CN105802859A - 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用 - Google Patents

拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105802859A
CN105802859A CN201610282971.9A CN201610282971A CN105802859A CN 105802859 A CN105802859 A CN 105802859A CN 201610282971 A CN201610282971 A CN 201610282971A CN 105802859 A CN105802859 A CN 105802859A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
strain
fermentation
trichoderoma
medium
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610282971.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105802859B (zh
Inventor
姚彦坡
郑百芹
李爱军
杜瑞焕
肖琎
张鑫
周鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tangshan City Animal Husbandry Aquatic Product Quality Inspection Center
Original Assignee
Tangshan City Animal Husbandry Aquatic Product Quality Inspection Center
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tangshan City Animal Husbandry Aquatic Product Quality Inspection Center filed Critical Tangshan City Animal Husbandry Aquatic Product Quality Inspection Center
Priority to CN201610282971.9A priority Critical patent/CN105802859B/zh
Publication of CN105802859A publication Critical patent/CN105802859A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105802859B publication Critical patent/CN105802859B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/885—Trichoderma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F3/00—Fertilisers from human or animal excrements, e.g. manure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Pest Control & Pesticides (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Fertilizers (AREA)

Abstract

本发明涉及微生物肥料技术领域，具体公开一株康氏木霉菌株及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用。本发明公开的拟康氏木霉菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO:M 2016146。本发明公开的拟康氏木霉菌株对侵染玉米、花生的黄曲霉菌及毒素污染防治效果明显，该菌株具有较强的抑菌和解毒活性。本发明还提供一种含有该菌株的有机肥，该有机肥施入土壤后，该菌株能够在作物根际快速繁殖并长期生存，形成优势菌群，施用本微生物有机肥既能防治黄曲霉毒素对农产品的污染，同时能减少化学农药的残留，在现代农业种植及农产品质量安全应用中前景广阔。

Description

拟康氏木霉菌TG-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用
技术领域
本发明涉及微生物肥料技术领域，具体公开一种拟康氏木霉菌株、含菌有机肥及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用。
背景技术
玉米是世界上重要的粮食作物，也是重要的饲料原材料。目前，在玉米的储藏过程中不可避免的产生霉菌毒素，解决霉菌毒素，特别是黄曲霉毒素对玉米等粮食和饲料的污染是一个世界性难题。黄曲霉毒素（AF）是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的次生代谢产物，是一类理化性质和结构相似的真菌毒素。黄曲霉毒素污染给玉米、花生等农作物的生产带来严重损失，每年导致的经济损失高达数百亿美元。黄曲霉毒素是广泛污染农产品的一类强致癌、剧毒性真菌毒素，其中B1最普遍且毒性最强，人或动物食用受毒素污染的农产品后会导致机体病变甚至死亡，严重威胁消费者健康与生命安全。因此，加强玉米、花生等农产品中黄曲霉毒素污染的防控刻不容缓。
黄曲霉菌对玉米的侵染主要发生在田间生长时期，毒素产生和污染主要在储藏时期，因此，如何防控好田间黄曲霉菌对玉米的侵染至关重要。目前，对玉米生长时期黄曲霉菌侵染的防控没有理想的措施，一般以化学防治为主。由于化学防治成本较高和易污染环境，而且病原物易对杀菌剂产生耐药性甚至抗药性，所以，寻找一种对人体健康、对环境友好的防控措施势在必行。国内外研究发现自然界中有许多种微生物能抑制和降解生长期和储藏期玉米或饲料中的黄曲霉毒素，这些微生物包括细菌、酵母菌、霉菌、放线菌及藻类等。采用微生物制剂或其产生的酶类抑菌降毒，不会破坏生态环境，不降低农产品品质，而且有些种类还能增加产品的营养价值。
以黄曲霉菌及毒素为研究对象，从健康的玉米籽粒中分离内生细菌，并采用活体方法筛选拮抗细菌，研究其抗菌活性，以期望为玉米黄曲霉毒素污染的防控瓶颈问题的解决探索新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有较强的抑菌和解毒活性的拟康氏木霉菌TG-102（TrichoderomakoningiiTG-102）。
本发明的另外目的是提供该菌株在防控黄曲霉菌对玉米污染中的应用，以及发酵制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥及其发酵制备方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种抗菌解毒的拟康氏木霉菌TG-102，保藏编号为CCTCCNO:M2016146，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期:2016年3月28日。
选取河北、山东、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，将称重后的玉米籽粒在无菌三角瓶中用3%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，沥干水分。用镊子夹住玉米籽粒，将籽粒用无菌剪刀平均分成3等份，放置在斜面培养基中，于28℃恒温培养，每天观察菌落生长状况，挑取形态似木霉菌的单菌落转接到斜面平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到斜面斜面上。
斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌20min后备用。
形态学特征：
斜面培养基上20℃5天菌落直径9.0cm，生长速度很快，蛛丝状至羊毛状，白色，散生光下由于产孢表面呈绿色，背面无色，后期由于产孢量大使菌落呈稍绿色；多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的菌丛；主枝宽4-5μm，侧枝多，形成金字塔形；侧生瓶梗可达5个，成拟轮状排列或单个沿小侧枝不规则排列；侧生瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶梗，5-7×3-3.5μm；顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细，13-18×2.5-3.5μm；瓶梗大多以大角度在其载体上着生，有时略弯向顶端；瓶梗孢子呈球状分生孢子头，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡绿色，2.8-3.2×2.5-2.8μm。结果如图1和图2所示。
通过16SrDNA方法（其16SrDNA如SEQIDN0：1所示）鉴定菌种为拟康氏木霉TG-102。
本发明还提供一种保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株在防控黄曲霉菌对玉米污染中的应。
本发明还提供一种保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株在制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥中的应用。
采用保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥。
本发明还提供一种微生物有机肥，所述有机肥中保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株含量在1.5×108cfu/g以上，有机质含量为38-45%。
本发明还提供了采用保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备微生物有机肥的方法，包括步骤如下：
（1)斜面培养：将保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株接种于斜面培养基中，25-28℃培养5-7天；
（2）茄瓶液体培养：将经斜面培养后的拟康氏木霉菌接种到体液培养基中，在培养箱中25-28℃条件下培养3-5天。
（3）中型发酵罐放大液体培养：将步骤（2）中的拟康氏木霉菌用无菌水冲下，接种到中型发酵罐中，发酵过程保持溶解氧浓度20%左右，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min。
（4）固体培养：将步骤（3）中的液体菌种按体积比10%的接种量接种于固体培养基中，接种完毕后转移到培养室内培养，培养室温度控制在28-31℃，培养基温度控制在25-29℃，空气相对湿度控制在95-98%，培养基厚度为5-7cm，培养时间为5-7天。
（5）干燥：固体发酵完毕后，将有机肥自然风干至含水量控制在7-10%，即可得到拟康氏木霉菌TG-102固体培养物。
（6）将拟康氏木霉菌与预先腐熟的木薯渣与畜禽粪便混合物进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机物料中加入拟康氏木霉菌TG-102固体培养物20公斤，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束；≤60℃进行干燥，使其含水量≤30%即可包装成品。
本发明提供的微生物有机肥的发酵方法的优选技术方案如下：
步骤（1)中的斜面培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
步骤（2)中液体培养基配方为：麦麸2.2%（按重量比计），葡萄糖1.0%（按重量比计），硫酸镁0.45%（按重量比计），磷酸二氢钾0.35%（按重量比计），氯化钙0.3%（按重量比计），余量为水，PH6.5-6.8。
步骤（2）中所述液体培养基在115-125℃灭菌25-35min，优选在121℃湿热条件下灭菌30min。
步骤（4）中所述固体培养基配方为：麦麸和麦秸粉重量比为8：2，含水量为70%，pH6.5，121℃灭菌30min。
本发明还提供一种所述微生物有机肥料在防治玉米上黄曲霉菌中的应用。
采用上述技术方案的本发明与现有技术相比，有益技术效果如下：
1.保藏编号为CCTCCNO:M2016146拟康氏木霉菌TG-102是从河北唐山稻地镇玉米籽粒中分离获得，经室内对峙拮抗实验、活体抑菌解毒实验和田间防治试验发现，该菌株抑菌能力较强，抑菌解毒效果好且稳定，容易培养。
2.本发明还提供一种含有该菌株的有机肥，该有机肥施入土壤后，该菌株能够在作物根际快速繁殖并长期生存，形成优势菌群，施用本微生物有机肥既能防治黄曲霉毒素对农产品的污染，同时能减少化学农药的残留，在现代农业种植及农产品质量安全应用中前景广阔。
菌株保藏情况：保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。保藏编号为CCTCCNO:M2016146，分类命名为拟康氏木霉菌TG-102，拉丁文名称：TrichoderomakoningiiTG-102。保藏日期为2016年3月28日。
附图说明
图1是拟康氏木霉菌TG-102的斜面平板培养形态图。
图2是拟康氏木霉菌TG-102的分生孢子梗及分生孢子图。
图3是拟康氏木霉菌TG-102对黄曲霉菌在玉米上的抑制作用图。
图4是拟康氏木霉菌TG-102代谢物对黄曲霉菌在平板上的抑制作用图。
图5是拟康氏木霉菌TG-102对土壤微生物区系的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例为本发明进行进一步的描述，但不能将方案中所涉及的方法及技术参数理解为对本发明的限制。
实施例1
保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株的分离和鉴定
选取河北、山东、山西及吉林等省份健康玉米籽粒，将称重后的玉米籽粒在无菌三角瓶中用3%次氯酸钠溶液浸泡10分钟，最后无菌水冲洗5次，沥干水分。用镊子夹住玉米籽粒，将籽粒用无菌剪刀平均分成3等份，放置在斜面培养基中，于28℃恒温培养，每天观察菌落生长状况，挑取形态似木霉菌的单菌落转接到斜面平板上进行纯化培养，镜鉴初步认定为木霉菌后编号，并保存到斜面斜面上。
斜面培养基：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。121℃灭菌20min后备用。
形态学特征：
斜面培养基上20℃5天菌落直径9.0cm，生长速度很快，蛛丝状至羊毛状，白色，散生光下由于产孢表面呈绿色，背面无色，后期由于产孢量大使菌落呈稍绿色；多分枝的树状分生孢子梗形成相当疏松的菌丛；主枝宽4-5μm，侧枝多，形成金字塔形；侧生瓶梗可达5个，成拟轮状排列或单个沿小侧枝不规则排列；侧生瓶梗基部略缢缩，中部膨大，向上渐狭成瓶梗，5-7×3-3.5μm；顶生的和不典型的瓶梗相对长且纤细，13-18×2.5-3.5μm；瓶梗大多以大角度在其载体上着生，有时略弯向顶端；瓶梗孢子呈球状分生孢子头，分生孢子近球形或倒卵形，壁光滑，淡绿色，2.8-3.2×2.5-2.8μm。结果如图1和图2所示。
通过16SrDNA方法（其16SrDNA如SEQIDN0：1所示）鉴定菌种为拟康氏木霉TG-102。
该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016146，分类命名为拟康氏木霉菌TG-102，保藏日期为2016年3月28日。
实施例2
保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株对玉米黄曲霉菌的抑制效果实验
（1）拟康氏木霉菌TG-102对病原菌的抑制作用：在斜面平板培养基上相距3cm处分别接入制备好的拟康氏木霉菌TG-102饼和病原菌饼作对峙培养，以单独接种各供试菌的菌饼为对照，置于培养箱25℃黑暗培养。每处理设3次重复。3d后测量菌落直径，计算供试菌株对病原菌生长的抑制率。所实验的350株菌株中，菌株TG-102菌株对黄曲霉菌的抑制作用最强，表1指出了所应用的效果较好10株生防菌对黄曲霉菌的抑制率。
表1拟康氏木霉菌TG-102等10菌株对玉米黄曲霉菌的抑制率（%）
注：表中的实验数据为三次重复的平均值。
（2）拟康氏木霉菌TG-102菌株的室内活体生防效果实验
拮抗菌接种体的制备：将试管斜面培养基中的拟康氏木霉菌TG-102接种到茄瓶内斜面培养基上，于25-28℃条件下，在培养箱中培养3-4天。
将茄瓶中的木霉孢子用无菌水冲下，接种到中型发酵罐中。发酵过程保持溶解氧浓度20%左右，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min。
按体积10%的接种量将发酵液接种于固体培养基中，接种完毕后转移到培养室内培养。培养室温度控制在28-31℃，培养基温度控制在25-29℃，空气相对湿度控制在90-95%，培养基厚度为5-7cm，培养时间为5-7天。
培养完毕后，将培养物自然风干，获得拮抗菌株的发酵菌剂。
拮抗菌的活体筛选：把上述拮抗菌稀释成孢子最终浓度为1.5×106孢子·g-1的孢悬液和培养7天生长旺盛的黄曲霉菌菌悬液(孢子最终浓度为1.5×106孢子·mL-1)分别浸泡玉米籽粒30min，阴凉处被干后放入无菌平板，每板30粒玉米，放入光照培养箱培养7d。
培养箱培养条件为：温度28℃，湿度70-80%，光照为12h黑暗/12h光照。以不浸菌液为空白对照，每处理设3次重复。计算生防菌对黄曲霉菌防治效果及抑毒率，见表2、图3。
结果表明，获得的生防菌在玉米籽粒上表现出较好防病效果，对黄曲霉菌毒素污染抑制率较高。拮抗菌株对黄曲霉菌的防病效果分别达44.2%-87.0%，其中，菌株TG-102对黄曲霉菌的防效最高，达87.0%，其次为菌株T12-1和T40-3，防效分别为69.5%和68.8%。
抑毒效果较好的菌株分别为TG-102、T21-2及T40-3，抑制率分别为85.0%、75.2%及68.5%，有进一步研究的价值。
表2拮抗菌对黄曲霉菌的防治效果及抑毒率
注：数据为三次重复的平均值
实施例3
保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备微生物有机肥及其制备方法
采用保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备防控田间黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥，该有机肥中保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株含量在1.5×108cfu/g以上，有机质含量为38-45%。
本实施例采用保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备微生物有机肥的方法，步骤如下：
（1)斜面培养：将保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株接种于斜面培养基中，25-28℃培养6天。
该斜面培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
（2）茄瓶液体培养：将经斜面培养后的拟康氏木霉菌接种到体液培养基中，在培养箱中25-28℃条件下培养4天。
该液体培养基配方为：麦麸2.2%，葡萄糖1.0%，硫酸镁0.45%，磷酸二氢钾0.35%，氯化钙0.3%，余量为水，PH6.7。
将液体培养基在121℃湿热条件下灭菌30min。
（3）中型发酵罐放大液体培养：将步骤（2）中的拟康氏木霉菌用无菌水冲下，接种到中型发酵罐中，发酵过程保持溶解氧浓度20%左右，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min；
（4）固体培养：将步骤（3）中的液体菌种按体积比10%的接种量接种于固体培养基中，接种完毕后转移到培养室内培养，培养室温度控制在28-31℃，培养基温度控制在25-29℃，空气相对湿度控制在95-98%，培养基厚度为5-7cm，培养时间为6天。
该固体培养基配方为：麦麸和麦秸粉重量比为8：2，含水量为70%，pH6.5，121℃灭菌30min。
（5）干燥：固体发酵完毕后，将有机肥自然风干至含水量控制在7-10%，即可得到拟康氏木霉菌TG-102固体培养物。
（6）将拟康氏木霉菌TG-102与预先腐熟的木薯渣与畜禽粪便混合物进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机物料中加入拟康氏木霉菌TG-102固体培养物20公斤，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，6天即可发酵结束；固体发酵微生物有机肥中拟康氏木霉菌TG-102含量达5×108cfu/g以上，有机质含量为38-45%。≤60℃进行干燥，使其含水量≤30%即可包装成品。
实施例4
保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株发酵制备微生物有机肥对玉米黄曲霉菌的抑制效果实验
田间试验小区随机设计，3个重复，每个小区的面积为15m×3m。将生防制剂以每亩4公斤(1.5×106孢子·g-1)，于玉米播种时随肥料施入，设置化学防治方法（70%甲基托布津可湿性粉剂0.5g/棵）及对照，农药的施用方法同生防制剂。玉米收获后每处理随机调查5个点，每点10株。计算拮抗菌抑毒率及对玉米促生效果，结果见表3。
结果表明获得的生防木霉菌对玉米生长表现出一定的促生效果，对黄曲霉菌毒素污染抑制率较高。较好的几株拮抗菌对黄曲霉菌的促生效果为0.8%-10.5%，其中，菌株TG-102促生效果最高，为10.5%，其次为菌株T95-2和T40-3，促生效果分别为5.5%和4.5%。抑毒效果较好的菌株分别为TG-102、T40-3及T85-5，抑制率分别为90.5%、60.5%及58.3%。
表3拮抗菌对黄曲霉菌产毒抑制率及对玉米促生效果
调查指标 TG-102 T95-2 T85-5 T12-1 T21-2 T40-3 T100 T22-1
促生率 % 10.5 5.5 0.0 2.5 2.7 4.5 0.0 0.8
抑毒率/% 90.5 50.5 58.3 50.8 53.2 60.5 23.5 45.0
拟康氏木霉菌TG-102代谢产物抑菌率的测定
生防菌代谢产物的制备
生防菌拟康氏木霉菌TG-102在斜面斜面上活化后，取一环于斜面培养液中，100mL/300mL装液量，30℃，160r/min振荡培养72h后，制备成以下处理液：上清液：培养液在12000r/min下离心15min，取上清，用0.22μm细菌过滤器过滤后得到无菌的上清液。
菌悬液：培养液在12000r/min下离心15min，弃上清，用无菌水清洗3次再离心，加入无菌水。
蛋白粗提液：培养液于4℃下12000r/min离15min弃沉淀，在上清液中加固体硫酸铵至70％饱和度，4℃静置过夜，于4℃下10000r/min离心20min，弃上清液，沉淀用1/25体积10mmol/L，pH7.0磷酸缓冲液悬浮，然后用0.22μm细菌过滤器过滤除掉可能存在的细菌。
生防菌代谢产物对黄曲霉菌菌丝生长的影响
测定方法：取黄曲霉菌菌悬液1.5×1065mL，放入温度降到45℃左右斜面三角瓶中（100mL/350mL），摇晃2min后，均匀的倒入培养皿中。用打孔器在斜面平板周围等距离打3个孔，用移液枪分别加入3mL上清液、过滤液、冷冻上清液、冷冻过滤液及蛋白粗提液，30℃培养5天待CK长满平板时检测各处理抑菌圈的半径，每个处理三个重复。实验结果如表4及图4。
结果显示生防菌培养液对黄曲霉菌菌丝生长的抑制作用均为100%；蛋白粗提液的抑制作用也很强，达到95%以上；生防菌过滤液和冻过滤抑菌率均在30%以上，其中TG-102抑菌率最强，分别达到60.5%和58.5%，其次是T85-5，达到57.3%和55.5%；生防菌的上清液和冻上清抑菌率在45%以上，其中TG-102抑菌率最强，分别达到65.0%和68.0%，其次是T85-5，达到58.5%和63.2%，见表4。
表4生防菌代谢产物对黄曲霉菌菌丝生长的抑制作用
拟康氏木霉菌TG-102的根部定殖实验
玉米种子经室内催芽，挑选长势一致的发芽种播种，每盆10粒，重复五次。待玉米出苗后开始接菌。拟康氏木霉菌TG-102的孢子悬浮液浓度为1.5×106/mL，将孢子悬浮液用注射器注入根围土壤，每穴15mL，清水作为对照。浇灌1天后采集第一次的样品，以后每7天收集一次，连续检测4周。准确称取待测土样1克，放入装有9ml无菌水的试管中，涡旋振荡3min，使土壤中的微生物充分分散，静置1min，即为10-1稀释液，用10-3和10-4的稀释液涂TSM培养基，28℃培养72h，测定玉米植株根际土壤中的拟康氏木霉菌TG-102，以此作为木霉真菌根际定殖能力的指标。计数时以未接种木霉菌的玉米植株根际土壤作为对照。结果见表5。
木霉菌半选择性培养基（TSM培养基）：MgSO4(7H20)0.2g，K2HPO40.9g，KCl0.15g，NH4NO31.0g，葡萄糖3.0g，玫瑰红0.15g，60%敌克松可湿性粉剂0.3克，PCNB0.2g，琼脂20g，蒸馏水950ml。121min灭菌20℃备用。
表5木霉TG-102在花生植株根际定殖能力(×10x/g)
处理 7天 14天 28天
TG-102 2×105 4×104 5×103
TG-102- A. flavus 3×105 2.8×104 2×103
注：表中的实验数据为三次重复的平均值。
生防菌对玉米根际微生物区系的影响
PCR-DGGE技术主要用于研究微生物多样性和种群差异，这种方法基于16SrDNA基因序列来揭示DNA序列遗传多态性，用于推断微生物的***发育关系。本实验研究了生防菌株TG-102对玉米根际土壤微生物多样性的影响，见图5。
本领域技术人员不脱离本发明的实质和精神，可以有多种方案实现本发明，以上所述仅为本发明较佳可行的实施例而已，并非因此局限本发明的权利范围，凡运用本发明说明书及附图内容所作的等效变化，均包含于本发明的权利范围之内。
SEQUENCELISTING
<110>唐山市畜牧水产品质量监测中心
<120>拟康氏木霉菌TG-102及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用
<130>1
<160>1
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>574
<212>DNA
<213>TrichoderomakoningiiTG-102
<400>1
ccaaacccaatgtgaacgttaccaaactgttgcctcggcgggatctctgccccgggtgcg60
tcgcagccccggaccaaggcgcccgccggaggaccaaccaaaactcttattgtatacccc120
ctcgcgggttttttttataatctgagccttctcggcgcctctcgtaggcgtttcgaaaat180
gaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcgaaa240
tgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattg300
cgcccgccagtattctggcgggcatgcctgtccgagcgtcatttcaaccctcgaacccct360
ccggggggtcggcgttggggatcggccctgccttggcggtggccgtctccgaaatacagt420
ggcggtctcgccgcagcctctcctgcgcagtagtttgcacactcgcatcgggagcgcggc480
gcgtccacagccgttaaacacccaacttctgaaatgttgacctcggatcaggtaggaata540
cccgctgaacttaagcatatcaataagcggagga574

Claims (10)

1.一种抗菌解毒的拟康氏木霉菌TG-102（TrichoderomakoningiiTG-102），其特征在于，保藏编号为CCTCCNO:M2016146，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏日期:2016年3月28日。
2.如权利要求1所述的保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株在防控黄曲霉菌对玉米污染中的应用。
3.如权利要求1所述的保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株在制备防控黄曲霉菌对玉米污染的微生物有机肥中的应用。
4.一种微生物有机肥，其特征在于，所述有机肥中保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株含量在1.5×108cfu/g以上，有机质含量为38-45%。
5.如权利要求3或4所述的微生物有机肥的发酵方法，包括步骤如下：
（1)斜面培养：将保藏编号为CCTCCNO:M2016146的菌株接种于斜面培养基中，25-28℃培养5-7天；
（2）茄瓶液体培养：将经斜面培养后的拟康氏木霉菌接种到体液培养基中，在培养箱中25-28℃条件下培养3-5天；
（3）中型发酵罐放大液体培养：将步骤（2）中的拟康氏木霉菌用无菌水冲下，接种到中型发酵罐中，发酵过程保持溶解氧浓度为18-22%，优选20%，温度28-30℃，搅拌速度200-250r/min，通气量为10-15L/min；
（4）固体培养：将步骤（3）中的液体菌种按体积比10%的接种量接种于固体培养基中，接种完毕后转移到培养室内培养，培养室温度控制在28-31℃，培养基温度控制在25-29℃，空气相对湿度控制在95-98%，培养基厚度为5-7cm，培养时间为5-7天；
（5）干燥：固体发酵完毕后，将有机肥自然风干至含水量控制在7-10%，即可得到拟康氏木霉菌TG-102固体培养物；
（6）将拟康氏木霉菌与预先腐熟的木薯渣与畜禽粪便混合物进行固体发酵，调节含水量，每吨固体有机物料中加入拟康氏木霉菌TG-102固体培养物20公斤，发酵两天后进行翻料，以后每天进行翻堆，5-7天即可发酵结束；≤60℃进行干燥，使其含水量≤30%即包装成品。
6.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，步骤（1)中的斜面培养基配方为：马铃薯200g，葡萄糖15g，琼脂20g，蒸馏水1000ml。
7.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，步骤（2)中液体培养基配方为：麦麸2.2%，葡萄糖1.0%，硫酸镁0.45%，磷酸二氢钾0.35%，氯化钙0.3%，余量为水，PH6.5-6.8。
8.如权利要求5或7所述的发酵方法，其特征在于，步骤（2）中所述液体培养基在115-125℃灭菌25-35min，优选在121℃湿热条件下灭菌30min。
9.如权利要求5所述的发酵方法，其特征在于，步骤（4）中所述固体培养基配方为：麦麸和麦秸粉重量比为8：2，含水量为70%，pH6.5，121℃灭菌30min。
10.如权利要求3至9任一项所述微生物有机肥在防治玉米上黄曲霉菌中的应用。
CN201610282971.9A 2016-05-03 2016-05-03 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用 Active CN105802859B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610282971.9A CN105802859B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610282971.9A CN105802859B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105802859A true CN105802859A (zh) 2016-07-27
CN105802859B CN105802859B (zh) 2020-06-02

Family

ID=56458940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610282971.9A Active CN105802859B (zh) 2016-05-03 2016-05-03 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105802859B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113004095A (zh) * 2021-01-15 2021-06-22 农业农村部环境保护科研监测所 一种防控黄曲霉毒素污染复合微生物肥料及其制备方法
CN113005050A (zh) * 2021-01-15 2021-06-22 农业农村部环境保护科研监测所 一种降低粮油作物黄曲霉侵染及其污染的复合微生物菌剂及其制备方法与应用
CN114933974A (zh) * 2022-05-11 2022-08-23 华北理工大学 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789230A (zh) * 2013-12-31 2014-05-14 浙江大学 生防菌株bs71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103789230A (zh) * 2013-12-31 2014-05-14 浙江大学 生防菌株bs71及其在防治农作物黄曲霉毒素污染中的应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
郝林华等: "拟康氏木霉液态发酵条件的研究", 《菌物学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113004095A (zh) * 2021-01-15 2021-06-22 农业农村部环境保护科研监测所 一种防控黄曲霉毒素污染复合微生物肥料及其制备方法
CN113005050A (zh) * 2021-01-15 2021-06-22 农业农村部环境保护科研监测所 一种降低粮油作物黄曲霉侵染及其污染的复合微生物菌剂及其制备方法与应用
CN114933974A (zh) * 2022-05-11 2022-08-23 华北理工大学 一种拟康氏木霉c5-9及其在拮抗灰葡萄孢菌中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105802859B (zh) 2020-06-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109266586B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌bmf 03及其用途与发酵方法
CN109055281B (zh) 贝莱斯芽胞杆菌zf2及其在植物病害防治中的应用
CN102433282B (zh) 枯草芽孢杆菌nb12及其培养方法和应用
CN102212485B (zh) 一种长柄木霉及其在防治蔬菜病害中的应用
CN105586300B (zh) 路德维希肠杆菌bg10-1及其在黄曲霉菌生物防治中的应用
CN101967455B (zh) 防治小麦根部病害的解淀粉芽孢杆菌ea19及其制剂
CN110734871B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌及其在农业生产中的应用
CN1766091A (zh) 一株枯草芽孢杆菌及其应用
CN112006035B (zh) 用于防治植物病害的微生物源杀菌剂及其制备方法
CN108410757B (zh) 一株分离的链霉菌nbf715及其在作物病害防治中的应用
CN110951645A (zh) 吸水链霉菌狭霉素亚种及其在防治植物卵菌和真菌病害、促进植物生长中的应用
CN101381685A (zh) 一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法
CN117136968A (zh) 一种复合型微生物组合物及其应用
CN113862160B (zh) 一株具有生防及诱导抗病作用的拟康宁木霉Tk905菌株及其应用
CN105802859A (zh) 拟康氏木霉菌tg-102及其在防控玉米黄曲霉毒菌污染中的应用
CN109880764A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治苹果病害中的应用
CN111808778B (zh) 一株防治黄萎病的韦氏芽孢杆菌及其培养方法、菌剂及其制备方法和应用
CN105695342B (zh) 康氏木霉菌tg-72及其在黄曲霉菌生物防治中的应用
CN105838643B (zh) 枯草芽孢杆菌jtfm1001及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用
CN111909863B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其用途
CN113943670A (zh) 一株防病促生长托拉斯假单胞菌及其应用
CN111642520A (zh) 一种淡紫拟青霉可湿性粉剂及其应用
CN106399165B (zh) 一株防治植物根结线虫的萎缩芽孢杆菌及其应用
CN114231467B (zh) 一株金黄垂直链霉菌df06、菌剂及其制备方法和应用
CN113925064B (zh) 耐硼赖氨酸芽孢杆菌在抑制火龙果软腐病菌生长方面的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant