CN101381685A

CN101381685A - 一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法

Info

Publication number: CN101381685A
Application number: CNA2008102334995A
Authority: CN
Inventors: 方敦煌; 卢秀萍; 李永平; 宋春满
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Science
Priority date: 2008-10-28
Filing date: 2008-10-28
Publication date: 2009-03-11

Abstract

本发明公开了一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法。烟草黑胫病菌菌丝块在28℃下恒温培养5～6天，培养物置于液体培养基中，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天，按3％～5％的体积比将液体菌液置于固体培养基中，在28℃下恒温培养10～12天，合格的固体培养物破碎成菌丝块，再与粗米糠、粗麦麸混匀，平铺，通风晾干，待水分降至35％～40％时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。运用该技术可缩短培养时间10～15天，培养获得的接种体容易分散，且有效侵染数量大，具有扩大培养的潜力，污染杂菌少。本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法。

背景技术

烟草黑胫病(tobacco black shank)是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，特别是在温带、亚热带和热带发生较重，是我国烟草的主要病害。目前，在实验室、温室有采用平板菌丝块、发酵搅碎菌丝液、游动孢子液等制备烟草黑胫病菌接种体的方法。这几类方法制备的接种体一般不适用于大田人工接种。在田间烟草黑胫病菌接种体应用较多的是谷物培养接种体，主要供烟草种质资源抗性鉴定或药剂筛选时人工接种病原物用。这种谷物培养制备方法的培养周期较长，通常需要45～60天；且培养时容易污染杂菌，导致培养失败。此外，培养成本相对较高。因此，如何更为有效的制备烟草黑胫病菌接种体，就成为烟草育种、植保工作中亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种经济有效的烟草黑胫病菌接种体的制备方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

除非另有说明，本发明所采用的百分数均为质量百分数。

一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法，包括以下步骤：

1、从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，菌种采用菌丝块水浸法置于10℃条件下恒温保存，备用；

2、将烟草黑胫病菌菌丝块移到试管平板培养基上，在28℃下恒温培养5～6天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种；所述的平板培养基配方为：燕麦片30g，琼脂17～20g，蒸馏水1000ml，pH自然；

3、用解剖刀切取烟草黑胫病菌菌丝块置于液体培养基中，每100毫升培养液接种菌丝2～4块，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天；所述的液体培养基配方为：燕麦片30g，蒸馏水1000ml，pH自然；培养得到的液体菌液要求：菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在10⁵个以上；

所述的菌丝块大小为2～4mm×2～4mm。

所述的培养液占容器容积的30％～50％。

4、按3％～5％的体积比将液体菌液置于盛有固体培养基三角瓶中，在28℃下恒温培养10～12天，所述的固体培养基配方为：粒径1～3mm的粗米糠和粗麦麸以8:2的质量比混匀，加入45％的清水，充分混匀；培养得到的固体培养物要求：菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在10⁵个以上；

所述的固体培养基占容器容积的50％～80％。

5、将合格的固体培养物破碎成0.5～1cm×0.5～1cm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸，米糠和麦麸按8:2的质量比混匀，搅碎、混匀，平铺，通风晾干2～3天，待水分降至35％～40％时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。

本发明相对于现有技术，具有以下优点：

1、可缩短培养时间10～15天；

2、培养获得的接种体颗粒比通常用的谷粒小，颗粒大小为2～3毫米，接种体容易分散；

3、接种体有效侵染数量大，具有扩大培养的潜力，污染杂菌少。

具体实施方式

通过下面给出的实施例和应用实施例，可以进一步清楚地了解本发明，但它们不是对本发明的限定。

实施例1

制备烟草黑胫病菌接种体，首先需要通过分离、培养、致病力测定获得强致病力病菌。通常可采用菌丝块贴接法、游动孢子灌根法接种病菌，测定发病情况，发病严重的菌株致病力强一些，以保证接种的有效性、可比性。然后培养制备接种体，培养采用平板、液体、固体3级培养的方式进行，再进行制备，本例采用游动孢子灌根法接种筛选获得的强致病力菌株98Pn022实施，具体如下：

①平板培养：平板培养基配方为CA：燕麦片30g，琼脂17～20g，蒸馏水1000ml，pH自然。

将4块烟草黑胫病菌98Pn022的菌丝块移到试管平板培养基上，在28℃恒温培养5～6天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种。

②液体培养：液体培养基配方为CA：燕麦片30g，蒸馏水1000ml，pH自然。

用解剖刀切取薄薄的一层烟草黑胫病菌98Pn022的菌丝块，菌丝块大小约为4mm×4mm，移到盛有250毫升培养液的500毫升三角瓶中，每瓶接种菌丝6～8块，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天。选择菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在10⁵个以上，作为固体培养的菌种。

③固体培养：固体培养基配方为：1毫米筛不能通过的粗米糠、粗麦麸以8:2的质量比混匀，按质量45％的比例加自来水，充分混匀。

用10毫升移液枪移取15～20毫升液体菌液到盛有固体培养基(至400毫升刻度处)的500毫升三角瓶，28℃恒温培养10～12天。选择菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子(每毫升10⁵个以上)，即为合格的固体培养物。

④接种体的制备

将封闭长满菌丝的固体培养物用25cm的镊子扳成0.5-1cm×0.5-1cm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸(8:2的质量比混匀)，搅碎、混匀，平铺，通风晾干2～3天，待水分降至35％～40％，即为所需的烟草黑胫病菌接种体，分装有孔塑料袋中，室温保存，备用。

应用实施例1

品种抗性评价

1.1 材料与方法

1.1.1 材料

供试接种病原为强致病力烟草疫霉98Pn022。供试品种为红花大金元、K326、云烟97、NC89。

1.1.2 方法

1.1.2.1 供试病原接种体的制备

烟草黑胫病菌接种体的制备：强致病力烟草疫霉98Pn022菌株固体接种体按实施例1进行。

1.1.2.2 抗性测定品种的小区布置

试验处理为4个处理，待测定的4个品种，每个品种为1个处理。每处理植烟20株，3次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约0.5亩。

1.1.2.3 病菌人工接种

移栽后的第四天在烟株根胫部周围株施烟草黑胫病菌固体接种体(本发明制备的接种体)3g，浇水后，培土。

1.1.2.4 病情调查

在烟草黑胫病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后的第80天调查一次病情。调查各处理的全部植株，调查记载采用YC/T39-1996“烟草病害分级及调查方法”中烟草根茎病害的行业标准。

1.2 结果与分析

品种抗性测定结果见表1，以病情指数大于30为感病、20≤病情指数<30为中度感病、10≤病情指数<20为中度抗病、小于10为抗病进行评价，可以看出红花大金元中度感病，云烟97、K326、NC89抗病。

表1 待测抗性品种的测定结果

应用实施例2

田间小区筛选拮抗烟草黑胫病的生防菌

2.1 材料与方法

2.1.1 材料

供试拮抗菌为温室盆栽筛选的6个菌株：GP1、GP3、GP8、GP13、、GP16、GP20。

供试接种病原为强致病力烟草疫霉98Pn022。供试品种为红花大金元。

2.1.2 方法

2.1.2.1 供试菌株接种体的制备

拮抗菌菌悬液的制备：挑取活化2～3次的6个待测菌株各一环，分别接种于300mlNA液体培养基中，28℃、150r/m振荡培养72小时，用灭菌水配成10^6-7cfu/ml的菌悬液。

2.1.2.2 生防菌剂的小区处理

试验处理为6个筛选菌株处理、甲霜灵锰锌药剂对照处理(CK^*)、培养液处理(CK)，共8个处理。每处理植烟20株，3次重复。小区随机排列。管理与种植同优质烤烟模式。试验用地约0.5亩。

2.1.2.3 生防菌剂的施用

生防菌剂的施用采用灌根的方法，于移栽后的第二天进行，每处理每株灌注0.25升。移栽后的第四天在烟株根胫部周围株施本发明接种体3g，浇水后，培土。

2.1.2.4 病情调查

在烟草黑胫病菌接种前一天，进行一次病情基数调查，接种后的第20天、第40天、第60天、第80天各调查一次病情。每次调查各处理的全部植株，调查记载采用YC/T39-1996“烟草病害分级及调查方法”中烟草根茎病害的行业标准。

2.2 结果与分析

拮抗菌的田间小区防治试验结果(表2)表明，温室筛选的6个菌株在大田中对黑胫病均具有一定的防治效果，其中GP13防治效果较显著，与对照的化学药剂甲霜灵锰锌效果接近，防效稳定在77.53％-93.33％。

表2 拮抗菌防治黑胫病的田间小区试验结果

注：CK^*为甲霜灵锰锌药剂对照，表中的数字为三个重复处理的平均值。

Claims

1、一种烟草黑胫病菌接种体的制备方法，包括以下步骤:

(1)从发病田块中采集病株，经过分离、纯化、致病力筛选测定，获得强致病力病菌，菌种采用菌丝块水浸法置于10℃条件下恒温保存，备用；

(2)将烟草黑胫病菌菌丝块移到试管平板培养基上，在28℃下恒温培养5～6天，选择菌丝纯白色、在平板表面形成一层较致密菌丝层的培养物，用作液体培养菌种；所述的平板培养基配方为:燕麦片30g，琼脂17～20g，蒸馏水1000ml，pH自然；

(3)用解剖刀切取烟草黑胫病菌菌丝块置于液体培养基中，每100毫升培养液接种菌丝2～4块，150转/分钟、28℃恒温培养7～8天；所述的液体培养基配方为:燕麦片30g，蒸馏水1000ml，pH自然；培养得到的液体菌液要求:菌丝白色、菌液不浑浊，菌丝不成团，镜检已产生游动孢子囊，并发现液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在10⁵个以上；

(4)按3％～5％的体积比将液体菌液置于盛有固体培养基三角瓶中，在28℃下恒温培养10～12天，所述的固体培养基配方为:粒径1～3mm的粗米糠和粗麦麸以8:2的质量比混匀，加入45％的清水，充分混匀；培养得到的固体培养物要求:菌丝长满整个固体基质，菌丝灰白色，菌丝低温诱导，镜检可产生游动孢子囊，液体中有大量带有鞭毛的游动孢子，每毫升孢子含量在10⁵个以上；

(5)将合格的固体培养物破碎成0.5～1cm×0.5～1cm大小的菌丝块，再加入三分之一质量比的新鲜、干燥粗米糠、粗麦麸；米糠和麦麸按8:2的质量比混匀，搅碎、混匀，平铺，通风晾干2～3天，待水分降至35％～40％时，即为所需的烟草黑胫病菌接种体。

2、根据权力要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的菌丝块大小为2～4mm×2～4mm。

3、根据权力要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(3)所述的培养液占容器容积的30％～50％。

4、根据权力要求1所述的制备方法，其特征在于:步骤(4)所述的所述的固体培养基占容器容积的50％～80％。