CN104120165A - 一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒，包括试剂1和试剂2，本发明通过对试剂1和试剂2的进一步的改进，使其能够有效的提高同型半胱氨酸检测试剂盒的稳定性，而对试剂的准确度和分析灵敏度没有影响。因此，本发明提供的稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒有利于在市场中进一步的推广使用。
Description
技术领域
本发明涉及临床体外检测试剂技术领域，特别涉及一种同型半胱氨酸检测试剂盒。
背景技术
同型半胱氨酸(又称高半胱氨酸，homocysteine, Hcy)是蛋氨酸代谢过程中的中间产物。同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。Hcy的测定，对心血管疾病、***、动脉粥样硬化、糖尿病、老年痴呆症等疾病的判定中，有重要的临床意义。
血浆中的同型半胱氨酸约70%与白蛋白结合，为结合型。其余的游离型则主要以二硫同型半胱氨酸和以二硫键结合的同型半胱氨酸-半胱氨酸化合物形式存在，只有少量以还原型同型半胱氨酸存在于血浆中。我们通常所指的是总的同型半胱氨酸浓度。
影响同型半胱氨酸水平最主要的因素莫过于遗传于食物营养缺乏。遗传因素主要包括N5甲基四氢叶酸转甲基酶及胱硫醚-β-合成酶的基因发生突变，引起酶的活性降低，从而导致高同型半胱氨酸血症。现在已经证明N5甲基四氢叶酸转甲基酶的缺陷，在体内叶酸缺乏的情况下，可以引起同型半胱氨酸浓度的明显升高。而根据Mudd等的研究，由遗传缺陷引起的胱硫醚-β-合成酶的活性降低，可导致血浆中同型半胱氨酸的浓度超过正常值的十倍左右。
对近1200名老人的研究表明，体内同型半胱氨酸的水平与饮食有着密切的关系，血浆中维生素B6、B12和叶酸的浓度越低，其同型半胱氨酸的浓度越高。由于动物蛋白中蛋氨酸的含量比植物蛋白约高三倍左右，可以产生较多的同型半胱氨酸，因此可对人体的动脉组织造成损伤。
其它因素包括性别、年龄、肾功能的损害、以及服用影响叶酸和B族维生素的药物，都可影响同型半胱氨酸的水平。尤其是肾功的损害，会严重影响那些含硫氨基酸的排出，因为肾小管内皮细胞的胱硫醚-β-合成酶对同型半胱氨酸的转化作用，被认为血液中的非蛋白结合型同型半胱氨酸很重要的代谢途径。
通常认为成人空腹血浆总Hcy水平正常值为4~12 μmol/L，理想值为<10 μmol/L，高于15 μmol/L则被认为是高同型半胱氨酸败血症；老年人(≥60岁)空腹血浆总Hcy水平正常值为15~20 μmol/L，高于20 μmol/L被认为是高同型半胱氨酸败血症。
目前，实验室常用的Hcy测定方法有色谱法、酶联免疫法及荧光偏振免疫法。色谱法具有特异性强、灵敏度高、重复性好等优点，现在公认其为测定血浆Hcy浓度的首选方法，但因色谱法(HPLC及GC-MS)需要的设备复杂且昂贵，难以适应常规临床化学实验室应用，而酶联免疫测定法可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛欢迎。
酶联免疫法检测同型半胱氨酸的原理是基于小分子捕获技术（SMT）的S-腺苷同型半胱氨酸水解酶。 Hcy被转化为游离型后，通过与共价底物反应，循环放大，同时产生腺苷。腺苷立即水解成氨和次黄嘌呤，氨在谷氨酸脱氢酶的作用下，使NADH转化为NAD，样本中的Hcy浓度与NADH转化速率成正比。
如所示：
。
酶免疫检测法是一种无需预处理样本，技术和设备要求不高，而精密度和特异性更高的分析方法，由于该方法不需要昂贵的设备，可以实现自动化，且可测定大量标本，因此受到临床广泛推广。但是普通的同型半胱氨酸检测试剂中由于存在多种酶，会使该试剂的稳定性受到影响，不利于试剂的长期保存，从而造成浪费的不良后果。
发明内容
针对于常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）存在的问题，本发明提供了一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），该试剂盒与常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）相比，稳定性比常规的检测试剂盒要好，但准确度和分析灵敏度不受影响，有利于提高试剂的稳定性。
本发明是通过以下措施实现的：
一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），包括组分1（R1）和组分2（R2），应用时体积比为R1：R2=240:65。各组分原料含量如下：
组分1（R1）：
S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1-1mM
NADH 0.3-3mM
三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5-5 mM
α－酮戊二酸 5-50mM
叠氮钠（NaN3） 0.1-10g/L
抗坏血酸氧化酶 2-10 KU/L；
组分2（R2）：
Hcy甲基转移酶（HMTase） 1-10KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH) 1-10KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5-25KU/L
腺苷脱氨酶（ADA） 5-50KU/L
牛血清白蛋白（BSA） 20-40g/L
椰油酰胺丙基甜菜碱 2-5g/L 。
本发明的有益效果：
本发明提供的稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），解决了试剂在稀溶液中不稳定这一难题，从而有效地增强了试剂盒的稳定性，却不会对试剂的准确度和分析灵敏度产生影响，有利于该试剂在市场中进一步的推广。
附图说明
图1为实施例1与实施例2检测数据相关性图。
图2为实施例1与实施例3检测数据相关性图。
图3为实施例1与实施例4检测数据相关性图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施例来进一步说明。
实施例1
组分1
S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mM
NADH 0.3mM
三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5 mM
α－酮戊二酸 5mM
组分2（R2）：
Hcy甲基转移酶（HMTase） 1KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH) 1KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5KU/L
腺苷脱氨酶（ADA） 5KU/L
本实施例描述的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），在使用时，其测定方法是采用具有双试剂功能的自动生化分析仪，如东芝120自动分析仪，操作如下表：
计算：同型半胱氨酸浓度＝（测定/min÷标准/min）×C标准。
实施例2
组分1
S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 1mM
NADH 3mM
三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 5 mM
α－酮戊二酸 50mM
叠氮钠（NaN3） 10g/L
抗坏血酸氧化酶 10 KU/L
组分2（R2）：
Hcy甲基转移酶（HMTase） 10KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH) 10KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 25KU/L
腺苷脱氨酶（ADA） 50KU/L
牛血清白蛋白（BSA） 40g/L
椰油酰胺丙基甜菜碱 5g/L 。
具体测定方法同实施例1。
实施例
组分1（R1）：
S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.5mM
NADH 2mM
三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 3 mM
α－酮戊二酸 25mM
叠氮钠（NaN3） 5g/L
抗坏血酸氧化酶 5 KU/L；
组分2（R2）：
Hcy甲基转移酶（HMTase） 5KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH) 5KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 15KU/L
腺苷脱氨酶（ADA） 25KU/L
牛血清白蛋白（BSA） 30g/L
椰油酰胺丙基甜菜碱 3g/L 。
具体测定方法同实施例1。
实施例4
组分1
S-腺苷甲硫氨酸（SAM） 0.1mM
NADH 0.3mM
三（2羧乙基）膦氯化氢（TCEP） 0.5 mM
α－酮戊二酸 5mM
叠氮钠（NaN3） 7g/L
抗坏血酸氧化酶 8 KU/L ；
组分2（R2）：
Hcy甲基转移酶（HMTase） 1KU/L
谷氨酸脱氢酶(GLDH) 1KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase） 2.5KU/L
腺苷脱氨酶（ADA） 5KU/L
牛血清白蛋白（BSA） 25g/L
椰油酰胺丙基甜菜碱 4g/L 。
具体测定方法同实施例1。
准确度验证实验：
应用实施例2、3、4的试剂盒与实施例1试剂盒进行对比，对40个样本进行检测，检测的结果如图1-图3。
通过检测数据可知，实施例2、3、4检测试剂盒与实施例1检测试剂盒的检测结果相关性分别为0.9986、0.9986、0.9987，均大于要求的0.990，相关性比较好，表明本发明的试剂盒与常规的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）有高度一致性，证明其准确性不受影响。
线性相关性验证实验
找到同型半胱氨酸高值样本为46.25μmol/L，用生理盐水进行系列稀释，配制6个不同浓度的样本，依次为37.00μmol/L、27.75μmol/L、18.50μmol/L、9.25μmol/L、0μmol/L浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定三次，分别取其平均值。分别利用实施例1、2、3、4的试剂进行检测。检测结果如表所示：
| 理论浓度（μmol/L） | 实施例1检测结果（μmol/L） | 实施例2检测结果（μmol/L） | 实施例3检测结果（μmol/L） | 实施例4检测结果（μmol/L） |
| 46.25 | 46.03 | 45.48 | 47.07 | 46.86 |
| 37.00 | 37.90 | 37.63 | 36.24 | 36.78 |
| 27.75 | 28.02 | 27.88 | 26.91 | 27.21 |
| 18.50 | 17.98 | 18.03 | 18.46 | 18.85 |
| 9.25 | 9.19 | 9.37 | 9.22 | 9.31 |
| 0.00 | 0.17 | 0.17 | 0.12 | 0.09 |
| 相关系数r | 0.9994 | 0.9993 | 0.9990 | 0.9995 |
检测结果显示，实施例1—实施例4检测结果相关性均大于0.990，达到产品标准要求，说明在试剂中加入牛血清白蛋白不会降低试剂检测的线性相关性。
稳定性验证实验
在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存试剂，检测四种实施例试剂的稳定性。四种试剂每月选取同一样本测定其吸光度三次，取平均值，与新鲜的实施例1试剂检测结果进行对比，从而确定试剂的稳定时间。
检测数据如下表：
| 时间 | 实施例1试剂检测结果 | 实施例2试剂检测结果 | 实施例3试剂检测结果 | 实施例4试剂检测结果 | 新鲜的实施例1试剂检测结果 |
| 12个月 | 0.2457 | 0.2506 | 0.2487 | 0.2498 | 0.2479 |
| 13个月 | 0.3528 | 0.3587 | 0.3616 | 0.3632 | 0.3622 |
| 14个月 | 0.4346 | 0.4188 | 0.4214 | 0.4204 | 0.4174 |
| 15个月 | 0.3328 | 0.3398 | 0.3382 | 0.3358 | 0.3407 |
| 16个月 | 0.1967 | 0.2943 | 0.2967 | 0.3001 | 0.2957 |
| 17个月 | 0.0684 | 0.2734 | 0.2686 | 0.2691 | 0.2729 |
| 18个月 | 0.0032 | 0.4826 | 0.4757 | 0.4811 | 0.4843 |
| 19个月 | 0.0002 | 0.3725 | 0.3733 | 0.3688 | 0.3698 |
| 20个月 | 0.0001 | 0.4685 | 0.4596 | 0.4623 | 0.4703 |
| 21个月 | 0.0000 | 0.5374 | 0.5421 | 0.5417 | 0.5461 |
| 22个月 | 0.0000 | 0.3284 | 0.3314 | 0.3321 | 0.3358 |
| 23个月 | 0.0000 | 0.3263 | 0.3198 | 0.3167 | 0.3265 |
| 24个月 | 0.0000 | 0.2178 | 0.2213 | 0.2121 | 0.2235 |
| 25个月 | 0.0000 | 0.3357 | 0.3443 | 0.3500 | 0.4232 |
| 26个月 | 0.0000 | 0.1365 | 0.1932 | 0.2397 | 0.5328 |
实验结果显示，实施例1试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存15个月稳定，而实施例2、3、4试剂在2℃～8℃、无腐蚀性气体的避光环境中贮存24个月稳定，说明在试剂中加入牛血清白蛋白能有效的提高同型半胱氨酸检测试剂盒的稳定性。
本发明提供的稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法），通过对试剂1和试剂2的改进，能够有效的提高同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）的稳定性，而对试剂的准确度和分析灵敏度没有影响。因此，本发明提供的稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒（酶法）有利于在市场中进一步的推广使用。
Claims (1)
1.一种稳定性强的同型半胱氨酸检测试剂盒，其特征在于，包括组分1和组分2，体积比为R1：R2=240:65，
各组分原料含量如下：
组分1：
S-腺苷甲硫氨酸 0.1-1mM
NADH 0.3-3mM
三（2羧乙基）膦氯化氢 0.5-5 mM
α－酮戊二酸 5-50mM
叠氮钠 0.1-10g/L
抗坏血酸氧化酶 2-10 KU/L ；
组分2：
Hcy甲基转移酶 1-10KU/L
谷氨酸脱氢酶 1-10KU/L
S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶 2.5-25KU/L
腺苷脱氨酶 5-50KU/L
牛血清白蛋白 20-40g/L
椰油酰胺丙基甜菜碱 2-5g/L 。
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