CN1766091A - 一株枯草芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

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CN1766091A CN 200510104872 CN200510104872A CN1766091A CN 1766091 A CN1766091 A CN 1766091A CN 200510104872 CN200510104872 CN 200510104872 CN 200510104872 A CN200510104872 A CN 200510104872A CN 1766091 A CN1766091 A CN 1766091A
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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用，其目的是提供一株具有广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌和以该株枯草芽孢杆菌为活性成分的微生物菌剂。本发明所提供的枯草芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451。以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451为活性成分的微生物菌剂可有效防治蔬菜、瓜类、豆类和苜蓿生产中由镰刀菌、腐霉菌、疫霉菌和立枯丝核菌引起的根腐病、猝倒病和立枯病等植物病害，而且该微生物菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，特别涉及以该株枯草芽孢杆菌为活性成分的微生物菌剂。
背景技术
随着菜篮子工程的实施和农业种植结构的调整，我国豆类、瓜类和蔬菜、苜蓿等种植面积呈现迅速发展的态势。同时因为国际、国内市场需求量的增大，无公害、绿色和有机农业生产基地栽培面积和基地建设规模逐年递增。根据周年动态多点监测和调查表明，由于保护地蔬菜的连年重茬种植，不规范的轮作，土传病原菌大量积累、繁衍，致使蔬菜苗期猝倒病(Pythium aphanidermatum)、立枯病(Rhizoctoniasolani)、枯萎病(Fusarium oxysporum)和由腐霉、疫霉及镰刀菌复合侵染造成的根腐病等土传病害的危害日益加重，导致严重的减产或降低产品质量，甚至绝收。某些串株镰刀菌和再育镰刀菌等菌株还可产生伏马霉素等聚酮类真菌毒素，直接影响农产品的品质及危害人和动物的健康。生产中主要依靠化学农药和化肥的施用，制约高产高效农业的发展。
化学防治在世界农业发展史上占有重要的地位。几个世纪以来，化学农药在植物病虫草鼠害的防治中发挥着积极的作用，为农业的稳产、增产、挽回损失和提高品质做出了重要贡献。但同时也因过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污染，影响非靶标生物及导致有害生物的抗药性产生和迅速发展等严重问题。尤其近年来因为农产品中农药残留超标，造成人畜中毒事件不断发生，严重威胁着人民的生活质量，也限制了我国农产品的外贸出口。土传病害的发生猖獗和化学杀菌剂的潜在污染已成为农业安全生产中首要的关键问题。
随着社会文明的发展，农业可持续发展问题使人类对资源与环境的认识有了新的飞跃，对农药提出了高效、低毒、环境友好型的要求。世界各国也在采取实际步骤减少化学合成农药的使用，如美国EPA在20世纪90年就宣布撤消91种化学农药的登记，荷兰、丹麦在1990年就制定了减少一半农药使用量的五年和十年计划，欧盟也制定了类似的计划。我国也已撤消十几种化学农药的登记。为了解决农产品提高产量和保证质量之间的矛盾，达到综合防治蔬菜重大病虫害、减少化学农药使用量的目的，发展生物防治技术越来越受到各国政府、科技工作者和民众的关注。生物菌剂(BCA)以其低毒、环境兼容性好、具有在作物幼苗根际建群的能力，持效期长，有害生物不易对其产生抗药性等特点得到广泛的关注和重视，目前国际上先进的农化公司大多积极参与生物菌剂的研究和市场化，特别是有益细菌在土传、种传病害的防治中已取得了一定进展，并有系列产品得到成功的应用，取得了显著的经济和生态效益。生物防治作为综合防治的一项重要措施，在植物病虫害综合治理中发挥着愈来愈重要的作用。
PGPR(促进植物生长的根际细菌)是目前比较受到广泛关注的一类生防细菌。也是国内应用于土传病害综合防治的主要生防因子之一，其通过移植于根系和优先占领根系或抑制根上的有害根际细菌和有害真菌(DRMO)来促进植物的生长。其中芽孢杆菌属(Bacillus spp.)以其分布广，易分离培养，能产生耐热耐干燥的内生孢子，贮藏期长，使用方便等特点，成为一种理想的生防微生物，自1945年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，半个多世纪以来各国的研究工作者对它可望成为一种生物控制因素而寄予极大关注，并在多种作物上进行了广泛的控制病害能力试验，有许多成功应用，在生产实践中表现出明显的防病增产作用，也进一步证实了芽孢杆菌生防菌剂在产品中的稳定性，与化学农药的相容性和不同植物不同年份防效的一致性方面明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌。
国内外学者先后分别报道了具有生物控制作用的各个不同株系的枯草芽孢杆菌的生物学特征、定殖条件、抗菌物质理化特性等相关研究及其在不同作物根部定植情况、对腐霉、镰刀菌等引起的不同土传病害的防治效果、潜在的诱导植物产生抗病性及促进幼苗生长等方面的研究。已有研究表明，因芽孢杆菌能产生内生芽孢，具有极强的抗逆能力，相比其他类型的生防因子，更有利于菌剂的生产，剂型加工及在环境中存活，定殖与繁殖。
发明内容
本发明的一个目的是提供一株具有广谱杀菌活性的枯草芽孢杆菌。
本发明所提供的枯草芽孢杆菌，是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259，已于2005年09月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1451。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451，是从黑龙江齐齐哈尔市克山县大豆田间土壤中分离得到的。
本发明的第二个目的是提供一种具有广谱杀菌活性的微生物菌剂。
本发明所提供的微生物菌剂，它的活性成分为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No.1451。
所述微生物菌剂可按如下方法获得：在YMA或玉米浆培养基中发酵枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451，将得到的发酵液与基质混合得到微生物菌剂。
所述玉米浆培养基中含有蔗糖5g，玉米粉2g，KH2O4 0.05g，(NH4)2SO4 0.5g，K2HPO40.05g，MgSO4 0.025g，CaCO3 2g，蒸馏水1000ml。
YMA培养基中含有甘露醇10g，酵母粉3g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，0.2g MgSO4.7H2O，NaCl 0.1g，CaCO3 3g，琼脂10g，蒸馏水1000ml，pH值7.2。
所述发酵条件中，培养温度可为25-30℃，通气量可为1∶0.5-1∶1.6，搅拌速度可为200-400rpm，培养时间可为24-48h；所述通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值。
其中，所述培养温度优选为28-30℃，通气量优选为1∶1-1∶1.2，搅拌速度优选为250-300rpm，培养时间优选为24-30h。
发酵时可加入植物油或有机硅油作为消沫剂。
所述植物油的质量百分含量可为1-2％；所述有机硅油的质量百分含量可为0.04-0.1％。
所述基质可为草炭、微粉碳酸钙、凹凸棒土或膨润土。
所述微生物菌剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451的活菌数可为5×109cfu/g，pH值可为6.0-7.8。
实验结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451对除假单胞菌属之外的四个真菌亚门13属的22种植物病原真菌和5个重要属的代表性病原细菌均具有明显的抑制生长作用，其中对瓜果腐霉，辣椒疫霉，胶胞镰刀菌、小麦禾谷丝核菌，苜蓿根腐病镰刀菌，棉花黄萎病菌，棉花枯萎病菌，苹果腐烂病菌和小麦立枯丝核菌的抑制率达到72.76％～94.86％。室内及温室试验表明该菌株用作土壤调控、种子处理和地上部喷雾，对土传、种传等病原菌引起的根腐病具有良好防治效果。在黑龙江省大豆重迎茬田和吉林省、北京郊区根腐病发生比较严重的多个蔬菜保护地和苜蓿田进行了防治试验，结果表明HL259及其代谢产物能够显著控制由Pythium，Phytophthora，Fusarium和Rhizoctonia等引起的烂种、猝倒、立枯、根腐等病害，并兼治部分细菌性病害，具有一定的增产作用，尤其用于种子处理和土壤处理后对于多种病原菌复合侵染导致的根腐病具有显著的防病保苗效果，是一株具有广谱杀菌活性的生防菌株。
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对作物均无致病作用，且剪叶接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对番茄茎长、辣椒茎长和西葫芦茎长有促进作用；针刺接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对黄瓜茎长、鲜重有促进作用；蘸根接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对甜瓜茎长、鲜重和苜蓿茎长有促进作用。
实验结果表明，以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451为活性成分的微生物菌剂可有效防治蔬菜、瓜类、豆类和苜蓿生产中由镰刀菌、腐霉菌、疫霉菌和立枯丝核菌引起的根腐病、猝倒病和立枯病等植物病害，而且该微生物菌剂的制备工艺简单、发酵周期短、投入低和易于保存。
附图说明
图1A为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的光学显微镜照片
图1B和图1C为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的电镜照片
图2为根据16SrRNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得的进化树结果
图3为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451与Bacillussubtilis US116的16SrRNA基因序列源性比较结果
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。
实施例1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的分离及鉴定
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的分离
从黑龙江齐齐哈尔市克山县大豆田间采集土样10g，加入内装100ml无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100转/min摇床上振荡20min，取0.5ml加入4.5ml无菌水中，依次稀释10-2，10-3，10-4倍，分别取以上悬浊液0.1ml在YMA、牛肉膏蛋白胨(细菌培养基)、马丁氏(真菌分离培养基)、改良高氏1号(放线菌培养基)培养基上涂布，每个浓度重复3次，置于28℃恒温箱中培养24h、3d和5d，分别进行细菌，真菌和放线菌的分离和纯化。并分别以Pythium，Phytophthora，Fusarium和Rhizoctonia为靶标菌，进行拮抗菌的筛选。从中筛选出对各个供试菌具有明显抑菌效果的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451的鉴定
(1)菌体的形态特征
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451在土壤浸汁琼脂培养基上(土壤1kg加水1000ml，高压蒸汽(121℃)灭菌30min。浸液加滑石粉后用双层滤纸过滤，pH值调节至中性，则按照土壤浸液100ml，琼脂17g，水900ml制备培养基)培养24h后菌落为圆形，白色不透明，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有皱褶状凸起，变为乳脂色，生长在其上的细胞物质不易在液体中分散，光学显微镜下观察到杆状细胞(图2A)，大多数运动，鞭毛周生，细胞为0.6～0.8×3～5μm，革兰氏染色均匀，并可见细胞中被染成蓝紫色芽孢。扫描电子显微镜观察进一步确证芽孢杆状形态，细胞壁外带有厚薄均一的黏质层，产生椭圆型芽孢，无伴胞晶体(图2B和图2C)。
(2)菌株的生理生化鉴定
将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451与枯草芽孢杆菌标准菌株1.504(中国菌种保藏管理委员会)在相同的实验条件下进行生理生化性状检测，结果如表1。
                       表1.HL259鉴定项目及结果
  检测项目  HL259   标准菌株   检测项目   HL259   标准菌株
革兰氏反应 + +   产黑色素  1％葡萄糖   -   -
 1％酪氨酸   -   -
  淀粉水解  +   +
  芽孢染色  +   +   利用  柠檬酸盐   +   +
  伴胞晶体  -   -  丙酸盐   -   -
  运动性  +   +   从NO3产生NO2   +   +
  接触酶  +   +   产生吲哚   -   -
  厌氧生长  -   -   分解  酪素   +   +
  V-P反应  +   +  酪氨酸   -   -
  卵黄反应  -   -   pH5.7生长   +   +
  7％NaCI生长a  +   +   50℃生长   +   +
  产酸   葡萄糖  +   +   明胶水解   +   +
  ***糖  +   +   产气  葡萄糖   -   -
  木糖  +   +
甘露醇 + +
注：a表示HL259在10％NaCl中也能生长。“+”表示阳性结果；“-”表示阴性结果。
(2)HL259菌株16SrRNA序列测定和质粒提取
16SrRNA基因序列测序结果表明HL259菌株的16SrRNA基因序列具有序列表中序列1的核苷酸序列，根据测序结果与Genbank中芽孢杆菌16SrRNA基因序列进行同源性比较，结果表明HL259与Bacillus subtilis US116的同源性达到99.52％(图3，图中，HL259行中的“-”表示与US116相应位点的碱基相同，“g、c、a”表示与US116相应位点的碱基不同)，说明HL259菌株属于芽孢杆菌属(Bacillus)。质粒提取和电泳结果表明，HL259含有一个大约4.5kb左右质粒，在含有50μg/ml氨苄青霉素(Amp)的平板上可以正常生长。
文献显示枯草芽孢杆菌可运动，革兰氏阳性，芽孢椭圆形或柱状、中生或偏中生，接触酶试验阳性，V-P试验阳性，7％-10％氯化钠中生长，从葡萄糖、***糖、木糖和甘露醇产酸，水解淀粉，利用柠檬酸盐作为碳源，还原硝酸盐成亚硝酸盐，分解酪素，卵黄反应阴性，在葡萄糖和酪氨酸琼脂上不形成黑色素，不利用丙酸盐和不分解酪氨酸等特点。将以上HL259的部分生理生化性状检测结果与枯草芽孢杆菌标准菌株相比较，根据《一般细菌常用鉴定方法》(中国科学院微生物细菌研究所细菌分类组编，科学出版社，1978年)，《芽孢杆菌属》(蔡妙英，战立克等译，农业出版社，1988年)和《微生物分类学》(张继忠，上海复旦大学出版社，1998)中的检索表进行检索，确定HL259生理生化性状与枯草芽孢杆菌相应性状吻合。同时16SrRNA序列及根据16SrRNA序列用DNAMAN Version 4.0分析获得的进化树结果(图2)进一步确认生化鉴定结果，鉴定HL259为枯草芽孢杆菌。
实施例2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №.1451的抑菌活性(抑菌谱测定)
一、抑菌活性测定
采用菌丝生长速率测定法和孢子萌发法检测了枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No.1451菌株及代谢产物对包括四个真菌亚门13属的22种植物病原真菌：立枯丝核病菌Rhizoctonia solani、苹果腐烂病菌Valsa mali、小麦赤霉病菌Fusarium graminearum、黄瓜蔓枯病菌Mycosphaerella melonis、番茄早疫病菌Alternaria solani、串珠镰刀菌Fusarium moniliforme、棉花枯萎病菌Fusariun oxysporum f.sp.vasinfectum、番茄灰霉病菌Botrytis cinerea、豌豆茄形镰刀菌、Fusarium solani f.sp.pisi、玉米小斑病菌Bipolaris maydis、苹果轮纹病菌Physalospora piricola、炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides、棉花黄萎病菌Verticillium dahliae、水稻稻瘟菌Piriculariaoryzae、辣椒疫霉Phytophthora capsici、瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum、胶孢镰刀菌Fusarium subglutinans、小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis、苜蓿根腐病镰刀菌Fusarium avenaceam、玉米丝黑穗病菌Sporisoriumholci-sorghi(Rivolta)vanky)；采用双层平板培养法和牛津杯方法测定了5个重要属的代表性病原细菌：薄壁菌门主要属中的土壤杆菌属(Agrobacterium)k27病菌，布克氏菌属(Ralstonia)茄青枯病菌，假单胞菌属(Pseudomonas)黄瓜角斑病菌，黄单胞菌属(Xanthomonas)水稻白叶枯病菌、棉花角斑病菌和番茄疮痂病菌；厚壁菌门主要属中的棒形杆菌属(Clavibacter)番茄溃疡病菌的抑菌活性和抑菌谱。
1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451抑制病原真菌效果检测
采用平板培养法，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451在523斜面28℃下活化48h，用0.85％生理盐水制成菌悬液，用麦克比浊法确定最终菌悬液浓度为109cfu/ml备用。供试真菌在PDA平板上25℃活化5d，使其形成菌落，用打孔器(直径5mm)制取菌饼，将菌丝面朝下接菌于PDA平板中央。将高温灭菌的双层滤纸片(直径5mm)在枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451菌悬液中浸湿，均匀摆放在PDA平板上，每皿3片，距离均匀，以放置浸湿无菌水纸片的PDA平板为对照，每个处理4次重复，25℃下黑暗培养4、5、6、7d后分别测量真菌菌落直径，并计算抑制生长率。
Figure A20051010487200091
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对供试病原真菌的抑制作用结果如表2所示。
表2.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对供试病原真菌的抑制作用
供试菌株   滤纸片法(菌落半径cm) 抑制率(％)
  CK   HL259
  立枯丝核病菌Rhizoctonia solani   4.00   0.76   92.57
  苹果腐烂病菌Valsa mali   3.80   0.85   89.39
  小麦赤霉病菌Fusarium graminearum   2.50   1.33   58.50
  黄瓜蔓枯病菌Mycosphaerella melonis   3.47   1.43   68.69
  番茄早疫病菌Alternaria solani   3.13   1.54   60.46
  串珠镰刀菌Fusarium moniliforme   3.23   1.33   69.60
  棉花枯萎病菌Fusariun oxysporumf.sp.vasinfectum   2.77   1.05   75.77
  番茄灰霉病菌Botrytis cinerea   3.97   1.45   72.62
  豌豆茄形镰刀菌Fusarium solani f.sp.pisi   3.62   1.09   81.09
  玉米小斑病菌Bipolaris maydis   2.52   1.40   55.44
  苹果轮纹病菌Physalospora piricola   2.27   1.18   61.58
  炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides   2.90   1.47   59.58
  棉花黄萎病菌Verticillium dahliae   3.28   1.14   76.98
  水稻稻瘟菌Piricularia oryzae   2.85   1.64   51.49
  辣椒疫霉Phytophthora capsici   2.77   1.05   75.77
  瓜果腐霉菌Pythium aphanidermatum   3.62   1.35   72.76
  胶孢镰刀菌Fusarium subglutinans   3.25   1.18   75.27
  小麦纹枯病菌Rhizoctonia cerealis   4.00   0.68   94.86
  苜蓿根腐病镰刀菌Fusarium avenaceam   3.62   1.09   81.09
  玉米丝黑穗病菌   采用混浊度法测定             70.88
注：玉米丝黑穗病菌采用混浊度法测定，即于650nm波长下分别测定不同处理的吸光度，并与不加药液的空白处理相比求出相对抑制百分率。
Figure A20051010487200101
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451抑制病原细菌效果检测
分别将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451和靶标细菌活化48h后制成菌悬液，用麦克比浊法将菌悬液调整到1.5×109cfu/ml，吸取0.1ml靶标菌菌悬液加到培养基平板上用涂布铲铺平。将牛津杯(牛津杯的直径为0.85cm)放在培养基上，在每个牛津杯内加入100μl的菌悬液，以津杯内加入100μl的无菌水的PDA平板为对照，每皿3个牛津杯，距离均匀，4℃下保存16h，每个处理3次重复，28℃下黑暗培养24-48h后测量抑菌圈直径。枯草芽孢杆菌(BACILLUSSUBTILIS)HL259 CGMCC No1451对供试病原真菌的抑制作用如表3所示，所用对照的抑菌圈直径均为0cm。
表3.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对供试主要病
                         原细菌的抑制作用
  供试菌株   三次重复的抑菌圈直径(cm)   平均抑菌圈直径(cm)
  1   2   3
  马铃薯软腐Erwinia carotovora   2.13   2.15   2.14   2.14
  水稻白叶枯Xanthomonas oryzae   1.97   2.03   2.07   2.02
 K27Agrobacterium rhizogenes   1.91   1.9   1.96   1.92
 黄瓜角斑Pseudomonas syringae   0.85   0.85   0.85   0.85
 棉花角斑Xanthomonas malvacearum   1.34   1.36   1.90   1.63
 番茄疮痂Xanthomonas resicatoria   1.48   1.55   1.65   1.56
 番茄溃疡Clavibacter michiganensissubsp.michiganensis   1.50   1.42   1.58   1.50
 茄青枯菌株Ralstonia solanacearum   1.6   1.58   1.58   1.59
检测结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对马铃薯软腐、水稻白叶枯、K27、番茄溃疡、茄青枯、番茄疮痂、棉花角斑有效果，对黄瓜角斑无效。
本实施例以包括四个真菌亚门13属的22种植物病原真菌和5个重要属的代表性病原细菌为靶标菌，测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC№1451的抑菌谱；结果表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC№1451对除假单胞菌属之外的其它供试靶标病菌均具有明显的抑制生长作用，表明枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451具有广泛的抑菌谱。其中对瓜果腐霉，辣椒疫霉，胶胞镰刀菌、小麦纹枯病菌，苜蓿根腐病镰刀菌，棉花黄萎病菌，棉花枯萎病菌，苹果腐烂病菌和立枯丝核病菌的抑制率达到72.76％～94.86％。
二、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451对作物的安全性测定
首先进行室内种子发芽安全性检测，即使用浓度为108cfu/ml的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC №1451菌悬液浸种处理几种主要作物种子后观测种子发芽安全性，以明确枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451用以种子处理的安全性，为田间试验应用提供理论依据。结果表明，菌悬液浸种处理后的番茄、辣椒、甜瓜、黄瓜、苜蓿、菜豆、西葫芦、茄子八种作物种子的发芽势和发芽率与对照无明显差异，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451浸种处理对菜豆发芽率、茄子发芽势还有明显促进作用。进一步采用蘸根接种法，针刺接种法和剪叶接种法在大棚或大田试验条件下检测枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451对以上八种作物有无致病性，为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451在生产中的进一步试验推广奠定基础。结果表明，接种枯枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451的八种作物的生长状况与对照相比较，可以看出枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451对八种作物均无致病作用，且剪叶接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451对番茄茎长、辣椒茎长和西葫芦茎长有促进作用；针刺接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No1451对黄瓜茎长、鲜重有促进作用；蘸根接种法接种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451对甜瓜茎长、鲜重和苜蓿茎长有促进作用。
实施例3、以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451为活性成分的微生物菌剂的制备
1、最适产素培养基和培养条件的确定
为了确定适合于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451生长的固体和液体培养基，比较了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCCNo1451在LB、YMA、YEM、PDA、金氏B、蔗糖蛋白胨培养基(蔗糖2.0％，蛋白胨0.5％K2HPO4 0.05％，MgSO4 7H2O 0.025％，蒸馏水1000ml，琼脂17.0g)、YGM(葡萄糖2.5％，酵母膏2.0g，K2HPO4 0.25g，KH2PO4 0.25g，MgSO4·7H2O 0.1g，MnSO4 0.15g，NaCl 0.05g，FeSO4·7H2O 0.005g，琼脂17.0g，蒸馏水1000ml)、523、BPY共9种培养基上的培养性状和生长速度，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451经划线接种，在28-30℃下培养24-48h，在9种培养基平板上均能生长培养，分别表现出浅黄褐色或淡灰白色，但不同培养基上菌落生长存在差异，在YMA上培养前期菌脓状，形成菌落较圆，逐渐菌落变厚，不透明，有皱褶，菌体变白，菌落扩展快；其次测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451在不同液体培养基中的生长曲线、OD450值和pH值的变化，进行综合分析确定YMA培养基较适于液体摇培，YMA培养液中摇培至12h菌量已达108cfu/ml，其菌量达到高峰的时期是24h，菌量为1010cfu/ml；随后进行枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451的最适产素培养基和培养条件筛选。试验表明，适合于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451产素的培养基为YMA和玉米浆培养基(蔗糖5g，玉米粉2g，KH2PO4 0.05g，(NH4)2SO4 0.5g，K2HPO4 0.05g，MgSO40.025g，CaCO3 2g，加水1000ml)。进而研究了包括摇培温度，起始pH，装液量和接种量等摇培条件的选择试验，确定斜面种子(108cfu/ml)以1～2％(体积比)接种量至摇床三角瓶，在装液量为20～40％(体积比)，培养温度为28～32℃，起始pH为6.0，摇床速度为180～220rpm培养条件下摇培18～24h，其代谢产物的抑菌作用最为显著。进一步从已确定的摇瓶条件，研究了种子罐至发酵罐的发酵条件：三角瓶内种子(1010cfu/ml)以1～2％(体积比)接种量至种子罐(30～50L)，种子罐内发酵液以3～5％(体积比)接种量接种到发酵罐(800～1000L)。种子罐和发酵罐的培养条件：25-30℃下培养24～48h，通气量为1∶0.5～1∶1.6(通气量定义为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值)，消沫剂用质量百分含量为1-2％的植物油或质量百分含量为0.04-0.1％的有机硅油，搅拌速度为200～400rpm；然后将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂，或将发酵液离心获得的菌体沉淀按1∶1的质量比与微粉碳酸钙混合制得生防菌剂，其中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451菌量大于等于5×108cfu/g。
2、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451微生物菌剂(HL259菌剂)的制备
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451经划线接种在YMA培养基上，于30℃下培养24h进行菌种活化；然后将斜面种子(108cfu/ml)以1～2％(体积比)的接种量接种至摇床三角瓶(容积为1000ml)的YMA培养液中，装液量为30％(体积比)，培养温度为28℃，起始pH为6.0，摇床速度为200rpm，摇培时间为24h；之后将三角瓶内种子(1010cfu/ml)以2％(体积比)接种量接种至种子罐(容积50L)内的玉米浆培养基内，28±1℃下培养24h，通气量为1∶1-1∶1.2，消沫剂用有机硅油0.04％，搅拌速度为260rpm；将种子罐内发酵液以5％(体积比)接种量接种到发酵罐(容积为1000L)的玉米浆培养液中，培养条件为28±1℃，通气量为1∶1-1∶1.2，消沫剂用有机硅油0.04％，搅拌速度为260rpm，培养24h。将菌液用草炭吸附制成粉末型菌剂，或将发酵液离心获得的菌体沉淀按1∶1的质量比与微粉碳酸钙混合制得生防菌剂，其中，粉末型菌剂的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HL259 CGMCC No1451菌量为5×109cfu/g。进一步通过显微观察，平板计数等手段检测菌剂中的有效活菌数，pH值及杂菌率，确定菌剂产品质量。菌剂产品质量分析以比浊、镜检和平板计数三种方法配合。比浊法和镜检简便、快捷，在三角瓶、种子罐和发酵罐等发酵过程中发酵液的含菌量和纯度的检测中使用。比浊检验时取发酵液500ml，以空白液体培养基作对照，测定发酵液的OD650，OD650高于1.0时，发酵液应作稀释，每个样品设3个重复，按测定的OD650在“含菌量(cfu/ml)-OD650”标准曲线上查出相应的含菌量。镜检菌体形态时取发酵液500ml，以纯菌种作对照，涂片，用番红染色，在显微镜下观察菌体形态，与纯菌种比较。在最终的成品质量检验时采用平板计数法。检测结果表明，粉末型生防菌剂的有效活菌数为8×109cfu/g，pH值7.2，杂菌率0％。
实施例4、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451菌剂防治西瓜立枯病、猝倒病和枯萎病的效果
立枯病、猝倒病、枯萎病是西瓜生长过程中主要病害，本实施例通过田间试验测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No1451菌剂对西瓜(兴农一号)出苗率、生长指标的影响及对苗期立枯病、猝倒病及中后期枯萎病的防治效果。具体方法如下：
供试药品：实施例3步骤2制备的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259CGMCC No1451粉末型菌剂、对照生防菌剂1号(购自北京市土肥工作站，活性成分为蜡质芽孢杆菌，有效活菌数为108cfu/g)、对照生防菌剂2号(购自北京市土肥工作站，活性成分为枯草芽孢杆菌，有效活菌数为108cfu/g)。
本试验7个处理，4次重复，共计28个小区。随机排列。
处理1：HL259菌剂1∶40浓度用于西瓜种子拌种。
处理2：HL259菌剂1∶50浓度用于西瓜各子拌种。
处理3：HL259菌剂1∶60浓度用于西瓜各子拌种。
处理4：对照生防菌剂1号1∶50拌种。
处理5：对照生防菌剂2号1∶50拌种。
处理6：50％福美双可湿性粉剂1∶200拌种。
处理7：不用药剂处理种子(对照)
每小区面积46.8M2，株距×行距＝36cm×65cm。试验地土壤为沙壤土。有机质(％)：1.2828碱解氮：93.56mg/kg速效磷：55.95mg/kg速效钾：69.2mg/kgpH值：8.09。前茬作物是西瓜。
播种前两天根据拌种或拌种药种比例，分别将各小区所需的药剂和种子混装于塑料袋中，采用手工抖动方式，将药剂均匀包被或粘附在种子表面。采用直播方式进行播种。播种后7天调查出苗率，每小区随机取样4点，每点固定5株，每个处理共调查80株。播种20天后每小区随机取样20株西瓜幼苗，调查和记录茎粗，蔓长，叶片长、叶宽，根长等主要生长指标。各处理小区药剂对西瓜出苗和西瓜生长指标的影响结果如表4和表5所示，表明HL259菌剂以1∶40和1∶50浓度拌种处理西瓜种子，对西瓜出苗率和生长指标的促进作用均优于其他处理。
         表4.不同处理小区西瓜幼苗出苗率(％)调查结果
  3   100.0   96.3   100.0   86.7   83.9   89.7   83.9
  4   100.0   96.3   92.6   100.0   92.9   96.3   96.3
  平均   100.0   97.2   95.3   94.8   93.2   94.6   89.3
            表5.不同处理小区西瓜生长指标调查结果
Figure A20051010487200151
  7   1   0.70   74.40   14.83   16.49   21.50
  2   0.71   72.80   14.53   16.38   20.68
  3   0.68   70.50   14.30   17.05   25.45
  4   0.66   66.30   14.50   16.55   24.15
  平均   0.69   70.90   14.45   16.60   22.95
播种21天后，每小区随机调查40株，记录发病死亡株数，与对照相比计算西瓜立枯和猝倒病的防治结果。播种60天后，每小区随机取样20株，记录病株率，并按以下分级标准调查病情基数，以病情指数计算枯萎病的防治效果。
分级标准如下：
0级—植株生长正常。
1级—病株比正常瓜秧稍短，剖茎维管束变黄褐色，瓜秧生产受到抑制。
2级—病株比正常瓜秧稍短，剖茎维管束变黄褐色，早晚表现正常，中午瓜秧萎蔫，影响西瓜生产。
3级—病株比正常瓜秧明显缩短，萎蔫枯死，拔出病苗观察根部变褐色，西瓜失去商品价值。
HL259菌剂对西瓜立枯和猝倒病的防治结果如表6，HL259菌剂以1∶40、1∶50和1∶60浓度拌种处理西瓜种子，对西瓜猝倒病具有较好的防治效果，分别为81.66％、77.08％和72.49％；对立枯病防效分别为88.89％、88.89％和72.22％。HL259菌剂对枯萎病的防治效果如表6，防病效果分别为91.24％、83.00％和75.95％，优于其他处理。
采用Duncan’s新复极差测验方法对猝倒病、立枯病和枯萎病防治效果进行了分析比较，以评价本试验中药剂处理之间防治西瓜三种主要病害的差异显著性。方差分析表明，HL259菌剂三种不同的拌种浓度对猝倒病和立枯病的防治效果差异不显著；对枯萎病的防治效果在5％和1％水平上均表现出显著的的差异，且与其他各处理在5％和1％水平上也存在着较大的差异。
整个试验期间西瓜生长正常，没有发现药害。说明HL259菌剂以1∶40和1∶50浓度拌种处理西瓜种子对西瓜生长安全。调查中未发现供试药剂对非靶标生物的不良影响，说明该药剂对环境安全。种子拌种的药种比为1∶40-50防治效果较好。
表6.HL259菌剂防治西瓜枯萎病、猝倒病和立枯病试验结果
  处理   重复   调查株数   枯萎病   调查株数   猝倒病   立枯病
  0级   1级   2级   3级   病情指数   防治效果(％)   发病株数(株)   发病率(％)   防治效果(％)   发病株数(株)   发病率(％)   防治效果(％)
  1   1   20   19   1   0   0   0.56   94.40   40   2   5.00   63.32   0   0.00   100.00
  2   20   19   1   0   0   0.56   94.4   40   1   2.50   81.66   0   0.00   100.00
  3   20   18   2   0   0   1.11   89.49   40   1   2.50   81.66   2   5.00   55.56
  4   20   19   0   1   0   1.11   86.67   40   0   0.00   100.00   0   0.00   100.00
  平均   20   0.83   91.24   40   -   2.50   81.66   -   1.25   88.89
  2   1   20   18   2   0   0   1.11   88.9   40   1   2.50   81.66   1   2.50   77.78
  2   20   18   1   1   0   1.67   84.19   40   1   2.50   81.66   1   2.50   77.78
  3   20   17   3   0   0   2.22   78.98   40   1   2.50   81.66   0   0.00   100.00
  4   20   18   1   1   0   1.67   79.95   40   2   5.00   63.32   0   0.00   100.00
  平均   20   1.67   83.00   40   -   3.13   77.08   -   1.25   88.89
  3   1   20   17   2   1   0   2.22   77.80   40   1   2.50   81.66   3   7.50   33.33
  2   20   16   3   1   0   2.78   73.67   40   3   7.50   63.32   1   2.50   77.78
  3   20   17   2   1   0   2.2   78.98   40   2   5.00   63.32   1   2.50   77.78
  4   20   17   2   0   1   2.22   73.35   40   1   2.50   81.66   0   0.00   100.00
  平均   20   2.34   75.95   40   -   4.38   72.49   -   3.13   72.22
  4   1   20   16   2   2   0   333   66.7   40   2   5.00   63.32   2   5.00   55.56
  2   20   16   2   1   1   3.89   63.16   40   2   5.00   63.32   4   10.00   11.11
  3   20   15   3   2   0   5.00   52.65   40   3   7.50   44.97   1   2.50   77.78
  4   20   15   3   2   0   3.89   53.30   40   1   2.50   81.66   2   5.00   55.56
  平均   20   4.03   58.95   40   -   5.00   63.32   -   5.63   50.00
  5   1   20   15   2   2   1   5.0   50.00   40   2   5.00   63.32   0   0.00   100.00
  2   20   15   3   1   1   4.44   57.95   40   4   10.00   26.63   1   2.50   77.78
  3   20   11   5   4   0   7.22   31.63   40   3   7.50   44.97   4   10.00   11.11
  4   20   14   3   2   1   5.56   33.25   40   0   0.00   100.00   1   2.50   77.78
  平均   20   5.56   43.21   40   -   5.63   58.73   -   3.75   66.67
6   1   20   14   3   1   2   6.11   38.90   40   0   0.00   100.00   2   5.00   55.56
  2   20   12   3   3   2   8.33   21.12   40   3   7.50   44.97   2   5.00   55.56
  3   20   12   4   3   1   7.22   31.63   40   4   10.00   44.97   1   2.50   77.78
  4   20   13   4   2   1   6.11   26.65   40   3   7.50   63.32   2   5.00   55.56
  平均   20   6.94   29.58   40   -   6.25   63.32   -   4.38   61.12
  7   1   20   11   3   3   3   10.00   -   40   5   12.50   -   4   10.00   -
  2   20   11   2   4   3   10.56   -   40   6   15.00   -   3   7.50   -
  3   20   10   3 5   2   10.56   -   40   4   10.00   -   6   15.00   -
  4   20   12   3   3   2   8.33   -   40   7   17.50   -   5   12.50   -
  平均   20   -   -   40   -   13.63   -   -   11.25   -
实施例5、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451菌剂防治黄瓜蔓枯病的效果
黄瓜蔓枯病是黄瓜生产中的重要病害，主要危害茎基部，初生油渍状病斑，表面变白，出现裂痕，有时溢出胶状物，该病害从秋到春季相对低温时期危害作物，尤其是多湿条件下迅速蔓延。本实施例通过田间试验测定HL259菌剂对津春2号(天津黄瓜研究所)黄瓜蔓枯病的防治效果。具体方法如下：
供试药品：实施例3步骤2制备的枯草芽孢杆菌(Baciillus subtilis)HL259CGMCC No.1451生防菌剂、对照生防菌剂1号(购自北京市土肥工作站，活性成分为蜡质芽孢杆菌，有效活菌数为108cfu/g)。
本试验设5个处理，4次重复，共计20个小区。采用随机区组排列。每个大棚小区面积15.5m2，株距×行距＝30cm×90cm。试验地土壤为沙壤土。前茬作物是黄瓜。
处理1：HL259菌剂1∶20比例稀释用于黄瓜喷施根部。
处理2：HL259菌剂1∶10比例稀释用于黄瓜喷施根部。
处理3：HL259菌剂1∶5比例稀释用于黄瓜喷施根部。
处理4：对照生防菌剂1号1∶5比例稀释喷施根部。
处理5：清水对照
施药前调查病情基数，施药后20d调查上次施药结果，计算总体防效。蔓枯病的防效调查参照农业部药检所《农药田间药效试验准则》(二)中有关“防治瓜类枯萎病药效试验准则”的方法。试验中采用小区普查，记录病株率，以病株率计算防治效果。
HL259菌剂的3个不同稀释浓度及对照生防菌剂1号对黄瓜蔓枯病防治效果如表7所示，HL259菌剂分别按照1∶20、1∶10和1∶5比例稀释剂量喷施黄瓜根茎部，对黄瓜蔓枯病的防效分别为53.31％、60.01％和86.60％；对照生防菌剂1号以1∶5比例稀释剂量喷雾后防效为53.24％。从结果可以看出HL259菌剂分别按照1∶10和1∶5的防效明显好于对照生防菌剂1号以1∶5比例稀释处理(处理4)。HL259菌剂分别按照1∶20稀释剂量的防效与处理4相当。
采用Duncan’s新复极差测验方法对蔓枯病防治效果进行了分析比较，以评价本试验中HL259菌剂不同剂量以及对照对照生防菌剂1号防治黄瓜蔓枯病的差异显著性。方差分析表明，处理3(1∶5)在5％水平上和其它处理存在显著差异，在1％水平上处理3(1∶5)和处理2(1∶10)差异不显著，但与对照生防菌剂1号之间存在显著差异。整个试验期间黄瓜生长正常，没有发现药害。说明HL259菌剂以供试浓度喷施处理黄瓜植株根部对作物生长安全。调查中未发现供试药剂对非靶标生物的不良影响，说明该药剂对环境安全。HL259菌剂在黄瓜蔓枯病发病初期进行根茎部土壤喷施处理可有效控制该病的发展和传播，是防治黄瓜蔓枯病的有效药剂，对作物正常生长无不良危害，且防治效果显著好于常规用药品种和应用剂量。HL259菌剂可按照1∶10和1∶5稀释比例剂量喷施黄瓜根茎部土壤。
表7.HL259菌剂的以不同稀释比例剂量喷施黄瓜根茎部土壤防治黄瓜蔓枯病结果
  处理   重复   总株数(株)   施药前病株数(株) 病株率％   施药后病株数(株) 病株率％ 防病效果％
  ck   1   72   1   1.39   5   6.94   -
  2   72   5   6.94   7   9.72   -
  3   72   4   5.56   6   8.33   -
  4   72   1   1.39   3   4.17   -
  平均   72   2.75   3.82   5.25   7.29   -
  1   1   108   1   0.93   3   2.78   46.68
  2   108   4   3.70   6   5.56   46.40
  3   108   3   2.78   5   4.63   46.68
  4   108   3   2.78   4   3.70   73.48
  平均   99   2   2.55   4.50   4.17   53.31
  2   1   108   3   2.78   5   4.63   46.68
  2   108   1   0.93   3   2.78   46.68
  3   108   3   2.78   4   3.70   73.48
  4   108   0   0.00   1   0.93   73.20
  平均   108   1.75   1.62   3.50   3.01   60.01
  3   1   108   2   1.85   3   2.78   73.20
  2   108   1   0.93   1   0.93   100.00
  3   108   0   0.00   1   0.93   73.20
  4   108   0   0.00   0.00   0.00   100.00
  平均   108   0.75   0.70   1.25   1.16   86.60
  4   1   108   2   1.85   4   3.70   46.68
  2   108   2   1.85   3   2.78   73.20
  3   108   4   3.70   6   5.56   46.40
  4   108   1   0.93   3   2.78   46.68
  平均   108   2.25   2.08   4.00   3.71   53.24
实施例6、HL259菌剂防治辣椒疫霉病的效果
辣椒疫病是辣椒生产中的一种毁灭性病害，在我国南方和北方都有分布，在温室和大棚及露地均有发生，尤其大棚移栽的辣椒幼苗受害最为严重，常导致幼苗期成片死亡，成株期受害会造成落叶和整株萎蔫枯萎，生产中需要提供有效的防治措施。本实施例通过田间试验测定HL259菌剂对京研辣椒3号、茄门甜椒辣椒疫病的防治效果。具体方法如下：
供试药品：实施例3步骤2制备的HL259粉末型菌剂、对照生防菌剂1号(购自北京市土肥工作站，活性成分为蜡质芽孢杆菌，有效活菌数为108cfu/g)。
本试验设5个处理，4次重复，共计20个小区。采用随机区组排列。每个大棚小区面积15.5m2，株距×行距＝30cm×90cm。试验地土壤为沙壤土。前茬作物是辣椒。
处理1：HL259菌剂1∶50比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理；
处理2：HL259菌剂1∶20比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理；
处理3：HL259菌剂1∶10比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理；
处理4：对照生防菌剂1号1∶50比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理；
处理5：对照生防菌剂1号1∶20比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理；
处理6：对照生防菌剂1号1∶10比例稀释用于辣椒叶片喷雾和灌根处理。
施药前调查病情基数；施药后15天调查上次施药结果，计算总体防效。疫病的防效调查参照农业部药检所《农药田间药效试验准则》(二)中有关“防治瓜类疫病药效试验准则”的方法。试验中采用五点取样方法，记录病情指数，计算防治效果。其中，病情指数分级方法为：0级，健康无症；1级，地上部仅叶、果有病斑；3级，地上茎、枝有褐腐斑；5级，茎基部有褐腐斑；7级，地上茎、枝和茎基部均有褐腐斑；9级，全株枯死。
HL259菌剂的3个不同稀释浓度及对照生防菌剂1号不同稀释浓度对京研辣椒3号辣椒疫病的防治效果如表8所示，HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量灌根施药，对辣椒疫病的防效分别为45.74％、73.46％和83.46％；对照生防菌剂1号以1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量灌根后防效为37.60％、56.96％和58.70％；说明HL259菌剂分别按照1∶20和1∶10的灌根施药防效明显好于对照生防菌剂1号处理。HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量喷雾叶片，对辣椒疫病的防效分别为56.33％、66.53％和74.48％；对照生防菌剂1号以1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量喷雾叶片后防效为42.64％、52.25％和59.97％；说明HL259菌剂分别按照1∶20和1∶10的喷雾施药防效明显好于对照生防菌剂1号处理。
HL259菌剂的3个不同稀释浓度及对照生防菌剂1号不同稀释浓度对茄门甜椒辣椒疫病的防治效果如表9所示，HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量灌根施药，对辣椒疫病的防效分别为77.32％、81.58％和86.35％；对照生防菌剂1号以1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量灌根后防效为49.19％、54.17％、57.47％。说明HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10的灌根施药防效明显好于对照生防菌剂1号处理。HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量喷雾叶片，对辣椒疫病的防效分别为53.85％、59.52％和70.87％；对照生防菌剂1号以1∶50、1∶20和1∶10比例稀释剂量喷雾叶片后防效为39.54％、51.44％和47.52％。说明HL259菌剂分别按照1∶50、1∶20和1∶10的防效明显好于对照生防菌剂1号处理。
整个试验期间辣椒生长正常，没有发现药害。说明HL259菌剂以供试浓度喷施处理辣椒植株叶片或灌根对作物生长安全。调查中未发现供试药剂对非靶标生物的不良影响，说明该药剂对环境安全。HL259菌剂在辣椒疫病发病初期进行根部灌根处理和叶部喷雾处理可有效控制该病的发展和传播，是防治辣椒疫病的有效药剂，对作物正常生长无不良危害，且防治效果显著好于对照菌剂1号。较好的使用方式是HL259菌剂按照1∶20和1∶10稀释比例剂量喷施辣椒，灌根处理根茎部土壤。
             表8.HL259菌剂对京研辣椒3号的防治效果
处理           喷雾施药            灌根施药
  病情指数(％)   防治效果(％)   病情指数(％)   防治效果(％)
    CK     35.50
HL259菌剂生防菌1(cfu/mL)     1∶501∶201∶101∶501∶201∶10     14.5011.889.0620.3616.9514.21     56.3366.5374.4842.6452.2559.97     19.269.425.8722.1515.2814.66     45.7473.4683.4637.6056.9658.70
                       表9.HL259菌剂对茄门甜椒的防治效果
  处理           喷雾施药          灌根施药
  病情指数(％)     防治效果(％)    病情指数(％)   防治效果(％)
        CK     43.60
  HL259菌剂   1∶501∶20     20.1217.65     53.8559.52     9.898.03     77.3281.58
生防菌1(cfu/mL)   1∶101∶501∶201∶10   12.7026.3621.1722.88   70.8739.5451.4447.52   5.9522.1519.9818.54   86.3549.1954.1757.47
                                序列表
<160>1
<210>1
<211>1448
<212>DNA
<213>枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)
<400>1
tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg ctccctgatg ttagcggcgg     60
acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg gataactccg ggaaaccggg    120
gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac    180
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg    240
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga    300
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac    360
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg    420
ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg    480
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg    540
ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt    600
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat    660
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct    720
gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac    780
gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaaa cgcattaagc    840
actcccgcct ggggagtacg gtcgcaagac tgaaactcaa aggaattgac gggggcccgc    900
acaagcggtg gagcatgtgg tttaattcga agcaacgcga agaaccttac caggtcttga    960
catcctctga caatcctaga gataggacgt ccccttcggg ggcagagtga caggtggtgc   1020
atggttgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc   1080
ttgatcttag ttgccagcat tcagttgggc actctaaggt gactgccggt gacaaaccgg   1140
aggaaggtgg ggatgacgtc aaatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct   1200
acaatggaca gaacaaaggg cagcgaaacc gcgaggttaa gccaatccca caaatctgtt   1260
ctcagttcgg atcgcagtct gcaactcgac tgcgtgaagc tggaatcgct agtaatcgcg   1320
gatcagcatg ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccacg   1380
agagtttgta acacccgaag tcggtgaggt aaccttttag gagccagccg ccgaaggtgg   1440
gacagatg                                                            1448

Claims (10)

1、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451。
2、一种微生物菌剂，它的活性成分为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451。
3、一种制备权利要求2所述的微生物菌剂的方法，是在YMA或玉米浆培养基中发酵枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451，将得到的发酵液与基质混合得到微生物菌剂。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述玉米浆培养基中含有蔗糖5g，玉米粉2g，KH2PO4 0.05g，(NH4)2SO4 0.5g，K2HPO4 0.05g，MgSO4 0.025g，CaCO3 2g，加水1000ml。
5、根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵条件中，培养温度为25-30℃，通气量为1∶0.5-1∶1.6，搅拌速度为200-400rpm，培养时间为24-48h；所述通气量为每分钟通入发酵罐的空气体积与发酵罐中发酵液的体积比值。
6、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述培养温度为28-30℃，通气量为1∶1-1∶1.2，搅拌速度为250-300rpm，培养时间为24-30h。
7、根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法中，发酵时加入植物油或有机硅油作为消沫剂。
8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述植物油的质量百分含量为1-2％；所述有机硅油的质量百分含量为0.04-01％。
9、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述基质为草炭、微粉碳酸钙或凹凸棒土或膨润土。
10、根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述微生物菌剂中枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HL259 CGMCC No.1451的活菌数为5×109cfu/g，pH值为6.0-7.8。
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