CN105814214A - 遗传标记和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明特别涉及用于确定动物和/或它的后代是否很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法。它还提供了用于选择或排除动物、一个或多个细胞或胚胎；估计动物的价值；产生具有所期望的基因型/表型的动物；对动物进行克隆和育种；以及畜群形成的方法。
Description
技术领域
本发明特别涉及用于确定动物和/或它的后代是否很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，并且特别是但不仅仅涉及用于选择或排除动物、一个或多个细胞或胚胎；估计动物的价值；对动物进行育种；以及畜群形成的方法。
背景技术
在热胁迫下维持正常体温的能力是牛和其它动物的一种重要的性状。这对于亚热带地区和热带地区中的动物来说是特别重要的。在牛中，例如，热胁迫已与产奶量的减少、发情检出率的降低、更低的生育率和妊娠率、以及胚胎死亡率的增加有关。这些因素可能对生产动物的养殖有显著的影响。
一些动物天生能够在亚热带气候和热带气候中比其它动物更有效地调节体温。这种动物的实例是牛的塞纳普(Senepol)品种。塞纳普牛具有非常短的光滑的被毛。
能够鉴定很有可能能够在热胁迫下维持正常的体温或更有效地调节体温的动物将是有用的。然后可以将所述动物选用于纳入畜群中或用于实现育种的目的。这在意图将动物养殖在其中将使它们暴露于相对高的温度条件的地方的情况下可能尤其有用。
本文所提到的出版物的著录项目细节集中在说明书的末尾。
目的
本发明的目的在于提供以下各项中的一种或多种：一种确定动物和/或它的后代是否很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法；一种用于选择或排除动物的方法；一种用于选择或排除一个或多个细胞的方法；一种用于估计动物的价值的方法；一种用于对动物进行育种的方法；一种用于克隆动物的方法；一种用于产生动物的方法；一种形成畜群的方法；一种用于鉴定一个或多个标记的方法，所述标记推断了提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感；一种用于鉴定动物(和/或它的后代)、或一个或多个细胞或胚胎是否可能具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感相关的标记的方法；一种核酸；一种肽；一种试剂盒；和/或至少为公众提供一种有用的选择。
发明内容
本申请的发明人已经鉴定出，催乳素受体(PRLR)基因中的序列改变或变异与具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物有关。所述改变或变异可以被用作遗传标记以确定动物是否很有可能具有提高的耐热性。这样的信息可以用于例如选择、筛选动物以及对动物进行育种、农场管理、以及估计动物对于特定产业的价值的方法中。
在第一个方面，本发明提供了一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，其中在所述核酸包括所述遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，所述动物和/或它的后代被确定为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于由对应于普通牛(BosTaurus)的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于所述PRLR基因的最后一个外显子中的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定处于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列。
在一个实施方案中，对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的存在推断了所述动物和/或它的后代很有可能具有提高的耐热性。
在第二个方面，本发明提供了一种用于选择或排除动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，其中一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的存在推断了所述动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果动物包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么选择所述动物，并且如果动物不包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么将它排除。
在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，如果动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物被推断为不是很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么将它排除。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于所述PRLR基因的最后一个外显子中的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
在一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定处于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：
a)分析来自所述动物的核酸以确定存在于对应于位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列；以及
b)基于所述存在于所述对应于位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列来选择或排除动物。
在一个实施方案中，如果存在所述对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么选择所述动物。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产奶量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产肉量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产蛋量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对毛皮、毛发、羊毛、外皮或羽毛产量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以针对所期望的皮毛质感选择或排除动物。在另一个实施方案中，执行所述方法以实现为了育种目的选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了纳入到畜群中选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，在所述方法是用于为了育种目的和/或为了纳入到畜群中选择或排除动物的情况下，所述方法包括确定所述动物就所述一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是否是纯合的或杂合的。在一个具体的实施方案中，在所述动物就所述一个或多个遗传改变和/或所述与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是纯合的情况下，这推断了动物很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，因此选择所述动物。
在第三个方面，本发明提供了一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，其中所述一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的存在推断了所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括位于所述PRLR基因的最后一个外显子中的一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
在一个实施方案中，所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定处于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列。
在一个实施方案中，如果存在所述对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或存在与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，则推断了所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第四个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：至少选择第一动物，所述第一动物具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记；以及使所述第一动物与第二动物交配。
在一个实施方案中，所述方法还包括在以下基础上选择所述第二动物，即它包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，如果所述第一动物和/或所述第二动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于所述PRLR基因的最后一个外显子中。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述第一动物和/或所述第二动物具有对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第一动物和/或所述第二动物。在一个实施方案中，所述方法包括在存在所述对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在一个实施方案中，所述方法包括在所述第一动物和/或所述第二动物被确定为就一个或多个特定的遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是纯合的情况下，选择所述动物。
在第五个方面，本发明提供了一种用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的核酸，以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。在一个实施方案中，这样的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的存在推断了所述一个或多个细胞或胚胎适合用于对动物进行育种或克隆的方法中，所述动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎。在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物不包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么将所述一个或多个细胞或胚胎排除。
在一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于所述PRLR基因的最后一个外显子中。
在一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的核酸，以确定处于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：
a)分析来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的核酸，以确定存在于对应于位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列；以及
b)基于所述存在于所述对应于位置39136559的位置处的核苷酸和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列来选择或排除一个或多个细胞或胚胎。
在一个实施方案中，如果存在对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎。
在一个实施方案中，所述方法包括确定所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物就所述一个或多个遗传改变和/或所述与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是否是纯合的或杂合的。在一个具体的实施方案中，在所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物就所述一个或多个遗传改变和/或所述与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是纯合的情况下，选择所述一个或多个细胞或胚胎。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了用于克隆动物和/或对动物进行育种而选择或排除一个或多个细胞或胚胎的目的。在一个实施方案中，对动物进行育种可以涉及IVF。
在第六个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子。
在一个实施方案中，所述方法还包括在以下基础上选择所述第二配子，即它包括所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
在第七个方面，本发明提供了一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的胚胎。
在第八个方面，本发明提供了一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的一个或多个细胞。
在第六个方面至第八个方面中任一个的一个实施方案中，所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于所述PRLR基因的最后一个外显子中。
在第六个方面至第八个方面中任一个的一个实施方案中，所述方法包括在所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或一个或多个细胞具有对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或一个或多个细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在存在所述对应于位置39136559的位置处C的缺失和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞。在一个实施方案中，所述方法包括在所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或一个或多个细胞被确定为就一个或多个遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记来说是纯合的情况下，选择所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或一个或多个细胞。
在本发明的第一个至第八个宽泛的方面中任何一个或多个的一个实施方案中，所述方法包括分析核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异单独或和与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的组合。在一个实施方案中，所述方法涉及分析核酸以确定存在于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸单独或和与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的组合。
优选地，使用以下各项中的一种或多种，根据本发明的第一个至第八个方面中的任何一个或多个对核酸进行分析：聚合酶链反应(PCR)；凝胶电泳；DNA印迹；核酸测序；限制性片段长度多态性(RFLP)；单链确认多态性(SSCP)；LCR(连接酶链反应)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)；等位基因特异性寡核苷酸(ASO)；识别核酸错配的蛋白质；RNA酶保护；寡核苷酸阵列杂交；变性HPLC(dHPLC)；高分辨率熔解(HRM)；以及基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)、qRT-PCR。
在第九个方面，本发明提供了一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：在所述动物中观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或所期望的皮毛质感的动物有关，并且与所述标准相比，来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平更高，则推断所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在第十个方面，本发明提供了一种用于选择或排除动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平。
在一个实施方案中，如果动物具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，那么选择所述动物，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在一个实施方案中，如果动物不具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，那么将它排除，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关，并且与所述标准相比，来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平更高，则推断所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果推断动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物被推断为不是很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么将它排除。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产奶量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产肉量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产蛋量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对毛皮、毛发、羊毛、外皮或羽毛产量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以针对所期望的皮毛质感选择或排除动物。在另一个实施方案中，执行所述方法以实现为了育种目的选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了纳入到畜群中选择或排除动物的目的。
在第十一个方面，本发明提供了一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物相关，并且与所述标准相比，来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平更高，则推断所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在第十二个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一动物，所述第一动物被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物；以及使所述第一动物与第二动物交配。
在另一个实施方案中，所述方法还包括选择第二动物，所述第二动物被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：观测来自所述第一动物和/或所述第二动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平以鉴定它是否具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物相关，并且在所述第一动物和/或所述第二动物被观测到与所述标准相比具有更高水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在一个实施方案中，如果所述第一动物和/或所述第二动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在第九个至第十二个方面中任何一个或多个的一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：
a)从动物获取样品；
b)在所述样品中检测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种；以及
c)将所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平相对于标准进行比较。
在第十三个方面，本发明提供了一种用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测所述一个或多个细胞或胚胎或产生它的动物中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平。
在一个实施方案中，在所述一个或多个细胞或胚胎或产生它的动物被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述一个或多个细胞或胚胎，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在一个实施方案中，在所述一个或多个细胞或胚胎或产生它的动物被鉴定为不具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，将所述一个或多个细胞或胚胎排除，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生它的动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物相关，并且与所述标准相比，来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平更高，则推断所述一个或多个细胞或胚胎适合用于对动物进行育种或克隆的方法中，所述动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物具有更高水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了用于克隆动物和/或对动物进行育种而选择或排除一个或多个细胞或胚胎的目的。在一个实施方案中，对动物进行育种可以涉及IVF。
在第十四个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子。
在一个实施方案中，所述方法还包括在所述第二配子被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述第二配子，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第十五个方面，本发明提供了一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：在胚胎被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述胚胎，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第十六个方面，本发明提供了一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：在一个或多个细胞被鉴定为具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述一个或多个细胞，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第十四个至第十六个方面的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：观测所述第一配子和/或所述第二配子、所述一个或多个细胞或所述胚胎中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平以鉴定它是否具有如下水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种，所述水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，第十四个至第十六个方面的方法包括将所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平与一个或多个标准相比较。
在第十四个至第十六个方面中任一个的一个实施方案中，所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物相关，并且在所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞被观测到与所述标准相比具有更高水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的情况下，选择所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞。
在一个实施方案中，PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平是其表达水平。
在第九个至第十六个方面的某些实施方案中，使用免疫测定、基于诸如分子量和等电点的特征进行的分离、凝胶电泳、蛋白质印迹、或质谱法来测定PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平。优选地，所述免疫测定是ELISA。优选地，所述凝胶电泳是2D凝胶电泳或基于微流体技术的无凝胶***。
在第十七个方面，本发明提供了一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：在所述动物中观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物相关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且与所述标准相比，所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平更高，则推断所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第十八个方面，本发明提供了一种用于选择或排除动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平。
在一个实施方案中，如果动物具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，那么选择所述动物，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在一个实施方案中，如果动物不具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，那么将它排除，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且与所述标准相比，所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平更高，则推断所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果推断动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物被推断为不是很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么将它排除。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产奶量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产肉量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产蛋量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对毛皮、毛发、羊毛、外皮或羽毛产量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以针对所期望的皮毛质感选择或排除动物。在另一个实施方案中，执行所述方法以实现为了育种目的选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了纳入到畜群中选择或排除动物的目的。
在第十九个方面，本发明提供了一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且与所述标准相比，所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平更高，则推断所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第二十个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一动物，所述第一动物被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物；以及使所述第一动物与第二动物交配。
在另一个实施方案中，所述方法还包括选择第二动物，所述第二动物被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：观测来自所述第一动物和/或所述第二动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的活性水平以鉴定它是否具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的活性水平与一个或多个标准相比较。
在一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且在所述第一动物和/或所述第二动物被观测到与所述标准相比具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的更高的活性水平的情况下，选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在一个实施方案中，如果所述第一动物和/或所述第二动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在第十七个至第二十个方面中任何一个或多个的一个实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：
a)从动物获取样品；
b)在所述样品中检测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的活性水平；以及
c)将所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平相对于标准进行比较。
在第二十一个方面，本发明提供了一种用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平。
在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎不具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，那么将它排除，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在一个实施方案中，所述方法包括将PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平相对于一个或多个标准进行比较。
在一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且与所述标准相比，所述一个或多个细胞或胚胎、或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平更高，则推断所述一个或多个细胞或胚胎适合用于对动物进行育种或克隆的方法中，所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物具有更高水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了用于克隆动物和/或对动物进行育种而选择或排除一个或多个细胞或胚胎的目的。在一个实施方案中，对动物进行育种可以涉及IVF。
在第二十二个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子。
在一个实施方案中，所述方法还包括在所述第二配子被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平的情况下，选择所述第二配子，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第二十三个方面，本发明提供了一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：在胚胎被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平的情况下，选择所述胚胎，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第二十四个方面，本发明提供了一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：在一个或多个细胞被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平的情况下，选择所述一个或多个细胞，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第二十二个至第二十四个方面的方法的一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：观测所述第一配子和/或所述第二配子、所述一个或多个细胞或所述胚胎中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的活性水平以鉴定它是否具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的如下活性水平，所述活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
在第二十二个至第二十四个方面的方法的一个实施方案中，所述方法包括将所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的水平与一个或多个标准相比较。
在第二十二个至第二十四个方面中任一个的一个实施方案中，所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平，并且在所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞被观测到与所述标准相比具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的更高的活性水平的情况下，选择所述第一配子和/或所述第二配子、所述胚胎或所述一个或多个细胞。
在第二十五个方面，本发明提供了一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异，其中在所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种具有所述一个或多个变异的情况下，所述动物和/或它的后代被确定为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第二十六个方面，本发明提供了一种用于选择或排除动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异，其中所述一个或多个变异的存在推断了所述动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物被推断为不是很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么将它排除。
在一个实施方案中，如果动物包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一个或多个氨基酸变异，那么选择所述动物，并且如果动物不包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一个或多个氨基酸变异，那么将它排除。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产奶量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产肉量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对产蛋量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现针对毛皮、毛发、羊毛、外皮或羽毛产量选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以针对所期望的皮毛质感选择或排除动物。在另一个实施方案中，执行所述方法以实现为了育种目的选择或排除动物的目的。在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了纳入到畜群中选择或排除动物的目的。
在第二十七个方面，本发明提供了一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异，其中所述一个或多个变异的存在推断了所述动物和/或它的后代很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第二十八个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：至少选择第一动物，所述第一动物已经被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异；以及使所述第一动物与第二动物交配。
在一个实施方案中，所述方法还包括在以下基础上选择所述第二动物，即它已经被鉴定为具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
在一个实施方案中，如果所述第一动物和/或所述第二动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述第一动物和/或所述第二动物。
在第二十九个方面，本发明提供了一种用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种，以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异。在一个实施方案中，这样的一个或多个变异的存在推断了所述一个或多个细胞或胚胎适合用于对动物进行育种或克隆的方法中，所述动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物具有PRLR的氨基酸序列中的一个或多个变异，那么选择所述一个或多个细胞或胚胎。在一个实施方案中，如果一个或多个细胞或胚胎或产生所述一个或多个细胞或胚胎的动物不具有PRLR的氨基酸序列中的一个或多个变异，那么将它排除。
在一个实施方案中，执行所述方法以实现为了用于克隆动物和/或对动物进行育种而选择或排除一个或多个细胞或胚胎的目的。在一个实施方案中，对动物进行育种可以涉及IVF。
在第三十个方面，本发明提供了一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子。
在一个实施方案中，所述方法还包括在以下基础上选择所述第二配子，即它具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
在第三十一个方面，本发明提供了一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择胚胎，所述胚胎具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
在第三十二个方面，本发明提供了一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择一个或多个细胞，所述一个或多个细胞具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
在第二十五个至第三十二个方面中任一个的一个实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个变异是使得PRLR活性提高的变异。
在第二十五个至第三十二个方面中任一个的一个实施方案中，一个或多个变异是一个或多个氨基酸的取代、一个或多个氨基酸的缺失、和/或一个或多个氨基酸的添加。在一个具体的实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个变异是引起PRLR被截短的缺失。
在第二十五个至第三十二个方面中任一个的一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异位于以下区域内，所述区域是从对应于普通牛的PRLR的氨基酸430的位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸490的位置。在一个实施方案中，一个或多个变异使得PRLR在以下区域中被截短，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置430的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的位置490的氨基酸位置。
在第二十五个至第三十二个方面中任一个的一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异包括在对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置处丙氨酸被缬氨酸取代。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异使得PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异是位置461处丙氨酸被缬氨酸取代以及PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。
在第三十三个方面，本发明提供了一种用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：将一个或多个遗传改变引入到用于产生所述动物的一个或多个细胞的PRLR基因中。在一个相关方面，本发明还提供了一种用于产生可以用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物的一个或多个细胞的方法，所述方法至少包括以下步骤：将一个或多个遗传改变引入到一个或多个细胞的PRLR基因中。在另一个方面，本发明提供了一种由所述方法产生的细胞。
在一个实施方案中，所述用于产生所述动物的方法涉及IVF。在一个实施方案中，所述用于产生所述动物的方法是一种克隆方法。
在一个实施方案中，一个或多个遗传改变是提高了PRLR的活性的遗传改变。在一个实施方案中，一个或多个遗传改变包括位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内的遗传改变。在一个实施方案中，一个或多个遗传改变是位于PRLR基因的最后一个外显子中的遗传改变。在一个实施方案中，一个或多个遗传改变包括对应于普通牛的染色体20上的位置39136559的位置处的遗传改变。在一个实施方案中，一个或多个遗传改变包括对应于普通牛的染色体20上的位置39136559的位置处C的缺失。
在一个实施方案中，所述一个或多个细胞选自配子或合子。在一个实施方案中，所述一个或多个细胞是体细胞或来自细胞系的细胞。
在一个实施方案中，第三十三个方面的克隆方法还包括以下步骤：使用本发明的第二个、第五个、第十个、第十三个、第十八个、第二十一个、第二十六个或第二十九个方面的方法中的任何一种或多种的方法来选择或排除一个或多个动物、细胞或胚胎。
在一个实施方案中，第三十三个方面的IVF方法还包括以下步骤：使用本发明的第二个、第五个、第十个、第十三个、第十八个、第二十一个、第二十六个或第二十九个方面的方法中的任何一种或多种的方法来选择或排除一个或多个动物、细胞或胚胎。
在一个相关方面，本发明提供了一种由本发明的第三十三个方面的方法所产生的动物。
在第三十四个方面，本发明提供了一种形成畜群的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a.执行本发明的第一个、第二个、第三个、第四个、第九个、第十个、第十一个、第十二个、第十七个、第十八个、第十九个、第二十个、第二十五个、第二十六个、第二十七个或第二十八个方面中任何一个或多个的方法；
b.基于步骤a)的结果选择或排除动物；以及
c.形成所选动物的畜群。
在一个实施方案中，如果动物被推断为不是很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么将它排除。在一个实施方案中，如果动物被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，那么选择所述动物。
在一个实施方案中，如果动物包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的氨基酸序列中的一个或多个变异，那么选择所述动物。在一个实施方案中，如果动物与标准相比具有更高水平的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段和/或编码其任何一种或多种的核酸，那么选择所述动物，其中所述标准包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段和/或编码其任何一种或多种的核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关。在一个实施方案中，如果动物与标准相比具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的更高的活性水平，那么选择所述动物，其中所述标准包括与具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感的动物有关的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平。
在一个相关方面，本发明提供了一种由本发明的第三十四个方面的方法所形成的畜群。
在第三十五个方面，本发明提供了一种用于鉴定PRLR基因中的一个或多个遗传变异的方法，所述遗传变异推断了动物的提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定PRLR基因中的一个或多个遗传变异以及确定它是否使得PRLR的水平或活性提高。在一个实施方案中，在所述一个或多个改变使得PRLR的水平或活性提高的情况下，它被确定为推断了动物的提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第三十六个方面，本发明提供了一种用于鉴定动物(和/或它的后代)、一个或多个细胞或胚胎是否具有或可能具有一个或多个遗传改变的方法，所述遗传改变与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感相关，所述方法包括观测核酸序列以鉴定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的遗传标记。在所述核酸序列被鉴定为具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的遗传标记的情况下，所述动物、细胞或胚胎被鉴定为具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感相关的一个或多个遗传改变。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变使得PRLR的水平或活性提高。
在第三十七个方面，本发明提供了一种用于鉴定PRLR中的一个或多个氨基酸变异的方法，所述氨基酸变异推断了动物的提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在一个实施方案中，所述方法包括鉴定PRLR中的一个或多个氨基酸变异以及确定它是否使得PRLR的水平或活性提高。在一个实施方案中，在所述一个或多个改变使得PRLR的水平或活性提高的情况下，它被确定为推断了动物的提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在第三十八个方面，本发明提供了一种用于鉴定动物(和/或它的后代)、一个或多个细胞或胚胎是否具有或可能具有一个或多个氨基酸变异的方法，所述氨基酸变异与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感相关，所述方法包括观测氨基酸序列以鉴定它是否包括PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型或其一个或多个片段的氨基酸序列中的一个或多个变异。在鉴定出所述动物、细胞或胚胎具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、或其一个或多个片段的氨基酸序列中的一个或多个变异的情况下，所述动物、细胞或胚胎被鉴定为具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感相关的一个或多个氨基酸变异。在一个实施方案中，所述一个或多个氨基酸变异使得PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型或其一个或多个片段的水平或活性提高。
在本发明的第一个至第三十八个方面中任何一个或多个的一个实施方案中，所述动物是哺乳动物。在某些实施方案中，所述动物是来自牛科(Bovidae)、雉科(Phasianidae)、或猪科(Suidae)。在某些实施方案中，所述动物具有如本文之后所述的属、种或品种。在一个具体的实施方案中，所述动物是牛属动物。在一个具体的实施方案中，所述牛属动物是普通牛或瘤牛(Bosindicus)。在一个具体的实施方案中，所述动物选自由以下各项组成的组：娟珊牛(Jersey)、荷兰牛(Holstein)、弗利生牛(Friesian)或杂交奶牛。在其它实施方案中，所述动物选自由以下各项组成的组：克里奥尔牛(Creole)，包括罗曼西牛(Romosinuano)、克里罗牛(Criollo)、卡罗拉牛(Carora)、塞纳普牛、或杂交牛。
在一个实施方案中，本发明的第一个至第三十八个方面中任何一个或多个的方法还包括分析一个或多个另外的生物标记。在一个实施方案中，所述一个或多个生物标记是一个或多个遗传标记。
在一个实施方案中，本发明的方法可以包括以下步骤中的两个或更多个：分析核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记；观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平；在所述动物中观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的活性水平；以及分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异。这样的分析和观测可以使用本文之前所述的本发明的各方面的一种或多种方法来进行。
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸，所述核酸在对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处包含del(C)改变。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，其中C存在于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处。在另一个实施方案中，所述核酸包含如下的核苷酸序列，其中对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的C已经缺失。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，所述核酸包含以下序列或其功能上等同的变体或由以下序列或其功能上等同的变体组成：GACCAAACAGACCAACATGTTTAAAAGCCTCAAAAACCA(SEQIDNo.3)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸，所述核酸包含SEQIDNo.6的序列或其功能上等同的变体或由SEQIDNo.6的序列或其功能上等同的变体组成。
在一个方面，本发明提供了一种cDNA，所述cDNA包含本文所述的一个或多个遗传标记。
在另一个方面，本发明提供了如本文之后进一步所述的一种或多种另外的核酸。
在另一个方面，本发明提供了一种如本文所述的分离的肽。在一个实施方案中，本发明提供了一种分离的肽，所述肽包含SEQIDNo.7的序列或其功能上等同的变体或由SEQIDNo.7的序列或其功能上等同的变体组成。
在其它方面，本发明提供了：
-通过第二个、第十个、第十八个、以及第二十六个方面中任何一个或多个的方法所选择的动物；
-通过第五个、第十三个、第二十一个以及第二十九个方面中任何一个或多个的方法所选择的一个或多个细胞或胚胎；
-通过第四个、第六个、第七个、第八个、第十二个、第十四个、第十五个、第十六个、第二十个、第二十二个、第二十三个、第二十四个、第二十八个、第三十个、第三十一个、以及第三十二个方面中任何一个或多个的方法所产生的后代或动物。
本发明还可以被宽泛地认为在于在本申请的说明书中单独或共同提到或指示的部分、要素以及特征、所述部分、要素或特征中两种或更多种的任何或所有组合，并且在本文提到具体的整体方案并且所述整体方案在与本发明相关的领域中具有已知的等同方案的情况下，这些已知的等同方案被认为并入到本文中，如同单独地阐述这些已知的等同方案一般。
附图说明
根据以下说明，参考附图，应当在本发明的所有新颖方面被考虑的本发明的这些方面和其它方面将变得显而易见，所述说明仅是以举例方式给出的，其中：
图1：图示了普通牛催乳素受体(PRLR)转录变体2mRNA的核苷酸序列(NCBI参考序列：NM_001039726.2)。PRLR长型。翻译区被突出显示。起始于位置85的起始密码子对应于UMD3.1上的位置39115293。如由NCBI所公开的外显子1起始于39115245。起始于mRNA序列中的位置1828的终止密码子处于基因组构建体UMD3.1中的位置39136922处。在来自塞纳普牛的DNA中所鉴定出的碱基缺失处于mRNA序列中的位置1466(突出显示)以及基因组位置39136559处。所引起的移码编码了缬氨酸，继而是引起蛋白质截短的终止密码子(图2)。
图2：普通牛催乳素受体(PRLR)转录变体2mRNA。
产物是PRLR长型(NCBI参考序列：NM_001039726.2)。由本申请的发明人所观测到的移码突变将经由去除突出显示的序列而使得蛋白质从581个氨基酸截短成461个氨基酸；以及使新的羧基末端氨基酸从丙氨酸转变成缬氨酸。
图3：普通牛催乳素受体(PRLR)转录变体2mRNA，它显示出由本申请的发明人所鉴定出的改变，即塞纳普牛PRLR中缺失的碱基(处于BTA20上的39136559处)(c)，该缺失的碱基是通过省略来指示的。产物是PRLR长型(NCBI参考序列：NM_001039726.2)。
图4：由于普通牛BTA20的位置39136559处的碱基C缺失所产生的塞纳普牛催乳素受体的预测氨基酸序列(n461)。
图5：图示了普通牛催乳素受体(PRLR)转录变体2mRNA的核苷酸序列(NCBI参考序列：NM_001039726.1)。PRLR长型。翻译区被突出显示。起始于位置87的起始密码子对应于UMD3.1上的位置39115293。如由NCBI所公开的外显子1起始于39115245。起始于mRNA序列中的位置1830的终止密码子处于基因组构建体UMD3.1中的位置39136922处。在来自塞纳普牛的DNA中所鉴定出的碱基缺失处于mRNA序列中的位置1468(突出显示)以及基因组位置39136559处。所引起的移码编码了缬氨酸，继而是引起蛋白质截短的终止密码子(图2)。
具体实施方式
以下是在总体上给出的对包括本发明的优选实施方案在内的本发明的说明。本发明进一步由在部分“实施例”下所给出的公开内容所阐明，所述公开内容特别提供了支持本发明的实验数据。
本申请的发明人已经鉴定出位于普通牛的染色体20的区域中催乳素受体(PRLR)基因中的遗传标记的特定等位基因与在具有提高的耐热性的塞纳普品种的牛中所观测到的非常短的光滑的被毛有关。这是首次将PRLR基因中的改变与牛的短而光滑的被毛和耐热性状直接相关联。因此，本申请的发明人设想，PRLR基因中的任何遗传改变，特别是使得PRLR活性提高的那些可以用作标记来确定动物是否很有可能具有提高的耐热性。因此，虽然随后的说明可能集中在对这一基因中特定位置处的核苷酸序列的分析，但是它应当被理解成扩展到对所述基因内任何其它位置处的核苷酸序列的分析。
本申请的发明人还设想，对与PRLR基因中这样的改变处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记进行的分析也可以被用于实现相同的目的。此外，包括两个或更多个这样的遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的标记的组合的单倍型也可以用于实现这一目的。
此外，本申请的发明人设想，用于确定动物(和/或它的后代)是否很有可能具有提高的耐热性的方法可以包括观测PRLR、其一种或多种亚型、其一种或多种前体、其一个或多个片段和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的水平，其中在一个实施方案中，这些分子中的任何一种或多种的水平提高则推断它很有可能将具有提高的耐热性。此外，本申请的发明人设想了如下的方法，所述方法涉及观测PRLR(包括对其一种或多种亚型、其一种或多种前体、其一个或多个片段和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的提及)的活性，其中在一个实施方案中，PRLR(包括对其一种或多种亚型、其一种或多种前体、其一个或多个片段和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸的提及)的活性水平提高则推断所述动物将很有可能具有提高的耐热性。
此外，就某些遗传变异或改变使得PRLR的氨基酸序列发生变化来说，本申请的发明人设想，用于确定动物(和/或它的后代)是否很有可能具有提高的耐热性的方法可以包括观测这些分子是否在它们的氨基酸序列中包括一个或多个变异。应当了解的是，这可以包括观测PRLR(包括对其一种或多种前体、亚型、片段、和/或编码其任何一种或多种的核酸的提及)的尺寸变异。
根据本发明对与PRLR具有相关性的一个或多个生物标记的分析还可以用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎。这样的分析可以有助于例如用于对动物进行育种或克隆的方法。
虽然在本文中在确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有提高的耐热性方面描述了本发明，但是应当了解的是，它同样适用于确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有降低的耐热性或在耐热性方面基本上没有提高的方法。本文中的说明(包括本发明的所有方面和实施方案在内)应当相应地被解读成将这涵盖在内。
除了使用本发明的方法来确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有提高的耐热性之外，本申请的发明人还设想，本发明的方法适用于确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有所期望的皮毛质感(如牛的短而光滑的皮毛)，这是因为这与在塞纳普牛中所观测到的表型有关并且与耐热性相关。此外，本申请的发明人设想，本发明的方法适用于确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有一定水平的对壁虱的抗性。壁虱抗性与皮毛类型有关，更短的皮毛会提高壁虱抗性而长的皮毛会增加壁虱侵扰，并且壁虱抗性与塞纳普牛有关。因此，虽然在本文中可能关于提高的耐热性来描述本发明的方法，但是应当了解的是，这些方法(包括本发明的所有方面和实施方案在内)作为另外一种选择或除此之外可以用于实现确定或推断动物和/或它的后代是否很有可能具有所期望的皮毛质感和/或一定水平的壁虱抗性或提高的对壁虱的抗性的目的。所述说明应当相应地被解读成涵盖这样的替代性方法或另外的方法。
在某些实施方案中，“所期望的皮毛质感”包括薄的、轻的、光滑的和/或短的皮毛。举例来说：在牛科和山羊科(Capra)的情况下，“所期望的皮毛质感”可以是短的和光滑的；在盘羊科(Ovis)的情况下，“所期望的皮毛质感”可以是短的、薄的和/或轻的；在猪科的情况下，“所期望的皮毛质感”可以是短的、薄的和/或轻的；在雉科的情况下，“所期望的皮毛质感”可以是薄的和/或长轻羽毛的。在某些实施方案中，“不期望的皮毛质感”是与具有显著有限的耐热性的动物有关的皮毛质感。“不期望的皮毛质感”可以包括厚的、重的、粗糙的和/或长的皮毛。
根据本发明对一个或多个生物标记进行分析可以有助于例如：预测表型性能，包括用于被称为标记辅助选择(MarkerAssistedSelection)的生产管理***中；为了育种目的选择或排除动物；针对产奶量、产肉量、产蛋量、毛皮、毛发、羊毛、外皮、或羽毛产量和/或所期望的皮毛质感选择或排除动物；管理动物以使它们单独的潜在性能和价值达到最大；估计动物的价值或经济价值；提高与出售动物和/或由所述动物生产的产品相关的利润；通过对所期望的动物进行选择和育种来改良动物群体的遗传学；产生和维持动物的畜群；克隆可能具有或没有特定性状的动物；预测动物和/或它的后代对于用于不同的产业和/或环境和/或育种计划或克隆的适应性。在不同程度上适用于特定的生产***、产业或环境的动物可以被测试或筛选以预测寿命性能并且被隔离或管理以适合它们的基因型并且因此适合预测的表型。动物可以在它们的生命期间的任何时间被测试或筛选，包括但不限于出生早期、作为配子、合子、胚胎、胎儿时。
本申请的发明人鉴定出PRLR基因中的改变与耐热性和所期望的皮毛质感(例如牛的短而光滑的被毛)有关还允许使用克隆和/或基因编辑(geneediting)方法产生具有这样的所期望的表型的动物，在所述方法中，将一个或多个特定的遗传改变引入到PRLR基因中。举例来说，可以在IVF计划期间将一个或多个特定的改变引入到单个配子或合子中，或在克隆程序期间将一个或多个特定的改变引入到一个或多个相关的细胞中。因此，本发明应当被视作包括用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物的方法。
虽然本申请的发明人已经鉴定出牛属动物中的与本发明具有相关性的标记，但是他们设想，本发明的方法同样适用于多种不同的动物(如本文之后所述)，包括但不限于牛、绵羊、山羊、鸡以及猪。
定义
如本文所用的术语“一个或多个生物标记”应当被宽泛地认为并且包括例如一个或多个遗传标记；一种或多种蛋白质(包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)或编码一种或多种蛋白质(包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)的核酸的水平；一种或多种基因或蛋白质(包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)的表达水平；一种或多种蛋白质(包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)的活性水平；和/或蛋白质(包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)的氨基酸序列中的变异，这可以包括对蛋白质((包括对其一个或多个片段、其一种或多种前体、其一种或多种亚型的提及)的尺寸的观测。
如本文所用的术语“遗传标记”指的是在群体内具有多态性或含有序列改变或变异的核酸或特定基因座(包括特定核苷酸位置)，其等位基因可以通过一种或多种分析方法来检测和区分。术语“遗传标记”在它的范围内还包括以“单倍型”的形式共分离的多个遗传标记。在这种背景下，术语“单倍型”指的是一般共同遗传的多个遗传标记。通常，单倍型内的遗传标记处于连锁不平衡状态。术语“本发明的遗传标记”的“遗传标记”和类似术语在本文可以用于描述根据本发明的PRLR基因中的一个或多个遗传变异。
在本文中提到分析核酸以确定“遗传标记”的核苷酸序列或处于特定遗传位置处的核苷酸序列或者一个或多个遗传变异的存在或不存在或性质时，应当被认为包括分析和确定核酸的任何一条链上的核苷酸序列。本领域技术人员将能够容易地基于以下被充分了解的DNA分子结构来确定反向链上的核苷酸或碱基：C与G配对，A与T配对。因此，如果提到鉴定特定位置处T的存在，那么这应当被认为包括提到了鉴定DNA的反向链上A的存在，反之亦然。类似地，如果提到了鉴定特定位置处G的存在，那么这应当被认为包括提到了鉴定DNA的反向链上C的存在，反之亦然。
术语“单核苷酸多态性”(SNP)指的是在基因组序列中的单个核苷酸被改变时出现的核酸序列变异。单核苷酸多态性也可以是单核苷酸***或缺失。SNP内的不同核苷酸被称为等位基因。
如本文所用的术语“基因型”意指在一个或多个基因座处的基因组成或核苷酸序列，特别是基因座的等位基因的核苷酸序列。
“连锁不平衡”应当被宽泛地认为指的是等位基因在一个基因座处的存在预测等位基因在一个或多个其它基因座处的存在(例如不同的遗传标记)的倾向。所述基因座不必一定处于同一染色体上。然而，在一个优选的实施方案中，所述基因座位于同一染色体上。在本发明的一个具体的实施方案中，与根据本发明的遗传改变处于连锁不平衡状态的标记位于普通牛的定位到约38.35Mb至约39.85Mb的位置之间的区域的染色体20上。在一个具体的实施方案中，处于连锁不平衡状态的标记位于定位到约38.4Mb至约39.8Mb的位置之间的区域的染色体20上。在另一个实施方案中，处于连锁不平衡状态的标记位于定位到约38.5Mb至约39.7Mb的位置之间的区域的染色体20上。
连锁不平衡的一个量度是DELTA2，它是使用由Devlin等(Genomics29(2):311-22(1995))所述的公式来计算的，并且是处于第一基因座处的等位基因X在多大程度上预测了等位基因Y在第二基因座处的出现率的量度。1.0的DELTA2值表示预测是完全的(例如，如果Y存在，则X存在)。应当了解的是，在本文中提到连锁不平衡时，不应当被认为表示1.0的DELTA2值。在具体实施方案中，一个基因座处的等位基因与第二基因座处的等位基因之间的连锁不平衡具有至少0.75、至少0.80、至少0.85、至少0.90、至少0.95、以及最优选1.0的DELTA2值。
本领域技术人员将容易了解用于确定任何两个等位基因是否处于连锁不平衡状态的方法。然而，举例来说，参见《遗传数据分析II(GeneticDataAnalysisII)》,Weir,SinauerAssociates,Inc.Publishers,马萨诸塞州桑德兰(Sunderland,Mass.),1996。
在本文中提到分析核酸以确定它是否包括与PRLR基因中的一个或多个遗传变异处于连锁不平衡状态的遗传标记的情况下，应当了解的是，这样的遗传标记可以是(例如动物或一个或多个细胞的)基因组原生的或它可能已经被人工产生或***。“人工产生或***”的遗传标记是已经被引入到基因组中的遗传标记。这样的遗传标记可以包括多种遗传改变中的任何一个或多个，包括例如一个或多个核苷酸被添加到基因组中、基因组内的一个或多个核苷酸被一个或多个核苷酸取代、和/或一个或多个核苷酸从基因组中缺失。在一个具体的实施方案中，所述遗传标记是包含被***到基因组中的一个或多个核苷酸的异源性核酸。本发明相关领域的普通技术人员将容易地了解用于将这样的遗传标记引入到动物的基因组中的方法，包括多种重组技术，包括例如基因编辑方法和定点诱变。这样的技术可以描述于例如以下文献中：Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)》,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress,纽约州冷泉港(ColdSpringHarbor,NewYork)；以及《大型动物基因组的精确编辑(PrecisionEditingofLargeAnimalGenomes)》,Wenfang(Spring)Tan,DanielF.Carlson,MarkW.Walton,ScottC.Fahrenkrug以及PerryB.Hackett,AdvGenet.2012；80:37-97.doi:10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8；以及《通过CRISPR/Cas介导的基因组工程化单步产生在多个基因中携带突变的小鼠(One-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineering)》,HaoyiWang,HuiYang,ChikduS.Shivalila,MeeladM.Dawlaty,AlbertW.Cheng,FengZhang以及RudolfJaenisch.Cell.2013年5月9日；153(4):910-918.doi:10.1016/j.cell.2013.04.025。仅举例来说，这样的遗传标记可能已经被引入到待测试的一个或多个细胞的基因组中、动物的祖代的一个或多个细胞的基因组中、或待测试的动物的一个或多个细胞的基因组中。
PRLR、其亚型、片段和/或前体的“氨基酸序列中的变异”应当被宽泛地认为包括氨基酸序列的任何变化。仅举例来说，它应当被认为包括任何一个或多个氨基酸的取代、一个或多个氨基酸的添加和/或一个或多个氨基酸的缺失。
“遗传变异”也应当被宽泛地认为包括核苷酸序列的任何变化。仅举例来说，它应当被认为包括任何一个或多个核苷酸的取代、一个或多个核苷酸的添加和/或一个或多个核苷酸的缺失。
在关于鉴定或确定核酸是否包括一个或多个遗传变异或者肽或蛋白质是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异来描述本发明的情况下，应当了解的是，这样的变异是核酸或氨基酸序列和与如下的一只或多只动物相关的核酸序列相比所存在的差异，所述动物具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感或不具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。通常，所述变异将是相对于参考序列来确定的。在某些实施方案中，所述参考序列是编码PRLR基因的一部分或全部和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核酸以及PRLR、其亚型、前体或片段的氨基酸序列，它与具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的动物有关，如本文所定义。在一个实施方案中，核酸参考序列是SEQIDNo.4或其一部分。在一个实施方案中，氨基酸参考序列是SEQIDNo.5或其一部分。在其它实施方案中，参考序列可以是具有已经众所周知与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感有关的序列的核酸或肽或蛋白质，如本文所定义。因此，在提到“变异”时，不应当限于意指所分析的核酸、肽或蛋白质与参考序列不同。
在提到蛋白质或肽被截短“到对应于位置Z的位置”以及类似短语时，意在表示蛋白质或肽终止于位置Z。
在提到“由特定的核苷酸或氨基酸所界定”的区域时，应当被认为意指包含所述核苷酸或氨基酸的区域。换句话说，所述区域包括所提到的末端核苷酸或氨基酸。举例来说，“由位置39136469和位置39136649处的核苷酸所界定”的区域包括存在于位置39136469和位置39136649处的核苷酸。
“使得PRLR活性提高的遗传改变或变异”可以是对PRLR基因产物(包括对其亚型、片段和/或前体的提及)的水平、表达或活性有影响的任何遗传变化。举例来说，它可以提高所述基因产物的表达水平或改变所述基因产物的结构或功能。类似地，“使得PRLR活性提高的氨基酸序列变异”或类似短语可以是对PRLR(包括对其亚型、片段和/或前体的提及)的水平或活性有影响的任何变化。术语“提高”不应当被认为表示任何特定的活性水平或功能水平，所需要的只是与没有所述变异或改变的一只动物或多只动物(包括对同一只动物的提及，如果所述动物没有根据本发明的生物标记的话)相比活性存在至少一定的提高。
一般来说，在提到PRLR、其亚型、其片段、其前体、和/或编码其任何一种或多种的核酸的水平或活性“提高”或“降低”的情况下，它应当被宽泛地认为包括所述水平与一只参考动物或多只参考动物或标准相比有任何的提高或降低。在本文中还可以提到与一只参考动物或多只参考动物或标准相比，PRLR、其亚型、其片段、其前体、和/或编码其任何一种或多种的核酸的水平或活性“更高”或“更低”。这不应当被认为表示PRLR、其亚型、其片段、其前体和/或编码其任何一种或多种的核酸的特定水平或活性。可以容易地使用本领域已知的标准测定来确定变异是否使得与标准相比PRLR的水平或活性提高或降低或使得PRLR的水平或活性与标准相比更高或更低，所述标准测定包括本文之后所举例说明的那些技术。
在一个实施方案中，本申请的发明人设想，与没有所期望的表型(提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感)的一只动物或多只动物相比，PRLR的水平或活性高出至少约20％则可以指示确实具有所期望的表型(提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感)的动物。
在提到“PRLR基因”时，应当被认为包括提到所述基因的编码区和非编码区，包括上游和下游调节元件在内。PRLR基因已经被报道被转录成在长度上有所不同的两种mRNA形式：短型和长型。因此，“PRLR基因”在本文中可以使用诸如“长型”或“短型”的术语来提及，这分别意指所述基因被转录成长型mRNA或短型mRNA。在提到PRLR基因内遗传改变的特定位置(例如在最后一个外显子中)时，应当在考虑长型的情况下被解读。然而，除非另外说明，否则一般提到PRLR基因时，应当被认为包括提到短型和长型这两者。在本发明的一个优选的实施方案中，PRLR基因是长型。
“PRLR”是催乳素受体。除非上下文另有要求，否则在本文提到“PRLR”时，应当被认为包括提到PRLR的前体、PRLR的亚型和/或PRLR的片段。举例来说，本发明的方法可以包括分析PRLR、PRLR的亚型、PRLR的前体和/或PRLR的片段和/或编码其任何一种或多种的核酸的序列、水平和/或活性。除此之外，已知PRLR以两种常见的亚型存在，即长型和短型。在本文提到PRLR时，应当被认为包括提到这两种形式。然而，在一个优选的实施方案中，PRLR是长型。
在本文所提到的任何特定核酸的“功能上等同的变体”应当被宽泛地认为涵盖如下的任何核酸，所述核酸的核酸序列可能不同于所提供的特定序列，但是所述核酸保留基本上相同的功能；例如，在用于检测本发明的遗传标记的寡核苷酸的情况下，以所期望的特异性与特定的靶核酸结合或引发特定的反应的能力。短语“功能上等同”不应当被认为表示所述变体与产生它作为变体的核酸具有相同的活性水平，尽管这可能是所期望的。在一个实施方案中，任何特定核酸的“功能上等同的变体”将与产生它作为变体的核酸具有至少约80％、约90％、约95％、或约99％的序列同源性或同一性。
在本文所提到的任何特定肽或蛋白质的“功能上等同的变体”应当被宽泛地认为涵盖如下的任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质的氨基酸序列可以不同于所提供的特定序列，但是所述肽或蛋白质保留基本上相同的功能。短语“功能上等同”不应当被认为表示所述变体与产生它作为变体的肽或蛋白质具有相同的活性水平，尽管这可能是所期望的。在一个实施方案中，任何特定肽或蛋白质的“功能上等同的变体”将与产生它作为变体的肽或蛋白质具有至少约80％、约90％、约95％、或约99％的序列相似性或同一性。
术语“动物”应当被宽泛地认为包括多种不同的动物。在一个实施方案中，“动物”是哺乳动物。在一个具体的实施方案中，所述动物是来自牛科、雉科、或猪科。
在一个实施方案中，来自牛科的动物是来自牛亚科(Bovinae)。在一个实施方案中，所述动物属于牛属(Bos)。在某些实施方案中，所述动物是普通牛或瘤牛。在一个具体的实施方案中，所述动物是肉牛品种和/或奶牛品种。还举例来说，所述动物可以选自包括但不限于以下各项的动物的组：娟姗牛、荷兰牛、弗利生牛、爱尔夏牛(Ayrshire)、杂交奶牛、安格斯牛(Angus)、海福特牛(Hereford)、西门塔尔牛(Simmental)以及杂交肉牛。在其它实施方案中，所述动物选自以下各项的组：牛的克里奥尔品种，包括罗曼西牛、克里罗牛、卡罗拉牛、塞纳普牛以及杂交奶牛或肉牛。在一个具体的实施方案中，所述动物是已知具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物品种与已知具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的动物品种之间的杂种。本领域技术人员将容易地了解本发明可以应用的多种其它物种和品种。
在另一个实施方案中，来自牛科的动物是来自羊亚科(Caprinae)在一个实施方案中，所述动物属于山羊属。在某些实施方案中，所述动物是家山羊(Caprahircus)。在一个实施方案中，所述动物是用于乳制品、肉类和/或羊毛养殖和生产的品种。在某些实施方案中，所述动物可以选自包括但不限于以下各项的动物的组：萨能奶山羊(Saanen)、阿尔卑斯山羊(Alpine)、努比亚山羊(Nubian)、波尔山羊(Boer)以及克什米尔山羊(Cashmere)。在另一个实施方案中，所述动物具有盘羊属。在某些实施方案中，所述动物是家绵羊(Ovisaries)。在一个实施方案中，所述动物是用于乳制品、肉类和/或羊毛养殖和生产的品种。在某些实施方案中，所述动物可以选自包括但不限于以下各项的动物的组：边区来斯特羊(BorderLeicester)、美利奴羊(Merino)、威尔特郡羊(Wiltshire)、陶赛特羊(Dorset)、东弗里生羊(EastFriesian)以及拉卡恩羊(Lacaune)。本领域技术人员将容易地了解本发明可以应用的多种其它物种和品种。
在一个实施方案中，来自猪科的动物是来自猪亚科(Suinae)。在一个实施方案中，所述动物属于猪属(Sus)。在某些实施方案中，所述动物是野猪(Susscrofa)。在一个实施方案中，所述动物是用于肉类和/或皮革养殖和生产的品种。在某些实施方案中，所述动物可以选自包括但不限于以下各项的动物的组：长白猪(Landrace)、杜洛克猪(Duroc)、梅山猪(Meisham)、伯克夏猪(Berkshire)以及菲律宾土猪(Philippinenative)。本领域技术人员将容易地了解本发明可以应用的多种其它物种和品种。
在一个实施方案中，来自雉科的动物是来自雉亚科(Phasianinae)。在一个实施方案中，所述动物属于原鸡属(Gallus)。在某些实施方案中，所述动物是原鸡(Gallusgallus)。在一个实施方案中，所述动物是用于肉类、羽毛和/或蛋类养殖和生产的品种。在某些实施方案中，所述动物可以选自包括但不限于以下各项的动物的组：奈姆特鸡(Namtam)、来航鸡(Leghorn)、乌骨鸡(Silkie)、以及温多德鸡(Wyandotte)。本领域技术人员将容易地了解本发明可以应用的多种其它物种和品种。
在本文中可以通过提到动物的“畜群”来描述本发明。这个术语应当被宽泛地认为包括相同物种的任何一组动物。所述术语应当被认为涵盖其它集合名词，所述集合名词用于指代任何特定物种的一组动物，如“兽群”或“牧群”。
“提高的耐热性(increasedtolerancetoheat)”、“提高的耐热性(increasedheattolerance)”以及类似短语应当被宽泛地认为意指与没有如本文所述的遗传改变或其它生物标记的动物相比，动物能够在热胁迫下更好地维持或调节体温。在一个实施方案中，与没有根据本发明的生物标记的动物(包括对同一只动物的提及，如果它没有根据本发明的生物标记的话)相比，所述动物在热胁迫下具有更低的平均体温。
如本文所用的“显著有限的耐热性”和类似短语意指动物具有有限的或基本上没有在热胁迫下维持或调节它的体温的能力。在一个实施方案中，与具有根据本发明的生物标记的动物(包括对同一只动物的提及，如果它具有根据本发明的生物标记的话)相比，所述动物在热胁迫下将具有更高的平均体温。
如本文所用的“热胁迫”应当被宽泛地认为意指暴露于至少约25℃的温度。所述温度可以在考虑到空气温度、湿度、辐射热、以及对流热中的任何一种或多种的情况下使用已知的方法被计算为复合温度。在一个实施方案中，“热胁迫”包括暴露于约72的温度湿度指数(THI)。
在本文中使用“皮毛”时，应当被认为包括提到毛皮、毛发、羊毛、或羽毛，这可以根据具体动物的情况而定。
“壁虱抗性”、“对壁虱的抗性”以及类似术语应当被宽泛地认为描述了与没有如本文所述的生物标记的动物(包括对同一只动物的提及，如果它没有根据本发明的生物标记的话)相比，动物抵抗壁虱、限制皮毛上所携带的壁虱数目和/或限制存活到成熟的壁虱数目的能力。它不应当被认为意指绝对没有壁虱将影响、侵扰或侵害动物或没有壁虱将存活到成熟。在一个实施方案中，本发明的生物标记的存在推断了至少一定水平的“提高”的对壁虱的抗性。这应当被宽泛地认为意指与没有本文所述的生物标记的动物(包括对同一只动物的提及，如果它没有根据本发明的生物标记的话)相比，动物能够更好地抵抗壁虱，包括例如皮毛上所携带的壁虱减少、壁虱侵害或侵扰减少、和/或存活到成熟的壁虱数目更少。
如本文所用的“显著有限的对壁虱的抗性”和类似短语意指动物具有有限的或基本上没有抵抗壁虱侵害或侵扰的能力。在一个实施方案中，在壁虱存在下，与具有根据本发明的生物标记的动物(包括对同一只动物的提及，如果它具有根据本发明的生物标记的话)相比，所述动物将在它的皮毛上携带更高数目的壁虱和/或更高数目的存活到成熟的壁虱。
如本文所用的动物的“价值”指的是用于评价动物对于例如育种目的、畜群中的纳入、畜群管理的价值的指标。“价值”是通常由经济价值权衡的可能与所述动物相关的一个或多个特征的估计价值的总和。示例性特征包括奶脂、蛋白质、奶体积、活重、生育力、以及奶体细胞数、生长速率、饲料转化率、以及产蛋量。术语“价值”应当被认为涵盖“育种价值”以及用于评估动物价值的其它已知的指标。本发明相关领域的技术人员将容易了解适用于基于许多不同的特征估计育种价值的方法和公式。由本发明的方法所产生的结果、数据和/或信息可以用于计算以估计“价值”。
应当了解的是，在本发明的方法涉及对动物进行育种的情况下，可以利用任何适当的育种方法，包括例如自然授精、人工授精以及体外受精(IVF)。因此，词语“交配”应当被宽泛地解释并且不限于两只动物的实际交配。应当了解的是，对动物进行育种的方法可以包括一个或多个基因编辑步骤和/或克隆技术。
如本文先前所指出，本发明的方法可以用于鉴定适用于克隆的动物。它们也可以在克隆过程期间被用于确定一个或多个细胞、胚胎或所克隆的动物是否具有PRLR基因中的遗传变异并且有可能具有(或发育成具有以下特征的动物)提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。可以使用任何适当的克隆方法。然而，举例来说，这样的克隆技术包括体细胞核转移、染色质转移、以及胚胎分割。本领域的普通技术人员将容易了解适当的体细胞核转移和染色质转移方法。然而，举例来说，可以使用以下出版物中所述的方法：《牛体细胞核转移(Bovinesomaticcellnucleartransfer)》,RossPJ和Cibelli,JB2010.《分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)》,636:155-177；以及《通过染色质转移进行的克隆对牛妊娠期第45天时的胎盘基因表达的影响(InfluenceofcloningbychromatintransferonplacentalgeneexpressionatDay45ofpregnancyincattle)》,MesquitaFS,MachadoSA,DrnevichJ,BorowiczP,WangZ,NowakRA.AnimReprodSci.2013年1月30日；136(4):231-44.doi:10.1016/j.anireprosci.2012.10.030.2012年11月8日电子出版。
在本发明的上下文中使用IVF的情况下，可以使用任何适当的IVF方法，如对于本发明相关领域的普通技术人员来说将显而易见的那样。然而，举例来说，适当的方法描述于例如以下文献中：ImaiK,TagawaM,YoshiokaH,MatobaS,NaritaM等,(2006)《在牛中通过采卵和体外受精进行的胚胎生产的效率(Theefficiencyofembryoproductionbyovumpick-upandinvitrofertilizationincattle)》,JReprodDev52:19-29。
本发明的方法在本文中可以通过提到“标准”来描述。所述标准可以包括足以和来自动物的样品的结果相比较的任何适当的样品或其它信息。在一个实施方案中，所述标准可以是来自具有已知表型的动物的包含PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)和/或编码其的核酸的对照样品，所述对照样品是与来自待测试的动物的样品一起被同时测试的。然而，在另一个实施方案中，所述标准可以是含有先前产生的数据的打印图表或电子信息等，所述数据被认为提供了适当的标准并且可以基于例如颜色、荧光水平、或数值与测试样品相比较。适当标准的实例将在本文之后进一步阐明。然而，在一个实施方案中，所述标准将代表具有显著有限的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或不期望的皮毛质感的动物。在另一个实施方案中，所述标准将代表具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在某些实施方案中，可以使用这两个标准。
本发明的方法可以包括从待测试的动物获取“样品”。所述样品可以是任何适当的组织或体液样品。在一个实施方案中，所述样品可以包括一个或多个细胞、血液、肌肉、骨骼、一个或多个体细胞、唾液、皮肤、肝脏、脑、胎盘、羊水和/或***。可以使用本领域已知的标准技术从动物获取“样品”。应当了解的是，可以从处于包括出生前在内的任何生命阶段的动物获取样品；非限制性实例有合子、胚胎、胎儿。也可以使用本发明的方法测试单个配子。这可以有助于育种和/或克隆计划。因此，“样品”应当被认为包括合子、胚胎组织、胎儿组织以及配子。样品也可以在动物死亡之后被获取。
除此之外，应当了解的是，在妊娠期间对动物的核酸或肽进行分析或观测的情况下，可以在所述动物出生之前通过分析该动物的可能存在于母体血液供应、胎盘、羊水或任何其它母体组织或流体中的蛋白质、肽、核酸或一个或多个细胞来进行所述分析或观测。因此，在提到分析来自动物的核酸、分析来自动物的PRLR、其前体、亚型和/或片段、观测动物的一种或多种PRLR、其前体、亚型和/或片段的水平、和/或观测动物的PRLR、其前体、亚型和/或片段的活性水平等时，应当被认为包括提到分析和/或观测可能存在于母体组织或流体中的来自该动物的这些中的一种或多种。
“胚胎”应当被宽泛地认为包括来自合子的第一次***的生物体。在某些实施方案中，胚胎是介于合子的第一次***直到它变成胎儿时之间的生物体。在提到“胚胎”时，应当被认为包括提到处于不同发育阶段的生物体，包括例如囊胚、胚泡、原肠胚、以及桑椹胚。
在一个方面，本发明提供了用于选择或排除一个或多个细胞的方法。在某些实施方案中，这样的“细胞”可以包括配子(例如***或卵子)或合子。对这样的细胞进行的选择可以用于例如IVF程序中。在其它实施方案中，这样的“细胞”可以是例如体细胞、胚胎细胞、胚胎干细胞、细胞系中的细胞、用于克隆的一个或多个细胞。对这些细胞进行的选择可以用于例如克隆程序或制备用于克隆和其它程序的细胞系。
在本文中可以通过提到“使第一配子和第二配子融合”以形成合子来描述本发明的某些方面和实施方案。这个短语应当被宽泛地认为包括受精过程，如可以用于体外受精过程。本领域技术人员将容易了解使配子“融合”形成合子的标准手段。
为了便于参考，本发明的方法在本文之后可以关于分析“动物”中或来自“动物”的生物标记(如核酸序列、氨基酸序列、蛋白质和肽的水平或蛋白质或肽的活性水平)或以确定“动物”是否具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感有关或相关的特定标记或确定“动物”的基因型等来描述。应当了解的是，本发明的方法还适用于分析和确定包括配子在内的单个细胞和胚胎是否可能具有相关的生物标记。因此，除非上下文另有要求，否则在提到“动物”时，还应当被认为包括提到一个或多个细胞或胚胎。
在本文中可以通过提到PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)和/或编码其的一种或多种核酸的氨基酸序列或核酸序列、或水平或活性水平“指示”具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)来描述本发明。“指示”不应当被认为意指所述水平和与这样的一只动物或多只动物相关的水平完全相同。然而，在一个实施方案中，所述水平或活性水平和与这样的一只动物或多只动物相关的水平或活性水平基本上相似或基本上相同。使用如本文所述的各种方法可以容易地鉴定PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)和/或编码其的一种或多种核酸的氨基酸序列或核酸序列、或水平或活性水平是否“指示”具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)；例如，将来自测试样品的结果相对于一个或多个标准或参考进行比较。在提到“一只动物或多只动物”时，应当被认为意指特定的参考或标准是基于来自单一动物或由一组动物汇集或求平均的值。
标记
本文所鉴定出的特定标记位于普通牛的染色体20上的核苷酸位置处的PRLR基因中。对于这个基因和特定遗传标记所给出的序列和位置是基于基因库(GenBank)数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中牛构建体UMD3.1中染色体20的基因组序列(gi|258513347|ref|AC_000177.1|)。所述遗传标记的位置应当在假定序列(gi|258513347|ref|AC_000177.1|)中的第一个核苷酸被表示为位置1的情况下根据作为所述改变的起始位点的碱基位置来读取。此外，有关PRLR基因和它在染色体20上的位置的序列信息提供于NCBI数据库上：例如参考序列NM_001039726.2和基因ID：281422。PRLR基因定位到38,951,611和39,146,316(不包括启动子序列)。在本文中对PRLR基因内特定遗传改变的位置的提及(参见例如下表3)将关于它在长型基因内的位置来解读。类似地，在本文中对PRLR内特定氨基酸变异的位置的提及将关于它在普通牛的长型PRLR蛋白质内的位置来解读。有关普通牛PRLR的示例性转录物和蛋白质序列信息在本文提供于图1和图2中。
在本文中提到了PRLR转录变体2mRNA，它作为NM_001039726.2提供于NCBI上。对于这个序列：起始密码子起始于位置85，所述位置85对应于UMD3.1上的位置39115293；如由NCBI所公开的外显子1起始于39115245；终止密码子起始于mRNA序列中的位置1828，该位置1828处于基因组构建体UMD3.1中的位置39136922处；由本申请的发明人所鉴定出的碱基缺失处于位置1466和基因组位置39136559处。应当了解的是，存在这个NCBI序列的先前版本(NM_001039726.1)，即图5，SEQIDNo.8。对于这个序列：起始密码子起始于位置87，所述位置87对应于UMD3.1上的位置39115293；如由NCBI所公开的外显子1起始于39115245；终止密码子起始于mRNA序列中的位置1830，该位置1830处于基因组构建体UMD3.1中的位置39136922处；由本申请的发明人所鉴定出的碱基缺失处于mRNA序列中的位置1468处，该位置1468对应于基因组位置39136559。
将了解的是，本发明的遗传标记的精确位置可以在基因组之间略有不同；例如，在不同物种的动物中或在不同品种的动物中，标记的位置可能不同。同样，PRLR蛋白质中任何氨基酸变异的精确位置可以在蛋白质组之间略有不同；例如，在不同物种的动物中或在不同品种的动物中，改变的位置可以不同。然而，本发明相关领域的技术人员将能够容易地鉴定出不同基因组和/或PRLR蛋白质(包括其亚型、片段以及前体)中的特定标记，这是经由常规的序列比对以及在已知它存在于PRLR基因/PRLR蛋白质(包括其亚型、片段以及前体)中的情况下实现的。为了说明任何特定的遗传标记的位置在基因组间的这种变化，所述标记在本文中被描述为“处于对应于普通牛的染色体20的X位置的位置处”，X是相对于UMD3.1基因组构建体中的染色体20序列所读取的核苷酸数或碱基对数。类似地，为了说明特定氨基酸变异的位置在蛋白质组间的任何变化，氨基酸变异在本文中可以被描述为“处于对应于普通牛的PRLR(或PRLR的长型)的Y位置的位置处”，Y是相对于本文之后在图2中所提供的普通牛PRLR序列所读取的氨基酸数。
有关除普通牛以外的动物的示例性PRLR核酸和氨基酸序列信息可以见于NCBI数据库中。然而，以下数据库登录号是通过举例方式给出的：
猪(野猪(581))NC_010458.3(全核苷酸序列)和NM_001001868.1(蛋白质序列)；
鸡(原鸡)NC_006127.3(全核苷酸序列)和NP_990185.1(蛋白质序列)；
绵羊(家绵羊)NC_019473.1(全核苷酸序列)、O46561.1(蛋白质序列)；以及
山羊(家山羊)JF966783.1(全核苷酸序列)、AEJ76924.1(蛋白质序列)。
表3：所鉴定出的特定遗传标记
虽然本申请的发明人已经观测到表3中所示的改变指示了动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，但是他们设想，核苷酸序列在这个基因座处的任何变异均可以指示提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。此外，本申请的发明人设想，PRLR基因的核苷酸序列中使得PRLR的活性提高的任何变异均可以指示提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。本发明应当相应地被解释。这样的变异可以包括例如一个或多个核苷酸的添加、一个或多个核苷酸的缺失、一个或多个核苷酸的取代或其两种或更多种的组合。
在一个实施方案中，一个或多个改变位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内。在其它实施方案中，一个或多个改变位于由对应于位置39136498和39136620、对应于位置39136528和39136590、或对应于位置39136543和39136575的核苷酸所界定的区域内。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于PRLR基因的最后一个外显子中；例如，由对应于普通牛的染色体20的位置39136033至39136920的核苷酸所界定的区域。
在一个实施方案中，一个或多个改变使得对应于普通牛的PRLR的位置461的位置处丙氨酸被缬氨酸取代。在一个实施方案中，一个或多个遗传改变使得由PRLR基因所表达的转录物或肽被截短。在某个实施方案中，一个或多个改变使得PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置430的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的位置490的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置440的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置480的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置450的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置470的氨基酸位置；或PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置455的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置465的氨基酸位置。在一个实施方案中，一个或多个改变使得PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。在一个实施方案中，一个或多个改变使得位置461处丙氨酸被缬氨酸取代以及PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。
类似地，虽然本申请的发明人已经观测到本文所述的PRLR中的氨基酸变异指示了动物很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，但是他们设想，氨基酸序列在同一位置处的任何变异均可以指示提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。此外，本申请的发明人设想，PRLR的氨基酸序列中使得PRLR的活性提高的任何变异均可以指示提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。本发明应当相应地被解释。这样的变异可以包括例如一个或多个氨基酸的添加、一个或多个氨基酸的缺失、一个或多个氨基酸的取代或其两种或更多种的组合。
在本发明的某些实施方案中，一个或多个氨基酸变异位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置430至氨基酸位置490的区域中；位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置440至氨基酸位置480的区域中；位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置450至氨基酸位置470的区域中；或位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置455至氨基酸位置465的区域中。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异是对应于普通牛的PRLR的位置461的位置处丙氨酸被缬氨酸取代。在一个具体的实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个变异是使得PRLR被截短的缺失。在一个实施方案中，一个或多个变异使得PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置430的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的位置490的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置440的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置480的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置450的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置470的氨基酸位置；或PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置455的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置465的氨基酸位置。在一个实施方案中，一个或多个改变使得PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异是位置461处丙氨酸被缬氨酸取代以及PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。
本申请的发明人注意到，表3中所提到的特定改变在性质上是显性的。他们相信PRLR基因中的其它改变也将如此。因此，例如，在动物就改变来说是杂合的情况下，将推断它很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。鉴于此，本发明的方法不需要确定动物的纯合性或杂合性。然而，在某些实施方案中，可能期望确定所述动物是否是纯合的。举例来说，在选择动物以用于育种目的或用于纳入畜群中的情况下，已知所述动物是否是纯合的可能具有益处，这是因为它将有助于确保任何后代均携带所期望的遗传改变。
核酸序列中的改变
在某些实施方案中，本发明的方法包括分析来自动物的核酸(包括一个或多个核酸)以确定PRLR基因中存在或不存在一个或多个遗传改变。这样的一个或多个遗传改变将指示具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物和/或多只动物。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变使得PRLR的活性提高。
应当了解的是，一个或多个遗传改变可以通过观测PRLR基因或其一部分或区域的尺寸来鉴定。
在一个实施方案中，一个或多个改变位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和39136649的核苷酸所界定的区域内。在其它实施方案中，一个或多个改变位于由对应于位置39136498和39136620、对应于位置39136528和39136590、或对应于位置39136543和39136575的核苷酸所界定的区域内。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变位于PRLR基因的最后一个外显子中；例如，由对应于普通牛的染色体20的位置39136033至39136920的核苷酸所界定的区域。
在一个实施方案中，例如，所述方法包括分析核酸(包括一个或多个核酸)以确定存在于对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸。
作为另外一种选择或除此之外，所述方法可以包括分析核酸的核苷酸序列以确定与PRLR基因中的遗传改变处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的核苷酸序列，所述遗传改变例如上述位置处的遗传标记(遗传变异)。
在一个具体的实施方案中，本发明的方法可以包括分析核酸的核苷酸序列以确定例如动物、一个或多个细胞或胚胎的单倍型，其中所述单倍型包括上述的遗传标记(PRLR基因中的遗传变异)和与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的组合。
还应当了解的是，可以分析核酸的任何一条链的核酸序列以鉴定特定基因座或位置处的序列；例如，并不是分析与上列序列变体相关的链，而是可以分析DNA的反向链或互补链的核苷酸序列。本领域技术人员将在考虑到本文所含的信息和核酸碱基配对原理(即A与T配对以及C与G配对)的情况下容易地了解这样的反向链上与上述基因型相关的核酸序列变异。
可以根据任何适当的技术分析核酸以确定遗传标记的基因型/序列。这样的技术包括例如聚合酶链反应(PCR)，包括等位基因特异性PCR；凝胶电泳；使用寡核苷酸探针杂交；DNA印迹；直接测序；限制性酶切消化；限制性片段长度多态性(RFLP)；单链确认多态性(SSCP)；LCR(连接酶链反应)；变性梯度凝胶电泳(DGGE)；使用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)；使用识别核酸错配的蛋白质，如大肠杆菌mutS蛋白质；RNA酶保护测定；寡核苷酸阵列杂交(例如微阵列)；变性HPLC(dHPLC)；荧光猝灭PCR(TaqManTM，美国加利福尼亚州的应用生物***公司，邮编94404(AppliedBiosystems,CA94404,USA))；高分辨率熔解(HRM)；基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)；以及qRT-PCR。可以使用这些技术中的两种或更多种的组合。这样的组合可以提高所进行的分析的灵敏度。
在某些实施方案中，可以对单个细胞进行分析。在这些情况下，可以使用基因组扩增和/或下一代的测序方法。本领域技术人员将容易了解适当的方法。然而，例如，以下文献中所述的方法：Navin等(Nature,2011年4月7日；472(7341):90-4.doi:10.1038/nature09807.2011年3月13日电子出版。可以使用通过单细胞测序所推断的肿瘤演变。
所用的一种或多种技术将取决于所要检测的标记的性质，如将由本领域技术人员所了解的那样。举例来说，可以使用能够分辨序列之间单核苷酸差异的那些技术来分析单核苷酸多态性(SNP)；例如直接测序或LCR、等位基因特异性PCR、RFLP、SSCP、DGGE、使用等位基因特异性寡核苷酸(ASO)、或识别核酸错配的蛋白质、寡核苷酸阵列杂交、dHPLC、荧光猝灭PCR、以及基质MALDI-TOFMS。
可以使用在上文所提到的技术中的任何一种或多种(包括例如SSCP、RFLP、DGGE、dHPLC以及直接测序)来分析可以包括一个或多个核苷酸的***或缺失的遗传标记。
应当了解的是，用于分析根据本发明的遗传标记的技术中的某些技术将利用与包含所述标记、与所述标记相邻、或侧接所述标记的遗传区域杂交的一个或多个寡核苷酸。这样的寡核苷酸可以是DNA、RNA或其衍生形式并且包括核酸引物，如PCR引物和LCR引物；以及核酸探针。
本发明相关领域的普通技术人员将在考虑到PRLR基因、染色体20，特别是与遗传标记邻近的遗传区域中的核酸序列、所要分析的遗传标记的性质、以及核酸杂交的一般原理中的一种或多种的情况下容易地了解用于本发明中的适当的寡核苷酸。所述核酸将能够以特异性方式与靶核酸杂交并且在引物的情况下，它们将能够引发PCR或类似反应。虽然这样的核酸将优选地与它们在所关注的蛋白质的mRNA或cDNA中的靶区域具有100％的互补性，但是它们可以在特定的位置处含有一个或多个非互补核苷酸，而仍基本上保留了对它们被设计用于结合的靶核酸的特异性。举例来说，核酸与它的靶标可以具有约80％、约90％、约95％、或约99％的互补性或同源性。还举例来说，在某些情况下，所述寡核苷酸可以被设计以使得特定核苷酸位置处的错配指示了所分析的遗传标记的性质(例如SNP)。举例来说，核苷酸中存在于LCR引物的3'末端处的错配将抑制提供了有关该位置处核苷酸的性质的指示的反应。错配可以类似地用于包括RNA酶保护测定和等位基因特异性PCR在内的技术以及例如荧光猝灭PCR中。通常，所述核酸将在严格杂交条件下与它们的靶核酸杂交(参见例如Sambrook和Russell,《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:ALaboratoryManual)》,2001,ColdSpringHarborLaboratoryPress,纽约州冷泉港)。
寡核苷酸探针或引物可以在考虑到它们被设计用于结合的遗传区域的序列的情况下具有适合于具体应用的任何长度。探针或引物通常将能够与它被设计用于杂交的互补序列形成稳定的杂交体。因此，长度取决于核酸组成以及寡核苷酸与它的互补序列之间的同源性百分比、以及所利用的杂交条件(例如温度和盐浓度)。这些杂交因素是本发明相关领域公知的。举例来说，用于本发明中的寡核苷酸可以具有2个至500个核苷酸的长度。在一个实施方案中，具体来说，在它们用作引物的情况下，寡核苷酸可以具有约15个核苷酸至30个核苷酸的长度。
用于本发明中的寡核苷酸的非限制性实例包括CCTATTTTCTGGCCAATGGA(SEQIDNo.1)、CAGCCCAACTGGAGTCTGC(SEQIDNo.2)和/或其一个或多个的功能上等同的变体。在一个实施方案中，这些寡核苷酸在利用PCR的本发明的方法中用作正向引物和反向引物。
在一个具体的实施方案中，使用寡核苷酸CCTATTTTCTGGCCAATGGA(SEQIDNo.1)和CAGCCCAACTGGAGTCTGC(SEQIDNo.2)和/或其一个或多个的功能上等同的变体作为正向引物和反向引物来根据本发明的方法检测普通牛的染色体20的位置39136559处的遗传改变。
用于本发明中的寡核苷酸探针和引物可以通过许多常规的DNA合成方法来制备，包括重组技术和化学合成，或它们可以是购得的。将了解的是，可以使用适当的软件和有关编码所关注的蛋白质的核酸的序列信息，至少在理论上评价任何探针或引物的有用性。举例来说，可以使用软件包，如Primer3(http://primer3.sourceforge.net/)、PCOligo5(国家生物科技公司(NationalBioscienceInc))、Amplify(威斯康星大学(UniversityofWisconsin))、以及PrimerSelect程序(DNAStar公司)来设计和评价引物。
在本发明的方法中使用扩增技术(例如PCR)的情况下，可以根据本发明相关领域中的常规程序，如美国专利号4,683,202中所述的程序来进行扩增。举例来说，PCR反应将一般包括0.1μM-1μM的每一种引物、200μM的每一种dNTP、3mM-7mM的MgCl2、以及1U的TaqDNA聚合酶。此外，示例性PCR循环条件包括：在约94℃的温度下变性30秒至60秒，在基于引物的序列和长度(如本文之后所论述)所计算的温度下退火30秒至60秒，以及在约70℃至72℃的温度下延伸30秒至60秒。举例来说，运行25个至45个循环。
本领域的普通技术人员将了解的是，本文所提供的任何扩增条件仅仅是示例性的并且可以变化以优化条件，其中例如，使用替代性PCR循环仪或DNA聚合酶；其中模板DNA的质量不同；或其中使用没有在本文中具体举例说明的引物的变异，而不脱离本发明的范围。PCR条件可以通过例如改变反应内各种成分的浓度和/或改变反应的成分、改变扩增循环数、变性、退火或延伸时间或温度、或模板DNA的量来改变或优化。本领域技术人员将了解，存在可以对PCR条件进行优化以克服反应之间的可变性的许多其它方式。
应当了解的是，虽然在本文中没有具体举例说明，但是在本发明的范围内用于任何引物的适当的退火温度可以由该引物的所计算的解链温度来导出。这样的解链温度可以使用标准公式，如Sambrook和Russell,2001中所述的标准公式来计算。如本发明相关领域的普通技术人员所将了解的那样，退火温度可以高于或低于解链温度，但一般来说，比所述引物的所计算的解链温度低约5℃的退火温度是合适的。
用于检测和/或分析根据本发明的遗传标记的寡核苷酸可以经过修饰以有助于这样的检测。类似地，使用诸如PCR的技术所获得的核酸产物可以经过修饰以有助于检测和/或分析。举例来说，可以使用本领域中标准的技术将核酸分子标记以有助于进行目视鉴定。举例来说，可以使用P32将核酸放射性标记，如可能在Sambrook和Russell,2001中所述。此外，核酸可以被适当标记以用于显色、荧光或化学发光程序中。
将了解的是，本发明的方法可以使用一个或多个对照样品。这些对照样品可以是用于特定遗传标记的阳性对照或阴性对照。所使用的对照样品的类型可以不同，这取决于诸如所分析的遗传标记的性质以及用于这样的检测和分析的具体技术等因素。阳性对照可以包括例如具有已知的核酸序列或具有已知的尺寸的样品。阴性对照可以包括没有核酸存在的样品。一般举例来说，在分析SNP时，阳性对照样品可以包括已知在相关位置处具有特定核苷酸的核酸。在一个实施方案中，所述方法可以利用具有如下序列的对照样品，所述序列与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感无关或与显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感有关。在另一个实施方案中，所述方法可以利用具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感有关的序列的对照样品。
本发明的这个实施方案的方法可以包括将所测试的核酸的序列与一个或多个参考序列进行比较，如本文之前所述。
本发明的方法可以包括从待测试的动物获取样品(如本文之前所述)。在本发明的这个实施方案中，使用允许观测或分析核酸(包括特定核酸的序列)的技术来分析样品。
为了有助于对根据本发明的遗传标记进行检测，在分析之前可以对样品进行处理。举例来说，可以对样品进行处理以从待分析的样品中分离核酸或扩增待分析的特定遗传区域。
在一个实施方案中，在分析之前从样品中分离或提取核酸。在一个实施方案中，从样品中分离或提取基因组DNA。在一个替代性实施方案中，可以从样品中分离或提取mRNA。在这种情况下，可以使用本领域已知的逆转录技术将mRNA转化成cDNA。用于从样品中分离核酸的技术将容易由本领域技术人员所了解。举例来说，用于分离核酸的方法描述于Sambrook和Russell,2001中。
在本发明的这个实施方案的一种替代形式中，可以原位对核酸进行分析，从而避免了对从样品中提取核酸的需要。这可以使用例如PCR来进行。本领域技术人员将容易了解对于这个目的来说适当的技术和方法(参见例如Sambrook和Russell,2001)。
本发明的方法可以与用于评估基因型、预测表型、基于某些特征选择动物、细胞或胚胎、估计育种值或估计价值等的一种或多种其它方法组合。因此，除了分析本文所鉴定的遗传标记之外，本发明的方法还可以包括例如分析另外的遗传标记、和/或某些基因/蛋白质的表达水平、和/或一个或多个表型性状。
核酸
本发明还提供了携带本发明的遗传标记的核酸。举例来说，包含PRLR基因的其中存在有如本文之前所述的遗传标记的区域的分离的核酸由本发明所涵盖。
本发明还涵盖了可以与PRLR基因的其中存在有本发明的一个或多个遗传标记的区域杂交，优选地在严格条件(如本文之前所述)下杂交的核酸。这样的核酸可以用作引物或以其它方式用于分析本发明的遗传标记，如本文之前所述。
本发明的核酸可以与PRLR基因的相关区域具有100％的序列同一性、同源性或互补性，但是也可以具有一定的序列变异。举例来说，本发明的核酸可以具有约80％、约90％、约95％或约99％的序列同一性、同源性或互补性。
本发明的核酸可以具有任何适当的长度。在一个实施方案中，它们具有至少4个核苷酸的长度，或至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个或更多个核苷酸的长度。
在一个实施方案中，本发明提供了一种核酸，所述核酸包含(或在一个实施方案中，由以下核苷酸序列组成)核苷酸序列GACCAAACAGACCAACATG(C)delTTTAAAAGCCTCAAAAACCA，其中(C)del指示在该位置处不存在C(即GACCAAACAGACCAACATGTTTAAAAGCCTCAAAAACCA，SEQIDNo.3)。
在其它实施方案中，本发明的核酸包含(或在一个实施方案中，由以下核苷酸序列组成)核苷酸序列CCTATTTTCTGGCCAATGGA(SEQIDNo.1)、CAGCCCAACTGGAGTCTGC(SEQIDNo.2)、或作为其任何一个或多个的功能上等同的变体的核苷酸序列。这样的核酸可以在涉及PCR的使用的本发明的方法中用作引物。
在其它实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的遗传改变或编码PRLR、其亚型、片段或前体(包括在氨基酸序列中包含一个或多个变异的那些)的一个或多个cDNA。
氨基酸序列中的变异
在其它实施方案中，本发明的方法包括分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异。氨基酸序列中这样的一个或多个变异将指示具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物和/或多只动物。在一个实施方案中，所述一个或多个变异使得PRLR的活性提高。氨基酸序列中的变异可以是一个或多个氨基酸的添加、一个或多个氨基酸的缺失、一个或多个氨基酸的取代或其两种或更多种的组合。在一个具体的实施方案中，氨基酸序列中的变异是一个或多个氨基酸的缺失。在一个实施方案中，所述一个或多个变异是氨基酸取代。在一个实施方案中，PRLR的氨基酸序列被截短。在某些实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个变异如本文之前所述。
应当了解的是，氨基酸序列中的一个或多个变异可以通过观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的尺寸来鉴定。
在本发明的某些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变异位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置430至氨基酸位置490的区域中；位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置440至氨基酸位置480的区域中；位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置450至氨基酸位置470的区域中；或位于对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置455至氨基酸位置465的区域中。
在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异是对应于普通牛的PRLR的位置461的位置处丙氨酸被缬氨酸取代。在一个具体的实施方案中，氨基酸序列中的一个或多个变异是使得PRLR被截短的缺失。在一个实施方案中，一个或多个变异使得PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置430的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的位置490的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置440的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置480的氨基酸位置；PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置450的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置470的氨基酸位置；或PRLR被截短到处于以下区域中的氨基酸位置，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置455的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置465的氨基酸位置。在一个实施方案中，一个或多个改变使得PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。在一个实施方案中，一个或多个氨基酸变异是位置461处丙氨酸被缬氨酸取代以及PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置。在一个实施方案中，本发明的方法可以包括例如测试C末端缬氨酸的存在或不存在。
就根据本发明的生物标记可以包括一个或多个氨基酸的添加和/或缺失，即蛋白质(包括对其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的提及)的尺寸来说，本发明的方法可以包括观测或测量蛋白质、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段的尺寸。在一个具体的实施方案中，具有430个氨基酸的长度或更短、具有430个至490个氨基酸的长度、具有440个至480个氨基酸的长度、具有450个至470个氨基酸的长度、具有455个至465个氨基酸的长度的PRLR的存在推断了动物、细胞或胚胎携带与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感有关的生物标记。在一个具体的实施方案中，具有461个氨基酸的长度或更短的PRLR的存在推断了动物、细胞或胚胎携带与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感有关的生物标记。
可以使用本领域已知的标准技术来分析PRLR、其亚型、其前体和/或其片段。然而，举例来说，可以使用肽测序方法、质谱法、蛋白质印迹以及ELISA。
所述方法可以使用一个或多个对照样品，如用于特定的氨基酸序列变异的阳性对照和/或阴性对照。所使用的对照样品的类型可以不同，这取决于诸如所分析的变异的类型以及用于检测和分析的具体技术等因素。阳性对照可以包括例如具有已知的氨基酸序列或具有已知的尺寸的样品。阴性对照可以包括没有肽存在的样品。在一个实施方案中，所述方法可以利用具有如下序列的对照样品，所述序列与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感无关或与显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感有关。在另一个实施方案中，所述方法可以利用具有与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感有关的序列的对照样品。
本发明的这个实施方案的方法可以包括将所测试的肽或蛋白质的序列与一个或多个参考序列进行比较，如本文之前所述。
本发明的方法可以包括获取待测试的动物的样品。为了有助于分析根据本发明的肽，可以在分析之前根据许多已知方法中的任一种来处理样品。举例来说，可以处理样品以去除一种或多种一种或多种高丰度蛋白质，所述蛋白质可能会使得难以分析PRLR、其亚型、片段或前体。可以用于在分析PRLR、其亚型、片段或前体之前处理样品的示例性技术描述于本文中的其它地方。
蛋白质或肽
本发明还提供了携带本发明的生物标记的肽和蛋白质。举例来说，包含PRLR的其中存在有如本文之前所述的生物标记的区域的分离的肽或蛋白质由本发明所涵盖。
本发明的肽或蛋白质可以具有任何适当的长度。在一个实施方案中，它们具有至少4个氨基酸的长度，或至少10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个或更多个氨基酸的长度。
在一个实施方案中，本发明提供了由氨基酸序列SEQIDNo.7组成或包含氨基酸序列SEQIDNo.7(或在一个实施方案中，由上述氨基酸序列组成)的肽。
PRLR、前体、片段和/或亚型的水平
在另一个实施方案中，本发明的方法包括观测PRLR(包括对PRLR的任何一种或多种亚型、PRLR的任何一种或多种前体、PRLR的任何一个或多个片段的提及)和/或编码前述物质中的一种或多种的任何一种或多种核酸中的一种或多种的水平。
如本文之前所提到，本申请的发明人设想，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)和/或编码其的核酸的水平提高(例如表达水平提高)则推断了动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。因此，本申请的发明人设想，所述水平的任何提高均可以被认为推断了所述动物和/或它的后代的提高的耐热性(和/或提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感)。类似地，与标准相比所述水平(例如表达水平)降低或基本上没有提高也可以推断所述动物和/或它的后代具有降低的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性、和/或不期望的皮毛质感。
在本发明的某些实施方案中，所述方法可以从动物获取样品；观测PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)或编码其的核酸的水平(在一个实施方案中，是表达水平)；以及将所述水平相对于一个或多个标准进行比较。在所述样品中所观测到的水平以及所述样品与所述标准之间水平的任何差异推断了所述动物是否将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)和/或编码其的核酸的水平，所述水平与具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的一只动物或多只动物的水平有关。在另一个实施方案中，所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)和/或编码其的核酸的水平，所述水平与具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)的水平有关。
在一个实施方案中，与标准(例如具有与具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的一只动物或多只动物有关的水平)相比，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)或编码其的核酸的水平更高，则推断了所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在一个实施方案中，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)或编码其的核酸的水平基本上相似、基本上相同或更低，则推断所述动物将很有可能具有降低的或显著有限的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，在所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)和/或编码其的核酸与具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)的水平有关的水平并且所测试的动物具有与所述标准相比基本上相似、基本上相同或更高水平的PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)或编码其的核酸的情况下，推断所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在所测试的动物具有低于所述标准的水平的情况下，可以推断所述动物将很有可能具有降低的或显著有限的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性、和/或不期望的皮毛质感。
可以使用用于鉴定、定量和/或突出一种或多种蛋白质的差异水平或表达的技术中的任一种或组合来检测PRLR(包括对其一种或多种前体、片段和/或亚型的提及)和编码其的核酸并且将其水平与标准相比。这样的技术将容易由本发明相关领域的普通技术人员所了解。然而，举例来说，可以使用以下各项来测量PRLR(包括对其一种或多种前体、片段和/或亚型的提及)的水平：蛋白质纯化方法；免疫学技术；基于诸如分子量和等电点的特征进行的蛋白质分离，包括凝胶电泳(例如PAGE)和基于微流体的技术，例如在无凝胶蛋白质分离技术中；以及利用基于等重标记的MS的质谱法(MS)，如iTRAQ或无标记方法，如多反应监测(MRM)。
适当的免疫学技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)(夹心ELISA、双夹心ELISA、直接ELISA、微粒ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、免疫沉淀、蛋白质印迹、免疫组织化学染色、抗体阵列、或凝集测定。用于进行这样的技术的方案是容易获得的；例如参见“抗体：实验室手册(AntibodiesaLaboratoryManual)”,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1988)。
用于这样的免疫学技术中的抗体可以购得或根据本领域中的标准方法，在考虑到待测试的蛋白质的性质的情况下产生。举例来说，多克隆抗体和单克隆抗体可以根据教科书“抗体：实验室手册(AntibodiesaLaboratoryManual)”(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1988)中所述的程序，使用所述蛋白质或其片段中的一种或多种作为抗原而产生。优选地，使用单克隆抗体。
用于确定核酸水平(例如cDNA水平)的基于核酸的技术可以包括差异展示程序、RNA印迹、竞争性PCR、定量逆转录酶聚合酶链反应(qRT-PCR)、微阵列分析、以及RNA测序。本发明相关领域的技术人员将容易了解用于进行这些技术的方法。
用于检测(例如使用RNA印迹或竞争性PCR)根据本发明的蛋白质的表达水平的核酸，如寡核苷酸探针和引物将容易由本领域技术人员在考虑到本文所含的信息和有关PRLR的任何公开的氨基酸和/或核酸序列信息的情况下所了解。所述核酸将能够以特异性方式与和PRLR相关的mRNA或cDNA杂交并且在引物的情况下，它们将能够引发PCR或类似反应。
用于本发明中的质谱技术描述于例如“蛋白质和蛋白质组学：实验室手册(Proteinsandproteomics-Alaboratorymanual)”(RJSimpson,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(2002))中。
可以使用标准技术，在考虑到用于检测所述蛋白质或核酸的方法的情况下，将样品中PRLR(包括对一种或多种片段、前体和/或亚型的提及)或编码其的核酸的水平相对于标准进行比较。举例来说，可以使用比色和荧光测定技术，其中将检测分子(如抗体或核酸探针或引物)用可以由肉眼观察或以其它方式使用例如分光光度计或荧光计来检测的分子标记。或者，可以将检测分子用放射性同位素标记。在使用PCR扩增的情况下在所述PCR扩增期间将标记掺入到核酸中(而不是对诸如探针或引物的检测分子进行标记)也被设想。
用于对分子进行标记并且随后测量所产生的信号强度的方法将是本发明相关领域的技术人员已知的。
应当了解的是，除了分析样品和标准之外，本发明的方法还可以包括测试一个或多个阳性对照样品或阴性对照样品以确保结果的完整性。举例来说，可以包括不含蛋白质/核酸的样品和含有已知水平的蛋白质/核酸的一个或多个样品以使得可以在所述方法的不同运行之间对结果进行校准。
可以在分析PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)和/或编码其的核酸之前处理从动物获取的样品以有助于分析所述蛋白质或核酸。本领域技术人员将容易了解适当的处理步骤和适用于执行它们的技术。
在一个实施方案中，可以将有可能使得难以分析，如检测和/或测量PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的水平的高丰度蛋白质从样品中去除。举例来说，可以使用Top6或Top7耗竭法。还可以对样品进行蛋白水解消化。因而，对根据本发明的蛋白质或亚型进行的检测应当被认为包括检测其任何一个或多个片段。片段应当具有足以确保对PRLR的特异性的长度。这样的片段将例如具有至少8个氨基酸的长度，更优选地具有至少10个、15个或20个氨基酸的长度。
用于制备样品以分析编码PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的核酸的处理步骤可以包括裂解细胞；分离mRNA；以及使用诸如逆转录-PCR的标准程序产生cDNA，如将在本发明相关领域中已知的那样。在一个实施方案中，可以原位观测mRNA。
本领域技术人员可以容易了解可以对样品进行处理以用于本发明中的其它手段。
PRLR、前体、片段和/或亚型的活性
在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括观测PRLR(包括对其一种或多种前体、亚型和/或片段的提及)的活性水平。
如本文之前所提到，本申请的发明人设想，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)的活性水平提高则推断了所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。因此，本申请的发明人设想，所述活性水平的任何提高均可以被认为推断所述动物和/或它的后代的提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。类似地，与标准相比所述活性水平降低或基本上没有提高也可以推断所述动物和/或它的后代具有降低的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性、和/或不期望的皮毛质感。
在本发明的某些实施方案中，所述方法可以包括从动物获取样品；观测PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的活性水平；以及将所述活性水平相对于一个或多个标准进行比较。在所述样品中所观测到的活性水平以及所述样品与所述标准之间的任何差异推断了所述动物是否将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的活性水平，所述活性水平与具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的一只动物或多只动物的水平有关。在另一个实施方案中，所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的活性水平，所述活性水平与具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)的水平有关。
在一个实施方案中，与标准(例如具有与具有显著有限的耐热性、显著有限的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感的一只动物或多只动物有关的水平)相比，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的活性水平更高，则推断了所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在一个实施方案中，PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体或片段的提及)的活性水平基本上相似、基本上相同或更低，则推断所述动物将很有可能具有降低的或显著有限的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性和/或不期望的皮毛质感。
在一个实施方案中，在所述标准代表PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)与具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物(或多只动物)的水平有关的活性水平并且所测试的动物具有PRLR(包括对其一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)与所述标准相比基本上相似、基本上相同或更高的活性水平的情况下，推断所述动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。在所测试的动物具有低于所述标准的水平的情况下，可以推断所述动物将很有可能具有降低的或显著有限的或基本上没有提高的耐热性、基本上没有提高的对壁虱的抗性、和/或不期望的皮毛质感。
可以使用本领域已知的标准方法，在考虑到PRLR的功能的情况下来测量PRLR的活性水平。举例来说，所使用的方法可以涉及以下技术中的一种或多种：免疫沉淀、蛋白质印迹、ELISA、质谱法、表面等离子体共振、等温滴定量热法、荧光素酶测定以及报告基因测定。在一个实施方案中，可以通过测量PRLR信号转导下游的一个或多个事件来测量PRLR的活性，如可以使用一种或多种分子的磷酸化。在一个具体实施例中，可以使用如下的方法，所述方法包括用PRLR抗体进行免疫沉淀，继而进行蛋白质印迹或ELISA以测量PRLR信号转导下游的JAK2(Janus激酶2)和/或其它磷酸化分子的酪氨酸磷酸化。还举例来说，可以使用Perot-Applanat等,1997,MolEndo11(8)中所述的方法。
可以使用标准技术，在考虑到用于检测活性的方法的情况下，将样品中PRLR(包括对一种或多种片段、前体和/或亚型的提及)的活性水平以及其中的任何差异相对于标准进行比较。举例来说，可以使用比色和荧光测定技术，其中将检测分子(如抗体或核酸探针或引物)用可以由肉眼观察或以其它方式使用例如分光光度计或荧光计来检测的分子标记。或者，可以将检测分子用放射性同位素标记。然而，举例来说，可以使用Perrot-Applanat等,1997MolEndo11(8)中所述的方法。
应当了解的是，除了分析样品和标准之外，本发明的方法还可以包括测试一个或多个阳性对照样品或阴性对照样品以确保结果的完整性。举例来说，可以包括不含蛋白质的样品和含有具有已知活性水平的蛋白质的一个或多个样品以使得可以在所述方法的不同运行之间对结果进行校准。
可以在分析PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)活性之前处理样品。本领域技术人员将容易了解适当的处理步骤和适用于执行它们的技术。
在一个实施方案中，可以将有可能使得难以分析，如检测和/或测量PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)的活性水平的高丰度蛋白质从样品中去除。举例来说，可以使用Top6或Top7耗竭法。还举例来说，还可以使用对所关注的蛋白质进行的免疫沉淀。
用于制备样品以分析PRLR(包括对一种或多种亚型、前体和/或片段的提及)活性的处理步骤可以包括例如细胞裂解、免疫沉淀以及细胞膜的制备。本领域技术人员将容易了解可以使用的其它有用的技术。
本领域技术人员可以容易了解可以对样品进行处理以用于本发明中的其它手段。
育种和克隆
如本文之前所提到，本发明提供了用于对动物进行育种的方法。本发明的各种方法(如用于确定动物是否很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的那些方法和用于选择动物(例如包括选择它们的配子)的方法)可以用于鉴定用于育种方法中的动物(或例如配子)。这样的方法可以包括鉴定至少一只第一动物(使用如本文所述的一种或多种方法)，所述第一动物具有或被推断很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感；以及使所述动物与第二动物交配。在一个实施方案中，所述方法还可以包括鉴定至少一只第二动物，所述第二动物具有或被推断很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感；以及使所述至少一只第二动物与所述至少一只第一动物交配。举例来说，方法可以包括选择被鉴定为具有如本文所述的一个或多个生物标记的第一动物(以及任选的第二动物)。在一个优选的实施方案中，所述交配将产生一个或多个后代。
本发明还涵盖了育种方法，所述方法包括：1)选择第一配子和/或第二配子并且使所述第一配子与所述第二配子融合以形成合子；2)选择胚胎。本发明还提供了一种克隆动物的方法，所述方法包括使用本发明的方法选择一个或多个细胞。本发明的一种或多种方法(如用于选择或排除一个或多个细胞或胚胎的那些)可以用于鉴定和选择用于这些育种方法的适当的配子和胚胎。举例来说，本发明的这些实施方案的方法可以包括选择被鉴定为具有如本文所述的一个或多个生物标记的配子、胚胎或细胞。
在本发明的育种方法中，可以使用任何适当的方法使动物交配，包括自然、人工授精或IVF。在这些情况下，可以选择单个配子以用于所述过程中。可以使用本发明的方法来选择这样的配子；例如，可以使用本发明的方法来鉴定被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物，并且将来自那些动物的配子选用于育种计划或过程中，或可以根据本发明测试配子，然后将所述配子选用于育种计划或过程中。在一个具体的实施方案中，可以使用选择或排除一只或多只动物的方法(例如根据本文之前所述的本发明的第二个、第十个、第十八个或第二十六个方面)来选择第一动物和/或第二动物并且将它们的配子用于IVF中。在另一个实施方案中，可以使用选择或排除一个或多个细胞的方法(根据本发明的第五个、第十三个、第二十一个或第二十九个方面)来选择第一配子和/或第二配子并且将所选择的配子用于IVF。在选择雄配子和雌配子之后，使雌配子在体外受精。在有关时间，将一个或多个胚胎移植到妊娠载体中。
在一个实施方案中，可以对雌配子进行体外受精，然后使用本发明的方法来确定胚胎是否具有所期望的基因型/表型以及对于进一步用于育种计划中来说是否应当被选择或排除。这在受精之前没有对单个配子、或产生或衍生它们的动物进行测试以确定它们是否有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感的情况下可能进行(因此，本发明应当被认为包括如下的育种方法，其中没有基于这样的测试来选择第一动物和/或第二动物和/或配子，但是对所得的胚胎或后代进行测试和选择)。或者，可以在已经基于具有所期望的基因型/表型对单个配子或产生或衍生它们的动物进行测试和选择的情况下使用本发明的方法以实现质量控制的目的或双重检查所得的胚胎具有相同的所期望的基因型/表型。
任选地，在使动物交配之后，可以使用本发明的一种或多种方法来确定任何后代是否具有或可以被推断为具有如本文之前所述的与PRLR相关的所期望的特征。这样的测试可以在后代的生命期间的任何时间进行，包括在出生之前；仅举例来说，对胚胎、胎儿、羊水、胎盘、母体血液、在出生时进行测试。
在某些情况下，可以使用克隆来产生动物。在这些情况下，所述方法可以包括鉴定至少一只第一动物(使用如本文所述的一种或多种方法)，所述第一动物具有或被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感；以及将来自该动物的一个或多个细胞的核或染色质用于克隆程序中(如体细胞核转移、染色质转移技术、以及胚胎分割)。这些克隆方法描述于例如《牛体细胞核转移(Bovinesomaticcellnucleartransfer)》,RossPJ和Cibelli,JB2010.《分子生物学方法(MethodsinMolecularBiology)》,636:155-177中。在克隆程序期间的相关时间，将一个或多个胚胎移植到妊娠载体中。
在某些实施方案中，克隆程序可以利用源自于细胞系的细胞并且可以使用本发明的方法选择这样的细胞或细胞系，所述细胞或所述细胞系的细胞能够用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。在一个实施方案中，所述细胞系可以是胚胎细胞系。
可以使用本发明的方法选择用于克隆的一个或多个细胞。在选择一个或多个细胞之后，可以进行克隆程序。举例来说，可以使用本发明的方法来鉴定被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物并且将来自那些动物的细胞选用于克隆过程中。类似地，可以使用本发明的方法来鉴定来自细胞系的包含如本文所述的一个或多个遗传改变并且可以用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物的细胞。可以使用本发明的第五个、第十个、第十五个和/或第二十个方面的方法来实现这样的目的。还可以使用本发明的方法来鉴定动物，所述动物的细胞可以用于产生用于克隆目的的细胞系。
在一个具体的实施方案中，可以使用选择或排除一只或多只动物的方法(例如根据本文之前所述的本发明的第二个、第十个、第十八个或第二十六个方面)来选择用于克隆的动物。在另一个实施方案中，可以使用选择或排除一个或多个细胞的方法(根据本发明的第五个、第十三个、第二十一个或第二十九个方面)来选择用于克隆的一个或多个细胞。
任选地，在克隆程序期间的各个阶段时，可以使用本发明的一种或多种方法来确定任何所克隆的动物是否具有或可以被推断为具有如本文之前所述的与PRLR相关的所期望的特征。这样的测试可以在所克隆的动物的生命期间的任何时间进行。仅举例来说，对胚泡、胚胎、胎儿、羊水、胎盘、母体血液、在出生时进行测试。
此外，本发明的克隆方法可以包括在没有针对与提高的耐热性和/或所期望的皮毛质感相关的生物标记的存在或不存在对那些细胞或产生它们的动物或细胞系进行测试的情况下选择所期望的细胞。可以开始所述克隆程序，然后使用本发明的方法来确定由所述克隆程序产生的胚胎、胎儿或动物是否具有根据本发明的相关生物标记并且在胚胎、胎儿或动物具有所期望的基因型/表型的情况下，选择所述胚胎、胎儿或动物。
本发明的育种和克隆方法可以包括对例如一个或多个细胞、合子、胚胎和/或胎儿进行许多标准生长和/或妊娠方法中的任一种。
形成畜群
本发明还提供了用于形成动物的畜群的方法。这样的方法可以包括例如根据本文所述的本发明的第三十六个或第三十八个方面确定动物是否携带与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感有关的生物标记；根据本文所述的本发明的第一个、第九个、第十七个、和/或第二十五个方面确定动物(和/或它的后代)是否很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感；根据如本文所述的本发明的第二个、第十个、第十八个和/或第二十六个方面选择或排除动物；和/或根据如本文所述的本发明的第三个、第十一个、第十九个和/或第二十七个方面估计动物的价值。在某些实施方案中，包括选择或排除一个或多个细胞的本发明的方法也可以用于选择一只或多只动物以纳入畜群中。可以基于本发明的上述方法中的一种或多种的结果针对向畜群中的纳入来选择或排除动物。在某些实施方案中，在动物被鉴定为具有根据本发明的一个或多个生物标记或被推断为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感和/或具有所期望的“价值”的情况下，可以将它选用于纳入畜群中。在动物被鉴定为不具有根据本发明的一个或多个生物标记或被推断为很有可能不具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感或被推断为具有显著有限的耐热性和/或不期望的皮毛质感和/或不具有所期望的“价值”的情况下，可以将它排除并且不选用于纳入畜群中。
在某些实施方案中，将就根据本发明的一个或多个生物标记来说纯合的动物选用于纳入畜群中，尽管这可能不是优选的。
因此，在某些实施方案中，本发明的这个方面的方法包括根据本发明的第一个、第二个、第三个、第五个、第九个、第十个、第十一个、第十三个、第十七个、第十八个、第十九个、第二十一个、第二十五个、第二十六个、第二十七个和/或第二十九个方面中的任何一个或多个的方法测试一个或多个动物或细胞；选择具有所期望的基因型/表型或被推断为具有一个或多个所期望的特征或价值的动物；以及用所选择的动物形成畜群。
本发明还应当被认为包括一种由本文所述的方法形成的畜群。
动物的畜群可以出于任何所期望的原因而形成。然而，仅举例来说，可能期望形成畜群以用于：牛肉养殖；奶类生产；肉类生产；蛋类生产；和/或毛皮、毛发、羊毛、外皮或羽毛生产。
基因编辑方法
如本文之前所指出，本申请的发明人鉴定出PRLR基因中的改变与所期望的皮毛质感和耐热性有关还允许使用克隆和/或基因编辑方法产生具有这样的所期望的表型的动物，在所述方法中，将一个或多个遗传改变引入到PRLR基因中。举例来说，可以将一个或多个特定改变引入到可以用于产生动物的一个或多个细胞中。因此，本发明提供了一个或多个细胞，在所述一个或多个细胞中已经根据本发明引入了一个或多个特定改变。
被引入到PRLR基因中的遗传改变可以具有任何性质，包括一个或多个核苷酸的***、一个或多个核苷酸的缺失、和/或一个或多个核苷酸的取代。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变是提高PRLR活性的改变。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变包括对应于普通牛的染色体20上的位置39136559的位置处的遗传改变。在一个实施方案中，所述一个或多个遗传改变包括对应于普通牛的染色体20上的位置39136559的位置处C的缺失。在其它实施方案中，所述一个或多个遗传改变如本文之前所述。
在一个实施方案中，用于产生动物的一个或多个细胞包括例如单个配子、合子、胚胎、体细胞、来自细胞系的细胞。在一个实施方案中，在使用IVF的情况下，可以将一个或多个遗传改变引入到例如一个或多个配子或合子中。在一个实施方案中，在使用克隆的情况下，可以将一个或多个遗传改变引入到例如一个或多个体细胞或来自细胞系的细胞中。
这样的方法还可以包括在基因编辑步骤之后测试或筛选一个或多个细胞、胚胎、或动物以确保它们包括所期望的遗传改变并且可以推断由所述方法产生的动物将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
可以使用许多标准方法中的任一种根据本发明将一个或多个遗传改变引入到PRLR基因中。然而，举例来说，可以使用TALEN或CRISPR方法。在CRISPR的情况下，可以通过将Cas9mRNA和sgRNA注射到受精卵中来直接修饰胚胎基因组，从而例如使得高效产生在给定基因中携带双等位基因突变的动物。这样的技术描述于例如以下文献中：《大型动物基因组的精确编辑(PrecisionEditingofLargeAnimalGenomes)》,Wenfang(Spring)Tan,DanielF.Carlson,MarkW.Walton,ScottC.Fahrenkrug以及PerryB.Hackett,AdvGenet.2012；80:37-97.doi:10.1016/B978-0-12-404742-6.00002-8；以及《通过CRISPR/Cas介导的基因组工程化单步产生在多个基因中携带突变的小鼠(One-StepGenerationofMiceCarryingMutationsinMultipleGenesbyCRISPR/Cas-MediatedGenomeEngineering)》,HaoyiWang,HuiYang,ChikduS.Shivalila,MeeladM.Dawlaty,AlbertW.Cheng,FengZhang以及RudolfJaenisch.Cell.2013年5月9日；153(4):910-918.doi:10.1016/j.cell.2013.04.025。
在一个实施方案中，育种方法可以涉及IVF。在这个实施例中，可以首先基于单个雄配子和雌配子的遗传优势或其它方面来选择所述单个雄配子和雌配子；对一个或这两个配子进行基因编辑方法以将至少一个所期望的改变引入到PRLR基因中；以及使雌配子在体外受精。或者，可以选择单个雄配子和雌配子，使雌配子在体外受精，然后对受精的合子进行基因编辑方法以将至少一个所期望的改变引入到PRLR基因中。应当了解的是，还可以将一个或多个其它改变引入到配子或合子的基因组中。在有关时间，可以将一个或多个胚胎移植到妊娠载体中。
这个实施方案的方法可以任选地包括进行本文之前所述的本发明的方法以确定任何细胞或动物是否具有所期望的改变以及是否可以推断所述动物将更有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感。这样的测试可以在所述过程以及任何动物的生命期间的任何时间进行。举例来说，对胚泡、胚胎、胎儿、羊水、胎盘、母体血液、在出生时进行测试。在一个实施方案中，在移植到妊娠载体中之前测试胚胎。在另一个实施方案中，在出生时测试动物。
在一个实施方案中，将基因编辑与克隆组合。在这个实施例中，可以首先基于动物的遗传优势或其它方面来选择用于克隆中的动物。可以对来自所述动物的细胞进行基因编辑方法以将至少一个所期望的改变引入到PRLR基因中。然后可以将来自这样的细胞的核用于已知的克隆方法中，如染色质转移、体细胞核转移以及胚胎分割。应当了解的是，在必要时还可以将一个或多个其它改变引入到基因组中。在有关时间，可以将一个或多个胚胎植入到用于妊娠的载体雌性动物中。
这个实施方案的方法可以任选地包括进行本文之前所述的本发明的方法以确定任何所克隆的细胞或动物是否具有所期望的改变以及是否可以推断所述动物将更有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。这样的测试可以在所述过程以及任何动物的生命期间的任何时间进行。举例来说，对胚胎、胎儿、羊水、胎盘、母体血液、在出生时进行测试。在一个实施方案中，在移植到妊娠载体中之前测试胚胎。在另一个实施方案中，在出生时测试动物。
试剂盒
本发明还涉及试剂盒，所述试剂盒用于本发明的方法中。
在一个实施方案中，所述试剂盒包括适用于分析根据本发明的一个或多个遗传标记的至少一种或多种试剂。适用于分析所述标记中的一个或多个的试剂包括如本文所述的一种或多种核酸探针和/或引物。
在另一个实施方案中，所述试剂盒包括至少一种或多种试剂，所述试剂适用于检测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段和/或编码其一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平或活性。
举例来说，在使用免疫学程序的情况下，所述试剂盒可以包括对PRLR(包括对其一种或多种前体、亚型和/或片段的提及)具有特异性的一种或多种抗体。在一个具体的实施方案中，使用ELISA并且所述试剂盒包括针对PRLR(包括对其一种或多种前体、亚型和/或片段的提及)的一种或多种捕获抗体和/或检测抗体。
还举例来说，在本发明的方法包括检测编码PRLR、其一种或多种前体、一种或多种亚型和/或一个或多个片段中的一种或多种的一种或多种核酸的水平的情况下，它可以包括对一种或多种靶核酸具有特异性的一种或多种核酸探针和/或引物。
所述试剂盒还可以包括一个或多个标准和/或其它对照，所述一个或多个标准和/或其它对照包括特定位置处的序列或基因型已知的一种或多种核酸、或含有已知量的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段和/或编码其的一种或多种核酸中的一种或多种。此外，本发明的试剂盒还可以包括有关使用所述试剂盒的组分的说明书以及可以用作可以与由测试样品所获得的结果相比较的标准的打印图表等。试剂可以容纳在任何合适的容器中。
实施例
实施例1
来自塞纳普公牛的***是从新西兰剑桥利明顿格雷斯大街21号的GeneticEnterprises有限公司(GeneticEnterprisesLtd21GraceAve.,Leamington,Cambridge,NewZealand)获得的。使用标准的苯酚/氯仿提取程序从***中提取基因组DNA。使用各种引物对(包括表1中所提供的那些)和KAPA2G稳健PCR***(KAPA生物***公司(KAPABiosystems))来扩增编码催乳素受体的DNA片段。按照制造商的说明书，使用缓冲液A(含有1.5mM氯化镁)和25ng基因组DNA在50μL反应物中进行PCR。按照制造商的说明书进行PCR循环(每次运行30个循环)，所述说明书包括用于退火步骤的55摄氏度至68摄氏度的温度梯度。在72摄氏度将延伸进行60秒。使用1％琼脂糖/TBE凝胶评估PCR产物。通过Sanger测序(奥克兰大学的基因组学、蛋白质组学和代谢组学中心(CentreforGenomics,ProteomicsandMetabolomics,TheUniversityofAuckland))，使用被用于PCR扩增的相同引物对含有足够的并且清洁的产物的PCR反应物进行测序。
表1：
在分析所获得的序列数据时，本申请的发明人已经在PRLR基因中鉴定出先前没有被观测到并且似乎是塞纳普牛独有的遗传改变。
这个改变是39136559delC(位于所述基因的最后一个外显子中)；表2。所述改变的位置是相对于基因库数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中普通牛构建体UMD3.1的染色体20(gi|258513347|ref|AC_000177.1|)上的位置来读取的，如本文之前所详述。本申请的发明人还已经在长型PRLR基因中对所述改变的位置进行了定位(表2)。
使用在乳腺组织中进行的RNA测序，本申请的发明人凭经验确定了牛催乳素受体转录物的结构。这一转录物含有参考PRLR转录物(NCBI基因ID：281422.AC_000177.1)的约120kb的另外的上游5'UTR外显子，这类似于在转录物XM_05221577.1(基因ID：281422)中所看到的那样。实验得到的转录物还具有大得多的3'UTR，它具有约10kb的长度。本申请的发明人使用这一更新的注释来设计PCR引物和代表所有的PRLR外显子、5kb的启动子序列以及3'UTR的扩增子。
表2：
39136559delC被鉴定为是PRLR的最后一个外显子中的移码突变并且因此被预测为对催乳素受体的长型的活性有主要的功能影响。这些数据表明这一移码突变可能是(或至少是)塞纳普牛的耐热性和光滑皮毛的促成性突变；虽然不希望受任何具体理论所束缚，但是本申请的发明人设想，这可能是经由催乳素信号转导通路的激活增强而实现的。
图1和图2图示了普通牛催乳素受体(PRLR)长型(NM_001039726.2)的核苷酸序列(SEQIDNo.4)和氨基酸序列(SEQIDNo.5)，指示了39136559delC的位置。所鉴定出的碱基缺失(C)处于mRNA序列中的位置1466(箭头)和基因组位置39136559处。在这个位置处包括缺失的C的基因的核苷酸序列提供于图3(SEQIDNo.6)中。所引起的移码编码了缬氨酸，继而是引起蛋白质截短的终止密码子(图2)。所观测到的移码突变将经由去除突出显示的序列(图2)而使得蛋白质从581个氨基酸截短成461个氨基酸；以及使新的羧基末端氨基酸从丙氨酸转变成缬氨酸。截短的蛋白质序列示于图4(SEQIDno.7)中。PRLR的长型对于催乳素功能的许多方面来说是重要的。
PRLR的短型的NCBI参考序列NM_174155.2产生了具有296个氨基酸的PRLR变体，这意味着由本申请的发明人所鉴定出的单碱基缺失变体不可能影响这种亚型的氨基酸序列。然而，本申请的发明人认为缺失也可能影响短亚型的功能，这是因为在这种转录物的3'UTR内仍含有所述变体。
所获得的结果与本申请的发明人先前所鉴定出的并且位于催乳素激素基因(PRL)中的突变相关，所述突变与降低的耐热性和‘蓬乱’的皮毛组成表型有关。因此，本申请的发明人认为PRLR基因中的改变是使得塞纳普牛与其它品种的牛相比具有短的、光滑的皮毛和提高的热耐受性或耐热性的原因。这是首次证实了PRLR基因中的改变与塞纳普牛的这些表型之间的直接联系。先前，对于涉及这些牛的短的、光滑的皮毛和提高的耐热性的基因存在一定的不确定性，已经提出了各种其它基因与所述表型相关联。
实施例2
罗曼西品种的牛也已经被报道具有“光滑的”表型。
从五只哥斯达黎加(CostaRican)罗曼西牛获取耳打孔样品以进行PRLR基因分型。将耳打孔样品送到GeneSeek公司(美国内布拉斯加州的林肯(Lincoln,Nebraska,USA))进行DNA提取并且使用SequenomiPLEX(Sequenom公司)对chr20:39136559delCPRLR变体进行基因分型，从而在正向链定向和反向链定向这两者上靶向等位基因。
本申请的发明人在罗曼西品种的两只“光滑”表型动物中鉴定出chr20:39136559delC移码突变。这两只动物就所述缺失(基因型C.Del)来说是杂合的。
这些数据证实了由本申请的发明人所鉴定出的与耐热性和光滑的皮毛有关的移码突变已经在非塞纳普牛中被鉴定出。
实施例3
本申请的发明人将具有塞纳普血统并且包括红色安格斯(RedAngus)和/或图利(Tuli)血统的28只杂交牛作为目标以进行PRLR基因分型。将牛的皮毛定性地评定为光滑的或正常的。
将毛发样品送到GeneSeek公司(美国内布拉斯加州的林肯)进行DNA提取并且使用SequenomiPLEX(Sequenom公司)对chr20:39136559delCPRLR变体进行基因分型，从而在正向链定向和反向链定向这两者上靶向等位基因。
表3示出了有关具有塞纳普血统的28只杂交动物的基因型和表型信息。被定性地分类为具有光滑的皮毛的所有动物均显示出带有chr20:39136559delC处的移码缺失的完全分离。除了单个纯合子(基因型Del.Del)以外，这些动物就所述缺失来说都是杂合的(基因型C.Del)。没有携带所述突变的七只动物(基因型CC)被定性地分类为具有“正常的皮毛”。
表3：
在PLINK1(1.07版，Purcell,S.http://pngu.mgh.harvard.edu/purcell/plink)中，使用显性遗传模型对这些数据进行的分析得出移码缺失与皮毛类型的高度显著相关性(P<0.00000012)。
这些数据证实了由本申请的发明人所鉴定出的移码突变与耐热性和光滑的皮毛强相关。虽然不希望受任何具体理论所束缚，但是本申请的发明人设想，这可能是经由催乳素信号转导通路的激活增强而实现的。
这一数据支持了本申请的发明人的发现，即PRLR基因中的改变是产生短的、光滑的皮毛以及提高的热耐受性或耐热性的原因。这些性状通常存在于塞纳普品种的牛中。所述数据还证实了PRLR基因中的改变与这些表型之间的直接联系。
实施例4
对115只动物进行外显子组测序，这些动物代表了荷斯坦牛(HolsteinFriesian)(N＝10)、娟姗牛(N＝10)、安格斯牛(N＝9)、比利时蓝牛(BelgianBlue)(N＝29)、婆罗门牛(Brahman)(N＝10)、夏洛来牛(Charolais)(N＝10)、尼洛牛(Nelore)(N＝10)、塞纳普牛(N＝9)、西门塔尔牛(N＝10)以及牦牛(Yak)(N＝8)品种。
使用SureSelect靶向序列富集***(TargetEnrichmentSystem)(安捷伦科技公司(Agilent))进行靶向RefSeq、Ensembl、以及人类旁系同源基因的定制捕获，在HiSeq2000上进行101bp配对末端测序。外显子组靶向序列间的平均测序深度是每个样品25×-40×。
在将分析限于在对塞纳普牛和塞纳普牛杂种的独立的分析中所报道的1Mbp共有区间并且过滤到存在于所有塞纳普牛中，但是不存在于其它品种中的非参考变体的情况下，仅得到了chr20:39136559delC处的移码缺失。
这些结果证实了在染色体20的所报道的‘光滑’共有区间中由本申请的发明人所鉴定出的移码缺失存在于“光滑”表型塞纳普牛中，但不存在于被观测到不具有“光滑”表型的动物中。
这些数据进一步证实了由本申请的发明人所鉴定出的移码突变与耐热性和光滑的皮毛强相关。虽然不希望受任何具体理论所束缚，但是本申请的发明人设想，这可能是经由催乳素信号转导通路的激活增强而实现的。
这一数据进一步支持了本申请的发明人的发现，即PRLR基因中的改变是产生短的、光滑的皮毛以及提高的热耐受性或耐热性的原因。这些性状通常存在于塞纳普品种的牛中。所述数据还进一步证实了PRLR基因中的改变与这些表型之间的直接联系。
实施例5
使用基因编辑产生动物
通过用来自所期望的公畜的***使来自所期望的(通常是在生产性能性状方面的高遗传优势)母畜的***在体外受精来产生胚胎。
对于农畜的目标物种，鉴定PRLR基因中的一个或多个遗传改变，例如使得PRLR活性提高的那些。在一个实施例中，鉴定将使由PRLR基因的长型所产生的蛋白质对于牛来说截短到461个氨基酸的长度或对于目标物种来说截短到等同的氨基酸位置的突变。这些突变可以由如塞纳普牛‘光滑’突变中的单碱基缺失、单碱基添加组成，或可以更复杂，从而在PRLR基因中的所期望的位置处产生终止密码子。所述一个或多个遗传改变可以通过参考先前存在的信息或知识(如已知的遗传改变)或通过分析一只或多只动物以鉴定先前未知的所期望的遗传改变来鉴定。
在已经鉴定PRLR基因中的一个或多个适当的遗传变化的情况下，将使用基因编辑工具(如Wang等,2013和Wenfang等,2013中所述的那些)以将一个或多个所期望的碱基变化引入到合子中的PRLR基因中。
在已经进行基因编辑之后，可以使胚胎在体外生长以使得可以获取细胞以验证所述编辑是正确的。然后将所选择的胚胎植入到接受体母牛的子宫中以怀有它们直到足月。
这种程序特别可以使得能够产生高遗传优势雄性，所述雄性可以用于广泛授精以将耐热性特征引入到一群或多群牛、猪、绵羊、山羊或鸡中。
实施例6
经由克隆产生动物
可以使用克隆技术(如由Brophy等,2003.NatureBiotechnology21,157-162所述)将一个或多个所期望的遗传改变引入到动物中。简单地说，这将包括将一个或多个所期望的突变在体外引入到细胞系中以及核转移到去核的***中。
如实施例2中那样，可以使胚胎在体外生长以使得能够对胚胎进行活检和测试以使得能够选择携带所期望的基因型的那些。
已经在本文中参考某些优选的实施方案对本发明进行描述以使得读者能够实施本发明而无需过多的实验。然而，本领域的普通技术人员将容易认识到，可以在某种程度上对许多组分和参数进行改变或改动或用已知的等同物替代而不脱离本发明的范围。应当了解的是，这些改动和等同物被并入本文中，如同单独地对它们进行阐述一般。本发明还包括在本说明书中单独地或共同提到或表明的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征中的任何两个或更多个的任何和所有组合。此外，提供题目、标题等以促进读者对这份文件的理解，并且不应当被视作限制本发明的范围。
在上文和下文所引用的所有申请、专利以及出版物(如果有的话)的全部公开内容在此以引用方式并入本文。然而，在本说明书中对任何申请、专利以及出版物的提及不是并且不应当被视作承认或以任何形式表明它们构成了有效的现有技术或形成世界上任何国家的公知常识的一部分。
在整个本说明书以及所附的任何权利要求中，除非上下文另有要求，否则词语“包含(comprise)”、“包含(comprising)”等将被解释成具有包括性的意义而不是排他性的意义，也就是说具有“包括但不限于”的意义。
Claims (36)
1.一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，其中在所述核酸包括所述一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，所述动物和/或它的后代被确定为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
2.一种用于选择或排除动物、一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自动物、一个或多个细胞或胚胎的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或包括与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
3.一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的核酸以确定它是否包括PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记，其中所述一个或多个遗传变异和/或与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的存在推断了所述动物和/或它的后代将很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
4.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一动物，所述第一动物具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记；以及使所述第一动物与第二动物交配，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二动物具有所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第二动物。
5.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二配子具有所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记的情况下，选择所述第二配子。
6.一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择胚胎，所述胚胎具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
7.一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择一个或多个细胞，所述细胞具有PRLR基因中的一个或多个遗传变异和/或具有与其处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
8.如权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述PRLR基因中的一个或多个遗传改变使得PRLR活性提高。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述方法包括分析来自所述动物的核酸以确定：
它是否包括位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和位置39136649的核苷酸所界定的区域内的一个或多个遗传改变；
它是否包括位于所述PRLR基因的最后一个外显子中的一个或多个遗传改变；
对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的核苷酸；
它是否包括对应于所述对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处C的缺失的遗传改变；和/或
它是否包括与前述各项中的一个或多个处于连锁不平衡状态的一个或多个遗传标记。
10.一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：在所述动物中观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平。
11.一种用于选择或排除动物、一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测动物、一个或多个细胞或胚胎中PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平。
12.一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：观测PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平。
13.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一动物，所述第一动物具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感的一只动物或多只动物；以及使所述第一动物与第二动物交配，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二动物具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的如下水平和/或活性水平的情况下，选择所述第二动物，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性和/或所期望的皮毛质感的一只动物或多只动物。
14.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物或多只动物；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二配子具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的如下水平和/或活性水平的情况下，选择所述第二配子，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物或多只动物。
15.一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择胚胎，所述胚胎具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的一只动物或多只动物。
16.一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择一个或多个细胞，所述一个或多个细胞具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、其一个或多个片段、和/或编码其任何一种或多种的一种或多种核酸中的一种或多种的水平和/或活性水平，所述水平和/或活性水平指示了具有或很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物。
17.一种用于确定动物和/或它的后代是否很有可能将具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异，其中在所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种具有所述一个或多个变异的情况下，所述动物和/或它的后代被确定为很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
18.一种用于选择或排除动物、一个或多个细胞或胚胎的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自动物、一个或多个细胞或胚胎的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种，以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异。
19.一种用于估计动物和/或它的后代的价值的方法，所述方法至少包括以下步骤：分析来自所述动物的PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种以确定它是否包括氨基酸序列中的一个或多个变异，其中所述一个或多个变异的存在推断了所述动物和/或它的后代很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感。
20.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一动物，所述第一动物具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异；以及使所述第一动物与第二动物交配，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二动物具有所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异的情况下，选择所述第二动物。
21.一种用于对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择第一配子，所述第一配子具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异；以及使所述第一配子与第二配子融合以形成合子，所述方法任选地还包括以下步骤：在所述第二配子具有所述PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异的情况下，选择所述第二配子。
22.一种对动物进行育种的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择胚胎，所述胚胎具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
23.一种克隆动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：选择一个或多个细胞，所述一个或多个细胞具有PRLR、其一种或多种前体、其一种或多种亚型、和/或其一个或多个片段中的一种或多种的氨基酸序列中的一个或多个变异。
24.如权利要求17至23中任一项所述的方法，其中所述氨基酸序列中的一个或多个变异包括以下各项中的一个或多个：
使得PRLR活性提高的变异；
使得PRLR被截短的缺失；
位于以下区域内的变异，所述区域从对应于普通牛的PRLR的氨基酸430的位置到对应于普通牛的PRLR的氨基酸490的位置；
使得PRLR在以下区域中被截短的变异，所述区域大致从对应于普通牛的PRLR的位置430的氨基酸位置到对应于普通牛的PRLR的位置490的氨基酸位置；
对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置处丙氨酸被缬氨酸取代；和/或
使得PRLR被截短到对应于普通牛的PRLR的氨基酸位置461的位置的变异。
25.一种用于产生很有可能具有提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感的动物的方法，所述方法至少包括以下步骤：将一个或多个遗传改变引入到用于产生所述动物的一个或多个细胞的PRLR基因中。
26.如权利要求25所述的方法，其中一个或多个遗传改变包括以下各项中的一个或多个：
提高了所述PRLR的活性的改变；
位于由对应于普通牛的染色体20的位置39136469和位置39136649的核苷酸所界定的区域内的改变；
位于所述PRLR基因的最后一个外显子中的改变；
对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处的改变；和/或
所述对应于位置39136559的位置处C的缺失。
27.如权利要求25或26所述的方法，所述方法包括以下步骤：使用如权利要求2、11或18中任一项所述的方法中的任何一种或多种的方法来选择或排除一个或多个动物、细胞或胚胎。
28.一种动物，所述动物是由如权利要求4至7、13至16、20至23或25至27中任一项所述的方法产生的。
29.一种形成畜群的方法，所述方法至少包括以下步骤：
a.执行如权利要求1至3、10至12、或17至19中任一项所述的方法；
b.基于步骤a.的结果选择或排除动物；以及
c.形成所选动物的畜群。
30.一种畜群，所述畜群是使用如权利要求28所述的方法形成的。
31.一种用于在动物中鉴定PRLR基因中的一个或多个遗传变异或PRLR中的一个或多个氨基酸变异的方法，所述一个或多个遗传变异或一个或多个氨基酸变异推断了提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感，所述方法包括鉴定所述PRLR基因中的一个或多个遗传变异或PRLR中的一个或多个氨基酸变异以及确定它是否使得所述PRLR的水平或活性提高。
32.一种用于鉴定动物(和/或它的后代)、一个或多个细胞或胚胎是否具有或可能具有PRLR基因中的一个或多个遗传改变或PRLR中的一个或多个氨基酸变异的方法，所述一个或多个遗传改变或一个或多个氨基酸变异与提高的耐热性、提高的对壁虱的抗性、和/或所期望的皮毛质感相关，所述方法包括观测所述PRLR基因的核酸序列或所述PRLR、其一种或多种前体、其一个或多个片段、和/或其一种或多种亚型的氨基酸序列，以鉴定它是否包括氨基酸变异和/或遗传改变和/或与其处于连锁不平衡状态的遗传标记中的一个或多个。
33.一种分离的核酸，所述核酸在对应于普通牛的染色体20的位置39136559的位置处包含del(C)改变。
34.一种分离的核酸，所述核酸包含SEQIDNo.3的序列或SEQIDNo.6的序列或其任一个的功能上等同的变体或由SEQIDNo.3的序列或SEQIDNo.6的序列或其任一个的功能上等同的变体组成。
35.一种分离的肽，所述肽包含SEQIDNo.7的序列或其功能上等同的变体或由SEQIDNo.7的序列或其功能上等同的变体组成。
36.一种分离的核酸，所述核酸包含SEQIDno.1的序列或SEQIDno.2的序列或其任一个的功能上等同的变体或由SEQIDno.1的序列或SEQIDno.2的序列或其任一个的功能上等同的变体组成。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |