分混合，用荧光分光光度计扫描反应后的溶液在490nm激发波长下的荧光发射光谱，测定荧光强度，将测得的荧光强度导入标准曲线，计算获得待测样品中冈田酸的浓度；
所述检测冈田酸的荧光适配体传感器是由5’端被荧光基团标记的可识别冈田酸的核酸适配体和氧化石墨烯自组装形成；
其中，
5’端被荧光基团标记的冈田酸的核酸适配体为Aptamer，所述Aptamer的序列如下：
5′-FAM-ATTTGACCATGTCGAGGGAGACGCGCAGTCGCTACCACCT-3′；
所述氧化石墨烯用作荧光猝灭剂。
2.权利要求1所述使用荧光适配体传感器检测冈田酸的方法，其特征在于，所述荧光适配体传感器的制备方法，步骤如下：
浓度为1μM的冈田酸适配体在95℃下加热5min冷却至室温，将20μL冈田酸适配体加入到20μL的浓度为20μg/mL的氧化石墨烯中，震荡摇匀在室温下孵育10min，以使冈田酸适配体与氧化石墨烯充分结合，形成冈田酸适配体-氧化石墨烯复合物即为检测冈田酸的荧光适配体传感器。
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