KR20100133319A

KR20100133319A - 표적 특이적인 게놈의 재배열을 위한 표적 특이적 뉴클레아제 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20100133319A
Application number: KR1020100055642A
Authority: KR
Inventors: 김진수; 이형주; 김은지
Original assignee: 주식회사 툴젠; 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-06-11
Filing date: 2010-06-11
Publication date: 2010-12-21
Also published as: WO2010143917A3; JP2012529287A; WO2010143917A2; US20120149115A1

Abstract

본 발명은 게놈상의 DNA를 재배열시키는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 표적 특이적 뉴클레아제를 사용하여 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체, 또는 재배열시키는 방법, 상기 방법에 의하여 DNA가 결실, 중복, 역위, 교체, 또는 재배열된 세포, 상기 표적 특이적 뉴클레아제를 세포내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 게놈상의 특정한 한 부위를 자르는 표적 특이적 뉴클레아제를 사용하여 게놈상에 합성 DNA를 삽입시키는 방법, 상기 방법에 의하여 DNA가 삽입된 세포, 및 상기 표적 특이적 뉴클레아제를 세포내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.

Description

표적 특이적인 게놈의 재배열을 위한 표적 특이적 뉴클레아제 및 이의 용도 {Targeted genomic rearrangements using site-specific nucleases}

현재 유전공학에서 널리 사용되고 있는 DNA재조합 기술은 생명과학 발전에 매우 큰 기여를 하였으며 생명공학 산업의 탄생에 직접적인 동기로 작용했다. DNA재조합 기술의 핵심적 도구는 제한효소이며 시험관 내에서 DNA를 자르고 붙이는 데 사용된다. 그러나 제한효소는 DNA를 너무 자주 자르기 때문에 세포 내에서 게놈 DNA를 재조합하는 데에는 사용할 수 없다. 따라서 현재까지 DNA재조합 기술은 시험관 내에서 DNA를 자르고 붙이는 방법에 국한되어 사용되고 있을 뿐, 세포 내에서 게놈 DNA를 자르고 붙이는 방법은 존재하지 않는다. DNA 염기서열 분석 기술의 발전으로 여러 생명체의 게놈 염기서열이 규명되고 그 결과 게놈 이후 시대를 맞이한 지금, 게놈 엔지니어링을 위한 새로운 기술의 개발이 요구되고 있다. 세포 내 DNA 재조합 기술은 고등 진핵세포와 생명체에서 i) 게놈 DNA 일부를 특이적으로 제거하거나, ii) 합성 DNA 올리고뉴클레오티드 (ODN) 카세트를 게놈의 정해진 장소에 삽입하거나, iii) 게놈 일부와 합성 DNA 분자를 교체하는 것을 의미한다. 세포 내 DNA 재조합 기술의 개발은 생명과학, 의과학, 생명공학에 이르기까지 광범위한 분야에서 새로운 차원의 발전을 가져올 것으로 기대된다.

현재 사용되고 있는 게놈 엔지니어링의 다양한 방법들은 세포 내 DNA 재조합 기술로서는 부족한 점이 많다. 일례로 게놈 엔지니어링을 위해 가장 쉽게 많이 쓰이는 방법은 무작위로 외부 유전자를 게놈에 삽입하는 방법인데 이로 인해 필수적인 유전자가 망가질 수도 있고 외부 유전자와 동반해서 넣어 주는 인핸서, 프로모터로 인해 발현되지 말아야 할 내부 유전자가 활성화되는 경우가 있어 바람직하지 않다. 상동재조합 (Homologous recombination, HR)을 이용한 유전자 적중은 정교하게 게놈 변이를 유도하는 방법이기는 하지만 그 효율이 너무 낮아 대부분의 고등 생명체와 세포에서 널리 사용되지 못하고 있다. Cre와 같은 재조합효소 (recombinase)는 게놈 엔지니어링의 새로운 도구가 될 수 있지만 사전에 이들의 인지 염기서열을 게놈에 삽입해야 한다는 문제가 있고 효소 처리 이후에도 인지 염기서열이 게놈에 그대로 남아 있게 된다는 문제를 수반한다. 전이효소 (transposase) 역시 게놈에 변이를 남기는 문제가 있고 무작위로 작용할 뿐 표적 특이적이지 않다는 제한이 있다.

게놈 엔지니어링의 한 방법으로 10 kbp이상 되는 크기의 DNA를 게놈 상에서 제거하는 방법은 유전자군, 인트론, 엑손, 유전자 사이 영역 등을 선택적으로 제거하는데 쓸 수 있기 때문에 유전학 연구의 새로운 도구가 될 수 있을 뿐 아니라 생명공학 및 유전자치료의 여러 분야에서 널리 활용될 가능성이 있으나, 현재 대부분의 고등 진핵세포에서 표적 특이적으로 게놈 결실을 일으킬 수 있는 편리한 방법은 없다. 생쥐 배아줄기세포에서 Cre/loxP 방법 (Ramirez-Solis et al., 1995) 또는 BAC을 기반으로 한 유전자 적중법 (Valenzuela et al., 2003)을 사용하여 표적 특이적으로 큰 길이의 게놈 DNA 결실을 일으킨 사례가 보고되었다. 하지만, 이러한 방법들은 다른 세포에 비해 상동재조합을 통한 유전자 조작이 보다 쉬운 생쥐 배아줄기세포에 그 적용이 제한되어 있다. 게다가 Cre/loxP 방법은 상동재조합(homologous recombination, HR)을 통한 두 번의 loxP 염기서열의 삽입, 다른 자매염색분체 상이 아닌 동일 염색체 상에 두 loxP가 함께 삽입된 세포의 분리, 중간 DNA를 제거하기 위한 Cre 재조합효소의 처리를 거쳐야 하고, 표적 특이적 결실이 일어난 후에도 게놈 상에 loxP 염기서열을 한 자리 남기게 된다. BAC 기반 유전자 적중법도 BAC 벡터의 거대한 크기로 인해 벡터 준비와 재조합 클론 스크리닝이 어렵다는 단점을 가지고 있다. 더군다나, BAC 벡터의 파손과 부분 삽입으로 인해 위양성 (false positive) 클론을 얻는 경우도 종종 있다 (Gomez-Rodriguez et al., 2008). 따라서, 위와 같은 방법들은 생쥐 배아줄기세포에서조차도 매우 시간과 노력이 많이 드는 방법이며, 현재까지 생쥐 배아줄기세포 외의 다른 포유류 동물세포 또는 식물세포 등에서 미리 정해진 큰 길이의 게놈 일부를 표적 특이적으로 결실을 일으킨 사례는 없었다.

표적 특이적 뉴클레아제 (site-specific nuclease)란 DNA 염기서열을 특이적으로 인식하여 절단할 수 있는 효소를 통칭하는 것으로, 표적 특이적 뉴클레아제의 하나인 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease, 이하, "ZFN"이라 함)는 게놈 엔지니어링을 위한 새롭고 유망한 기술이다. ZFN은 인공 제한효소로서 DNA염기서열을 특이적으로 인식하는 징크 핑거 도메인과 FokI 제한효소로부터 유래한 DNA 절단 도메인으로 구성된다. 재조합효소와는 달리 ZFN은 재프로그래밍이 가능하여 맞춤형으로 게놈상의 특정 장소를 표적으로 하는 ZFN을 손쉽게 만들 수 있다. ZFN은 세포 내에서 표적 염기서열을 인식해 DNA를 절단하여 이중가닥손상 (Double strand break, 이하, "DSB"이라 함)를 유발한다. ZFN에 의해 유발된 세포 내 DSB는 상동재조합 (homologous recombination, HR)과 비상동말단접합(non-homologous end joining, NHEJ)으로 구별되는 세포의 두 가지 내재적 DNA 수선 기작에 의해 수리되는 데 이때 연구자가 원하는 방식으로 표적 특이적 돌연변이를 유도할 수 있다.

지금까지 여러 연구진에 의해 포유동물 배양세포, 식물, 지브라피쉬, 초파리 등에서 특정 유전자를 불활성화시키거나 특정한 변이를 도입하는 데 ZFN을 사용한 사례가 있다. 그러나, 지금까지의 ZFN 기술은 세포 내 게놈의 정해진 장소에서 국지적인 돌연변이를 일으키는 데 사용되었을 뿐, 게놈 DNA 일부를 특이적으로 제거하거나, 합성 DNA 올리고뉴클레오티드(ODN) 카세트를 게놈의 정해진 장소에 삽입하거나, 게놈 일부와 합성 DNA 분자를 교체하는 데에는 이르지 못 했다. 따라서 ZFN은 게놈 엔지니어링의 유망한 도구이기는 하지만 세포 내 DNA 재조합 기술의 도구로서는 부족하였다.

이에 본 발명자들은 ZFN을 이용해 앞서 열거한 게놈의 결실, 삽입, 교체를 유도할 수 있도록 예의 노력한 결과 인간 세포 내 염색체상의 서로 다른 두 부위를 표적으로 2쌍 또는 특정한 두 부위 이상을 절단할 수 있는 ZFN의 쌍을 찾고, 인간 염색체에서 수백 염기쌍에서 15 Mbp 까지의 범위의 게놈 DNA를 제거할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 사용하여 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시킨 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상에 특정한 한 부위를 자르는 단계를 포함하는, 합성 DNA를 삽입시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법을 사용하여 합성 DNA를 삽입시킨 세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 절단하고자 하는 특정한 염기서열을 결정하는 단계; (b) 상기 염기서열을 인식하는 징크 핑거 모듈을 선택하는 단계; (c) 상기 (b) 단계의 징크 핑거 모듈을 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 제조된 징크 핑거 뉴클레아제를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제 (site-specific nuclease)를 사용하여 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는, 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "표적 특이적 뉴클레아제"란 게놈상의 DNA의 특정 위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제를 의미하며, 본 발명의 목적상 게놈상의 특정 위치를 인식하는 도메인과 절단하는 도메인이 융합된 뉴클레아제가 포함될 수 있으며, 그 예로 변형된 메가뉴클레아제 (meganuclease), 게놈상의 특정 위치를 인식하는 도메인인 식물 병원성 유전자에서 유래한 TAL 작동자 (transcription activator-like effector) 도메인과 절단 도메인이 융합된 융합 단백질, 징크 핑거 뉴클레아제가 제한 없이 포함될 수 있으나, 바람직하게는 징크 핑거 뉴클레아제이다.

본 발명에서 용어 "변형된 메가뉴클레아제"란 게놈상의 DNA 10bp 이상을 인식할 수 있는 제한효소인 메가뉴클레아제를 공지의 분자생물학 기법을 이용하여 새로운 DNA 절단 특이성을 갖도록 변형된 효소를 의미한다.

본 발명에서 용어, "징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nuclease)"란 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하는 융합단백질을 의미하며, 공지의 또는 상용의 징크 핑거 뉴클레아제 모두를 포함할 수 있다. 또한, 이에 제한되는 것은 아니나 바람직한 일 실시예에서 사용한 표 3에 기재된 것 중의 하나의 징크 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있다. 본 발명에서 용어, "징크 핑거 뉴클레아제" 와 "ZFN"은 혼용될 수 있다.

징크 핑거 뉴클레아제는 동형이량체 (homodimer) 또는 이형이량체 (heterodimer) 형태인 이량체 (dimer) 형태로 작용할 수 있으며, 이중가닥을 절단하여 본 발명의 원하는 목적을 이룰 수 있다.

이량체(dimers)로서 기능을 하는 징크 핑거 뉴클레아제 (ZFN)의 경우 목적으로 하는 하나의 DNA 부위 (single DNA site)를 인지하기 위하여 두 개의 ZFN 단량체 (monomers)로 구성된다. 두 개의 ZFN 단량체는 5 내지 6 bp 정도의 적당한 거리를 두고 서로 상보적인 DNA 가닥을 인식한다. 또한, 하나의 징크 핑거 모듈은 DNA 3 bp를 인식하여 결합하므로, 징크 핑거 모듈 2개 내지 4개로 구성된 징크 핑거 도메인은 DNA 6 내지 12 bp의 DNA 인지부위에 결합하여 ZFN 한쌍을 구성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "징크 핑거 도메인 (zinc finger domain)"이란 하나 또는 수 개의 징크 핑거 모듈을 통하여 서열 특이성을 갖는 방식으로 뉴클레오티드와 결합하는 단백질을 말한다. 징크 핑거 도메인은 최소 2개 이상의 징크 핑거 모듈을 포함한다. 징크핑거 도메인은 징크핑거 단백질 또는 ZFP로 간략히 표시되기도 한다.

본 발명에서 용어, "징크 핑거 모듈 (zinc finger module)"이란 아연 이온과 배위결합을 하는 동안에 구조가 안정적인 도메인의 내부에 있는 아미노산 서열을 말한다. 본 발명의 징크 핑거 모듈은 자연계에 존재하는 야생형과 동일한 서열로 구성되거나 그 야생형 서열의 일부 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 임의적으로 변형된 서열을 가진다. 상기 야생형 징크 핑거 모듈은 어떠한 진핵세포, 예를 들어 진균 (예로, 효모), 식물 또는 동물 (예로, 인간이나 쥐와 같은 포유동물)로부터 유래할 수 있다. 본 발명에서 사용가능한 징크 핑거 모듈은 공지에 알려진 모듈은 물론 상용의 모듈을 포함할 수 있으며, 이에 제한이 있지 않다. 바람직하게 본 발명의 징크 핑거 모듈은 2개 이상의 징크 핑거 모듈을 사용할 수 있으며, 더 바람직하게는 2개 내지 4개의 징크 핑거 모듈을 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3개의 징크 핑거 모듈을 사용할 수 있으며, 더더욱 바람직하게는 하기 표 1에 기재된 모듈 중에서 선택하여 사용할 수 있다.

징크 핑거 뉴클레아제의 징크 핑거 도메인은 DNA 3 bp를 인식하는 징크 핑거 모듈을 2개 이상 연결한 구조로 되어 있다. 각각의 모듈들은 독립적으로 DNA 염기서열을 인식하기 때문에, 예를 들어 2 내지 4개의 모듈로 구성된 징크 핑거 도메인은 6 또는 12 bp 서열에 결합할 수 있다. 따라서 이량체 (dimer)로 작용하는 징크 핑거 뉴클레아제의 경우 각각 2-4개의 징크 핑거 모듈로 구성된 징크 핑거 뉴클레아제 1쌍은 12-24 bp을 특이적으로 인식할 것이다. 하나의 구체적 예로서, 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제의 징크 핑거 도메인은 2개 이상, 바람직하게는 2개 내지 4개, 더 바람직하게는 3개의 징크 핑거 모듈로 구성되어 있다.

본 발명에서 용어, "절단"은 뉴클레오티드 분자의 공유결합된 백본의 연결을 해제하는 것을 의미하며, "절단 도메인"이란 이러한 뉴클레오티드 절단을 위한 효소적 활성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 의미한다.

상기 절단 도메인은 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 절단 도메인을 얻어낼 수 있는 엔도뉴클레아제의 예로는, 이에 한정되지는 않지만, 제한성 엔도뉴클레아제가 있다. 이러한 효소들은 절단 도메인의 기원으로 사용할 수 있다. 또한, 상기 절단 도메인은 단일의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있을 뿐만 아니라, 그 절단 도메인의 기원에 따라 이중 결합의 뉴클레오티드 서열을 절단할 수 있다. 이러한 의미에서 이중 결합된 뉴클레오티드 서열을 모두 절단하는 절단 도메인을 절단 하프 도메인으로 사용하기도 한다.

제한효소는 많은 부류의 종에 존재하고, DNA (인식 부위)와 서열 특이성 결합이 가능하며, 결합 부위의 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 어떤 제한효소, 예를 들어 타입 IIs는 인식 부위가 제거된 부위에서도 DNA를 절단하여 분리된 결합 도메인과 절단 도메인을 가진다. 예를 들어, 타입 IIs 효소인 FokI는, 하나의 나선에서 인식 부위와 9 뉴클레오티드 떨어진 장소 및 다른 하나의 나선에서 인식 부위로부터 13 뉴클레오티드 떨어진 장소에서 DNA의 이중 나선 절단을 촉진한다.

타입 IIs 제한효소의 예는 FokI, AarI, AceIII, AciI, AloI, BaeI, Bbr7I, CdiI, CjePI, EciI, Esp3I, FinI, MboI, sapI, SspD51 등이 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 보다 구체적인 예는 Roberts et al. (2003) Nucleic acid Res. 31:418-420 등을 참조할 수 있다.

본 발명에서 용어, "융합단백질"이란 상이한 2개 이상의 폴리펩타이드가 펩타이드 결합 (peptide bond)을 통하여 한 가닥의 폴리펩타이드로 연결된 단백질을 의미한다. 상기 폴리펩타이드는 징크 핑거 도메인 및 뉴클레오티드 절단 도메인을 포함하며, 이는 뉴클레오티드 서열 내의 목적하는 부위를 임의적으로 절단할 수 있다. 융합단백질 (또는 융합단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드)을 디자인하고 구축하는 방법은 당해 기술분야에 널리 알려져 있는 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드는 벡터에 삽입될 수 있으며, 삽입된 벡터는 세포 안으로 도입될 수 있다. 일반적으로 융합단백질 (예로, ZFP-FokI 융합)의 징크 핑거 도메인은 융합단백질의 아미노 말단 (N 말단) 근처에, 절단 하프 도메인은 카르복시 말단 (C 말단) 근처에 위치한다. 이것은 FokI 제한효소에 의해 생성되는 자연적인 절단 도메인 이량체에서 절단 도메인의 상대적 위치를 반영하는데, 여기에서도 DNA 결합 도메인은 아미노 말단 근처에 위치하고, 절단 하프 도메인은 카르복시 말단 근처에 위치한다.

본 발명에서 용어, "게놈 (genome)상의 특정한 두 부위"란 게놈상의 절단하고자 하는 부위를 의미하며, 게놈이란 유전자군을 가진 염색체 세트를 의미한다. 본 발명은 목적하는 게놈상의 부위가 서로 다른 두 부위를 의미하는 것으로, 동일하지 않은 부위를 자름으로 인하여 본 발명이 목적하는 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열을 일으킬 수 있다.

상기 "게놈상의 특정한 두 부위"란 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 잘리는 위치로서, 적어도 6개 이상의 염기쌍 이상 떨어져 있는 부위를 의미한다.

바람직한 일 실시태양으로, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 결실시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이며, 더욱 바람직하게는 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 1쌍 또는 2쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있으며, 상기 1쌍의 징크 핑거 뉴클레아제는 서로 다른 부위를 인식할 수 있는 1쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 의미한다. 더더욱 바람직하게는 2쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 사용할 수 있으며, 상기 2쌍의 징크 핑거 뉴클레아제는 동일하거나 상이한 징크 핑거 도메인을 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 각각 서로 다른 징크 핑거 도메인을 가진 징크 핑거 뉴클레아제가 2쌍이 작용하여, 표적으로 삼는 특정한 두 부위 이상을 자를 수 있다. 징크 핑거 뉴클레아제로 제거하려는 게놈 DNA 단편은 세포 내에 내재한 염색체 단편이 될 수 있고, 외부에서 삽입한 트랜스 유전자 카세트 (transgenic cassettes)가 될 수도 있다.

일반적으로, 하나의 징크 핑거 모듈은 3개의 염기쌍을 인식할 수 있으며, 본 발명에서 조합하여 사용할 수 있는 징크 핑거 뉴클레아제는 징크 핑거 모듈을 2개 이상을 사용함으로 인하여, 게놈상의 특정한 두 부위는 징크 핑거 모듈 2개를 사용하였을 때 인식할 수 있는 길이인 적어도 6개의 염기쌍 이상 떨어져 있어야 징크 핑거 뉴클레아제가 작용할 수 있다. 만일 두 징크 핑거 뉴클레아제 사이의 잘리는 DNA의 길이가 5개의 염기쌍 이내가 되면 한 쌍의 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 잘린 DNA에 두 번째 징크 핑거 뉴클레아제가 작용하지 못하게 된다. 왜냐하면 한 쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 구성하는 각각의 단량체 (monomer)는 최소 2개의 징크 핑거 모듈로 구성되어 있고, 이 경우 최소 6개의 염기쌍을 인식하기 때문이다.

본 발명의 바람직한 실시예 1에서 사용한, 인간 유전자인 케모카인 (chemokine: C-C motif) 수용체인 CCR5 와 CCR2는 3번 염색체에 서로 인접하게 위치하고 있으며 두 유전자의 염기서열이 매우 유사하여, 동일한 징크 핑거 뉴클레아제 1쌍이 CCR5와 CCR2 유전자 각각에 절단을 일으켜서, 15 kbp의 결실을 일으키는 것을 확인하여 게놈상의 특정한 두 부위를 자르는 징크 핑거 뉴클레아제 1쌍에 의해 게놈상의 DNA를 결실시킬 수 있음을 확인하였다 (도 2). 도 3에 나타난 바와 같이 절단 접합 부분에서 작은 삽입/결실이 빈번히 일어난다는 사실을 확인하여 징크 핑거 뉴클레아제 인식 자리의 스페이서 염기서열이 일치할 필요가 없음을 발견하였다. 이는 표적 특이적으로 게놈상의 특정한 두 부위를 인식할 수 있는 징크 핑거 도메인을 선택하여 게놈상의 DNA의 결실을 일으킬 수 있음을 의미한다. 또한, 실시예 2에서, 두 쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 사용해 게놈의 결실을 일으킬 수 있는지 확인하기 위해, 유사성이 없는 동일 염색체상의 다른 두 자리를 각각 표적으로 하는 징크 핑거 뉴클레아제 두 쌍을 만들어 실험한 결과, 두 자리 사이의 DNA 결실이 일어났음을 확인하였다 (도 4 내지 6). 또한 실시예 3에서 수십 kbp 이상의 긴 길이의 DNA를 결실 시킬 수 있음을 징크 핑거 모듈 4개로 이루어진 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 확인하였다 (도 7 내지 10).

바람직한 일 실시 태양으로, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 중복시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다. 상기 징크 핑거 뉴클레아제의 특징은 위에서 설명한 게놈상의 DNA를 결실시키는 방법과 동일하다.

두 이중가닥손상이 동일 염색체에서 일어났을 경우 염색분체 내 접합 (intra-sister-chromatidal joining)에 의해 게놈 결실이 일어나는 반면 두 이중가닥손상이 두 개의 자매염색분체에서 따로따로 일어났을 경우에는 염색분체 간의 접합(inter-sister-chromatidal joining)에 의해서 한 염색분체에서는 결실이, 다른 염색분체에서는 중복이 일어나는 것이라고 설명할 수 있다. 본 발명의 게놈상의 특정 부위의 중복은 유전자 개수 (gene dosage)의 증가를 초래할 수 있다. 징크 핑거 뉴클레아제에 의한 중복은 항상 결실을 수반하게 됨으로 한 세포 내에서 중복된 유전자의 숫자는 변화가 없지만 생식세포분열이 일어난 후 수정이 되면 한 세포 내에서 3 개, 4 개로 증가할 수 있다. 따라서 본 발명의 중복시키는 방법은 식물과 동물의 특정 유전자 개수를 증가시켜 유용한 개체를 만드는데 쓰일 수 있다.

이와 같은 게놈상의 중복은 실시예 4에서 서로 다른 부위를 절단시키는 징크 핑거 뉴클레아제 2쌍을 발현시켜서 확인하였다 (도 12 내지 14).

바람직한 일 실시 태양으로, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 역위시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다. 상기 징크 핑거 뉴클레아제의 특징은 위에서 설명한 게놈상의 DNA를 결실시키는 방법과 동일하다.

게놈 역위는 게놈의 일부가 원래의 게놈과 비교할 때 거꾸로 배치된 것을 의미한다. 게놈 역위는 종종 암 세포와 유전병 환자 세포에서 발견된다. 예를 들어 체르노빌 원자력 발전사고를 통해 방사선에 노출되어 생긴 갑상선암 환자의 경우 10번 염색체에 500 kbp 부분이 역위 되어 있고 (Nikiforov et al., 1999; Nikiforova et al., 2000), 절반 가까운 중증 혈우병 환자에서 X염색체의 인자VIII을 포함한 DNA 역위가 발견된바 있다 (Lakich et al., 1993). 본 발명의 게놈의 역위를 이용하면 상기와 같은 질병의 예방과 치료에 큰 도움이 될 것이다

게놈의 역위는 실시예 5에서 게놈상의 특정한 두 부위를 자르는 징크 핑거 뉴클레아제를 발현시켜, 같은 방향을 가리키는 프라이머 쌍을 이용한 실험으로 확인하였다 (도 15 및 16). 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제를 이용할 경우, I-SceI를 사용할 때와 달리 사전에 게놈상에 변이를 도입할 필요 없이 맞춤형으로 징크 핑거 뉴클레아제를 제작함으로써 역위를 일으킬 수 있다.

바람직한 일 실시태양으로, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 dsODN (double stranded oligonucleotide)와 같은 합성 DNA로 교체시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다. 상기 징크 핑거 뉴클레아제의 특징은 위에서 설명한 게놈상의 DNA를 결실시키는 방법과 동일하다.

삽입, 교체에 사용될 수 있는 DNA 분자는 합성된 올리고뉴클레오티드 카세트 이외에도 클로닝된 긴 길이의 프로모터, 인핸서, 유전자 등을 고려할 수 있다. 이때 삽입하려는 DNA의 5' 돌출부위를 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 생성되는 게놈상의 이중가닥손상이 5' 돌출부위와 상보적으로 만들어서 일정 방향으로 외부 DNA를 삽입하는 것이 가능할 것이다. 본 발명의 교체시키는 방법을 이용하면 세포 내에서 낮게 발현되는 유전자 앞에 강력한 프로모터, 인핸서를 삽입하여 그 유전자의 발현을 활성화시킬 수도 있고 반대로 강력한 프로모터 뒤에 관심 유전자를 삽입하여 그 유전자의 발현을 높일 수도 있을 것이다. 삽입과 교체에 사용할 DNA 분자는 다양한 화학적 치환을 포함할 수 있다. 5' 돌출 부위에 적적한 화학적 변화를 가해 DNA 분해 효소에 의해 분해되는 것을 막을 수 있다. 예를 들어 포스포티오에이트 수식 (phosphothioate modification)을 이용하여 돌출부위를 보호할 수 있다.

삽입, 교체는 게놈 DNA의 일부를 다른 위치로 옮기는 데에도 사용할 수 있다. 즉 1번 염색체상에 있는 유전자 A를 2번 염색체의 유전자 B와 교체하는 것도 가능할 것이다. 이를 위해서는 유전자 A의 양쪽에 각각 작용하는 ZFN 두 개와 유전자 B에 작용하는 ZFN 두 개를 만들어서 세포 내에서 함께 발현시켜야 한다. 이러한 게놈 셔플링은 유전자와 염색체의 상호작용을 연구하는 데 중요한 기여를 할 수 있을 것이고 작물과 어류, 가축의 게놈을 개량하는 데에도 쓰일 수 있을 것이다.

게놈의 교체는 실시예 9에서 게놈 상에서 결실과 삽입이 동시에 이루어져서 교체가 이루어질 수 있는지를 조사하여 교체가 이루어질 수 있음을 확인하였다 (도 29).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시킨 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다.

상기 세포는 세포는 E. coli와 같은 원핵세포, 또는 이스트, 진균, 원생동물, 고등 식물, 곤충과 같은 진핵 세포, 또는 양서류 세포, 또는 CHO, HeLa, HEK293, COS-1과 같은 포유류 세포 등, 예를 들어 배양된 세포 (시험관내), 이식편 및 1차 배양물 (시험관내 및 생체외), 및 생체내 세포일 수도 있으며, 인간을 포함한 포유류의 세포 등 당업계에서 통상적으로 사용되는 세포로 그 제한을 두지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 한 부위를 자르는 단계를 포함하는, 합성 DNA를 삽입시키는 방법에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다.

본 발명자들은 징크 핑거 뉴클레아제를 이용해 인간 배양세포에서 게놈상의 DNA 결실을 일으킬 수 있다면 삽입도 일으킬 수 있을 것이라고 추론하여서 실시예 7에서 합성 DNA 올리고뉴클레오티드를 삽입하여 올바르게 삽입되었는지 여부를 확인하였다 (도 23 내지 25). 또한 실시예 8에서 원하는 위치로의 합성 DNA 올리고뉴클레오티드가 삽입되는 지 여부를 확인하였다 (도 26 내지 28). 두 개의 이중가닥손상이 선행되어야 하는 결실과는 달리 삽입은 한 개의 이중가닥손상이 선행하는 것으로 충분하다.

바람직한 일 실시태양으로, 합성 DNA는 DNA 합성기를 이용하여 만든 두 가닥의 올리고뉴클레오티드를 담금질하여 만들 수 있다. 이때 올리고뉴클레오티드 5' 말단에 인산기 (phosphate group)을 붙일 수도 있고 아니면 인산기가 없는 상태 그대로 사용할 수도 있다. 바람직하게는 담금질하여 만든 합성 DNA가 5' 말단에 4 bp 또는 5 bp의 돌출부위를 가지고 있고 이 돌출부위 염기서열이 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 절단되어 형성된 게놈 상의 절단 부위의 돌출된 염기서열과 상보적이 되도록 만든다.

바람직한 일 실시태양으로, 합성 DNA는 PCR을 이용해 만들 수 있다. 이와는 또 다른 방법으로 합성 DNA는 플라즈미드와 같은 벡터에 클로닝된 DNA를 제한효소로 처리하여 얻은 DNA 조각이 될 수도 있다.

상기 합성 DNA의 염기서열은 연구자가 원하는 변이에 따라 마음대로 그 길이와 서열 자체를 설계할 수 있다. 일례로 stop codon을 지정하고 있는 합성 DNA를 게놈상의 유전자 중간에 삽입하여 그 유전자 발현을 중단시킬 수도 있고 GFP, FLAG tag과 같은 아미노산 서열을 프레임을 맞추어 삽입할 수도 있다. 합성 DNA는 cDNA 전체 또는 일부가 될 수도 있고 인핸서, 프로모터, 엑손, 인트론 등이 될 수도 있다.

상기 징크 핑거 뉴클레아제는 1쌍을 사용할 수 있다. 바람직한 일 실시태양으로 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 2개 이상의 징크 핑거 모듈을 포함할 수 있다. 바람직하게는 상기 징크 핑거 모듈은 표 1에 기재된 모듈 중에서 선택될 수 있다. 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 뉴클레오티드 서열을 절단하는 작용을 함에 있어서 이량체 형태로 작용할 수 있다. 바람직하게는 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 표 3에 기재된 것 중의 하나일 수 있다.

징크 핑거 뉴클레아제를 이용해 게놈상에 합성 DNA를 삽입하거나 교체하는 방법은 상동재조합을 이용한 유전자 적중법에 의한 게놈 엔지니어링에 비해 두 가지 면에서 큰 장점이 있다. 첫째, 유전자 적중법은 그 효율이 매우 낮다. 둘째, 유전자 적중법을 사용하기 위해서는, 삽입하고자 하는 염기서열 양쪽에 상동 팔 (homology arm)을 최소 1 kbp 이상 포함하는 유전자 적중 벡터를 만들어야 한다. 이에 비해 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제를 이용한 삽입, 교체는 유전자 적중 벡터를 만들 필요가 없고 높은 효율로 변이를 일으킬 수 있다는 장점이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제에 게놈상의 특정한 한 부위를 자르는 단계를 포함하여 합성 DNA를 삽입시킨 세포에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다.

합성 DNA의 삽입은 결실, 중복, 역위, 교체 등과 달리 게놈상의 특정한 한 부위의 절단에 의해서 일어날 수 있다. 삽입을 위해서는 징크 핑거 뉴클레아제의 한 쌍의 사용으로도 가능하다. 본 발명의 삽입 방법을 이용하면 고등 진핵세포에서 합성 DNA를 재현성 있게 게놈상의 특정 장소에 삽입할 수 있을 것이다.

바람직한 실시 태양에서 합성 DNA의 삽입을 PCR 결과로 확인하였다 (도 23 내지 25). 대부분의 클론들이 작은 결실이나 삽입이 없이 합성 DNA 카세트가 완벽하게 징크 핑거 뉴클레아제에 의해 절단된 위치에 삽입되었음을 관찰하여, 합성 DNA 카세트를 설계할 때 이중가닥손상의 돌출부위 염기서열과 상보적으로 만들어서 원하는 변이를 정확히 유도할 수 있음을 확인하였다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 특이적 뉴클레아제를 이용한 게놈 수술 방법 (zinc finger nuclease-induced genome surgery, 이하, "ZiGS"라 함)에 관한 것이다. 바람직하게 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제이다.

본 발명의 방법을 사용하면 고등 진핵세포 및 개체에서 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 표적 특이적으로 게놈 결실과 역위를 일으킬 수 있으며, 이를 이용하여 관심 게놈의 유전자군을 삭제할 수 있다. 동물 실험이나 생체 외 실험에서 한 개의 유전자를 녹아웃 (knock-out)시켰을 때 아무런 표현형의 변화를 보이지 않는 경우가 종종 있는데 이런 무변화는 대부분 상동 유전자의 존재 때문이다. 흥미롭게도, 상동 유전자는 게놈상에서 군을 이루는 경향이 있다. 예를 들면, 본 발명의 바람직한 실시예에서 사용한 CCR2와 CCR5는 염색체 3p21부위에 바로 옆에 서로 인접해서 위치하고 있다. 본 발명의 징크 핑거 뉴클레아제를 사용하면 동일 세포에서 한 염색체 안에 군을 이루고 있는 상동 유전자들을 한 번에 제거할 수 있으며, 징크 핑거 뉴클레아제에 의한 게놈 결실을 이용하면 유전자 사이 염기서열과 인트론을 선택적으로 제거할 수 있다. 징크 핑거 뉴클레아제를 이용하여 질병과 관계된 유전자를 줄기세포나 체세포에서 선택적으로 제거할 수 있다. 유전자 사이 영역이나 인트론 부분의 다른 두 자리를 표적으로 하면 프로모터나 엑손을 제거할 수 있다. 더군다나, 프로모터를 포함하는 DNA 조각을 표적 특이적으로 제거하게 되면, 관심유전자를 완벽하게 녹아웃시켜 표현형을 100% 없앨 수 있다. 이처럼 ZiGS는 고등 진핵세포와 개체에서 게놈 결실, 역위를 유도하는데 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 절단하고자 하는 특정한 염기서열을 결정하는 단계; (b) 상기 염기서열을 인식하는 징크 핑거 모듈을 선택하는 단계; (c) 상기 (b)단계의 징크 핑거 모듈을 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제를 제조하는 단계; 및 (d) 상기 제조된 징크 핑거 뉴클레아제를 세포내로 도입시키는 단계를 포함하는 징크 핑거 뉴클레아제를 세포 내에서 발현시키는 방법에 관한 것이다.

상기 (a) 단계의 뉴클레오티드 서열은 세포 내 또는 외에 존재할 수 있으며, 그 길이의 제한은 없다. 또한 상기 뉴클레오티드 서열은 원형 배치, 단일 사슬 또는 이중 사슬의 형태로 존재할 수 있다.

상기 (b) 단계는 상기 염기 서열을 인식하는 징크 핑거 모듈을 선택하는 단계로 징크 핑거 모듈은 공지의 모듈은 물론 상용의 모듈 모두를 사용할 수 있으며, 새롭게 합성할 수도 있다.

상기 (c) 단계의 징크 핑거 모듈은 2개 이상의 모듈을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 2개 내지 4개의 모듈을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3개의 모듈을 포함할 수 있다. 또한, 바람직하게는 제조하는 징크 핑거 뉴클레아제는 다른 부위를 인식할 수 있는 1쌍일 수 있으며, 또는 다른 부위를 인식할 수 있는 2쌍일 수 있다. 더 바람직하게는 2쌍의 징크 핑거 뉴클레아제를 제조할 수 있다.

상기 (d) 단계의 세포내로 도입시키는 방법은 당업계에 알려진 공지의 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 형질감염 (transfection) 또는 형질도입 (transduction)에 의해 외래 DNA를 세포로 유입시킬 수도 있다. 형질감염은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 형질감염법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 (d) 단계의 징크 핑거 뉴클레아제의 세포 내에서 발현은 당업계에 알려진 어떠한 방법도 사용할 수 있으며, 그 예로는 벡터를 이용할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 서열 및 인핸서 같은 발현 조절 인자 외에도 분비를 위한 시그널 서열 등을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

참고문헌

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본 명세서에서 언급되는 특허 및 특허출원을 포함하는 모든 참고문헌은 가능한 한 전체적인 범위로 본 발명에 참고문헌으로서 포함된다.

본 발명의 인간 게놈상의 긴 길이의 결실, 중복, 역위, 교체, 삽입, 재배열을 시킬 수 있는 표적 특이적 뉴클레아제, 구체적으로 징크 핑거 뉴클레아제의 쌍을 이용하여, 특이적인 게놈의 결실을 통해 관심 게놈상의 유전자군을 삭제하거나 줄기세포 연구와 유전자 치료, 및 중복을 통하여 유전자 개수의 증가를 통한 식물과 동물의 특정 유전자 개수를 증가시켜 유용한 개체를 생성하거나, 역위를 통한 암세포와 유전병 환자의 치료의 도구로 사용하거나, 교체 및 삽입을 통한 작물과 어류, 가축을 개량하거나, 궁극적으로는 표적 특이적 뉴클레아제, 구체적으로 징크 핑거 뉴클레아제에 의한 게놈 수술을 통한 특이적으로 원하는 유전자를 변형 시킬 수 있는 효과가 있다.

도 1은 ZFN에 의한 CCR2와 CCR5 사이의 결실을 도식화한 것이다. 지그재그 선은 ZFN 표적 위치를 의미한다. F2와 R5 (화살표)는 게놈 결실을 탐지하기 위해 사용된 PCR 프라이머이다. DSB, 이중가닥손상.
도 2는 ZFN으로 처리한 세포 게놈 DNA의 PCR 분석을 나타낸다. p3는 음성 대조군으로 사용된 빈 (empty) 플라스미드이다.
도 3은 PCR 산물의 DNA 염기서열을 나타낸다. PCR 증폭 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. CCR2와 CCR5사이에 보존되어 있지 않은 염기는 소문자로 표시하였다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 4는 ZFN에 의한 CCR5 내 두 종류의 게놈 결실을 도식화한 것이다. F5와 R5 (화살표)는 CCR5 코딩 염기서열 증폭에 사용된 프라이머이다.
도 5는 CCR5 내 두 종류의 결실을 보여주는 PCR 분석결과를 나타낸다. 상기 도 4에서 예상하는 것과 같이 야생형 PCR 산물 (1,060 bp)과 함께 결실이 일어난 PCR 산물 (①199 bp와 ②331 bp)을 얻었다. p3는 음성 대조군으로 사용된 빈 (empty) 플라스미드이다.
도 6은 ZFN에 의한 CCR5 내 두 종류의 게놈 결실이 일어난 절단 접합 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. CCR2와 CCR5사이에 보존되어 있지 않은 염기는 소문자로 표시하였다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 7은 긴 길이 결실을 나타내는 것으로 염색체상의 ZFN 표적 위치를 나타낸다. 3번 염색체 일부를 확대한 곳에서 각 ZFN의 표적 위치를 화살표로 표시하였다.
도 8은 긴 길이 결실을 보여주는 PCR 분석결과를 나타낸다. 7쌍의 새로 만든 ZFN을 각각 HEK293 세포에서 S162과 함께 발현시켰다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 목록은 표 2에 정리되어 있다.
도 9는 긴 길이 결실이 일어난 절단 접합 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 10은 긴 길이 결실이 일어난 절단 접합 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 11은 ZFN에 의한 중복을 도식화한 것이다. F5와 R2 (화살표)는 게놈 중복을 탐지하기 위해 사용된 PCR 프라이머이다.
도 12는 ZFN에 의한 중복을 탐지하는 PCR 분석결과를 나타낸다. p3는 음성 대조군으로 사용된 빈 플라스미드이다.
도 13은 ZFN에 의한 중복이 일어난 절단 접합 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸다. CCR5 염기서열은 검은색, CCR2 염기서열은 회색으로 표시하였다. 중복이 일어난 염기서열은 CCR5 코딩 부위의 5부분과 CCR2 코딩 부위의 3부분이 직접 연결되어 있다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. CCR2와 CCR5사이에 보존되어 있지 않은 염기는 소문자로 표시하였다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다.
도 14는 새로운 ZFN 조합으로 일으킨 중복에서 보이는 절단 접합 부분의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다.
도 15는 ZFN에 의한 역위를 도식화한 것이다. 절단 접합 자리 1 (Breakpoint junction 1)을 탐지하기 위해서는 PCR 프라이머 F_A와 F_B가, 절단 접합 자리 2 (Breakpoint junction 2)를 위해서는 R_A와 R_B가 사용되었다. Cleaved, ZFN에 의해 염색체가 절단된 상태를 의미한다; Flipped, 잘린 부위의 DNA가 180도 회전한 상태를 의미한다; Inverted, 비상동말단접합 (NHEJ)에 의해 절단 부위가 접합된 상태를 의미한다.
도 16은 역위를 보여주는 PCR 분석결과를 나타낸다. 6쌍의 새로 만든 ZFN을 각각 HEK293 세포에서 S162과 함께 발현시켰다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 목록은 표 2에 정리되어 있다.
도 17은 역위가 일어난 절단 접합 자리의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 18은 역위가 일어난 절단 접합 자리 1의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다.
도 19는 역위가 일어난 절단 접합 자리 2의 DNA 염기 서열을 나타낸다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다.
도 20은 클론 세포 분석을 나타내는 것으로 클론 세포의 CCR2와 CCR5 의 ZFN 표적 자리 DNA 염기서열을 나타낸다. 게놈 결실이 일어난 염색체와 결실이 일어나지 않은 염색체의 염기 서열을 표시하였다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 마이크로호몰로지와 삽입 염기는 각각 밑줄과 이탤릭체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 21은 클론 세포 분석을 나타내는 것으로 서던 블롯 분석결과를 나타낸다. CCR2 주위의 DNA를 프로브로 사용하면 게놈 결실이 일어났을 때에만 생성되는 DNA 밴드 (9.7 kb)를 확인할 수 있다. X, XbaI 제한효소 자리를 나타낸다. S162, ZFN 표적 자리를 나타낸다. 흰색 화살표, CCR2 코딩 부위를 나타낸다. 회색 화살표, CCR5 코딩 부위를 나타낸다. WT, 야생형 HEK293 세포를 나타낸다.
도 22는 ZFN에 의한 DNA 삽입 (insertion)과 교체 (replacement)를 도식화한 것이다. 지그재그 선은 ZFN 표적 위치를 의미한다. F와 R (화살표)은 게놈내 삽입과 결실을 탐지하기 위해 사용된 PCR 프라이머이고 OF와 OR은 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. dsODN cassette는 OF와 OR을 담금질하여 만든 것이다.
도 23는 ZFN과 합성 DNA로 처리한 세포 게놈 DNA의 PCR 분석을 나타낸다. p3는 음성 대조군으로 사용된 빈 (empty) 플라스미드이다. OR-30, OR-891은 dsODN 카세트를 구성하는 한 개의 ODN 가닥을 의미한다. F-30, F-891은 합성 DNA 삽입을 관찰하기 위해 사용한 프라이머다.
도 24는 Z30과 dsODN 카세트를 처리한 세포 게놈으로부터 얻은 PCR 산물의 DNA 염기서열을 나타낸다. PCR 증폭 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 25는 Z891과 dsODN 카세트를 처리한 세포 게놈으로부터 얻은 PCR 산물의 DNA 염기서열을 나타낸다. PCR 증폭 산물을 클로닝하여 염기서열을 분석하였다. ZFN 표적 위치는 볼드체로 나타내었다. 대시(-)는 결실된 염기를 나타낸다. 괄호 안은 해당 염기서열이 동일하게 나온 횟수이다. WT는 야생형 DNA 염기서열을 의미한다.
도 26 내지 28은 ZFN (S162)에 의한 CCR5 유전자 내의 dsODN의 삽입의 결과를 확인한 도면이다. 형광 PCR (fluorescent PCR) 방법을 이용해 음성대조군으로 사용한, ZFN을 발현시키지 않은 세포 게놈 DNA (도 26)와 ZFN을 발현시킨 세포 (도 27), 그리고 ZFN 과 dsODN 카세트를 함께 처리한 (도 28) 세포 게놈 DNA를 분석한 결과를 나타낸다. *표지는 ZFN에 의해 일어난 작은 DNA 결실에 의해 형성된 PCR 산물에 해당하고, **는 ZFN에 의해 발생한 5-bp DNA 삽입에 의한 결과이다. ZFN에 의한 dsODN 카세트 삽입 결과는 ***표지로 나타내었는데, 다른 대조군에서는 보이지 않는 피크임을 알 수 있다. 표시한 숫자는 각 피크의 면적을 나타내는데 이는 각 피크에 해당하는 DNA의 양에 비례한다.
도 29는 ZFN에 의한 게놈 DNA 교체를 나타낸 도면이다. ZFN으로 처리한 세포로부터 CCR2-CCR5 사이의 15-kbp DNA 결실을 확인할 수 있는 PCR을 수행한 후 이를 EcoRI 효소로 절단했다. 각각의 래인은 음성대조군으로 사용한 p3를 처리한 세포 게놈과 ZFN을 처리한 세포, 그리고 ZFN 과 dsODN 카세트를 함께 처리한 세포 게놈을 EcoRI 효소로 절단한 결과를 나타낸다. 화살표는 dsODN 카세트에서 유래한 EcoRI으로 잘린 DNA 단편을 나타낸다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: CCR5 - CCR2 결실

<1-1> CCR5 - CCR2 결실

Kim et al., (2009) 방법에 의해 CCR5 유전자를 표적으로 하는 ZFN들을 제작하였고, 이들 CCR5 표적 ZFN중 대부분은 CCR2의 유사한 자리에도 동일하게 작용할 수 있으므로, 상기 ZFN들이 이들 두 자리에 각각 표적특이적인 돌연변이를 일으킬 뿐만 아니라 게놈 상에서 긴 길이의 결실을 일으킬 수 있는지를 알아보았다.

ZFN 발현 플라스미드를 HEK 293 (Human embryonic kidney 293) 세포에 형질감염 (transfection)한 3일 후에 게놈 DNA를 분리하여 게놈 결실을 탐지할 수 있는 DNA 증폭실험의 주형으로 사용하였다. DNA 증폭을 위해 CCR2와 CCR5 부분에 해당하는 게놈상에서 16 kbp 떨어져 있는 두 프라이머를 사용하였다 (도 1). 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 정리되어 있다.

그 결과, 음성 대조군으로 사용한 ZFN을 발현시키지 않은 세포로부터는 DNA가 증폭되지 않았고, CCR5와 CCR2 유전자 내에 각각 표적 장소를 가지고 있는 7개의 서로 다른 ZFN들을 각각 발현시킨 세포로부터는 증폭된 DNA 조각을 얻을 수 있었다 (도 2). 증폭된 DNA의 길이는 약 1 kbp로서, 두 ZFN 표적 위치 사이가 염색체로부터 결실되었을 때 예상되는 길이와 일치하였다. 반면, Z30과 Z266은 (여기서 숫자는 DNA 절단이 일어나는 염기의 대략적인 위치를 CCR5 유전자의 개시 코돈을 기준으로 표시한 것이다) CCR2 유전자에 인식 자리가 보존되어 있지 않기 때문에 아무런 DNA도 증폭되지 않고, 이는 게놈 결실이 일어나지 않았다는 결과이다.

이러한 결과는 ZFN이 인간 세포 내에서 긴 길이의 DNA 결실을 일으키기 위해서는 염색체상에서 이중가닥손상 (double-strand breaks, DSBs)을 한 자리가 아니고 두 자리에서 일으켜야 한다는 사실을 의미한다.

<1-2> CCR2 - CCR5 결실 염기서열 분석

증폭된 DNA 조각을 클로닝하여 DNA 염기서열을 분석한 결과, 실제로 CCR2와 CCR5 유전자 사이의 15-kbp DNA가 결실되고 양끝이 접합 된 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 절단 접합 부분 (breakpoint junction)의 염기서열은 ZFN에 의해 DNA 절단이 일어난 패턴과 일치하였다. ZFN은 이량체 (dimer)로서 기능을 하는데 각 단량체 (monomer)는 9-bp 또는 12-bp의 절반 자리 (half-site)를 인식하게 되고 이 두 절반 자리는 5-6 bp의 스페이서로 떨어져 있다. ZFN은 스페이서 내부를 절단하고 그 결과 4-bp 또는 5-bp의 5' 돌출 (overhang)이 만들어진다(Smith et al., 2000). PCR에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다. PCR 산물의 염기서열은 CCR2의 절반 자리 A와 CCR5의 절반 자리B가 바로 이어졌고 그 사이의 15-kbp DNA, 즉, CCR2의 다른 절반 자리 B에서부터 CCR5의 절반 자리 A까지 제거된 상태를 보여주었다. 또한 절단 접합 부분(breakpoint junction)의 염기서열에서는 15-kbp 결실에 더하여 작은 크기 (1-14 bp)의 삽입/결실이 관찰 되었다 (도 3). 이러한 작은 삽입/결실 돌연변이 양상은 비상동말단접합 (non-homologous end-joining, 이하, "NHEJ"이라 함)이 일어났을 때 보이는 전형적인 결과이다. 이와 더불어 1-5 base의 마이크로호몰로지(microhomologies)가 접합 부분에서 관찰되었다 (도 3).

절단 접합 부분에서 작은 삽입/결실이 빈번히 일어난다는 사실은 게놈 결실을 일으키기 위해서 두 ZFN 인식 자리의 스페이서(spacer) 염기서열이 일치할 필요가 없음을 의미한다. 이 점에서 본 실험에서 사용한 상가모 (Sangamo Biosciences, Inc.)의 CCR5 표적 ZFN을 주목할 필요가 있다. (이 ZFN은 Perez et al.(Perez et al., 2008)에서 ZFN-215로 명명되었지만, 혼란을 피하기 위해 본 명세서의 명명법을 따라서 S162로 표기하기로 한다). 우리가 사용한 다른 6개의 ZFN은 CCR5와 CCR2 자리에서 스페이서 염기서열이 동일하게 보존되어 있지만, S162는 두 자리에서 다른 돌출 염기서열을 만든다. 즉, S162에 의해 CCR5에서는 5' CTGAT가 형성되고 CCR2에서는 5' ATTAA (도 3에는 이에 대한 상보 서열을 기재)가 형성된다. 이러한 돌출 서열은 DNA 수선이 일어날 때 채워지거나 제거된다. 그 결과 S162를 발현시켰을 때 특이적인 15-kbp의 게놈 결실이 관찰 되었다(도 2 및 3).

실시예 2: 두 쌍의 ZFN 에 의한 결실

<2-1> 두 쌍의 ZFN 에 의한 결실

비대립유전자 간의 상동 재조합 (non-allelic homologous recombination)에 의한 DNA 수선이 일어났는지를 확인하기 위해, 유사성이 없는 두 자리를 표적으로 하는 서로 다른 두 쌍의 ZFN이 동일 염색체상의 다른 두 자리를 표적으로 했을 때 두 자리 사이의 결실을 유도할 수 있는지를 알아보았다.

이를 위해서 CCR5 표적 ZFN 중에서 두 개씩 선정하여 Z30+Z891과 S162+Z891의 조합을 시험하였다. 두 쌍의 ZFN을 발현시킨 세포로부터 게놈 DNA를 분리하고 이로부터 CCR5 코딩 염기서열을 증폭하였다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다.

그 결과, DNA 결실이 일어나지 않은 야생형 게놈 DNA에서는 CCR5 코딩 염기서열에 해당하는 1,060-bp DNA 밴드가 증폭되었고, Z30+Z891 조합을 발현시킨 세포로부터는 199 bp 밴드가 S162+Z891 조합의 경우에는 331 bp 크기의 DNA 밴드가 관찰되었다 (도 4 및 5). 그러나 ZFN을 발현시키지 않은 세포 또는 각각의 조합을 구성하는 두 쌍의 ZFN 중 한 쌍의 ZFN만을 발현시킨 세포로부터는 이와 같은 PCR 산물이 생성되지 않았다.

<2-2> 두 쌍의 ZFN 에 의한 결실의 염기서열 분석

PCR 증폭산물을 클로닝하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 Z30+Z891로 처리한 세포에서는 약 861 bp, S162+Z891로 처리한 세포에서는 약 729-bp DNA 결실을 확인할 수 있었다 (도 6). 상기 실시예 1-2와 유사하게 접합 부분의 염기서열은 특이적인 결실과 함께 작은 삽입/결실과 마이크로호몰로지를 나타내었다. 이러한 사실은 DNA 결실이 비상동말단접합에 의해서 일어났음을 강하게 시사한다. 더욱이 CCR5 유전자 내에서 유사성이 없는 다른 두 자리를 표적으로 하는 두 쌍의 ZFN을 사용했을 때에도 게놈 결실이 일어났다는 사실은 상동재조합에 의해서 결실이 일어났을 가능성을 배제한다.

상기 실시예 1에서와 마찬가지로, 두 ZFN 표적 자리의 스페이서 염기서열이 다르다는 사실은 게놈 결실을 일으키는 데 아무런 방해가 되지 않았다. 예를 들면, Z30과 Z891는 각각 5' ATGT(도 6에는 이에 대한 상보 서열을 기재)과 5' CCTT 돌출을 만들었지만, CCR5 유전자 내의 약 861 bp 결실을 일으킬 수 있었다. 이러한 결과는 표적 특이적 게놈 결실을 일으키기 위해서 ZFN을 설계할 때, ZFN 인식 자리나 스페이서의 염기 서열이 아무런 제약 조건이 되지 않는다는 것을 의미한다.

실시예 3: 긴 길이 결실

ZFN을 이용하여 인간 게놈의 긴 DNA 결실을 유도할 수 있는지 알아보기 위해 CCR5 유전자의 상류로부터 멀리 떨어진 곳에 작용하는 ZFN을 제작하였다. 4 핑거 모듈의 ZFN (징크 핑거 모듈 4 개로 구성된 ZFN)을 만들기 위해 인간 또는 초파리 게놈에 자연적으로 존재하는 17개의 징크 핑거들을 모듈로 사용하였다 (표 1).

각각의 징크 핑거 모듈은 3 bp DNA 부위를 인식하고, 전체 17개 징크 핑거 모듈들은 64개의 가능한 3 bp DNA 부위 중에 21 개를 인식할 수 있다. ZFN은 이량체 (dimer)로 작용하므로, 한 장소에 작용하는 ZFN을 만들기 위해서는 두 개의 4 핑거 ZFN 단량체 (monomer)을 제작해야 한다. 4-핑거 ZFN은 두 개의 12-bp 절반자리로 구성된 24-bp DNA 장소에 작용한다. 이렇게 만들어진 30쌍의 ZFN은 CCR5 유전자로부터 30 kbp에서 최대 46 Mbp 떨어진 장소를 인식할 수 있었다.

각각의 ZFN쌍들을 CCR5유전자에 작용하는 S162 와 함께 DNA 형질감염 방법을 이용해 HEK 293 cell에서 발현시켰다. 이때 사용한 S162는 새로 만든 ZFN 단량체들과의 이량체 형성을 방지하기 위해서 의무적 이형이량체 (obligatory heterodimer)를 사용했다. 의무적 이형이량체는 이량체 인터페이스의 아미노산을 변화시켜 만든 것으로 (AA, BB와 같은) 동형이량체(homodimer)를 만들 수 없고 (AB와 같이) 서로 간에만 이량체를 만든다 (Miller et al., 2007). 따라서 S162를 구성하는 각각의 단량체는 새로 합성한 ZFN 단량체와도 이량체를 형성할 수 없다 (본 발명에 사용한 다른 ZFN은 따로 명시하지 않을 경우, 의무적 이형이량체 형태가 아닌 야생형을 사용하였음).

그 결과, S162와 함께 도입된 ZFN 30쌍 중 7쌍에서 긴 길이 결실을 입증하는 PCR 결과물을 얻었다 (이들 ZFN에 대한 정보는 하기 표 3에 나타냄). PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다. 하기 표 3에 나타낸 ZFN은 두 개의 단량체로 구성된 이량체로 작용한다. 예를 들어, K33은 K33R과 K33F가쌍을 이루어 구성된다. 아래 기술한 징크 핑거 모듈 이름은 염기와 상호 작용할 것으로 예상되는 주요 위치의 아미노산 잔기 4개로부터 유래한 것이다. F1은 N 말단의 징크 핑거 모듈이고 F4는 C말단의 징크 핑거 모듈이다. F2와 F3은 F1과 F4의 사이에 위치하는 징크 핑거 모듈이다. F1은 DNA의 3' 말단의 3-bp와 결합하고 F4는 5' 말단 3-bp와 결합한다. 징크 핑거 모듈들은 "TGEKP" 아미노산 서열로 서로 연결되어 있다. F4와 FokI 제한효소 도메인은 (F4H)-TGEK-(FokI QLV)와 같이 연결되어 있다.

이를 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, 각각 33 kbp, 230 kbp, 276 kbp, 781 kbp, 835 kbp와 15.1 Mbp에 해당하는 게놈 결실을 확인할 수 있었으며 이와 더불어 작은 삽입/결실과 마이크로호몰로지를 관찰할 수 있었다 (도 7 내지 10). 반면 새로 만든 ZFN이나 S162를 단독으로 발현시킨 세포로부터는 PCR 산물이 나타나지 않았다.

또한, S162 없이 새로 합성한 ZFN만으로 게놈 결실을 일으킬 수 있는지 알아보기 위해서 상기의 7쌍 ZFN을 몇 가지 조합으로 세포에 발현시켜 게놈 결실을 유도하여 K230과 M15가 14.9Mbp (=15.1-0.23)의 게놈 결실을 일으킴을 확인하였다. 상기 실시예 1-2 및 2-2와 마찬가지로 PCR 산물의 염기서열 분석을 통해서 ZFN에 의한 게놈 결실은 마이크로호몰로지와 작은 삽입/결실을 수반함을 확인할 수 있었다 (도 9 및 10).

결론적으로, CCR5 유전자 내에서 두 가지 유전자 결실 (730 bp와 860 bp), CCR2와 CCR5 유전자 사이의 15 kbp DNA에 해당하는 일곱 가지 다른 유전자 결실, CCR5유전자와 CCR5 상류방향으로 일곱 가지 결실 (33 kbp, 230 kbp, 243 kbp, 276 kbp, 781 kbp, 835 kbp, 15.1 Mbp), 마지막으로 CCR5 상류부분의 새로 만든 ZFN들 사이에서 얻은 세 가지 유전자 결실 (538 kbp, 551 kbp, 14.9 Mbp) 등 다양한 유전자 결실을 인간 세포 내에서 확인하였다. 상기 결과를 바탕으로, 활성이 있는 두 종류의 ZFN을 이용하여 인간 세포에서 특이적으로 게놈 결실을 일으킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 4: 중복

ZFN이 인간 세포 내에서 결실뿐만 아니라 중복이나 역위와 같은 다른 형태의 게놈 재배열을 일으킬 수 있는지 실험을 수행하였다.

도 11에서 도식화로 나타낸 바와 같이, 두 개의 자매염색분체 (sister chromatid)의 다른 자리에서 각각 이중가닥손상이 일어난 후 서로 간에 접합이 일어난다면 하나의 염색분체에서는 게놈 결실이 일어나고 다른 하나의 염색분체에서는 중복이 일어나게 된다.

도 12에 나타낸 바와 같이, CCR5와 CCR2 유전자 내에 각각 표적 위치를 가지고 있는 ZFN는 모두 중복이 일어난 결과를 나타냈고, ZFN을 발현하지 않는 음성 대조군 세포 (도 12 에 p3으로 표시함)와 CCR5에는 표적 장소가 있지만 CCR2에는 없는 ZFN인 Z30, Z266을 각각 발현한 세포는 증폭 산물을 얻을 수 없었다 (상기 도 2에서 보았듯이 Z30과 Z266은 15-kbp DNA 결실도 일으키지 못함). PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다.

PCR 산물 중 일부를 클로닝하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 CCR5 코딩 부위의 5' 부분과 CCR2 코딩 부위의 3' 부분이 직접 연결되어 있음을 확인할 수 있었고 이는 두 개의 ZFN 표적 장소 사이의 DNA가 중복되었을 때에만 나타는 결과이다 (도 13).

또한, 30 kbp 이상의 게놈 결실을 일으키는 데 사용된 ZFN을 다양하게 조합하여 실험을 수행한 결과, 모든 ZFN 조합에서 두 ZFN 인식 자리 사이의 DNA의 중복이 일어났음을 나타내는 증폭 산물을 얻을 수 있었다 (데이터는 제시하지 않음). 반면 한 자리만을 표적으로 하는 한 쌍의 ZFN을 처리한 세포로부터는 증폭산물이 나오지 않았다. 결실에서와 마찬가지로, 중복의 절단 접합 부위에서 작은 크기의 삽입/결실과 마이크로호몰로지를 관찰할 수 있었다 (도 14). 이러한 결과는 ZFN에 의한 중복 형성에 비상동말단접합이 관여하는 것을 시사한다.

실시예 5 : 역위

역위의 발생 기작을 탐구하고 나아가 역위가 일어난 DNA를 다시 제자리로 뒤바꿔 놓을 수 있는 가능성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 HEK 293 세포에 일시적으로 ZFN을 발현시킨 후 나타나는 현상을 관찰했다.

ZFN에 의해 특정 부위의 역위가 일어나는지는 도 15에 도식화한 바와 같이 같은 방향을 가리키는 프라이머를 이용하여 PCR을 수행함으로써 확인하였다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다. 역위가 일어나지 않는다면 PCR 산물이 생기지 않을 것이고 역위가 일어난다면 특정한 크기의 PCR 산물이 얻어질 것이다.

그 결과, 두 장소에서 DNA를 절단하는 다양한 조합의 ZFN인 염색체 3q21에서 230 kbp, 243 kbp, 276 kbp, 781 kbp, 835 kbp, 15.1 Mbp DNA의 게놈 역위에 해당하는 PCR 산물을 확인할 수 있었지만 ZFN을 발현하지 않는 세포에서는 상기와 같은 PCR 산물을 얻지 못했다 (도 16).

PCR 산물을 클로닝하여 DNA 염기서열을 분석한 결과 실제 해당 부위의 역위가 일어났음을 확인하였다 (도 17 내지 19). 게놈 역위는 두 군데의 절단 접합 자리를 만든다. 이들 각각의 DNA 염기서열을 분석한 결과 작은 결실/삽입과 마이크로호몰로지가 관찰되었다. 이러한 사실은 ZFN으로 유도된 게놈 역위 역시 비상동말단접합에 의해 생성되었음을 의미한다.

이상의 결과는 염색체 상에 두 군데 이중가닥손상이 생기면 해당 부위의 게놈 역위가 발생함을 보여주는 동시에, ZFN 기술을 이용하여 역위된 부분을 제자리로 돌려 놓아 고칠 수 있는 가능성을 시사한다.

실시예 6: 클론 세포 분석

<6-1> PCR 을 이용한 클론 세포 분석

ZFN에 의한 게놈 결실의 빈도를 예측하고 게놈 결실의 특징을 알아보기 위해서 표적 특이적 게놈 결실이 일어난 클론을 개별적으로 스크리닝하였다.

S162로 처리한 세포를 96 웰 플레이트의 한 웰마다 평균 0.7개의 세포로 희석하여 15-21일 동안 배양하였다. 각각의 분리된 클론 세포로부터 게놈 DNA를 분리한 후 게놈 결실 여부를 탐지하기 위해서 PCR분석을 실시하였다. PCR 증폭에 사용된 프라이머 서열은 상기 표 2에 정리되어 있다.

그 결과 수십 개 클론 세포 중 2개의 클론 세포에서 예상되는 크기의 증폭 산물을 얻었다. 상기 증폭 산물의 염기서열은 두 표적자리 (CCR2와 CCR5유전자 상의 각각 한 자리) 사이의 15 kbp가 결실되어 재접합 되었음을 의미한다 (도 20). HEK 293 세포는 다배체 (multiploid)이기 때문에 3번 염색체도 적어도 3 개가 있는 것으로 짐작된다. 2번 클론에서는 두 개의 서로 다른 15 kbp 결실의 염기서열이 나왔고 이는 두 상동 염색체 (homologous chromosome)에서 결실이 일어났음을 의미한다. 2번 클론의 또 하나의 3번 염색체에서는 15kbp 결실은 일어나지 않았지만 CCR5 유전자상의 자리에서 S162에 의해 지역적인 돌연변이가 일어났음을 확인하였다. 1번 클론의 경우 한 개의 상동 염색체에서만 15 kbp 결실이 일어났고, 결실이 일어나지 않은 상동 염색체에서는 1 개의 정상 염기서열과 서로 다른 3개의 돌연변이 염기서열이 관찰되었다. 이로부터 1번 클론은 단일 클론이 아니고 2개의 클론 세포가 섞여 있는 것으로 추정된다. 1, 2번 클론 모두에서 15-kbp DNA 중복은 관찰되지 않았다. 이것은 결실이 일어날 때 반드시 중복이 함께 일어나지는 않을 것이라는 예측과 부합한다.

<6-2> 서던 블롯팅 분석

위의 클론들이 염색체상에서 실제로 게놈 결실이 일어난 결과인지를 확인하기 위해서 서던 블롯팅으로 분석하였다. 1 및 2번 클론과 야생형 HEK 293 세포로부터 게놈 DNA를 분리한 후 이를 XbaI으로 자른 다음 전기영동을 실시하고 CCR2 주위의 DNA를 프로브로 사용하여 게놈의 변이를 확인하였다.

그 결과, 도 21에 나타낸 바와 같이 1번 클론과 2번 클론에서 15 kbp DNA가 결실되었을 때에만 생성되는 DNA 밴드를 확인하였다. 본 발명자들이 분석한 수십 개 클론 중 2개에서 ZFN에 의한 게놈 결실이 일어났고, ZFN에 의한 게놈 결실의 효율은 2% 이상으로 추정되었다. 이는 매우 높은 효율로서 ZFN 방법을 이용해 손쉽게 표적 부위가 결실된 세포 또는 개체를 얻을 수 있음을 의미한다.

실시예 7: 합성 DNA 분자의 게놈 내 삽입

ZFN에 의한 게놈 내 DNA 삽입의 가능성을 확인하기 위하여 작은 올리고뉴클레오티드를 두 가닥 합성한 후 담금질하여 이중나선 dsODN (oligodeoxynucleotide) 카세트를 만들었고, 이를 HEK293 세포에 ZFN과 함께 형질감염 방법으로 도입시켰다. 이 실험을 위하여 Z30과 Z891을 각각 사용하였다. Z30은 CCR5 유전자에 작용하여 DNA를 자르게 되면 5'-ACAT, 5'-ATGT의 돌출 염기서열을 만들고, dsODN 카세트는 이와 상보적인 5' 돌출부위를 가지도록 설계된 두 개의 상보적인 27-mer ODN (도 22에 OF, OR로 표시함)으로 구성되었다. dsODN 카세트가 Z30을 발현시킨 세포에 삽입되었는지를 확인하기 위하여 카세트를 구성하는 ODN 중 하나를 프라이머로 사용하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 예상되는 크기의 DNA 밴드를 얻었고 (도 23), 상기 DNA 밴드를 클로닝한 후 염기서열을 분석한 결과 실제로 게놈 상에 dsODN 카세트가 삽입되었음을 확인하였다 (도 24). Z891의 경우에도 유사한 결과를 확인하였다 (도 25).

실시예 8: ZFN 에 의한 합성 DNA 분자의 게놈 내 정해진 장소에 대한 삽입 확인

ZFN을 이용해 인간 배양 세포에서 게놈의 특정 장소에 합성된 DNA 단편을 삽입할 수 있는지 여부를 형광 PCR을 이용해 조사하였다. 6-FAM 형광물질이 연결된 PCR 프라이머를 사용해서 S162 ZFN의 표적 장소 주변을 증폭한 후 PCR 산물을 ABI 3730xl DNA 분석기로 분석하였고 이를 ABI 피크 스캐너 (peak scanner) 프로그램을 이용하여 데이터화했다.

이때 사용한 프라이머 염기서열은 하기와 같다.

Z30F : 5'-TGCACAGGGTGGAACAAGATGG-3' (서열번호 37)

S162R: 5'-GAGCCCAGAAGGGGACAGTAAGAAGG-3' (서열번호 38)

이러한 분석으로 ZFN 표적자리를 포함하는 280 bp의 PCR 산물과 함께, ZFN에 의한 돌연변이를 나타내는 더 작고, 더 큰 피크를 함께 확인할 수 있었다. 음성 대조군으로 p3 (빈 플라스미드)를 처리한 세포 게놈 DNA를 사용했을 때에는 280 bp의 결과물이 얻어졌고 (도 26), ZFN을 발현시킨 세포 게놈 분석은 ZFN으로 인해 발생한 5 bp 염기 삽입을 나타내는 피크 (**)와 결실 (*)이 함께 나타났다 (도 27). ZFN과 dsODN 카세트를 함께 처리한 결과, dsODN이 세포 내 정해진 장소에 삽입되는 것을 확인하였다 (도 28). 즉, ZFN에 의한 작은 결실 (*), 5 bp 삽입 (**)과 함께 dsODN에 해당하는 28 bp가 삽입된 피크 (***)가 함께 나타났다. 이상의 실험결과는 ZFN을 이용해 인간 배양 세포에서 게놈의 특정 장소에 합성된 DNA 단편을 삽입시킬 수 있음을 시사하는 결과이다.

위 실험에서 사용한 dsODN 카세트는 다음의 ODN 두 개로 구성되어 있으며 ZFN 표적자리에서 생성되는 5' 돌출부위와 상보적인 5' 돌출부위를 형성한다.

S162 5F: 5'-CTGATTTGAGTGAATTCTCACGTGACAG-3' (서열번호 39)

S162 5R: 5'-ATCAGCTGTCACGTGAGAATTCACTCAA-3' (서열번호 40)

실시예 9: 교체

ZFN을 이용해 결실과 삽입을 동시에 일으킬 수 있는지를 조사하였다. 즉, S162 및 Z891을 각각 사용해 CCR2와 CCR5 사이의 15-kbp에 해당하는 인간 게놈 DNA 단편을 제거하고 이를 올리고뉴클레오티드 카세트 (dsODN)로 교체할 수 있음을 증명하기 위해 PCR을 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 도 1에서 ZFN에 의한 DNA 결실을 관찰하기 위해 사용한 프라이머와 동일하다 (서열번호 18 및 21). 도입한 dsODN 카세트에 EcoRI 효소 표적자리를 삽입하여 단순히 결실이 일어났을 때 형성되는 PCR 산물과 구별이 될 수 있도록 하였다. ZFN과 dsODN 카세트를 함께 처리했을 경우, 증폭된 PCR 산물을 EcoRI 효소로 처리한 후 전기영동으로 분석하였더니 카세트가 삽입되었을 때에 기대되는 DNA 밴드를 확인할 수 있었다 (도 29에 화살표로 표시). 반면 같은 시료에 EcoRI을 처리하지 않은 경우에는 잘려진 DNA 밴드가 나오지 않았다. dsODN 카세트를 가하지 않고 ZFN만 발현시킨 세포로부터 분리한 게놈 DNA의 경우 EcoRI에 의한 DNA 밴드를 관찰할 수 없었다. ZFN을 발현시키지 않고 dsODN 카세트만 가한 세포의 경우 결실에 해당하는 PCR 산물도 관찰되지 않았으며, 증폭된 PCR 산물은 결실을 나타내는 크기의 밴드만 얻어졌다. 즉, EcoRI 효소에 의한 잘린 DNA 조각은 ZFN과 dsODN 카세트를 함께 처리한 세포 게놈 DNA에서만 얻을 수 있었다. 이와 같은 결과는 ZFN을 이용해 배양세포에서 긴 길이의 유전체 DNA를 결실시킴과 동시에 이를 합성한 DNA 단편으로 교체할 수 있음을 증명하는 것이다.

이 실험에서 사용한 dsODN의 염기서열은 아래와 같다. dsODN 카세트는 4, 5-bp에 해당하는 돌출부위 염기서열을 5' 말단에 가지고 있는데 이 염기서열은 ZFN에 의해 형성되는 게놈 DNA의 돌출부위 염기서열과 상보적이다.

F891 ZFN: F-891, 5'-CCTTTTGAGTGAATTCTCACGTGACAG-3' (서열번호 41)

OR-891, 5'-AAGGCTGTCACGTGAGAATTCACTCAA-3' (서열번호 42)

S162 ZFN: 2-F-162, 5'-TTAATTTGAGTGAATTCTCACGTGACAG-3' (서열번호 43)

5-OR-162, 5'-ATCAGCTGTCACGTGAGAATTCACTCAA-3' (서열번호 44)

<110> Toolgen Incorporation SNU R&DB FOUNDATION <120> Targeted genomic rearrangements using site-specific nucleases <130> PA100286/KR <150> KR10-2009-0051896 <151> 2009-06-11 <160> 44 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DSAR2 zinc finger module <400> 1 Tyr Ser Cys Gly Ile Cys Gly Lys Ser Phe Ser Asp Ser Ser Ala Lys 1 5 10 15 Arg Arg His Cys Ile Leu His 20 <210> 2 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DSCR zinc finger module <400> 2 Tyr Thr Cys Ser Asp Cys Gly Lys Ala Phe Arg Asp Lys Ser Cys Leu 1 5 10 15 Asn Arg His Arg Arg Thr His 20 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DSNR zinc finger module <400> 3 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Asp Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gln Arg His Val Arg Asn Ile His 20 <210> 4 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ISNR zinc finger module <400> 4 Tyr Arg Cys Lys Tyr Cys Asp Arg Ser Phe Ser Ile Ser Ser Asn Leu 1 5 10 15 Gln Arg His 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Claims

표적 특이적 뉴클레아제를 사용하여 게놈상의 특정한 두 부위 이상을 자르는 단계를 포함하는, 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제인 방법.
제2항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 2개 이상의 징크 핑거 모듈을 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 징크 핑거 모듈은 표 1에 기재된 모듈 중에서 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 2쌍인 방법.
제5항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제 2쌍은 각각 서로 다른 징크 핑거 도메인을 포함하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 서로 다른 두 부위를 인식하는 기능을 가지는 징크 핑거 뉴클레아제인 방법.
제7항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 1쌍 또는 2쌍인 방법.
제2항에 있어서, 상기 게놈상의 특정한 부위는 적어도 6개의 염기쌍 이상 떨어져 있는 두 부위인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 게놈상의 DNA를 결실, 중복, 역위, 교체 또는 재배열시킨 세포.
표적 특이적 뉴클레아제에 의해 게놈상의 특정한 한 부위를 자르는 단계를 포함하는, 게놈상에 합성 DNA를 삽입시키는 방법.
제11항에 있어서, 상기 표적 특이적 뉴클레아제는 징크 핑거 뉴클레아제인 방법.
제12항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 2개 이상의 징크 핑거 모듈을 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 징크 핑거 모듈은 표 1에 기재된 모듈 중에서 선택되는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 징크 핑거 뉴클레아제는 1쌍인 방법.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 게놈상에 합성 DNA를 삽입시킨 세포.