MX2007008623A - Marcadores de adn para el crecimiento de ganado. - Google Patents

Abstract

La invencion provee metodos para identificar un polimorfismo genetico asociado con el aumento del peso de destete en la progenie de ganado vacuno hembra que comprende el polimorfismo; los metodos de seleccion asistida por marcadores geneticos que provee la invencion permiten evitar las pruebas e imprecisiones fenotipicas potencialmente costosas asociadas con esquemas y mejoramientos tradicionales de cria de manadas de ganado vacuno.

Description

MARCADORES DE ADN PARA EL CRECIMIENTO DE GANADO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reclama el beneficio de, y la prioridad a, la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos 60/643,683, presentada en enero 13 de 2005, la cual se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere en general al campo de genética de los mamíferos. Más particularmente, se refiere a marcadores genéticos para la selección de ganado que tiene una predisposición genética para progenie con rasgos de crecimiento superiores.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA Se ha demostrado que es extremadamente difícil identificar las mutaciones causales que sustentan los loci de rasgos cuantitativos (QTL) del ganado, y esto ha obstaculizado severamente la aplicación de la selección asistida por marcadores (MAS) en las especies de ganado comerciales. Se ha esperado que la disponibilidad de una secuencia del genoma completo ayude en la identificación de genes candidatos dentro de una región crítica que alberga un QTL, y también en el diseño de iniciadores de la reacción en cadena de polimerasa para seleccionar para diversidad dentro de las regiones reguladoras codificantes y no codificantes de genes candidatos elegidos como objetivo. Sin embargo, esto no ha superado el problema clave para la identificación de nucleótidos de rasgos cuantitativos (QTN), el reconocimiento de las regiones reguladoras importantes y la identificación de mutaciones causales dentro de estas regiones. El proyecto del genoma humano (HGP) comenzó en 1990 con la expectativa de que la secuencia del genoma humano revelaría los mecanismos genéticos que sustentan la variación humana, en particular la enfermedad, y llevaría a nuevas terapéuticas que pudieran adaptarse individualmente de acuerdo al genotipo del paciente. La llegada del HGP desencadenó un fervor biotecnológico similar en agricultura animal. Un área de éxito ha sido la identificación de QTL asociados con la calidad y cantidad de leche. Se ha mostrado que una sustitución no conservativa de lisina a alanina (K232A) en el gen de acilCoA: diacilglicerol aciltransferasa de bovino (DGAT1 ), es la mutación causativa que afecta la variación en los rasgos de composición y rendimiento de la leche de vacas Holstein (Grisart et al., 2002, 2004; solicitud de patente de E.U.A. publicación No. 20040076977). El alelo de la alanina produce un incremento en el rendimiento general y proteína de la leche, pero disminuye también la grasa de la leche. Aunque el alelo de la alanina está bajo selección positiva en la población Holstein de los Estados Unidos, en la cual se ha seleccionado principalmente para el rendimiento general de leche, se ha seleccionado para el alelo de la lisina en las poblaciones de ganado vacuno para carne de Nueva Zelanda, en donde la grasa incrementada de la leche es de importancia económica primaria (Spelman et al., 2002). Mientras que lo anterior ha sido benéfico para la mejora del ganado lechero, han estado faltando ampliamente técnicas para la mejora del ganado vacuno para carne. La lista de rasgos importantes para la producción de ganado vacuno para carne difiere del ganado lechero, y es extensa. Sin embargo, poca mejora genética para la calidad de la carne o la eficiencia de producción ha ocurrido en las poblaciones de ganado vacuno para carne en los últimos 100 años a pesar del desarrollo de la teoría del índice de selección desde hace más de 60 años. Esto se debe por lo menos en parte a la poca información disponible sobre la cual se toman decisiones de selección para mejorar estos rasgos. Es extremadamente difícil y costoso obtener información de la canal en plantas empacadoras comerciales, y retener la identidad de cada uno de los animales. Por consiguiente, muy pocas asociaciones de crianza de ganado han sido capaces de desarrollar diferencias de progenie esperadas (EPDs), una estimación estadística del valor genético aditivo promedio de un gameto producido por un individuo, y se han dedicado esfuerzos considerables en desarrollar técnicas de ultrasonido en animales vivos que provean medidas indirectas de los rasgos de la canal. Poca a ninguna información está por lo tanto disponible sobre qué decisiones de reproducción deben tomarse para mejorar la eficiencia neta del crecimiento. Debido a la importancia de estos rasgos y a su costo y dificultad de medición, existe una gran necesidad de desarrollar medidas indirectas para la selección de rasgos benéficos en el ganado vacuno para carne, tales como diagnósticos de ADN. Dichas técnicas podrían incrementar ampliamente la productividad de los programas de reproducción y eliminar la necesidad de selecciones fenotípicas costosas o ineficaces.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la invención provee un método para obtener una cabeza hembra de ganado vacuno para carne que comprende una predisposición genética para dar progenie con peso incrementado al destete, el método comprendiendo los pasos de: (a) genotipificar por lo menos una primera cabeza hembra de ganado vacuno para carne para un polimorfismo genético en DGAT1 asociado con peso incrementado al destete en la progenie de ganado vacuno para carne hembra que comprende el polimorfismo; y (b) seleccionar una cabeza hembra de ganado vacuno para carne que tenga el polimorfismo. En modalidades particulares de la invención, el polimorfismo genético puede definirse además como una sustitución de lisina a alanina (K232A) en el gen de DGAT1 de bovino. La genotipificación de la primera cabeza madre hembra de ganado vacuno para carne para la presencia del polimorfismo genético en DGAT1 puede comprender, además de la prueba directa del progenitor hembra, poner a prueba ambos progenitores, o uno de ellos, del progenitor hembra, para determinar el genotipo del primer progenitor hembra. Dicho polimorfismo puede detectarse mediante cualquier método, tanto al nivel de ácido nucleico como de proteína. Un método conveniente para la detección comprende el uso de la reacción en cadena de polimerasa. Esta y otras técnicas son bien conocidas por los expertos en la materia como se describe en la presente más adelante. El material genético puesto a prueba puede comprender, por ejemplo, ADN genómico o ARN. Este puede obtenerse de ganado post-parto, o puede obtenerse de animales fetales, incluyendo de embriones in vitro. La selección puede comprender la transferencia del embrión del embrión, de modo que la primera cabeza de ganado vacuno para carne se desarrolle del embrión. Los métodos de la invención pueden usarse con relación a cualquier tipo de ganado vacuno para carne, incluyendo ganado de las especies Bos indicus y Bos taurus. En otro aspecto, la invención provee un método para reproducir ganado, para aumentar la probabilidad de obtener una cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne que tenga peso incrementado al destete, el método comprendiendo los pasos de: (a) seleccionar una primera cabeza madre hembra de ganado vacuno para carne para la presencia de un polimorfismo genético en DGAT1 , en donde el polimorfismo está asociado con peso incrementado al destete en la progenie del ganado vacuno para carne hembra que comprende el polimorfismo; y (b) reproducir la primera cabeza madre de ganado vacuno para carne con una cabeza madre macho de ganado vacuno para carne para obtener por lo menos una primera cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne que comprende peso incrementado al destete respecto a una progenie de una cabeza hembra de ganado vacuno para carne que comprende el polimorfismo. El método puede comprender además seleccionar la segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne con base en el polimorfismo genético en DGAT1. La selección de la primera cabeza madre hembra de ganado vacuno para carne para la presencia del polimorfismo genético en DGAT1 , puede comprender la prueba directa del progenitor hembra, así como de un progenitor o ambos progenitores del progenitor hembra. En un aspecto de la invención, las técnicas anteriores pueden ser "invertidas", y se usa la selección del genotipo DGAT1 para obtener un alelo que disminuya el peso al destete de las terneras a través de la selección de progenitores con los genotipos DGAT1 adecuados. Dicha selección puede usarse, por ejemplo, para proveer otros beneficios, incluyendo el uso más eficiente de la energía por los animales hembras y la resistencia de los animales. La invención abarca por lo tanto los métodos anteriores, en donde se selecciona para el alelo de la lisina en el aminoácido 232 de DGAT1. En un aspecto de la invención, se provee por lo tanto un método que comprende (a) genotipificar por lo menos una primera cabeza hembra de ganado vacuno para carne para un polimorfismo genético en DGAT1 asociado con peso disminuido al destete en la progenie de ganado vacuno para carne hembra que comprende el polimorfismo; y (b) seleccionar una cabeza hembra de ganado vacuno para carne que tenga el polimorfismo. En modalidades particulares de la invención, el polimorfismo genético puede definirse además como un alelo K232. La invención provee también por lo tanto un método que comprende los pasos de: (a) seleccionar una primera cabeza madre hembra de ganado vacuno para carne para la presencia de un polimorfismo genético en DGAT1 asociado con peso disminuido al destete en la progenie de ganado vacuno para carne femenino, que comprenda el polimorfismo; y (b) reproducir la primera cabeza madre de ganado vacuno para carne con una cabeza madre macho de ganado vacuno para carne, para obtener por lo menos una primera cabeza de progenie de ganado vacuno para carne que comprenda peso disminuido al destete respecto a una progenie de una cabeza hembra de ganado vacuno para carne que carezca del polimorfismo. En un método de la invención, la primera cabeza madre de ganado vacuno para carne o la segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne, o ambas, pueden ser cualquier tipo de ganado vacuno para carne, por ejemplo, una cabeza de ganado vacuno para carne de Bos indicus o Bos taurus. El método puede definirse aún más comprendiendo cruzar una cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne con una tercera cabeza de ganado vacuno para carne para producir una cabeza de descendencia de segunda generación de ganado vacuno para carne. La tercera cabeza de ganado vacuno para carne puede ser un progenitor de la cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne, o puede estar no relacionada con la cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne. En ciertas modalidades de la invención, los pasos mencionados anteriormente se repiten de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces, en donde la primera cabeza madre de ganado vacuno para carne se selecciona de una cabeza de descendencia de ganado vacuno para carne que resulta de una repetición previa del paso (a) y el paso (b), y en donde la segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne es de una raza de ganado seleccionada en la cual se desea introducir peso incrementado al destete. Esta técnica permitirá por lo tanto, por ejemplo, la introducción de la característica benéfica en un fondo genético que de otra manera carece del rasgo, pero que posee otros rasgos deseables.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los siguientes dibujos forman parte de la presente especificación, y se incluyen para demostrar mejor ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor haciendo referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente. La figura 1 muestra los análisis de intervalos (cM de Haldane) para EPDs de la leche de Angus para el cromosoma 14 del ganado que contiene el gen de DGAT1.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS La invención provee, en un aspecto, métodos y composiciones para la mejora del ganado vacuno para carne con respecto al peso al destete de la progenie obtenida del ganado vacuno para carne. Se encontró sorprendentemente que la sustitución no conservativa de lisina a alanina (K232A) en el gen de acílCoA: diacilglicerol aciltransferasa (DGAT1 ) de bovino responsable del rendimiento y la composición de la leche en vacas lecheras Holstein, causa variación en el peso al destete del ganado vacuno para carne. Se encontró que la EPDs de la leche de toros que fueron homocigóticos para un alelo de alanina en DGAT1 es en promedio 2.86 kg mayor para el peso al destete, que de toros que fueron homocigóticos para un alelo de lisina en el mismo locus. Por lo tanto, las hijas de toros que fueron homocigóticos para el alelo de alanina de terneras destetadas, fueron en promedio 2.86 kg más pesadas que las hijas de toros que fueron homocigóticos para el alelo de usina después de que se dio razón de los genes que afectan directamente el crecimiento de un animal. Las técnicas de la invención son significantes porque permiten la mejora del ganado vacuno para carne para un rasgo de ganado vacuno para carne previamente no identificado, sin la necesidad de pruebas fenotípicas costosas o no confiables y selecciones de reproducción manuales. Con los costos crecientes asociados con la inseminación artificial y la reproducción de los animales, cada cabeza de ganado producido representa una inversión sustancial de tiempo y dinero. Los métodos tradicionales de reproducción del ganado han incluido técnicas de reproducción estándar en las cuales se estudian las progenies de los progenitores. Sin embargo, dichas técnicas pueden carecer de precisión debido a variación ambiental o error de la clasificación. Además, la acción compleja de los genes y la interacción entre los genes, pueden complicar la reproducción. Con frecuencia, la selección fenotípica no toma en cuenta eficientemente dicha variabilidad genética. La selección basada en pruebas de ADN, es por lo tanto significante porque permite la mejora del ganado vacuno para carne para peso al destete de la progenie sin el costo y la falta de confiabilidad de las pruebas o selecciones convencionales. El uso de pruebas genéticas que permiten identificar los polimorfismos identificados en la presente asociados con el peso incrementado al destete, encontrará uso en la reproducción o selección de ganado vacuno para carne producido para la matanza, por ejemplo, para la producción de productos cárnicos. De esta manera, una modalidad de la invención comprende un programa de reproducción dirigido a intensificar las características de crecimiento en razas de ganado vacuno para carne adaptadas para la producción de carne, opuestamente al ganado adecuado o usado específicamente para la producción de productos lácteos. Hasta la fecha, dichas técnicas han estado faltando ampliamente para el ganado vacuno para carne. Mientras que el uso de cruzas de B. taurus x ß. indicus ha resultado en la detección de numerosos QTL que afectan el crecimiento así como la composición de la canal, no parece haber ayudado en la identificación de las mutaciones causales que sustentan estos efectos de QTL. Esto puede deberse a una combinación de factores que incluyen: 1 ) la falta de la secuencia del genoma completo para el ganado, 2) experiencia limitada en la identificación de mutaciones reguladoras asociadas con la transcripción, empalme alternativo, estabilidad y localización del ARN mensajero, o la eficiencia de la traducción, y 3) la ocurrencia de SNPs con diferencias alélicas fijas entre B. taurus y B. indicus tan frecuentemente como cada 1700 pb de secuencia codificante que lleva a la enorme dificultad para eliminar candidatos para las mutaciones causales, puesto que las exploraciones del genoma pueden resolver la localización de un QTL sólo a un intervalo de cromosoma de 5 a 20 Mb que contiene de 60 a 240 genes (Heaton et al., 2001 ; White ef al., 2003). La tarea para dilucidar SNPs causales es por lo tanto extremadamente difícil, y ha obstaculizado la implementación de la selección asistida por marcadores fuera de la población en la cual un QTL es detectado inicialmente, puesto que las frecuencias alélicas de QTL y las relaciones de fase de alelos de QTL-marcador se desconocen en las poblaciones comerciales en las cuales se desea la mejora. La disponibilidad de pruebas genéticas para rasgos benéficos del ganado vacuno para carne, representa por lo tanto un avance significante.

I. Selecciones y pruebas genéticas Las selecciones asistidas por pruebas genéticas para la mejora ganadera, son importantes porque permiten que se hagan selecciones sin la necesidad de cría y prueba fenotípíca de la progenie. En particular, dichas pruebas permiten que ocurran selecciones entre individuos relacionados que no necesariamente exhiben el rasgo en cuestión, y que pueden usarse en estrategias de introgresión para seleccionar para el rasgo que será introgresado y contra rasgos de fondo no deseables (Hillel et al., 1990). Sin embargo, ha sido difícil identificar pruebas genéticas para loci que dan rasgos altamente heredables de gran efecto, particularmente ya que muchos de dichos rasgos pueden no estar segregando y son fijados ya con alelos casi óptimos en líneas comerciales. La invención supera esta dificultad, proveyendo dichas pruebas para alelos que están segregando en poblaciones de ganado vacuno para carne. De conformidad con la invención, cualquier prueba que seleccione e identifique animales con base en diferencias alélicas de DGAT1 , puede usarse y se incluye específicamente dentro del alcance de esta invención. El experto en la técnica reconocerá que, habiendo identificado un polimorfismo causal para un rasgo asociado particular, existe un número esencialmente infinito de formas para genotipificar animales para este polimorfismo. Dichas pruebas pueden hacerse al nivel de ácido nucleico y proteína. El diseño de dichas pruebas alternativas representa solamente una variación de las técnicas provistas en la presente, y está de esta manera dentro del alcance de esta invención como se describe enteramente en la presente. Procedimientos ilustrativos se describen en la presente más adelante. Ejemplos no limitativos de métodos para identificar la presencia o ausencia de un polimorfismo, incluyen análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla (SSCP), análisis de RFLP, análisis de heterodúplex, electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante, electroforesis de gradiente de temperatura, reacción en cadena de ligasa y secuenciación directa del gen. Las técnicas que usan detección por PCR™ son ventajosas porque la detección es más rápida, de trabajo menos intensivo, y requieren tamaños de muestra más pequeños. Iniciadores que pueden usarse a este respecto se describen en la solicitud de patente de E.U.A. publicación No. 20040076977, cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. Una porción amplificada por PCR™ del gen de DGAT1 puede seleccionarse para un polimorfismo, por ejemplo, con secuenciación directa de la región amplificada, mediante detección de polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción producidos poniendo en contacto el fragmento amplificado con una endonucleasa de restricción que tenga un sitio de corte alterado por el polimorfismo, mediante PCR™ específica de alelos en la cual los alelos de la lisina y la alanina sean amplificados individualmente por oligonucleótidos iniciadores específicos, así como por medio de análisis SSCP de la región amplificada. Estas técnicas pueden llevarse a cabo también directamente en ácidos nucleicos genómicos sin la necesidad de amplificación por PCR™, aunque en algunas aplicaciones esto puede requerir más trabajo. Una vez que se ha seleccionado un formato de prueba, pueden hacerse no ambiguamente selecciones con base en genotipos puestos a prueba en cualquier momento después de que una muestra de ácido nucleico o proteína pueda colectarse de un individuo, tal como un animal infante, o incluso antes en el caso de la prueba de embriones in vitro o la prueba de la progenie fetal. Cualquier fuente de material genético (incluyendo, por ejemplo, ADN y ARN), o un producto codificado por el mismo, puede analizarse para clasificar el genotipo. En una modalidad de la invención, se seleccionan ácidos nucleicos que hayan sido aislados de la raíz del cabello, sangre o semen del bovino analizado. En general, se usan convenientemente leucocitos de sangre periférica como la fuente, y el material genético es ADN. Una cantidad suficiente de células se obtiene para proveer una cantidad suficiente de ADN para análisis, aunque sólo un tamaño de muestra mínimo se necesitará en donde la clasificación sea por amplificación de ácidos nucleicos. El ADN puede aislarse de las células sanguíneas, por medio de técnicas estándar de aislamiento de ácido nucleico conocidas por los expertos en la materia. En la reproducción asistida por pruebas genéticas, pueden colectarse huevos de hembras seleccionadas, y pueden fecundarse in vitro usando el semen de machos seleccionados, y pueden implantarse en otras hembras para su nacimiento. Pueden usarse en forma ventajosa pruebas con ganado macho y hembra. Mediante el uso de fecundación in vitro, pueden llevarse a cabo pruebas genéticas en embriones en desarrollo en la etapa de 4 a 8 células, por ejemplo, usando PCR™, y pueden hacerse selecciones en consecuencia. Pueden seleccionarse de esta manera embriones que sean homocigóticos para el marcador deseado, antes de la transferencia del embrión. El uso de selección asistida por el genotipo, provee resultados más eficientes y precisos, que los métodos tradicionales. Esto permite también la rápida introducción en, o la eliminación de, un fondo genético particular del rasgo o los rasgos específicos asociados con el marcador genético identificado. En el presente caso, la selección para alelos de DGAT1 que confieren peso incrementado o disminuido al destete, puede usarse para permitir la selección eficiente de hembras que destetarán terneras a menores pesos, y la selección de toros y vacas que producirán hijas que destetarán terneras de mayor peso al destete, según se desee. Pueden usarse pruebas genéticas para obtener información acerca de los genes que influyen sobre un rasgo importante, facilitando de esta manera los esfuerzos de reproducción. Los factores considerados en el desarrollo de marcadores para un rasgo particular incluyen: cuántos genes influyen sobre un rasgo, en dónde se localizan los genes en los cromosomas (por ejemplo, cerca de cuáles marcadores genéticos), cuánto afecta el rasgo cada locus, si el número de copias tiene un efecto (dosificación de genes), pleiotropía, sensibilidad ambiental y epistasis.

Un mapa genético representa el orden relativo de los marcadores genéticos, y sus distancias relativas de algún otro, a lo largo de cada cromosoma de un organismo. Durante la reproducción sexual en organismos superiores, las dos copias de cada par de cromosomas se alinean por sí mismas estrechamente con alguna otra. Los marcadores genéticos que están cerca de algún otro en el cromosoma rara vez se recombinan, y de esta manera se encuentran usualmente juntos en los mismos individuos de la progenie. Los marcadores que están cerca uno del otro muestran un pequeño por ciento de recombinación, y se dice que están ligados. Los marcadores ligados a loci que tienen efectos fenotípicos, son particularmente importantes porque pueden usarse para la selección de individuos que tengan el rasgo deseado. La identidad de un alelo determinado puede determinarse por lo tanto identificando marcadores genéticos cercanos que son usualmente co-transmitidos con el gen del progenitor a la progenie. Este principio se aplica a genes con grandes efectos sobre el fenotipo (rasgos simplemente heredados) y genes con pequeños efectos sobre el fenotipo. Como tal, mediante la identificación de un marcador ligado a un rasgo particular, esto permitirá la selección directa del polimorfismo ligado, sin la necesidad de detectar ese polimorfismo particular debido al ligamiento genético entre los rasgos. Los expertos en la técnica entenderán por lo tanto que cuando se mencionan en la presente pruebas genéticas para DGAT1 , esto abarca específicamente la detección de polimorfismos genéticamente ligados que son informativos para el alelo de DGAT1. Dichos polimorfismos tienen poder profético respecto al rasgo al punto de que están también ligados al locus que contribuye al rasgo. Dichos marcadores tienen también de esta manera potencial profético para el rasgo de interés. La mayoría de las poblaciones naturales de animales son genéticamente bastante diferentes de las poblaciones clásicas de mapeo del ligamiento. Mientras que las poblaciones de mapeo del ligamiento se derivan comúnmente de cruzas de dos generaciones entre dos progenitores, muchas poblaciones naturales se derivan de apareamientos de generaciones múltiples entre una colección de diferentes progenitores, que resulta en un reentremezclado masivo de genes. Los individuos en dichas poblaciones poseen un mosaico complejo de genes, derivados de muchos fundadores diferentes de la población. Las frecuencias génicas en la población como un todo pueden modificarse por medio de selección natural o artificial, o por deriva genética (por ejemplo, azar) en poblaciones pequeñas. Dada dicha población compleja con expresión promedio superior de un rasgo, un criador podría desear: (1 ) mantener o mejorar la expresión del rasgo de interés, mientras que mantiene niveles deseables de otros rasgos; y (2) mantener diversidad genética suficiente, de modo que alelos deseables raros que influyen sobre los rasgos de interés, no se pierdan antes de que su frecuencia pueda ser incrementada por selección. Las pruebas genéticas pueden encontrar utilidad particular para mantener diversidad genética suficiente en una población, mientras que mantienen alelos favorables. Por ejemplo, podría seleccionarse una fracción de la población con base en un fenotipo favorable (quizá para varios rasgos -podría usarse fácilmente el índice de selección), aplicar entonces pruebas genéticas como se describe en la presente a esta fracción, y conservar un subgrupo que represente mucha de la diversidad alélica dentro de la población. Las estrategias para extraer un máximo de variación fenotípica deseable a partir de poblaciones complejas, continúan siendo un área importante de la estrategia de reproducción. Un procedimiento integrado, que combine selección fenotípica clásica con un análisis basado en marcadores genéticos, puede ayudar a extraer genes valiosos de poblaciones heterogéneas. Las técnicas de la presente invención pueden usarse potencialmente con cualquier bovino, incluyendo ganado de las especies Bos taurus y Bos indicus. En modalidades particulares de la invención, las técnicas descritas en la presente se aplican específicamente para la selección de ganado vacuno para carne, ya que las pruebas genéticas descritas en la presente encontrarán utilidad para aumentar al máximo la producción de productos animales, tales como carne. Como se usa en la presente, el término "ganado vacuno para carne" se refiere a ganado desarrollado o criado para la producción de carne u otros productos animales no lácteos. Por lo tanto, una "cabeza de ganado vacuno para carne" se refiere a por lo menos un primer animal bovino desarrollado o criado para la producción de carne u otros productos animales no lácteos. Ejemplos de razas de ganado que pueden usarse con la invención incluyen, pero no están limitadas a, Africander, Alberes, Alentejana, American, American White Park, Amerifax, Amht Mahal, Anatolian Black, Andalusian Black, Andalusian Grey, Angeln, Angus, Ankole, Ankole-Watusi, Argentine Criollo, Asturian Mountain, Asturian Valley, Australian Braford, Australian Lowline, Ba-Bg, Bachaur, Baladi, Barka, Barzona, Bazadais, Beefalo, Beefmaker, Beefmaster, Belarus, Red, Belgian Blue, Belgian Red, Belmont Adaptaur, Belmont Red, Belted Galloway, Bengali, Berrendas, Bh-Bz, Bhagnari, Blanco Orejinegro, Blonde d'Aquitaine, Bonsmara, Boran, Braford, Brahmán, Brahmousin, Brangus, Braunvieh, British White, Busa, Cachena, Canary Island, Canchim, Carinthian Blond, Caucasian, Channi, Charbray, Charoláis, Chianina, Cholistani, Corriente, Costeño con Cuernos, Dajal, Damietta, Dangi, Deoni, Devon, Dexter, Dhanni, Dolafe, Droughtmaster, Dulong, East Anatolian Red, Enderby Island, English Longhom, Evolene, Fighting Bull, Florida Cracker/Pineywoods, Galician Blond, Galloway, Gaolao, Gascón, Gelbray, Gelbvieh, Germán Angus, Germán Red Pied, Gir, Glan, Greek Shorthorn, Guzerat, Hallikar, Hariana, Hays Converter, Hereford, Herens, Highland, Hinterwald, Holando-Argentino, Horro, Hungarian Grey, Indo-Brazilian, Irish Moiled, Israeli Red, Jamaica Black, Jamaica Red, Jaulan, Kangayam, Kankrej, Kazakh, Kenwariya, Kerry, Kherigarh, Khillari, Krishna Valley, Kurdi, Kuri, Limousin, Lincoln Red, Lohani, Luing, Maíne Anjou, Malvi, Mandalong, Marchigíana, Masai, Mashona, Mewati, Mirandesa, Mongolian, Morucha, Murboden, Murray Grey, Nagori, N'dama, Nelore, Nguni, Nimari, Ongole, Orma Boran, Oropa, Parthenais, Philíppine Native, Polish Red, Polled Hereford, Ponwar, Piedmontese, Pinzgauer, Qinchuan, Ratien Gray, Rath, Rathi, Red Angus, Red Brangus, Red Poli, Retinta, Rojhan, Romagnola, Romosinuano, RX3, Sa-Sg, Sahiwal, Salers, Salom, Sanlie, Santa Cruz, Santa Gertrudis, San Martinero, Sarabi, Senepol, Sh-Sz, Sharabi, Shorthorn, Simbrah, Simmental, Siri, Slovenian Cika, South Devon, Sussex, Swedish Red Polled, Tarentaise, Telemark, Texas Longhorn, Texon, Tharparkar, Tswana, Tuli, Ukrainian Beef, Ukrainian Grey, Ukrainian Whitehead, Umblachery, Ural Black Pied, Vestland Red Polled, Vosges, Wagyu, Welsh Black, White Caceres, White Park, Xinjiang Brown y razas de ganado Yanbian, así como animales reproducidos de las mismas y relacionados con las mismas.

II. Detección de ácidos nucleicos Técnicas para la detección de ácidos nucleicos pueden encontrar uso en ciertas modalidades de la invención. Por ejemplo, dichas técnicas pueden encontrar uso en la clasificación de individuos para genotipos, o en el desarrollo de marcadores novedosos enlazados al locus de efecto principal identificado en la presente. 1. Hibridación El uso de una sonda o iniciador que posee entre 13 y 100 nucleótidos, de preferencia entre 17 y 100 nucleótidos de longitud, o en algunos aspectos de la invención hasta 1 a 2 kilobases o más de longitud, permite la formación de una molécula dúplex que es estable y selectiva. Se prefieren generalmente moléculas que tengan secuencias complementarias sobre tramos contiguos mayores de 20 bases de longitud, para incrementar la estabilidad y/o selectividad de las moléculas híbridas obtenidas. Se preferirá en general diseñar moléculas de ácido nucleico para hibridación que tengan una o más secuencias complementarias de 20 a 30 nucleótidos, o incluso más largas, en donde se desee. Dichos fragmentos pueden prepararse fácilmente, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, o introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para producción recombinante. Por consiguiente, pueden usarse secuencias de nucleótidos de conformidad con la invención por su capacidad para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de moléculas de ADN y/o moléculas de ARN, o para proveer iniciadores para amplificación de ADN o ARN a partir de las muestras. Dependiendo de la aplicación prevista, se desearía usar condiciones variables de hibridación para lograr grados variables de selectividad de la sonda o los iniciadores para la secuencia objetivo. Para aplicaciones que requieren alta selectividad, se deseará típicamente usar condiciones de severidad relativamente alta para formar los híbridos, por ejemplo, condiciones de salinidad relativamente baja y/o condiciones de alta temperatura, tales como las provistas por NaCI a aproximadamente 0.02 M a aproximadamente 0.10 M a temperaturas de aproximadamente 50°C a aproximadamente 70°C. Dichas condiciones de alta severidad toleran pocos, si los hay, no apareamientos entre la sonda o los iniciadores y el molde o cadena objetivo, y serían particularmente adecuadas para aislar genes específicos o para detectar transcritos de ARN mensajero específicos. Se aprecia en general que puede hacerse que las condiciones sean más severas por la adición de cantidades crecientes de formamida. Para ciertas aplicaciones, pueden preferirse condiciones de menor severidad. Bajo estas condiciones, puede ocurrir hibridación aún cuando las secuencias de las cadenas hibridantes no sean perfectamente complementarias, pero estén no apareadas en una o más posiciones. Puede hacerse que las condiciones sean menos severas incrementando la concentración de sales y/o disminuyendo la temperatura. Por ejemplo, una condición de severidad media podría ser provista por NaCI a aproximadamente 0.1 a 0.25 M a temperaturas de aproximadamente 37°C a aproximadamente 55°C, mientras que una condición de baja severidad podría ser provista por sal a aproximadamente 0.15 M a aproximadamente 0.9 M, a temperaturas que varían de aproximadamente 20°C a aproximadamente 55°C. Las condiciones de hibridación pueden manipularse fácilmente, dependiendo de los resultados deseados. En otras modalidades, puede lograrse la hibridación bajo condiciones de, por ejemplo, Tris-HCl a 50 mM (pH 8.3), KCl a 75 mM, MgCI2 a 3 mM, ditiotreitol a 1.0 mM, a temperaturas entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 37°C. Otras condiciones de hibridación usadas podrían incluir Tris-HCl a aproximadamente 10 mM (pH 8.3), KCl a 50 mM, MgCI2 a 1.5 mM, a temperaturas que varían de aproximadamente 40°C a aproximadamente 72°C. En ciertas modalidades, será ventajoso usar ácidos nucleicos de secuencias definidas con la presente invención, en combinación con medios adecuados tales como una marca, para determinar la hibridación. Por ejemplo, dichas técnicas pueden usarse para clasificar el genotipo del marcador de FRLP. Una amplia variedad de medios indicadores adecuados se conocen en la técnica, incluyendo ligandos fluorescentes, radiactivos, enzimátícos u otros ligandos, tales como avidina/biotina, los cuales son capaces de ser detectados. En ciertas modalidades, puede desearse usar una marca fluorescente o un marcador de enzimas tales como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos no deseables desde el punto de vista ambiental. En el caso de marcadores de enzimas, se conocen substratos indicadores colorimétricos que pueden usarse para proveer medios de detección que son visiblemente o espectrofotométricamente detectables, para identificar hibridación específica con muestras que contienen ácido nucleico complementario. En general, se prevé que sondas o iniciadores serán útiles como reactivos en hibridación en solución, tal como en PCR™, para la detección de ácidos nucleicos, así como en modalidades que usan una fase sólida. En modalidades que implican una fase sólida, el ADN (o ARN) de prueba es adsorbido o de otra manera adherido a una matriz o superficie seleccionada.

Este ácido nucleico de cadena sencilla fijado, es sometido entonces a hibridación con sondas seleccionadas bajo condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares (dependiendo, por ejemplo, del contenido de G+C, tipo de ácido nucleico objetivo, fuente de ácido nucleico, tamaño de la sonda de hibridación, etc.). La optimización de las condiciones de hibridación para la aplicación particular de interés, es bien conocida por los expertos en la técnica. Después del lavado de las moléculas hibridadas para remover moléculas de la sonda no específicamente unidas, se detecta la hibridación, y/o se cuantifica determinando la cantidad de marca unida. Métodos representativos de hibridación de fase sólida se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,843,663, 5,900,481 y 5,919,626. Otros métodos de hibridación que pueden usarse en la práctica de la presente invención se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,849,481 , 5,849,486 y 5,851 ,772. Las porciones relevantes de estas y otras referencias identificadas en esta sección de la especificación, se incorporan en la presente como referencia. 2. Amplificación de ácidos nucleicos Los ácidos nucleicos usados como un molde para la amplificación pueden aislarse de células, tejidos u otras muestras, de acuerdo a metodologías estándar (véase, Sambrook et al., 1989). Dichas modalidades pueden encontrar uso particular con la invención, por ejemplo, en la detección de polimorfismos de la longitud de repetición, tales como marcadores de microsatélites. En ciertas modalidades de la invención, se realiza análisis de amplificación en homogenizados de células o tejidos enteros o muestras de fluidos biológicos, sin purificación sustancial del ácido nucleico molde. El ácido nucleico puede ser ADN genómico o ARN de una célula fraccionado o entero. En donde se use ARN, puede desearse convertir primero el ARN a un ADN complementario. El término "iniciador", como se usa en la presente, abarca cualquier ácido nucleico que sea capaz de iniciar la síntesis de un ácido nucleico naciente en un procedimiento dependiente del molde. Típicamente, los iniciadores son oligonucleótidos de 10 a 20 y/o 30 pares de bases de longitud, pero pueden usarse secuencias más largas. Los iniciadores pueden proveerse en forma de doble cadena y/o de cadena sencilla, aunque se prefiere la forma de cadena sencilla. Los pares de iniciadores diseñados para hibridar selectivamente con ácidos nucleicos, se ponen en contacto con el ácido nucleico molde bajo condiciones que permitan la hibridación selectiva. Dependiendo de la aplicación deseada, pueden seleccionarse condiciones de hibridación de alta severidad que permitirán sólo hibridación con secuencias que sean completamente complementarias a los iniciadores. En otras modalidades, puede ocurrir hibridación bajo severidad reducida para permitir la amplificación de ácidos nucleicos que contienen uno o más no apareamientos con las secuencias del iniciador. Una vez hibridado, el complejo de molde-iniciador se pone en contacto con una o más enzimas que faciliten la síntesis de ácido nucleico dependiente del molde. Se llevan a cabo rondas múltiples de amplificación, referidas también como "ciclos", hasta que se produzca una cantidad suficiente de producto de amplificación. El producto de amplificación puede detectarse o cuantificarse. En ciertas aplicaciones, la detección puede realizarse por medios visuales. En forma alternativa, la detección puede implicar la identificación indirecta del producto por medio de quimioluminiscencia, escintigrafía radiactiva de marca radiactiva incorporada o marca fluorescente, o incluso por medio de un sistema que usa señales de impulsos eléctricos y/o térmicos (tecnología Affymax; Bellus, 1994). Típicamente, la clasificación de los polimorfismos como variantes de longitud del fragmento se hará con base en el tamaño del producto de amplificación resultante. Están disponibles muchos procedimientos dependientes del molde para amplificar las secuencias de oligonucleótidos presentes en una muestra de molde determinada. Uno de los métodos de amplificación mejor conocidos es la reacción en cadena de polimerasa (referida como PCR™), que se describe en detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195, 4,683,202 y 4,800,159, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia, y en Innis, et al., 1988. Un procedimiento de amplificación por transcriptasa inversa- PCR™ puede llevarse a cabo para obtener ADNc, el cual a su vez puede clasificarse para polimorfismos. Métodos para transcribir en forma inversa ARN en ADNc, son bien conocidos (véase Sambrook et al., 1989). Métodos alternativos para transcripción inversa usan ADN polimerasas termoestables. Estos métodos se describen en el documento WO 90/07641. Las metodologías de reacción en cadena de polimerasa son bien conocidas en la técnica. Métodos representativos de RT-PCR se describen en la patente de E.U.A. No. 5,882,864. Otro método para la amplificación es la reacción en cadena de ligasa ("LCR"), descrita en la solicitud europea No. 320 308, incorporada en su totalidad en la presente como referencia. La patente de E.U.A. No. 4,883,750 describe un método similar a la LCR, para unir pares de sondas a una secuencia objetivo. Puede usarse también un método basado en PCR™ y prueba de ligasa de oligonucleótidos (OLA), descrita en la patente de E.U.A. No. 5,912,148. Métodos alternativos para la amplificación de secuencias de ácido nucleico objetivo que pueden usarse en la práctica de la presente invención, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,843,650, 5,846,709, 5,846,783, 5,849,546, 5,849,497, 5,849,547, 5,858,652, 5,866,366, 5,916,776, 5,922,574, 5,928,905, 5,928,906, 5,932,451 , 5,935,825, 5,939,291 y 5,942,391 , solicitud de Gran Bretaña No. 2 202 328, y en la solicitud del PCT No. PCT/US89/01025, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. La Qbeta replicasa, descrita en la solicitud del PCT No. PCT/US87/00880, puede usarse también como un método de amplificación en la presente invención. En este método, una secuencia replicativa de ARN que tiene una región complementaria a la de un objetivo, se añade a una muestra en presencia de una ARN polimerasa. La polimerasa copiará la secuencia replicativa que puede detectarse entonces. Un método de amplificación isotérmica, en el cual se usan endonucleasas de restricción y ligasas para lograr la amplificación de moléculas objetivo que contienen 5'-[alfa-tio]-trifosfatos de nucleótídos en una cadena de un sitio de restricción, puede ser también útil en la amplificación de ácidos nucleicos en la presente invención (Walker et al., 1992). La amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), descrita en la patente de E.U.A. No. 5,916,779, es otro método para llevar a cabo la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos, que implica rondas múltiples de síntesis y desplazamiento de cadena, es decir, traducción por muesca. Otros procedimientos de amplificación de ácido nucleico incluyen sistemas de amplificación basados en la transcripción (TAS), que incluyen amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA) y 3SR (Kwoh et al., 1989; Gingeras et al., 1990; solicitud del PCT WO 88/10315, incorporada en su totalidad en la presente como referencia. La solicitud europea No. 329 822 describe un procedimiento de amplificación de ácido nucleico que implica sintetizar cíclicamente ARN de cadena sencilla (ARNss), ADN de cadena sencilla (ADNss) y ADN de doble cadena (ADNds), que puede usarse de conformidad con la presente invención. La solicitud del PCT WO 89/06700 (incorporada en su totalidad en la presente como referencia), describe un esquema de amplificación de secuencia de ácido nucleico basado en la hibridación de una secuencia de iniciador/región de promotor con un ADNss objetivo, seguido de transcripción de muchas copias de ARN de la secuencia. Este esquema no es cíclico, es decir, no se producen nuevos moldes a partir de los transcritos de ARN resultantes. Otros métodos de amplificación incluyen "race" y "PCR™ unilateral" (Frohman, 1990; Ohara et al., 1989). 3. Detección de ácidos nucleicos Después de cualquier amplificación, puede ser deseable separar el producto de amplificación del molde y/o el exceso de iniciador. En una modalidad, los productos de amplificación se separan por medio de electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliachlamida, usando métodos estándar (véase, Sambrook et al., 1989). Los productos de amplificación separados pueden ser cortados y eluidos del gel para más manipulación. Medíante el uso de geles de agarosa de bajo punto de fusión, la banda separada puede removerse calentando el gel, seguido de extracción del ácido nucleico. La separación de ácidos nucleicos puede efectuarse también por medio de técnicas cromatográficas conocidas en la técnica. Existen muchos tipos de cromatografía que pueden usarse en la práctica de la presente invención, incluyendo cromatografía de adsorción, partición, intercambio iónico, de hidroxiapatita, de tamiz molecular, de fase invertida, en columna, en papel, en capa delgada y de gases, así como CLAR.

En ciertas modalidades, los productos de amplificación son visualizados. Un método de visualización típico implica la tinción de un gel con bromuro de etidio y visualización de las bandas bajo luz UV. En forma alternativa, si los productos de amplificación son marcados integralmente con nucleótidos radiométricamente o fluorométhcamente marcados, los productos de amplificación separados pueden ser expuestos a película de rayos X, o pueden visualizarse bajo los espectros excitatorios adecuados. En una modalidad, después de la separación de los productos de amplificación, una sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con la secuencia de marcador amplificada. La sonda es conjugada de preferencia con un cromóforo, pero puede ser marcada radiactivamente. En otra modalidad, la sonda es conjugada con un miembro de unión, tal como un anticuerpo o biotina, u otro miembro de unión que posea una porción detectable. En modalidades particulares, la detección es mediante Southern blotting, y la hibridación con una sonda marcada. Las técnicas implicadas en el Southern blotting son bien conocidas por los expertos en la técnica (véase, Sambrook et al., 1989). Un ejemplo de lo anterior se describe en la patente de E.U.A. No. 5,279,721 , incorporada en la presente como referencia, que describe un aparato y método para la transferencia y electroforesis automatizada de ácidos nucleicos. El aparato permite la electroforesis y blotting sin manipulación extema del gel, y es idealmente adecuado para llevar a cabo los métodos de conformidad con la presente invención.

Otros métodos de detección de ácidos nucleicos que pueden usarse en la práctica de la presente invención, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,840,873, 5,843,640, 5,843,651 , 5,846,708, 5,846,717, 5,846,726, 5,846,729, 5,849,487, 5,853,990, 5,853,992, 5,853,993, 5,856,092, 5,861 ,244, 5,863,732, 5,863,753, 5,866,331 , 5,905,024, 5,910,407, 5,912,124, 5,912,145, 5,919,630, 5,925,517, 5,928,862, 5,928,869, 5,929,227, 5,932,413 y 5,935,791 , cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia. 4. Otras pruebas Otros métodos para selección genética pueden usarse dentro del alcance de la presente invención, por ejemplo, para detectar polimorfismos en muestras de ADN genómico, ADNc y/o ARN. Los métodos usados para detectar mutaciones de punto incluyen electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante ("DGGE"), análisis de polimorfismos de la longitud del fragmento de restricción ("RFLP"), métodos de digestión química o enzimática, secuencíación directa de regiones objetivo amplificadas por PCR™ (véase antes), análisis de polimorfismos de conformación de cadena sencilla ("SSCP"), y otros métodos bien conocidos en la técnica. Un método de selección para mutaciones de punto se basa en la digestión de no apareamientos de pares de bases por ribonucleasa en heterodúplex de ARN/ADN o ARN/ARN. Como se usa en la presente, el término "no apareamiento" se define como una región de uno o más nucleótidos no apareados o mal apareados en una molécula de ARN de doble cadena/ARN, ARN/ADN o ADN/ADN. Esta definición incluye de esta manera no apareamientos debidos a mutaciones por inserción/deleción, así como mutaciones de punto de bases individuales o múltiples. La patente de E.U.A. No. 4,946,773 describe una prueba de digestión de no apareamientos por ribonucleasa A, que implica unir muestras de prueba de ARN o ADN de cadena sencilla a una sonda de ARN, y el tratamiento subsiguiente de los dúplex de ácido nucleico con ribonucleasa A. Para la detección de los no apareamientos, los productos de cadena sencilla del tratamiento con hbonucleasa A, separados electroforéticamente de acuerdo a su tamaño, se comparan con dúplex control tratados en forma similar. Las muestras que contengan fragmentos más pequeños (productos de digestión) no vistos en el dúplex control, se clasifican como positivas. Otros investigadores han descrito el uso de ribonucleasa I en pruebas de no apareamiento. El uso de ribonucleasa I para la detección de no apareamientos, se describe en la literatura de Promega Biotech. Promega pone a la venta un equipo que contiene ribonucleasa I que se reporta rompe tres de cuatro no apareamientos conocidos. Otros han descrito el uso de la proteína MutS u otras enzimas reparadoras de ADN para la detección de no apareamientos de una sola base. Métodos alternativos para la detección de mutaciones por deleción, inserción o sustitución que pueden usarse en la práctica de la presente invención, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,849,483, 5,851 ,770, 5,866,337, 5,925,525 y 5,928,870, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia. 5. Equipos Todos los materiales y/o reactivos esenciales requeridos para la selección de ganado para la genotipificación de marcadores genéticos de conformidad con la invención, pueden ensamblarse juntos en un equipo. Esto comprenderá generalmente una sonda o iniciadores diseñados para híbridar específicamente con ácidos nucleicos individuales de interés en la práctica de la presente invención, por ejemplo, secuencias de iniciador tales como aquellas para amplificar DGAT1. Incluidas también pueden ser enzimas adecuadas para amplificar ácidos nucleicos, incluyendo varias polimerasas (transcríptasa inversa, Taq, etc.), desoxinucleótidos y reguladores de pH que proveen la mezcla de reacción necesaria para la amplificación. Dichos equipos pueden incluir también enzimas u otros reactivos adecuados para la detección de ácidos nucleicos o productos de amplificación específicos. Dichos equipos comprenderán en general, en medios adecuados, contenedores distintos para cada reactivo o enzima individual, así como para cada sonda o par de iniciadores.

III. Ejemplos Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Los expertos en la técnica deben apreciar que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen, representan técnicas descubiertas por el inventor que funcionan bien en la práctica de la invención, y de esta manera puede considerarse que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, los expertos en la técnica deben apreciar, a la luz de la presente descripción, que pueden hacerse muchos cambios en las modalidades específicas que se describen, y obtener aún un resultado similar o igual sin que se aparten del espíritu y alcance de la invención.

EJEMPLO 1 Poblaciones de recurso, fenotipos y EPDs Se creó un depósito para muestras de ADN derivadas de por lo menos 1 paja o ámpula de semen (-360 µg de ADN/progenitor en promedio) en 1 ,555 toros Angus emparentados que abarcan 14 generaciones, con el toro más viejo nacido en 1956. Esta población representa los linajes de progenitores principales dentro de la raza Angus, y fue designada como la población Missouri Angus Pedigree (MAP). Dos hijos de Band 234 de Ideal 3163; Tehama Bando 155 (#9891499) y Q A S Traveler 23-4 (#9250717) fueron progenitores Angus populares, y tuvieron 21 y 29 hijos, respectivamente, en el depósito. N Bar Emulation EXT (#10776479) tuvo el número más grande de hijos (N = 69) en el depósito. Todos los progenitores, salvo probands de la familia, tuvieron ADN disponible en sus progenitores, y 77.9% tuvieron también ADN representado en sus antepasados maternos.

Todos los datos del pedigree, EPDs y fiabilidades para 20 rasgos, se obtuvieron de la American Angus Association para estos toros. Además, se obtuvo una colección del Circle A Ranch of Iberia, MO que comprendía muestras de ADN (- 110 µg/novillo) y una base de datos del pedigree y registros fenotípicos sobre la progenie de 5,485 novillos Angus con pedigree producidos en el Círcle A Angus Sire Alliance por acoplamiento con progenitores Angus registrados representados en el MAP. Los datos fenotípicos de novillos disponibles para la población, incluyeron pesos [nacimiento (N = 4,572); destete (4,562)], medidas de ultrasonido de los animales vivos [peso (4,257); grosor de la grasa (4,264); área del ojo de la costilla (4,267); por ciento de grasa intramuscular (4,267)], medidas de la canal [área del ojo de la costilla (4,551 ); clasificación de jaspeadura del USDA (4,564); grado de rendimiento (4,526); grosor de la grasa (4,549); peso de la canal caliente (4,592)] y todos los datos de peso e identificadores de grupo contemporáneos. Datos sobre la ración alimenticia de los animales individuales y el crecimiento estuvieron disponibles para 561 novillos con muestras de ADN y datos de la canal (N = 561 , ultrasonido; N = 341 , canal). Dentro de cada grupo contemporáneo de alimentación, se calculó una ración alimenticia residual (RFl) para novillos usando un modelo de regresión parcial en el cual se hizo retroceder la ración alimenticia diaria promedio en peso medio metabólico y ganancia diaria promedio [(peso al período de alimentación media)075] (Herd et al., 2003).

EJEMPLO 2 Análisis de QTL para loci asociados con el crecimiento Se examinaron BTA2 y BTA14 como posiciones posibles para la identificación de nuevos QTL asociados con el crecimiento. Hubo también un interés en clasificar las mutaciones de SNP en acilCoA: diacilglicerol aciltransferasa (DGAT1 ) (Grisart et al., 2002; 2004), para determinar si los polimorfismos DGAT1 estaban segregando en ganado vacuno Angus, y si es así, poner a prueba efectos fenotípícos posibles en el ganado vacuno para carne. Por consiguiente, se examinó específicamente DGAT1 como un QTL candidato para variación fenotípica en el ganado Angus. Se inició por lo tanto un examen del impacto del peso al destete de las terneras por variaciones de QTL en DGAT1 en el ganado vacuno para carne. Se eligieron primero microsatélites de los mapas genéticos publicados que poseían un gran número de alelos que pudieron clasificarse eficientemente (Barendse eí al, 1997, www.cgd.csiro.au/cgd.html; Kappes et al., 1997, www.marc.usda.gov/genome/genome.html). El iniciador de PCR™ delantero para cada marcador se sintetizó con una de 4 marcas de colorante fluorescente. Se desarrollaron pruebas de PCR™ múltiples basadas en las escalas de tamaño de los alelos, marca fluorescente y la capacidad empíricamente determinada de cada marcador para co-amplificar. Se realizó PCR™ múltiple usando reacciones de 5 µl en un termociclizador ABI 9700 (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) como es descrito por Schnabel et al., (2003). Los productos de PCR™ se separaron en un secuenciador automatizado ABI 3100 o ABI 3700, y se dimensionaron respecto al estándar de tamaño interno GS500 LIZ (Applied Biosystems). Se detectaron señales fluorescentes de los microsatélites marcados con colorante usando GENESCAN v3.1 (Applied Biosystems), y se asignaron genotipos usando Genotyper v3.7 (Applied Biosystems). Se extrajo ADN de los 555 progenitores de MAP, y de los 5,485 novillos Circle A Angus, y se crearon placas maestras de 5 x 384 cavidades para 1361 de los progenitores de MAP y 559 novillos con datos de ración alimenticia y RFl. No se preseleccionaron los marcadores por falta de información debido a la estructura de generaciones múltiples del MAP, y de esta manera hubo interés de que muchos microsatélites podrían no ser informativos en este pedigree de raza pura. En consecuencia, se eligió clasificar los marcadores a una alta resolución (4 cM) para estimar la proporción de marcadores informativos, y para estar seguros de producir mapas a una resolución promedio no menor de 10 cM (40% de marcadores informativos) sin grandes intervalos entre los marcadores. La exploración de BTA2 y BTA14 basada en mícrosatélites en estos 1920 machos, con 56 marcadores de microsatélites múltiples y mutaciones en TG5 (Barendse et al., 2001 ) y DGATI (Grisart et al., 2002; 2004) produciendo 113,637 después de herencias erróneas fue corregida, y se infirieron genotipos faltantes usando GENOPROB (Thallman et al., 2001 a, b). TG5 y DGAT1 fueron genotipificados como RFLPs por PCR™, y clasificados en geles de agarosa: 1.5% para DGAT1 y 3% para TG5 (50% de agarosa estándar y 50% de agarosa NuSieve 3:1 de alta resolución (Cambrex Bioscience, Rockland, ME)). El índice general de genotipos faltantes debido a PCR™ fallida o inyecciones fallidas (en un ABI 3700) fue de 4.6%, y no se hizo intento alguno por volver a introducir los genotipos faltantes. En promedio, se amplificaron 5.8 loci en cada reacción; sin embargo, se introdujeron 2 múltiples con sólo dos marcadores cada uno. La información completa del pedigree que enlaza a todos los animales genotipificados, se reunió para explotar las relaciones entre Angus. Se estimaron las probabilidades de origen de abuelos y el genotipo para cada uno de los animales genotipificados, usando la información del genotipo, mapa y pedigree. Los genotipos individuales con baja probabilidad (pGmx<0.98) estimada por medio de GENOPROB (Thallman et al., 2001 a, b), se excluyeron del análisis posterior. Sólo 2 marcadores no pudieron incorporarse en los mapas genéticos debido a una falta de meiosis informativa (IM) y 36 (64%) producidos en por lo menos 1 ,000 IM. A través de los 58 loci, el número promedio de IM excedió 1180. En 1 ,737 progenitores de MAP Angus y novillos Circle A, la frecuencia del alelo de DGAT1 de lisina fue de 14.8%, siendo 1.6% de los animales homocigóticos para este alelo.

EJEMPLO 3 Los polimorfismos DGAT1 segregan en el ganado vacuno para carne, y contribuyen con variación significativa en el índice de crecimiento de terneras de madres con diferentes genotipos de QTL Se detectó la mutación de DGAT1 K232A como un polimorfismo de la longitud del fragmento de restricción por reacción en cadena de polimerasa en geles de agarosa a 1.5%, en un pedigree extendido de 1361 progenitores Angus para inseminación artificial de la población Missouri Angus Pedigree descrita en el ejemplo 1. A un total de 1250 genotipos DGAT1 se le asignó pGmx>0.98 por GENOPROB, y se usaron en análisis subsiguientes. Se llevó a cabo también la genotipificación de un SNP dentro del gen de tiroglobulina y de 24 loci de microsatélites públicos en BTA14 en este pedigree para realizar un análisis de intervalo de cromosomas entero, que permitió la localización de genes que influyen sobre la variación en rasgos cuantitativos (QTL) hacia una posición específica en un cromosoma. El cuadro 1 contiene las identidades de los marcadores y su posición dentro del mapa genético del cromosoma 14 de bovino que fueron producidos en esta población de mapeo de Angus.

CUADRO 1 Identidad del marcador, número de meiosis informativas y mapa genético de BTA 14 para 24 microsatélites y 2 loci de SNP en un pedigree en el cual 1920 progenitores y novillos Angus Al fueron genotipificados Meiosis BTA141 Multiplex cM de Kosambi informativas DGAT PCR-RFLP 0.0 303 CSSM66 207 9.0 990 DIK4015 201 10.1 1521 BMS1747 203 10.1 1442 DIK4438 202 10.1 439 TG PCR-RFLP 12.0 625 RM180 204 26.9 602 RM011 206 37.0 1892 BMC1207 205 43.6 2153 BL1029 206 48.3 2164 BM1577 201 51.5 1078 BMS108 205 56.8 1404 BMS1304 200 57.8 939 BMS2513 209 59.7 932 BMS1899 207 61.0 1407 BMS947 201 62.7 1296 NRKM020 203 67.7 708 NRKM005 209 69.9 963 DIK2742 205 69.9 996 BM4513 201 71.1 1440 RM66 205 74.7 657 BM2934 202 75.3 1575 BM4305 204 75.5 1257 BL1036 201 87.1 1125 BM6425 202 89.3 1201 BMS2055 200 93.0 1667 Promedio 1183.7 Se usaron GENOPROB (Thallman et al., 2001 a, b) y CRI-MAP (Green et al., 1990) para identificar errores del genotipo, predecir los genotipos faltantes de madres en el pedigree, construir mapas de ligamiento de cromosomas enteros, y estimar haplotipos para la región DGAT1-TG5 en BTA14. Se estimaron las probabilidades de origen de abuelos y el genotipo para cada uno de los anímales genotipificados usando la información del genotipo, mapa y pedigree. Los genotipos individuales con baja probabilidad (pGmx <0.98) estimada por medio de GENOPROB, se excluyeron del análisis posterior. Después, se usó LOKI v2.4.5 (Heath, 1997) para el análisis de QTL de puntos múltiples, ajustando sólo el QTL en el modelo para EPDs de los progenitores, pero ajustando el QTL, una covariable para edad y un efecto poligénico al azar para los fenotipos de los novillos en un análisis simultáneo de BTA2 y BTA14. La figura 1 muestra el análisis del intervalo de BTA14 para "EPDs de la leche" en Angus. Las "EPDs de la leche" no son una medida de la producción de leche, sino más bien estiman el efecto de la capacidad de protección acumulativa sobre el peso al destete de una ternera. De esta manera, las EPDs de un toro para las EPDs de la leche, representan la capacidad genética de un toro para producir hijas que destetarán terneras más pesadas o más ligeras debido a los genes para la capacidad de protección que heredaron de su progenitor. Esta figura demuestra claramente la presencia de un QTL que causa variación en las EPDs de la leche de Angus localizadas en el marcador más centromérico en BTA14, que es DGAT1. Para estimar directamente el efecto de los genotipos DGAT1 sobre las EPDs de la leche de progenitores Angus, se usó ANOVA unidireccional ponderada y de mínimos cuadrados ponderada con pesos de 1-Acc¡ que son proporcionales a las variancias de error de predicción (Acc¡ es la precisión de predicción de EPDs¡), para estimar y poner a prueba la significancia del efecto de DGAT1 sobre las EPDs de la leche en el pedigree de Angus. Los resultados de estos análisis se dan en el cuadro 2. La figura 1 y el cuadro 2 demuestran que DGAT1 causa variación en el índice de crecimiento de terneras de madres de ganado vacuno para carne engendradas por toros con diferentes genotipos DGAT1. Los progenitores homocigóticos para el alelo de alanina de DGAT1 tienen EPDs de la leche que hacen que, en promedio, sus hijas desteten terneras 2.86 kg (o 0.58sG) (P<0.0001 ) más pesadas que sus progenitores homocigóticos para el alelo de lisina. DGAT1 explicó 2% de la variancia en las EPDs de la leche en la población de Angus. La frecuencia del alelo de lisina en 72 toros nacidos antes de 1980 fue de 26.4%, en 217 toros nacidos en la década de los ochenta fue de 17.1 %, en 312 toros nacidos de 1990 a 1994 fue de 17.9%, en 484 toros nacidos de 1995 a 1999 fue de 14.7%, y en 165 toros nacidos de 2000 a 2002, fue de 8.8%. De esta manera, parece ser que la selección aplicada por criadores de Angus sobre las EPDs de la leche que incrementó el peso al destete en la década previa, ha resultado en un incremento en la frecuencia del alelo de alanina en la población de Angus.

CUADRO 2 Análisis de asociación de DGAT1 con EPDs de la leche en el ganado Angus EPDs de la leche (x .454 kg) Genotipo DGAT1 LL LA AA Total Media 10.69 14.00 17.00 16.02 N 24 347 879 1250 Valor genotípico 2a=6.31 d=0.16 VDGATI 2.35 0.25*VA 117.52 VDGAT?/(0.25*VA) (%) 2.00 2a/sqrt(0.25*VA) 0.58 Prueba del genotipo F2?1247=13.72 PO.0001 Todos los métodos descritos y reclamados en la presente, pueden desarrollarse y ejecutarse sin experimentación indebida a la luz de la presente descripción. Mientras que las composiciones y los métodos de esta invención se han descrito en términos de modalidades preferidas, será evidente para los expertos en la técnica que pueden aplicarse variaciones a los métodos en los pasos o en la secuencia de pasos de los métodos descritos en la presente, sin que se aparten del concepto, espíritu y alcance de la invención. Más específicamente, será evidente que ciertos agentes que están químicamente y fisiológicamente relacionados pueden ser sustituidos por los agentes descritos en la presente, mientras que se obtendrían los mismos resultados o resultados similares. Se considera que dichos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la técnica, están dentro del espíritu, alcance y concepto de la invención como se define mediante las reivindicaciones anexas.

REFERENCIAS Las siguientes referencias, al punto de que proveen ejemplos de procedimientos u otros detalles complementarios a los expuestos en la presente, se incorporan específicamente en la presente como referencia. Barendse W et al., 1997. A medium-density genetic linkage map of the bovine genome. Mamm Genome. 8: 21-8. Barendse W, R Bunch, M Thomas, S Armitage, S Baud y N Donaldson. 2001. The TG5 DNA marker test for marbiing capacity in Australian feedlot cattie. Proc. Beef Quality CRC Marblíng Symposium Oct. 9- 10, 2001 , Coffs Harbour pp 30-35. Disponible en: www.beef.crc.org.au/PublicationsMarblingSym/Dayl/Tg5DNA. Bellus, J Macromol. Sci. Puré Appl. Chem., RS3241(1 ): 1355-1376, 1994. Boggs, D. L. y R. A. Merkel. 1984. Live Animal Carcass Evaluation and Selection Manual (2a. ed.) Kendall/Hunt Publishing Company, Dubuque, IA. Boldman, K. G., L. A. Kriese, L. D. van Vleck y S. D. Kachman. 1993. A manual for use of MTDFREML. ARS-USDA, Clay Center, NB. Bradley, D. G., R. T. Loftus, P. Cunningham y D. E. Machugh. 1998. Genetics and domestic cattie origins. Evolut. Anthropol. 6: 79-86. Edens, A. y F. Talamantes. 1998. Altemative processing of growth hormone receptor transcripts. Endocrine Rev. 19: 559-582.

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Claims (18)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un método para determinar la predisposición genética de una cabeza hembra de ganado vacuno para carne para peso incrementado al destete de la progenie de la cabeza de ganado vacuno para carne, que comprende genotipificar la cabeza de ganado vacuno para carne para determinar el genotipo para DGAT1.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la genotipificación comprende determinar el genotipo de por lo menos un progenitor de dicha cabeza de ganado vacuno para carne.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende genotipificar ambos progenitores de dicha cabeza de ganado vacuno para carne.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha cabeza de ganado vacuno para carne es una cabeza de ganado vacuno para carne de Bos indicus o Bos taurus.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque dicha cabeza de ganado vacuno para carne es un ganado vacuno para carne Angus.

6.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende genotipificar una población de ganado vacuno para carne para DGAT1. 7 '.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque comprende identificar por lo menos una primera cabeza de ganado vacuno para carne de la población que comprende un polimorfismo K232A en DGAT1. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende reproducir la primera cabeza de ganado vacuno para carne de la población que comprende un polimorfismo K232A en DGAT1 con una segunda cabeza de ganado vacuno para carne para obtener una cabeza de progenie de ganado vacuno para carne con un peso incrementado al destete respecto a una progenie de una cabeza hembra de ganado vacuno para carne de la misma raza que carece del polimorfismo. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la genotipificación se lleva a cabo poniendo a prueba el material genético de la cabeza de ganado vacuno para carne. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la genotipificación se lleva a cabo mediante PCR. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque la genotipíficación se lleva a cabo mediante hibridación de ácido nucleico. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el material genético es de un gameto. 13.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque el material genético es ADN genómico. 14.- Un método para reproducir ganado vacuno para carne para incrementar el peso al destete, que comprende los pasos de: (a) poner a prueba por lo menos una cabeza hembra candidata de ganado vacuno para carne para identificar una primera cabeza madre hembra de ganado vacuno para carne que comprende un polimorfismo genético en DGAT1 que confiere peso incrementado al destete en la progenie de la cabeza de ganado vacuno para carne; y (b) reproducir la primera cabeza madre de ganado vacuno para carne con una segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne para obtener una cabeza de progenie de ganado vacuno para carne con un peso incrementado al destete respecto a una progenie de una cabeza hembra de ganado vacuno para carne de la misma raza que carece del polimorfismo. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque la segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne comprende dicho polimorfismo genético. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende cruzar dicha cabeza de progenie de ganado vacuno para carne con una tercera cabeza de ganado vacuno para carne para producir una segunda generación de cabeza de progenie de ganado vacuno para carne. 1

7.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque dicha primera cabeza madre de ganado vacuno para carne se selecciona de una cabeza de progenie de ganado vacuno para carne que resulta de una repetición previa de dicho paso (a) y dicho paso (b), y en donde dicha segunda cabeza madre de ganado vacuno para carne es de una raza de ganado seleccionada en la cual se desea incrementar la ocurrencia de dicho polimorfismo. 1

8.- El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque comprende repetir el paso (a) y el paso (b) de aproximadamente 2 a aproximadamente 10 veces. 1

9.- Un método para reproducir ganado vacuno para carne, que comprende: (a) poner a prueba una población de ganado vacuno para carne para la presencia de un polimorfismo K232A en DGAT1 asociado con peso incrementado al destete en la progenie de ganado vacuno para carne femenino que comprende el polimorfismo; (b) seleccionar miembros de la población que comprenden el polimorfismo K232A; y (c) reproducir los miembros seleccionados de la población para producir la progenie de ganado vacuno para carne. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque también comprende: (a) poner a prueba la progenie de ganado vacuno para carne para la presencia de un polimorfismo K232A en DGAT1 asociado con peso incrementado al destete en la progenie de ganado vacuno para carne femenino que comprende el polimorfismo; (b) seleccionar la progenie de ganado vacuno para carne que comprende el polimorfismo K232A; y (c) reproducir la progenie seleccionada de ganado vacuno para carne para producir progenie de ganado vacuno para carne de una generación subsiguiente.