CN105777907A - 叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途 - Google Patents

叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途 Download PDF

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Abstract

提供新颖的抗癌剂，其包括但不限于结合至人类叶酸受体1的抗体与免疫缀合物。进一步提供使用该药剂、抗体或免疫缀合物的方法，例如抑制肿瘤生长的方法。

Description

叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途
本申请是申请日为2011年2月24日、中国专利申请号为201180019687.8(国际申请号为PCT/US2011/026079)、发明名称为“叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉引用
本申请案要求于2010年2月24日申请的美国临时申请案61/307,797号、于2010年5月20日申请的美国临时申请案61/346,595号以及于2010年11月12日申请的美国临时申请案61/413,172号的优先权，其在此将全文并入本文以做为参考。
技术领域
本发明的领域是广泛地相关于结合至人类叶酸受体1的抗体与免疫缀合物，以及相关于使用所述抗体与免疫缀合物的方法，该方法是用以治疗例如癌症的疾病。
背景技术
癌症是已开发国家主要死亡原因的，每年仅在美国就有超过一百万人诊断为癌症以及500,000人死亡。整体来说，据估计三个人中超过一人在他们的一生中将发展出某种形式的癌症。有超过200种不同的癌症，其中四种-乳癌、肺癌、直肠癌以及摄护腺癌-占了新病例的超过半数。(Jemaletal.,2003,CancerJ.Clin.53:5-26)。
叶酸受体1(FOLR1)，还称为叶酸受体-α或叶酸结合蛋白，为在细胞质膜上表现的N端糖化蛋白质。FOLR1具有对叶酸以及数种还原型叶酸衍生物的高度亲合力。FOLR1媒介生理叶酸5-甲基四氢叶酸的运输至细胞内部。
FOLR1在大多数的卵巢癌中以及在许多的子宫癌、子宫内膜癌、胰腺癌、肾脏癌、肺癌以及乳癌中过量表现，然而FOLR1在正常组织的表现被限制在肾脏近端小管的上皮细胞的顶膜、肺脏的泡状肺泡壁细胞、膀胱、睪丸、脉络丛以及甲状腺(WeitmanSD,etal.,CancerRes52:3396-3401(1992)；AntonyAC,AnnuRevNutr16:501-521(1996)；KalliKR,etal.GynecolOncol108:619-626(2008))。FOLR1的表现型态使其成为针对FOLR1的癌症疗法的适合标的。
因为卵巢癌直到晚期前典型地为无症状的，其经常在晚期被确诊，并且当以目前可用的程序，典型地为在手术减积(surgicalde-bulking)后以化疗药物治疗时具有不良的预后(vonGruenigenVetal.,Cancer112:2221-2227(2008)；AyhanAetal.,AmJObstetGynecol196:81e81-86(2007)；HarryVNetal.,ObstetGynecolSurv64:548-560(2009))。因此对于卵巢癌更有效的治疗法具有明确的未满足的医疗需求。
三种抗FOLR1抗体已被检验为潜在的抗癌药物。鼠类单株抗体Mov18以及Mov19于1980年代晚期被分离出(MiottiSetal.,IntJCancer39:297-303(1987))，经确认以FOLR1为标的(ConeyLRetal.,CancerRes51:6125-6132(1991))，并且于临床前研究中作为伴随细胞毒性核糖体失活蛋白质的缀合物，以测试它们消灭表现抗原的癌症细胞的能力(CondeFPetal.,EurJBiochem178:795-802(1989))。
将Mov19以对细胞毒性T细胞以及自然杀手细胞为目标的双特异性抗体而测试(MezzanzanicaDetal.,IntJCancer41:609-615(1988)；FerriniSetal.,IntJCancerSuppl4:53-55(1989)；FerriniSetal.,IntJCancer48:227-233(1991))，以及以Mov19的单链Fv(scFv)与介白素2的融合蛋白在体内测试(MelaniCetal.,CancerRes58:4146-4154(1998))。嵌合的(鼠类变异区/人类恒定区)抗FOLR1抗体Mov18以及Mov19已对它们在体外媒介细胞毒性免疫细胞依赖杀伤表现FOLR1的肿瘤细胞的能力作临床前检验(ConeyLRetal.,CancerRes54:2448-2455(1994))，并且在IgE依赖免疫疗法临床前模式中测试嵌合的Mov18-IgE(KaragiannisSNetal.,JImmunol179:2832-2843(2007)；GouldHJetal.,EurJImmunol29:3527-3537(1999))。
Mov18于临床前研究，接着在1990年代早期的临床试验中，以伴随许多放射性核素的缀合物的形式被研究(ZacchettiAetal.,,NuclMedBiol36:759-770(2009))，其以没有任何用于临床的药物被核准作结。
鼠类单株抗FOLR1抗体LK26的人源化形式MORAb003以未经修饰的抗体(EbelWetal.,CancerImmun7:6(2007))以及以放射性核素111In的缀合物(Smith-JonesPMetal.,NuclMedBiol35:343-351(2008))于临床前评估，并且目前正以未经修饰的抗体进行临床试验(D.K.Armstrongetal.J.Clin.Oncol.26:2008,May20suppl；摘要5500)。
发明概述
本发明提供结合至人类叶酸受体1的新颖抗体、包含这些抗体的免疫缀合物以及它们的使用方法。本发明进一步提供新颖的多肽，例如结合人类叶酸受体1的抗体、此类抗体的片段以及其它与此类抗体相关的多肽。还提供包含编码多肽的核酸序列的多核苷酸，因为是含有多核苷酸的载体。进一步提供包含本发明的多肽和/或多核苷酸的细胞。还提供包含新颖的叶酸受体1抗体或免疫缀合物的组合物(例如，药物组合物)。此外，还提供制造以及使用新颖的叶酸受体1抗体或免疫缀合物的方法，例如使用新颖的叶酸受体1抗体或免疫缀合物以抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
因此，在一方面，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQIDNO:56)的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。在某个具体实施例中，结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段具有与抗体嵌合的Mov19实质上相同的亲和力。在某个具体实施例中，人源化抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2序列RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)。
在某个具体实施例中，通过流式细胞仪、Biacore或放射免疫分析测量结合亲和力。
在另一具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中该抗体包含(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；以和/或(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
在某个具体实施例中，本发明提供的特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，包含SEQIDNO:6的重链。在另一具体实施例中，人源化抗体或其抗原结合片段通过在2010年4月7日保藏于ATCC并具有ATCC保藏编号PTA-10772以及PTA-10773或10774的质粒DNA编码。
在某个具体实施例中，本发明提供与抗体竞争结合至FOLR1的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQIDNO:56)的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。在某个具体实施例中，人源化抗体包含重链CDR2序列RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)。
在某个具体实施例中，本发明提供多肽、人源化抗体或其抗原结合片段，其包含与SEQIDNO:4至少约90％相同的重链变异区域，以及与SEQIDNO:10或SEQIDNO:11至少约90％相同的轻链变异区域。在另一具体实施例中，人源化抗体或抗原结合片段包含与SEQIDNO:4至少约95％相同的重链变异区域，以及与SEQIDNO:10或SEQIDNO:11至少约95％相同的轻链变异区域。在进一步的具体实施例中，人源化抗体包含与SEQIDNO:4至少约99％相同的重链变异区域，以及与SEQIDNO:10或SEQIDNO:11至少约99％相同的轻链变异区域。在某个具体实施例中，人源化抗体包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域。在某些具体实施例中，本发明提供与SEQIDNO:88-119至少约90％相同的多肽、抗体或抗原结合片段。在某些具体实施例中，本发明提供与SEQIDNO:88-119至少约95％相同的多肽、抗体或抗原结合片段。在某些具体实施例中，本发明提供与SEQIDNO:88-119至少约99％相同的多肽、抗体或抗原结合片段。
在某个具体实施例中，本发明提供在真核细胞中较chMov19表现高至少10倍的人源化抗体或其抗原结合片段。在某个具体实施例中，真核细胞为HEK-293T细胞。
在某些具体实施例中，本发明提供的特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：
(a)包含SSYGMS(SEQIDNO:30)的重链CDR1；包含TISSGGSYTY(SEQIDNO:31)的重链CDR2；和/或包含DGEGGLYAMDY(SEQIDNO:32)的重链CDR3；和/或(b)包含KASDHINNWLA(SEQIDNO:27)的轻链CDR1；包含GATSLET(SEQIDNO:28)的轻链CDR2；和/或包含QQYWSTPFT(SEQIDNO:29)的轻链CDR3。在另一具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TNYWMQ(SEQIDNO:60)的重链CDR1；包含AIYPGNGDSR(SEQIDNO:61)的重链CDR2；和/或包含RDGNYAAY(SEQIDNO:62)的重链CDR3；和/或(b)包含RASENIYSNLA(SEQIDNO:57)的轻链CDR1；包含AATNLAD(SEQIDNO:58)的轻链CDR2；和/或包含QHFWASPYT(SEQIDNO:59)的轻链CDR3。在另一具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TNYWMY(SEQIDNO:66)的重链CDR1；包含AIYPGNSDTT(SEQIDNO:67)的重链CDR2；和/或包含RHDYGAMDY(SEQIDNO:68)的重链CDR3；和/或(b)包含RASENIYTNLA(SEQIDNO:63)的轻链CDR1；包含TASNLAD(SEQIDNO:64)的轻链CDR2；和/或包含QHFWVSPYT(SEQIDNO:65)的轻链CDR3。在另一具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含SSFGMH(SEQIDNO:72)的重链CDR1；包含YISSGSSTIS(SEQIDNO:73)的重链CDR2；和/或包含EAYGSSMEY(SEQIDNO:74)的重链CDR3；和/或(b)包含RASQNINNNLH(SEQIDNO:69)的轻链CDR1；包含YVSQSVS(SEQIDNO:70)的轻链CDR2；和/或包含QQSNSWPHYT(SEQIDNO:71)的轻链CDR3。在另一具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TSYTMH(SEQIDNO:78)的重链CDR1；包含YINPISGYTN(SEQIDNO:79)的重链CDR2；和/或包含GGAYGRKPMDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3；和/或(b)包含KASQNVGPNVA(SEQIDNO:75)的轻链CDR1；包含SASYRYS(SEQIDNO:76)的轻链CDR2；和/或包含QQYNSYPYT(SEQIDNO:77)的轻链CDR3。
在某些具体实施例中，本发明中的多肽是全长抗体或抗原结合片段。在某些具体实施例中，抗体或抗原结合片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、单链Fv或scFv、连结二硫化物的Fv、VNAR区域、IgNar、内抗体、IgG-CH2、微抗体(minibody)、F(ab')3、四链抗体(tetrabody)、三链抗体(triabody)、双链抗体(diabody)、单域抗体、DVD-Ig、Fcab、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
在某些具体实施例中，本发明中的结合至人类叶酸受体1的抗体或多肽具有约1.0至约10nM的Kd。在一具体实施例中，结合至人类叶酸受体1的抗体或多肽具有约1.0nM或更佳的Kd。在某个具体实施例中，通过流式细胞仪、Biacore或放射免疫分析测量结合亲和力。
本发明还提供制作本发明中的抗体的方法，包含(a)培养表现所述抗体的细胞；以及(b)自所述培养的细胞分离抗体。在某个具体实施例中，细胞是真核细胞。
本发明还提供具有化学式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：(A)是本发明中的抗体或抗原结合片段或多肽；(L)是连接元以及(C)是细胞毒性剂，其中所述连接元(L)连结(A)至(C)。
在一具体实施例中，连接元选自可裂解连接元、不可裂解连接元、亲水性连接元以及二羧酸为基底的连接元的群组。在进一步的具体实施例中，连接元选自由：N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)或N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基戊酸酯(磺酸基-SPP)；N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB)或N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基丁酸酯(磺酸基-SPDB)；N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-磺基琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(sulfoSMCC)；N-琥珀酰亚胺-4-(碘乙酰基)-胺基苯甲酸酯(SIAB)；以及N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)组成的群组。在某个具体实施例中，连接元是N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)。
在一具体实施例中，免疫缀合物包含选自美登素衍生物、美登素衍生物类似物、苯二氮平、类紫杉醇、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素、倍癌霉素类似物、加利车霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、奥利斯汀、托美霉素衍生物以及细霉素衍生物或该剂的前药所组成的群组的细胞毒性剂。在进一步的具体实施例中，细胞毒性剂是美登素衍生物。在另一具体实施例中，细胞毒性剂是N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
在一具体实施例中，本发明提供免疫缀合物，其包含：(A)包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在一具体实施例中，本发明提供免疫缀合物，其包含：(A)包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫基)丁酸酯(SPDB)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在一具体实施例中，本发明提供免疫缀合物，其包含：(A)包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫基)2-磺基丁酸酯(磺基-SPDB)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在一具体实施例中，本发明提供免疫缀合物，其包含：(A)包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫基)-2-磺基戊酸酯(磺基-SPP)；以及(C)N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在一具体实施例中，本发明提供免疫缀合物，其包含：(A)包含SEQIDNO:4的重链变异区域，以及SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的轻链变异区域的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫基)戊酸酯(SPP)；以及(C)N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
本发明还提供包含本发明中的抗体、抗原结合片段、多肽或免疫缀合物的药物组合物以及药学上可接受的载体。在某个具体实施例中，药物组合物进一步包含第二抗癌剂。
本发明还提供包含被标记的本发明中的抗体、抗原结合片段、多肽或免疫缀合物的诊断剂。在一具体实施例中，标记选自放射性标记、荧光团、发色团、显影剂以及金属离子的群组。
本发明还提供包含本发明中的抗体、抗原结合片段、多肽或免疫缀合物的试剂盒。
本发明还提供抑制患者肿瘤生长的方法，其包含将治疗有效量的本发明中的抗体、抗原结合片段、多肽、免疫缀合物或药物组合物施用患者。在某个具体实施例中，本发明提供抑制患者肿瘤生长的方法，其包含将治疗有效量的具有化学式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物施用患者，其中：(A)是特异性结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段；(L)是连接元；以及(C)是选自由美登素衍生物以及美登素衍生物类似物组成的群组的细胞毒素；其中(L)将(A)连接至(C)，并且其中该免疫缀合物在KB异体移植模式中减少肿瘤体积至少二倍。在某个具体实施例中，此方法包含施用抗体或其抗原结合片段，其包含(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQIDNO:56)的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；以及Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。在进一步的具体实施例中，抗体含有包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)的重链CDR2。
在某个具体实施例中，本发明提供抑制肿瘤生长的方法，其包含施用抗体或其抗原结合片段，其通过在2010年4月7日保藏于ATCC并且具有ATCC保藏编号PTA-10772以及PTA-10773或10774的质粒DNA编码。
在另一具体实施例中，此方法提供施用包含含有重链变异区域SEQIDNO:4以及轻链变异区域SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的人源化抗体的免疫缀合物；(L)N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯(NHS-PEG4-马来酰亚胺)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
在另一具体实施例中，此方法包含施用免疫缀合物，其包含(A)包含重链变异区域SEQIDNO:4以及轻链变异区域SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在另一具体实施例中，此方法包含施用免疫缀合物，其包含(A)包含重链变异区域SEQIDNO:4以及轻链变异区域SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)2-磺酸基丁酸酯(磺酸基-SPDB)；以及(C)N(2')-去乙酰-N2-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在另一具体实施例中，此方法包含施用免疫缀合物，其包含(A)包含重链变异区域SEQIDNO:4以及轻链变异区域SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基戊酸酯(磺酸基-SPP)；以及(C)N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在另一具体实施例中，此方法包含施用免疫缀合物，其包含(A)包含重链变异区域SEQIDNO:4以及轻链变异区域SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的人源化抗体；(L)N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)；以及(C)N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素；其中(L)将(A)连接至(C)。
在另一具体实施例中，此方法包含施用免疫缀合物，其包含在2010年4月7日保藏于ATCC的抗体huFR-1-21并且具有ATCC保藏编号PTA-10775以及PTA-10776。在某个具体实施例中，此huFR1-21抗体包含(a)包含SSYGMS(SEQIDNO:30)的重链CDR1；包含TISSGGSYTY(SEQIDNO:31)的重链CDR2；包含DGEGGLYAMDY(SEQIDNO:32)的重链CDR3；以及(b)包含KASDHINNWLA(SEQIDNO:27)的轻链CDR1；包含GATSLET(SEQIDNO:28)的轻链CDR2；包含QQYWSTPFT(SEQIDNO:29)的轻链CDR3。在某些具体实施例中，此方法包含施用含有抗体为huFR1-48抗体的免疫缀合物，其包含：(a)包含TNYWMQ(SEQIDNO:60)的重链CDR1；包含AIYPGNGDSR(SEQIDNO:61)的重链CDR2；包含RDGNYAAY(SEQIDNO:62)的重链CDR3；以及(b)包含RASENIYSNLA(SEQIDNO:57)的轻链CDR1；包含AATNLAD(SEQIDNO:58)的轻链CDR2；包含QHFWASPYT(SEQIDNO:59)的轻链CDR3。在某些具体实施例中，此方法包含施用含有抗体为huFR1-49抗体的免疫缀合物，其包含：(a)包含TNYWMY(SEQIDNO:66)的重链CDR1；包含AIYPGNSDTT(SEQIDNO:67)的重链CDR2；包含RHDYGAMDY(SEQIDNO:68)的重链CDR3；以及(b)包含RASENIYTNLA(SEQIDNO:63)的轻链CDR1；包含TASNLAD(SEQIDNO:64)的轻链CDR2；包含QHFWVSPYT(SEQIDNO:65)的轻链CDR3。在某些具体实施例中，此方法包含施用含有抗体为huFR1-57抗体的免疫缀合物，其包含：(a)包含SSFGMH(SEQIDNO:72)的重链CDR1；包含YISSGSSTIS(SEQIDNO:73)的重链CDR2；包含EAYGSSMEY(SEQIDNO:74)的重链CDR3；以及(b)包含RASQNINNNLH(SEQIDNO:69)的轻链CDR1；包含YVSQSVS(SEQIDNO:70)的轻链CDR2；包含QQSNSWPHYT(SEQIDNO:71)的轻链CDR3。在某些具体实施例中，此方法包含施用含有抗体为huFR1-65抗体的免疫缀合物，其包含：(a)包含TSYTMH(SEQIDNO:78)的重链CDR1；包含YINPISGYTN(SEQIDNO:79)的重链CDR2；包含GGAYGRKPMDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3；以及(b)包含KASQNVGPNVA(SEQIDNO:75)的轻链CDR1；包含SASYRYS(SEQIDNO:76)的轻链CDR2；包含QQYNSYPYT(SEQIDNO:77)的轻链CDR3。
在一具体实施例中，此方法抑制卵巢肿瘤、脑肿瘤、乳腺肿瘤、子宫肿瘤、子宫内膜肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤或肺肿瘤生长。在某个具体实施例中，此方法抑制卵巢肿瘤生长。在另一具体实施例中，本发明抑制肺肿瘤生长。在某个具体实施例中，抑制肿瘤生长用以治疗癌症。在进一步的具体实施例中，此方法包含将第二抗癌剂施用受试者。在某个具体实施例中，第二抗癌剂是化疗剂。
本发明还提供产生本发明中的抗体、抗原结合片段或多肽的分离细胞。
本发明还提供分离的多核苷酸，其包含与选自由SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127所组成的群组的序列至少90％相同的序列。在某个具体实施例中，分离的多核苷酸与选自由SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127所组成的群组的序列至少95％相同的序列。在另一具体实施例中，分离的多核苷酸与选自由SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127所组成的群组的序列至少99％相同的序列。本发明还提供包含SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127的任一多核苷酸的载体。在另一具体实施例中，本发明提供含有包含SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127的多核苷酸的载体的宿主细胞。
附图简述
图1.鼠类(muMov19)以及人源化(huMov19)的Mov19的表面残基。(A)鼠类以及人源化Mov19的轻链表面残基。提供鼠类以及人源化Mov19的轻链变异区骨架表面残基以及位置编号(Kabat***)。将与原始鼠类序列相异的人类残基标示底线。*位置74不是表面位置，但为移去版本1.00中的一致性N端连接醣化位置，将此位置改成苏氨酸(在此位置最普遍的人类残基)，造成版本1.60。(B)鼠类和人类Mov19重链表面残基。提供鼠类以及人源化Mov19的重链变异区骨架表面残基以及位置编号(Kabat***)。将与原始鼠类序列相异的人类残基标示底线。
图2.嵌合的Mov19与huMov19重和轻链变异区域以及muFR1-21与huFR1-21重和轻链变异区域的排列。针对伴随它们的鼠类配对物的Mov19与Fr1-21变异区域的表面重塑序列的排列。A)以及C)轻链变异区域。B)以及D)重链变异区域。破折号“-”代表与鼠类序列相同。将CDR(Kabat定义)标示底线。
图3.嵌合Mov19与huMov19在HEK细胞中的表现。将嵌合和人类Mov19表现质粒暂时转染至悬浮的HEK293-T细胞中，在7天后收获，并且将表现的抗体通过定量ELISA测定。将轻链和重链质粒以各自3：1或6：1的摩尔比转染。
图4.抗FOLR1抗体的结合特异性性，通过它们结合至FOLR1-表现300-19细胞而检测。通过流动式细胞测量huMov19结合至300-19-FOLR1细胞。300-19亲代细胞表现FOLR-1。灰色实体阴影代表细胞自发荧光；黑色点状线条代表与FITC结合的抗人类第二抗体培养的细胞，黑色实线代表与huMov-19抗体以及与FITC结合的抗人类第二抗体培养的细胞。
图5.抗FOLR1抗体以及免疫缀合物的结合亲和力以及在体外的细胞毒活性。于SKOV3细胞测量huMov19以及多种鼠类以及人源化FR-1抗体的结合亲和力。还分析所列抗体的PEG4-Mal-DM4缀合物在体外的细胞毒活性。
图6.免疫缀合物的抗体相关细胞毒性。对Igrov1细胞分析huMov19、huFR1-21以及Mor003的ADCC活性。将Igrov1以15000细胞/孔培养，标的：NK细胞比率1：4。
图7.在KB细胞中huFR1-21-PEG4-mal-DM4以及huMov19-PEG4-mal-DM4持续暴露的细胞毒活性。当它们在KB细胞存在下一起培养时，过量的非共轭抗体抑制免疫缀合物活性，意指细胞毒活性是抗原依赖的。
图8.在KB异体移植模式中以huMov19为标的的缀合物在体内的功效。标的FOLR1的可裂解缀合物huMov19-SPDB-DM4(B)与非标的FOLR1huC242-SPDB-DM4(D)的比较，以及非可裂解缀合物huMov19-PEG4-Mal-DM4(C)与非标的huC242-PEG4Mal-DM4(E)的比较使用已建立的KB细胞植入SCID小鼠皮下的异体移植模式。通过huMov19标的FOLR1造成平均肿瘤体积的显著降低。
图9.在KB异体移植模式中huMov19-PEG4-Mal-DM4相较于鼠类FR-1抗FOLR1抗体在体内的功效。将与PEG4-Mal-DM4非共轭或共轭的FR-1系列抗体，对于它们相较于huMov19-PEG4-Mal-DM4在KB异体移植模式中降低平均肿瘤体积的能力测试。(A)FR-1-9，(B)FR-1-13，(C)FR-1-22以及(D)FR-1-23。
图10.在KB异体移植模式中huMov19-PEG4-Mal-DM4以及huFR1-21-PEG4-Mal-DM4在体内的功效。在接种执行后的第6天，执行huMov19-PEG4-Mal-DM4以及huFR1-21-PEG4-Mal-DM4的10mg/kg单氨基注射。huMov19-PEG4-Mal-DM4以及huFR1-21-PEG4-Mal-DM4皆显示平均肿瘤体积的显著降低。“MeanTV”意指平均肿瘤体积。
图11.在KB异体移植模式中HuMov19-PEG4-mal-DM4显示剂量依赖活性。在整个测试剂量的范围分析免疫缀合物的剂量依赖活性。每周以剂量施用造成抗肿瘤活性的改善。高药物量仅少量地改善10mg/kg剂量组别的活性，伴随在较低剂量组别中的活性降低。3.7DAR意指每抗体3.7药物分子。
图12.与DM1和DM4以各种连接元共轭的huMov19在体内的功效。将huMov19以每抗体3.9药物分子共轭至SMCC-DM1；以每抗体3.7药物分子共轭至磺酸基-mal-DM4(B)以及以每抗体8.23药物分子共轭至磺酸基-mal-DM4(C)并且相较于huMov19-PEG4-mal-DM4以各种浓度分析它们降低平均肿瘤体积的能力。
图13.与DM1和DM4以各种连接元共轭的huMov19在体内的功效。将huMov19以每抗体4.3药物分子共轭至SPP-DM1；以每抗体3.8药物分子共轭至磺酸基-SPDB-DM4，以每抗体3.8药物分子共轭至SPDB-DM4，以及以每抗体6.8药物分子共轭至磺酸基-SPDB-DM4并且分析它们降低平均肿瘤体积的能力。以5mg/kg(A)以及2.5mg/kg(B)的上列缀合物的一者或仅以PBS处理小鼠。
图14.在OVCAR-3异体移植肿瘤模式中huMov19-磺基-SPDB-DM4在体内的功效。以25、50或100μg/kg的huMov19-磺酸基-SPDB-DM4或仅以PBS处理小鼠。
图15.在IGROV-1异体移植肿瘤模式中huMov19-磺酸基-SPDB-DM4在体内的功效。以25、50或100μg/kg的huMov19-磺酸基-SPDB-DM4或仅以PBS处理小鼠。
图16.在OV-90异体移植肿瘤模式中huMov19-磺酸基-SPDB-DM4在体内的功效。以25、50或100μg/kg的huMov19-磺酸基-SPDB-DM4或仅以PBS处理小鼠。
图17.在KB异体移植模式中，可裂解以及非可裂解连接子对免疫缀合物的功效的影响。
图18.在(A)KB异体移植模式(B)OVCAR-3异体移植模式中，可裂解连接子对免疫缀合物的功效的影响。
图19.在KB以及异体移植肿瘤模式中huFR1-48、huFR1-49、huFR1-57以及huFR1-65-SMCC-DM1在体外以及在体内的功效。以200μg/kg单一剂量处理小鼠。
发明详述
本发明提供新颖的药剂，其包括但不限于多肽例如结合至人类叶酸受体1(FOLR1)的抗体以及免疫缀合物。还提供相关的多肽以及多核苷酸、包含结合FOLR1的药剂的组合物以及制作结合FOLR1的药剂的方法。进一步提供使用此新颖的结合FOLR1的药剂的方法，例如抑制肿瘤生长和/或治疗癌症的方法。
定义
为帮助了解本发明，将数个用语与措词定义如下。
该用语“人类叶酸受体1”或“FOLR1”，如同本文中所使用的，除非另外指明，意指任何自然人类FOLR1。该用语“FOLR1”包括“全长”、未处理的FOLR1以及起因于在细胞中处理的任何形式的FOLR1。该用语还包括天然发生的FOLR1的变体，例如，剪接变体、对偶变体以及异构物。本文中所描述的FOLR1多肽可由各种来源分离出，例如从人类组织类型或从另外的来源，或通过重组或合成方法制备。FOLR1序列的例子包括但不限于，NCBI参考编号P15328、NP_001092242.1、AAX29268.1、AAX37119.1、NP_057937.1以及NP_057936.1。
该用语“抗体表示透过免疫球蛋白分子的变异区内的至少一个抗原辨识位置辨认以及特异性性地结合至标的的免疫球蛋白分子，例如蛋白质、多肽、肽、碳水化合物、多核苷酸、脂肪或上述的结合。如同本文中所使用的，该用语“抗体”包括完整的多株抗体、完整的单株抗体、抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段)、单链Fv(scFv)突变、多特异性性抗体(例如由至少两个完整抗体生成的双特异性抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人类抗体、含有抗体的抗原决定部分的融合蛋白以及包含抗原辨认位置的任何其它经修饰的免疫球蛋白分子，只要抗体表现所希望的生物活性。抗体可以是免疫球蛋白的五个主要类别的任一者：IgA、IgD、IgE、IgG以及IgM，或其子类别(亚型)(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1以及IgA2)根据它们的重链恒定区的识别而分别称为α(alpha)、δ(delta)、ε(epsilon)、γ(gamma)以及μ(mu)。不同类别的免疫球蛋白具有不同且已熟知的次单元结构以及三度空间构形。抗体可为裸露的或共轭至其它分子例如毒素、放射性同位素等等。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体为抑制或降低其结合抗原的生物活性者，例如FOLR1。在某个具体实施例中，阻断抗体或拮抗剂抗体实质上或完全地抑制抗原的生物活性。希望地，降低生物活性10％、20％、30％、50％、70％、80％、90％、95％或甚至100％。
该用语“抗FOLR1抗体”或“结合至FOLR1的抗体”意指能够以足够的亲和力结合FOLR1的抗体，使得抗体在标的FOLR1以作为诊断和/或治疗剂是有效用的。抗FOLR1抗体结合至非相关的、非-FOLR1蛋白质的程度比抗体结合至FOLR1所测到的程度少约10％，例如，通过放射免疫测定法(RIA)。在某些具体实施例中，结合至FOLR1的抗体具有解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM或≤0.1nM。
该用语“抗体片段”意指完整抗体的一部分以及意指完整抗体的抗原决定变异区域。抗体片段的例子包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2以及Fv片段、线性抗体、单链抗体，以及由抗体片段形成的多特异性性抗体。
“单株抗体”意指涉及单一抗原决定物或抗原决定基的高度特异性辨识与结合的同源抗体族群。这与典型地包括以不同抗体针对不同抗原决定物的多株抗体相反。该用语“单株抗体”包括完整与全长两者的单株抗体以及抗体片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)突变物、包含抗体部分的融合蛋白以及任何其它含有抗原辨识位置的经修饰的免疫球蛋白分子。此外，“单株抗体”意指此类以任意数种方式而制造的抗体，其方式包括但不限于通过融合瘤细胞、噬菌体筛选、重组表现以及基因转殖动物。
该用语“人源化抗体”意指非人类(例如鼠类)抗体的形式，其为特异性的免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白或其包含最小的非人类(例如鼠类)序列的片段。典型地，人源化抗体是其中来自互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(例如小鼠、大鼠、兔、仓鼠)的CDR残基所取代的人类免疫球蛋白，其具有希望的特异性性、亲和力与功能(Jonesetal.,1986,Nature,321:522-525；Riechmannetal.,1988,Nature,332:323-327；Verhoeyenetal.,1988,Science,239:1534-1536)。在一些例子中，人类免疫球蛋白的Fv骨架区域(FR)残基被以相对应的来自非人类物种的抗体中的残基取代，其抗体具有希望的特异性性、亲和力与功能。人源化抗体可被进一步通过在Fv骨架区域和/或在被取代的非人类残基中的任一者的额外残基的取代作用而修饰，以改良并且最佳化抗体的特异性性、亲和力和/或功能。实质来说，人源化抗体将实质地包含其所有至少一个，以及典型地二或三个变异区，其包含全部或实质上全部的对应于非人类免疫球蛋白的CDR区域，而全部或实质上全部的FR区域为那些人类免疫球蛋白的致序列。人源化抗体还可包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区或域(Fc)，典型地为人类免疫球蛋白的免疫球蛋白恒定区或域(Fc)。用以生成人源化抗体的方法描述于美国专利5,225,539或5,639,641。
抗体的“变异区”意指抗体轻链的变异区或抗体重链的变异区其单独或结合的任一者。每个重以及轻链的变异区皆由以三个还称为超变异区的互补决定区段(CDR)所连接的四个骨架区(FR)组成。在每个链的CDR通过FR抓住靠近在一起，并且伴随来自其它链的CDR，促成抗体的抗原结合位置的生成。有至少两个技术用以测定CDR：(1)以跨物种序列变异性为基础的方法(即Kabatetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5thed.,1991,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMd.))；以及(2)以抗原-抗体复合物的晶体学研究为基础的方法(Al-lazikanietal(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。此外，有时本领域使用这两个方法的结合以测定CDR。
Kabat编号***一般用于意指在变异区域中的残基时(大约轻链的1-107残基以及重链的1-113残基)(例如Kabatetal.,SequencesofImmunologicalInterest.5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991))。
如同在Kabat中氨基酸位置的编号，意指使用作为在Kabatetal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1991)中的抗体编译的重链变异区或轻链变异区的编号***。使用此编号***，实际线性氨基酸序列可包含较少或额外的氨基酸对应于减短或***变异区的FR或CDR。举例来说，重链变异区可包括在H2的残基52之后的单一氨基酸***(根据Kabat残基52a)以及在重链FR残基82之后的***的残基(例如根据Kabat残基82a、82b以及82c等)。对于所给的抗体的残基的Kabat编号可通过与“标准”Kabat编号序列排列抗体的同源序列区域而决定。Chothia指出以结构环状的位置取代(ChothiaandLeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。当使用Kabat编号惯例将ChothiaCDR-H1环状的结尾编号时，依据环状的长度介于H32和H34间变化(此乃因为Kabat编号方案将***置于H35A以及H35B；若35A或35B皆不存在，此环结束于32；若只有35A存在，此环结束于33；若35A以及35B两者皆存在，此环结束于34)。AbM超变异区代表在KabatCDR以及Chothia结构环间的折衷，并且通过OxfordMolecular'sAbM抗体模型软件所而使用。
该用语“人类抗体”代表通过人类制造的抗体或具有对应于使用本领域所知的任何技术以人类制造的抗体的氨基酸序列的抗体。此人类抗体的定义包括完整的或全长的抗体、其片段和/或包含至少一个人类重和/或轻链多肽的抗体，例如举例来说，包含鼠类轻链以及人类重链多肽的抗体。
该用语“嵌合抗体”意指抗体其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列衍生自二或更多个物种。典型地，轻与重链的变异区两者皆对应于衍生自哺乳动物的物种(例如老鼠、大鼠、兔等)的抗体变异区，其伴随希望的特异性性、亲和力以及功能，而恒定区与衍生自另一物种(通常为人类)的抗体中序列同源，以避免引起在那个物种中的免疫反应。
该用语“抗原决定基”或“抗原决定物”于本文中交替使用并且意指抗原能够被辨识并特异性地被特定的抗体结合的那个部分。当抗原是多肽，抗原决定基可由相邻的氨基酸和蛋白质三级折迭并列的非相邻的氨基酸两者而形成。自相邻的氨基酸形成的抗原决定基典型地于蛋白质变性时保守，而自三级折迭而形成的抗原决定基典型地于蛋白质变性时失去。抗原决定基典型地包括至少3，并且更经常地，至少5或8-10个以独特空间构形的氨基酸。
“结合亲和力”一般意指分子(例如，抗体)单一结合位置以及其结合搭档(例如，抗原)之间的非共价交互作用力的总和强度。除非另外指明，如同本文中所使用的，“结合亲和力”意指反映结合对成员之间(例如，抗体以及抗原)1：1交互作用内部的结合亲和力。分子X对于其搭档Y的亲和力一般可通过解离常数(Kd)表示。亲和力可通过本领域所知的普遍方法测量，包括本文中所描述的那些方法。低亲和力的抗体一般结合抗原缓慢并倾向容易立刻解离，而高亲和力的抗体一般较快结合抗原并倾向维持更久的结合。有各种本领域所知的测量结合亲和力的方法，其任一者可用于本发明的目的。具体说明的具体实施例描述于下。
当本文中使用“或更佳”以意指结合亲和力时，意指分子和其结合搭档间更强的结合。当本文中使用“或更佳”以意指更强的结合，以更小数字的Kd值代表。举例来说，具有对于抗原亲和力“0.6nM或更佳”的抗体，此抗体对于抗原的亲和力为<0.6nM，即0.59nM、0.58nM、0.57nM等等或任何小于0.6nM的数值。
该措辞“实质上相似”或“实质上相同”，如同本文中所使用的，表示两数值间足够高程度的相似(一般地一者相关于本发明的抗体以及另一个相关于参考/比较抗体)使得本领域的技术人员将在所述的值所测得的生物特性的情况内考虑两数值间的差异为极小或无生物和/或统计显著性。所述两数值的差异为对于参考/比较抗体少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％或少于约10％的函数值。
被“分离”的多肽、抗体、多核苷酸、质粒、细胞或组合物为自然中找不到的形式的多肽、抗体、多核苷酸、质粒、细胞或组合物。被分离的多肽、抗体、多核苷酸、质粒、细胞或组合物包括那些已被纯化成它们不再是于自然中找到它们时的形式的程度。在一些具体实施例中，被分离的抗体、多核苷酸、质粒、细胞或组合物实质上是纯的。
如同本文中所使用的，“实质上纯的”意指是至少50％纯的物质(即，无污染物)、至少90％纯的、至少95％纯的、至少98％纯的或至少99％纯的。
如本文中所使用的该用语“免疫缀合物”或“缀合物”意指连接至细胞结合剂(即，抗FOLR1抗体或其片段)的化合物或其衍生物并由通式：C-L-A定义，其中C＝细胞毒素，L＝连接子，以及A＝细胞结合剂或抗FOLR1抗体或抗体片段。免疫缀合物还可由相反顺序的通式：A-L-C定义。
“连接子”是任何能够以稳定、共价的方式连接经常为药物，例如美登素衍生物的化合物至例如抗FOLR1抗体的细胞结合剂或其片段的化学基元。连接子在化合物或抗体保持活性的情况下对酸类诱发的裂解、光诱发的裂解、肽酶诱发的裂解、酯酶诱发的裂解以及二硫化键的裂解可以是敏感的或是实质上耐受的。合适的连接子为本领域熟知的，并且包括，举例来说，双硫基团、硫醚基团、不耐酸基团、不耐光基团、不耐肽酶基团以及不耐酯酶基团。连接子还包括带电的连接子，以及其如同本文中所描述的以及本领域所知的亲水形式。
该用语“癌症”以及“癌的”意指或描述在哺乳动物中的生理情况，其细胞族群以未调节的细胞生长为特征。癌症的例子包括但不限于，恶性肿瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤以及血癌。此类癌症更具体的例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、鳞状细胞肺癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、神经胶母细胞瘤、子***、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝肿瘤、乳癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜或子宫肿瘤、唾腺癌、肾脏癌、肝癌、***癌、外***癌、甲状腺癌、肝癌以及各种型式的头颈癌。
“肿瘤(tumor)”以及“肿瘤(neoplasm)”意指由过量细胞生长或增生引起的任何组织团块，良性(非癌的)或恶性(癌的)的任一者，包括癌症前期病变。
该用语“癌细胞”、“肿瘤细胞”以及语法的等同物意指衍生自肿瘤或癌症前期病变的全部细胞族群，包括无致癌性的细胞，其包含大批肿瘤细胞族群，以及致癌性的干细胞(癌症干细胞)两者。如同本文中所使用的，当仅意指那些缺乏更新与分化能力的肿瘤细胞时，该用语“肿瘤细胞”将以用语“非致癌性”修饰，以与那些来自癌症干细胞的那些肿瘤细胞区分。
该用语“受试者”意指任何动物(例如，哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类的灵长类动物、啮齿类动物，以及诸如此类，其为特定治疗的接受者。典型地，该用语“受试者(subject)”以及“患者(patient)”于本文中交替使用以意指人类受试者。
“结合”一或更多进一步的治疗剂施用包括同步(同时)以及以任何顺序连续进行施用。
该用语“药剂配方”意指其以此类形式以使活性成分的生物活性有效的制备，并且其不包含对此配方施用的受试者为不可接受毒性的额外成分。此类配方可以是无菌的。
抗体的“有效量”如同本文所揭露的是足够进行特定所述的目的的量。“有效量”可凭经验决定并且以与所述的目的相关的惯例方式。
该用语“治疗有效量”意指抗体或其它药物对“治疗”在受试者或哺乳动物中的疾病或失调有效的量。在癌症的案例中，药物的治疗有效量可降低癌细胞数目；减少肿瘤尺寸；抑制(即，延缓至某种程度以及在某个具体实施例中，停止)癌细胞渗透至周围器官；抑制(即，延缓至某种程度以及在某个具体实施例中，停止)肿瘤转移；某种程度地抑制肿瘤生长；和/或某程度地缓解一或更多相关于癌症的症状。见本文中“治疗”的定义。达到药物可防止生长和/或杀伤存在的癌细胞的程度，其可以是细胞生长抑制和/或细胞毒性的。“预防性有效量”意指在剂量以及必要的一段时间，以达到所希望的预防结果的有效量。典型但非必要地，因预防的剂量用于先前或于疾病的早期的受试者，预防性有效量将少于治疗有效量。
当本文使用该词语“标记”意指可检测的化合物或组合物，其直接或间接地结合至抗体，使得产生“标记”的抗体。此标记可以是本身可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)或，在酵素标记的例子中，可催化可检测的受质化合物或组合物的化学转变。
“化疗剂”是有效用于治疗癌症化学化合物，无论作用机制。化疗剂的类别包括但不限于：烷化剂、抗代谢物、纺锤毒素植物生物碱、细胞毒性/抗肿瘤抗生素、拓扑解旋酶抑制剂、抗体、光敏剂以及激酶抑制剂。化疗剂包括使用于“标耙疗法”以及传统化疗的化合物。
用语例如“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“治疗(totreat)”或“减轻(alleviating)”或“减轻(toalleviate)”意指两者1)治愈、延缓、减轻所诊断的病理情况或失调症状和/或停止所诊断的病理情况或失调的发展的治疗措施以及2)预防(Prophylatic)和/或预防(preventative)所针对的病理情况或失调的发展的预防性的或预防措施。因此，那些需要治疗的对象包括那些已经带有失调者；那些容易得到失调者；以及那些将预防失调者。在某些具体实施例中，若受试者显示以下一或更多，则受试者成功地根据本发明的方法“治疗”癌症：癌细胞数目降低或完全没有癌细胞；肿瘤尺寸降低；抑制或无癌细胞渗透至周围器官，其包括，举例来说，癌症扩散至软组织与骨；抑制或无肿瘤转移；抑制或无肿瘤生长；缓解一或更多相关于特定癌症的症状；降低发病率与死亡率；生活质量的改善；降低肿瘤的肿瘤发生率、致肿瘤频率或致肿瘤能力；降低肿瘤中的癌症干细胞的数量或频率；致癌细胞分化为非致癌状态；或一些效果的结合。
“多核苷酸”或“核酸”如同在本文中交替使用，意指任何长度的核苷酸聚合物，并且包括DNA与RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经修饰的核苷酸或碱基和/或它们的类似物，或任何可被DNA或RNA聚合酶并入的受质。多核苷酸可包含经修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸以及它们的类似物。如果存在，可在聚合物组装前或后给予对核苷酸结构的修饰作用。核苷酸序列可被非核苷酸成分中断。多核苷酸可在聚合作用后进一步修饰，例如通过与标记成分共轭。其它类型的修饰作用包括，举例来说，“加帽”，将一或更多自然发生的核苷酸以类似物取代的取代作用、核苷酸间修饰作用例如，举例来说，那些伴随不带电的键结(例如，甲基磷酸酯、磷酸三酯、亚磷胺、胺基甲酸酯等)以及伴随带电的键结(例如，硫代磷酸酯、硫代二磷酸酯等)、那些包含悬吊的基元，例如，举例来说，蛋白质(例如，核酸水解酶、毒素、抗体、信息胜肽、ply-L-赖氨酸等)、那些伴随嵌入试剂(intercalator)者(例如，吖啶、补骨脂素等)、那些包含螫合剂者(例如，金属、放射性金属、硼、氧化金属等)、那些包含烷化剂者、那些伴随经修饰的键结(例如，α异位性核酸等)以及多核苷酸未经修饰的形式。进一步地，任何原先存在于糖中的羟基基团可被举例来说，以磷酸脂基团、磷酸盐基团替换，可被标准保护基团保护，或可被活化以制备额外的键结至额外的核苷酸，或可被共轭至固体支持物。此5'与3'端OH可被磷酸化或以胺类或自1至20个碳原子的有机加帽基团基元取代。其它羟基还可被衍生为标准保护基团。多核苷酸也可包含本领域一般所知的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括举例来说，2'-O-甲基-,2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖、碳环糖类似物、α异位性糖、映异构糖例如***糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖、无环类似物以及无碱基核苷类似物例如甲基核糖苷。一或更多磷酸二酯键结可被替代的键结基团取代。这些替代的键结基团包括但不限于，具体实施例其中磷酸盐被P(O)S(“硫代盐”)、P(S)S(“二硫代盐”)、"(O)NR2(“酰胺盐”)、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2(“甲缩醛”)替代，其中每个R或R'独立地是H或任选地包含醚(--O--)键结、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳醛基的被取代或未被取代的烷基(1-20C)。不是所有在多核苷酸中的键结需为相同的。前面的描述适用于所有本文中所意指的多核苷酸，包括RNA以及DNA。
该用语“载体”代表一构建，其能够在宿主细胞中输送并表现一或更多有兴趣的基因或序列。载体的例子包括但不限于，病毒载体，裸DNA或RNA表现载体、质粒、黏接质粒或噬菌体载体、与阳离子凝结剂相关的DNA或RNA表现载体、包裹在脂质粒以及某些真核细胞，例如生产细胞中的DNA或RNA表现载体。
该用语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”于本文中交替使用，以意指任何长度的氨基酸聚合物。此聚合物可为线性或分支的，其可包含经修饰的氨基酸，以及其可被非氨基酸中断。该用语还包括已经天然或被***修饰的氨基酸聚合物；举例来说，二硫化键的生成、糖化、酯化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰，例如与标记成分共轭。还包括在定义中者为，举例来说，包含一或更多氨基酸的类似物的多肽(包括，举例来说，非自然氨基酸等)以及其它本领域所知的修饰作用。应了解因本发明的多肽根据抗体，在某些具体实施例中，多肽可以单链或组合链发生。
在二或更多个核酸或多肽的内容中该用语“相同(identical)”或“一致性(identity)”百分比意指二或更多相同或具有特定百分率的相同的核苷酸或氨基酸残基的序列或子序列，当以最大对应比较并比对(如有需要，引入间隔)时，不考虑以任何保守氨基酸的取代作为序列一致性的一部分。一致性百分比可使用序列比较软件或算法或通过目视检查而测得。各种算法以及软件为本领域所知的，其可使用以获得氨基酸或核苷酸序列的比对。此类序列比对算法的非限制性例子的者为描述于Karlinetal,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.,87:2264-2268的算法，如于Karlinetal.,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.,90:5873-5877中所修改，并且被纳入NBLAST以及XBLAST程序(Altschuletal.,1991,NucleicAcidsRes.,25:3389-3402)。在某些具体实施例中，GappedBLAST可如同描述于Altschuletal.,1997,NucleicAcidsRes.25:3389-3402而使用。BLAST-2、WU-BLAST-2(Altschuletal.,1996,MethodsinEnzymology,266:460-480)、ALIGN、ALIGN-2(Genentech,SouthSanFrancisco,California)或Megalign(DNASTAR)是可用以比对序列的额外的可公开取得软件程序。在某些具体实施例中，两核苷酸间的一致性百分比使用GCG软件中的GAP程序而测定(例如，使用NWSgapdna.CMP数组并且间隔权重40、50、60、70或90以及长度权重1、2、3、4、5或6)。在某些替代的具体实施例中，GCG软件套装中引入Needleman以及Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(48):444-453(1970))的GAP程序，可用以决定两氨基酸序列间的一致性百分比(例如，使用Blossum62数组或PAM250数组的任一者，以及间隔权重16、14、12、10、8、6或4以及长度权重1、2、3、4、5)。替代地，在某些具体实施例中，核苷酸或氨基酸序列间的一致性百分比使用Myers以及Miller的算法(CABIOS,4:11-17(1989))而决定。举例来说，一致性百分比可使用ALIGN程序(版本2.0)决定并且使用具有残基表格的PAM120而决定，间隔长度损失12以及间隔损失4。通过特定比对软件对于最大比对的合适参数可由本领域的技术人员决定。在某些具体实施例中，使用比对软件的预设参数。在某些具体实施例中，第一个氨基酸序列对第二个氨基酸序列的致性百分比“X”计算为100x(Y/Z)，其中Y是以在第一和第二个序列比对中记分为相同匹配的氨基酸残基数目(如同通过目视检查或特定序列比对程序而比对)以及Z是第二个序列的残基总数。若第一个序列的长度较第二个序列长，第一个序列对第二个序列的一致性百分比将会长于第二个序列对第一个序列的一致性百分比。
作为非限制性的例子，不论任何特定多核苷酸对参考序列具有特定百分率的序列一致性(例如，为至少80％相同、至少85％相同、至少90％相同，以及在一些具体实施例中，至少95％、96％、97％、98％或99％相同)，在某些具体实施例中，可使用Bestfit程序决定(WisconsinSequenceAnalysisPackage,Version8forUnix,GeneticsComputerGroup,UniversityResearchPark,575ScienceDrive,Madison,WI53711)。Bestfit使用Smith及Waterman,AdvancesinAppliedMathematics2:482489(1981)的区域同源性(localhomology)算法，以寻找两序列间最好的同源区段。当使用Bestfit或任何其它序列比对程序以决定特定序列对根据本发明的参考序列是否为，举例来说，95％相同，参数被设定使得一致性百分率透过参考核苷酸序列的全长而计算，并且容许达到参考序列中核苷酸总数5％的同源性间隔。
在一些具体实施例中，当以最大对应比较与比对，如使用序列比较算法或通过目视检查而测量，本发明的二个核酸或多肽为实质上相同，表示它们具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％，以及在一些具体实施例中，至少95％、96％、97％、98％或99％的核苷酸或氨基酸残基相同。在某些具体实施例中，一致性存在于至少约10、约20、约40-60个残基长度或任何介于之间的整数值的序列区域，或于较60-80残基长的整个区域，至少约90-100残基，或序列与相比较的序列全长为实质上相同的，像是举例来说核苷酸序列的编码区。
“保守氨基酸取代”为一个氨基酸残基被另一个具有相似侧链的氨基酸残基取代的情况。具有相似侧链的氨基酸残基家族已被本领域定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电极性侧链(例如，天门冬酰氨酸、谷酰氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。举例来说，用苯丙氨酸取代酪氨酸为保守性取代。在某些具体实施例中，在本发明中的多肽以及抗体序列的保守性取代不废除包含那个氨基酸序列的多肽或抗体结合至抗原，即，多肽或抗体结合的FOLR1。在某些具体实施例中，识别核苷酸以及氨基酸不消除抗原结合的保守性取代的方法为本领域熟知的(见例如，Brummelletal.,Biochem.32:1180-1187(1993)；Kobayashietal.ProteinEng.12(10):879-884(1999)；以及Burksetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA94:.412-417(1997))。
如同本揭露内容和权利要求所使用的，除非内文清楚另外指出，单数形式“一(a)”、“一(an)”以及“该(the)”包括复数形式。
已了解无论具体实施例于本文中以语言文字“包含(comprising)”描述，否则还提供以用语“由…组成(consistingof)”和/或“实质上由…组成(consistingessentiallyof)”描述的类似的具体实施例。
该用语“和/或”如同用于一措辞中例如“A和/或B”此处意图包括两者“A及B”、“A或B”、“A”以及“B”。同样的，该用语“和/或”如同用于一措辞中例如“A、B和/或C”意图包括下列实施例的每一者：A、B以及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；(仅)A；(仅)B；以及(仅)C。
FOLR1-结合剂
本发明提供特异性地结合人类FOLR1的药剂。这些剂本文统称为“FOLR1-结合剂”。对FOLR1的全长度氨基酸(aa)以及核苷酸(nt)序列为本领域所知的，并且还分别表示为SEQIDNO:25与26提供于本文。
在某些具体实施例中，FOLR1结合剂为抗体、免疫缀合物或多肽。在一些具体实施例中，FOLR1结合剂为人源化抗体。在某些具体实施例中，FOLR1结合剂为鼠类Mov19抗体的人源化版本(变异重链与轻链分别展示为SEQIDNO:17与18)。
在某些具体实施例中，FOLR1结合剂具有一或更多下列的效果：抑制肿瘤细胞增生、通过降低肿瘤中的癌症干细胞频率以降低肿瘤致癌性、抑制肿瘤生长、增加存活、触发肿瘤细胞的细胞死亡、分化致癌性的细胞为非致癌性的状态或预防肿瘤细胞的转移。
在某些具体实施例中，特异性地结合人类FOLR1的免疫缀合物或其它剂通过细胞毒性剂而触发细胞死亡。举例来说，在某些具体实施例中，将对人类FOLR1抗体的抗体共轭至在肿瘤细胞中活化的美登素衍生物，其肿瘤细胞通过蛋白质内化作用而表现FOLR1。在某些替代的具体实施例中，试剂或抗体不为共轭的。
在某些具体实施例中，FOLR1结合剂能够抑制肿瘤生长。在某些具体实施例中，FOLR1结合剂能够抑制肿瘤在体内生长(例如，在异体移植老鼠模式中和/或在具有癌症的人类中)。在某些具体实施例中，FOLR1结合剂能够抑制肿瘤在人类中生长。
因此，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQIDNO:56)的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；以及Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。在某些具体实施例中，抗体为huMov19抗体，其为包含重链CDR2RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)的上述抗体。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huMov19的CDRs伴随每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；包含RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
本发明还提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体(huFR1-21)或其抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含SSYGMS(SEQIDNO:30)的重链CDR1；包含TISSGGSYTY(SEQIDNO:31)的重链CDR2；以及包含DGEGGLYAMDY(SEQIDNO:32)的重链CDR3；和/或(b)包含KASDHINNWLA(SEQIDNO:27)的轻链CDR1；包含GATSLET(SEQIDNO:28)的轻链CDR2；以及包含QQYWSTPFT(SEQIDNO:29)的轻链CDR3。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huFR1-21的CDRs，具有每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含SSYGMS(SEQIDNO:30)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含TISSGGSYTY(SEQIDNO:31)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含DGEGGLYAMDY(SEQIDNO:32)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含KASDHINNWLA(SEQIDNO:27)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含GATSLET(SEQIDNO:28)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含QQYWSTPFT(SEQIDNO:29)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huFR1-48的CDR，具有每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TNYWMQ(SEQIDNO:60)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含IYPGNGDSR(SEQIDNO:61)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含RDGNYAAY(SEQIDNO:62)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含RASENIYSNLA(SEQIDNO:57)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含AATNLAD(SEQIDNO:58)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含QHFWASPYT(SEQIDNO:59)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huFR1-49的CDRs，具有每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TNYWMY(SEQIDNO:66)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含AIYPGNSDTT(SEQIDNO:67)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含RHDYGAMDY(SEQIDNO:68)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含RASENIYTNLA(SEQIDNO:63)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含TASNLAD(SEQIDNO:64)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含QHFWVSPYT(SEQIDNO:65)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huFR1-57的CDRs，具有每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含SSFGMH(SEQIDNO:72)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含YISSGSSTIS(SEQIDNO:73)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含EAYGSSMEY(SEQIDNO:74)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含RASQNINNNLH(SEQIDNO:69)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含YVSQSVS(SEQIDNO:70)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含QQSNSWPHYT(SEQIDNO:71)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合至FOLR1的人源化抗体或抗原结合片段，其包含huFR1-65的CDRs，具有每CDR多至四个(即0、1、2、3或4)保守性氨基酸取代。因此，在某些具体实施例中，本发明提供特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或抗原结合片段，其中抗体包含：(a)包含TSYTMH(SEQIDNO:78)的重链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含YINPISGYTN(SEQIDNO:79)的重链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含GGAYGRKPMDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或(b)包含KASQNVGPNVA(SEQIDNO:75)的轻链CDR1或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含SASYRYS(SEQIDNO:76)的轻链CDR2或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体；和/或包含QQYNSYPYT(SEQIDNO:77)的轻链CDR3或其包含1、2、3或4个保守性氨基酸取代的变体。
还提供包含描述于本文个别的轻链或重链的的多肽，以及包含轻链或重链两者的多肽(例如，抗体)。SEQIDNO:4与6的多肽分别包含huMov19的重链变异区，以及huMov19的重链。SEQIDNO:10-13的多肽分别包含huMov19的变异区轻链1.00版、变异区轻链1.60版、轻链1.00版以及轻链1.60版。SEQIDNO:42与46的多肽分别包含huFR1-21的重链变异区，以及huFR1-21的重链。SEQIDNO:41与45的多肽分别包含huFR1-21的变异区轻链以及轻链。SEQIDNO:97与113的多肽分别包含huFR1-48的重链变异区，以及huFR1-48的重链。SEQIDNO:96与112的多肽分别包含huFR1-48的变异区轻链以及轻链。SEQIDNO:99与115的多肽分别包含huFR1-49的重链变异区，以及huFR1-49的重链。SEQIDNO:98与114的多肽分别包含huFR1-49的变异区轻链以及轻链。SEQIDNO:101与117的多肽分别包含huFR1-57的重链变异区，以及huFR1-57的重链。SEQIDNO:100与116的多肽分别包含huFR1-57的变异区轻链以及轻链。SEQIDNO:103与119的多肽分别包含huFR1-65的重链变异区，以及huFR1-65的重链。SEQIDNO:102与118的多肽分别包含huFR1-65的变异区轻链以及轻链。
还提供的是多肽，其包含：(a)具有对SEQIDNO:4或6至少约90％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:10-13至少约90％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:42或46序列一致性至少约90％的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:41及45至少约90％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:97或113至少约90％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:96或112至少约90％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:99或115至少约90％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:98或114至少约90％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:101或117至少约90％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:100或116至少约90％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:103或119至少约90％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:102或118至少约90％序列一致性的多肽。在某些具体实施例中，多肽包含具有对SEQIDNO:4、6、10-13、41、42、45或46至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％序列一致性的多肽。因此，在某些具体实施例中，多肽包含(a)具有对SEQIDNO:4或6至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:10-13至少约95％序列一致性的多肽。在某些具体实施例中，多肽包含(a)具有对SEQIDNO:42或46至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:41或45至少约95％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:97或113至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:96或112至少约95％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:99或115至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:98或114至少约95％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:101或117至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:100或116至少约95％序列一致性的多肽。还提供的是多肽其包含：(a)具有对SEQIDNO:103或119至少约95％序列一致性的多肽；和/或(b)具有对SEQIDNO:102或118至少约95％序列一致性的多肽。在某些具体实施例中，多肽包含(a)具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施例中，多肽包含(a)具有SEQIDNO:45的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:46的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施例中，多肽包含(a)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽；和/或(b)具有SEQIDNO:12或SEQIDNO:13的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施例中，多肽是抗体和/或多肽特异性地结合人类叶酸受体1。在某些具体实施例中，多肽是特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体。举例来说，本发明提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:4的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:10或SEQIDNO:11的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施例中，包含SEQIDNO:4的多肽是重链变异区。在某些具体实施例中，包含SEQIDNO:10或11的多肽是轻链变异区。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:6的氨基酸序列的多肽；及(b)具有SEQIDNO:12或SEQIDNO:13的氨基酸序列的多肽。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:45的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:46的氨基酸序列的多肽。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:112的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:113的氨基酸序列的多肽。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:114的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:115的氨基酸序列的多肽。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:116的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:117的氨基酸序列的多肽。本发明还提供特异性地结合人类FOLR1的抗体或人源化抗体，其包含(a)具有SEQIDNO:118的氨基酸序列的多肽；以及(b)具有SEQIDNO:119的氨基酸序列的多肽。在某些具体实施例中，具有对SEQIDNO:4、6、10-13、41、42、45、46、96-103以及112-119特定百分率的序列一致性的多肽，与仅通过保守性氨基酸取代的SEQIDNO:4、6、10-13、41、42、45、46、96-103以及112-119物相异。
在某些具体实施例中，FOLR1结合剂包含、实质上由或由抗FOLR1抗体组成，其选自huMov19、FR-1-21、FR1-48、FR1-49、FR1-57以及FR1-65抗体所组成的群组。
在某些具体实施例中，huMov19抗体由质粒编码，该质粒于2010年4月7日保藏于美国菌种中心(ATCC)，并且具有ATCC保藏编号PTA-10772以及PTA-10773或10774。
在某些具体实施例中，FR-1-21抗体由质粒编码，该质粒于2010年4月7日保藏于美国菌种中心(ATCC)，并指派ATCC保藏编号PTA-10775以及10776。
在某些具体实施例中，人源化抗体以与抗体嵌合Mov19实质上相同的亲和力结合FOLR1。抗体对抗原的亲和力或结合性可使用本领域所熟知的任何合适的方法以实验决定，例如流式细胞仪、酵素连接免疫吸附分析法(ELISA)或放射性免疫分析(RIA)、或动力学(例如，BIACORETM分析)。可以容易地使用直接结合试验以及竞争性结合试验的形式(见，举例来说，Berzofsky,etal.,"Antibody-AntigenInteractions,"InFundamentalImmunology,Paul,W.E.,Ed.,RavenPress:NewYork,N.Y.(1984)；Kuby,JanisImmunology,W.H.FreemanandCompany:NewYork,N.Y.(1992)；以及描述于本文的方法)。若在不同条件下测量，测得的特定抗体-抗原交互作用的亲和力可能变动(例如，盐类浓度、pH、温度)。因此，亲和力和其它抗原-结合参数的测量(例如，KD或Kd、Kon、Koff)以标准化的抗体与抗原溶液，以及标准化的缓冲液，如同本领域所知的并且例如描述于本文的缓冲液作出。
在一方面，结合试验可使用流式细胞仪于在表面表现FOLR1抗原的细胞上而进行。举例来说，使用每样品1x105个细胞在100μLFACS缓冲液(以2％正常羊血清补充的RPMI-1640培养基)中将FOLR1阳性细胞例如SKOV3与多种浓度的抗FOLR1抗体培养。接着，将细胞沉淀、清洗并以100μL的结合FITC-羊-抗小鼠或羊-抗人类IgG-抗体培养1小时(像是从例如JacksonLaboratory获得，在FACS缓冲液中6μg/mL)。将细胞再沉淀、以FACS缓冲液清洗并且重新悬浮于包含1％甲醛的200μLPBS中。举例来说，样品使用FACSCalibur流式细胞仪伴随HTS多孔上样器以取得，并且使用CellQuestPro分析(所有皆来自BDBiosciences,SanDiego,US)。针对每个样品，将FL1(MFI)的平均荧光强度输出，并对抗体浓度以半-对数绘图，以产生结合曲线。将S形剂量-反应曲线对结合曲线最适化，并且使用程序例如GraphPadPrismv4以预设参数计算EC50数值(GraphPad软件，SanDiego,CA)。可使用EC50数值作为对每个抗体表观解离常数“Kd”或“KD”的测量。
单株抗体可使用融合瘤细胞的方法而制备，例如那些由KohlerandMilstein(1975)Nature256:495所描述者。使用融合瘤细胞的方法，将小鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物如同上述免疫接种，以引发淋巴细胞的抗体产生，其将特异性地结合至免疫注射的抗原。淋巴细胞还可于体外行免疫作用。在免疫作用之后，将淋巴细胞分离并使用例如聚乙二醇与合适的骨髓瘤细胞株融合，以生成融合瘤细胞，接着可将其从未融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞中筛选出来。产生特异性地针对所选抗原的单株抗体的融合瘤细胞如同通过免疫沉淀、免疫转渍、或通过体外结合反应(例如放射性免疫分析(RIA)；酵素连接免疫吸附分析法(ELISA))而测定，可以接着使用标准方法在体外培养(Goding,MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,1986)或在动物体内以腹水瘤而增殖。接着可将单株抗体如同对多株抗体所描述再由培养基或腹水中纯化。
替代的单株抗体还可使用如同在美国专利4,816,567的重组DNA方法制作。将编码单株抗体的多核苷酸从成熟的B细胞或融合瘤细胞中分离，例如通过使用特异性地放大编码抗体的重与轻链的基因的寡核苷酸引物的RT-PCR，并且它们的序列使用传统步骤决定。将分离的编码重与轻链的多核苷酸接着转殖至合适的表现载体，将其转染至不产生免疫球蛋白的宿主细胞例如E.coli细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞时，单株抗体通过宿主细胞而产生。同时，可将所希望物种的重组单株抗体或其片段如同叙述从表现所希望物种的CDR的噬菌体表现基因库中分离(McCaffertyetal.,1990,Nature,348:552-554；Clacksonetal.,1991,Nature,352:624-628；以及Marksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581-597)。
编码单株抗体的多核苷酸可进一步以数个不同的方式使用重组DNA技术修饰以产生替代的抗体。在一些具体实施例中，举例来说，小鼠单株抗体的轻与重链的恒定区可1)举例来说，以人类抗体的那些区域取代以产生嵌合抗体或2)以非免疫球蛋白多肽取代以产生融合抗体。在一些具体实施例中，恒定区被截断或移除以产生所希望的单株抗体的抗体片段。变异区的定点(site-directed)或高密度突变(high-densitymutagenesis)可用以最佳化单株抗体的特异性性、亲和力等。
在一些具体实施例中，对人类FOLR1的单株抗体是人源化抗体。在某些具体实施例中，此类抗体治疗性使用以在施用人类受试者时降低抗原性以及HAMA(人类抗小鼠抗体)反应。
用以设计、人源化或表面重塑非人类或人类抗体的方法还可被使用并且为本领域所熟知。经人源化的、表面重塑的或相似地设计的抗体可具有一或更多来自非人类来源的氨基酸残基，例如，但不限于，小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物或其它哺乳类动物。这些非人类氨基酸残基由经常称为“输入(import)”残基的残基取代，其典型地取自已知人类序列的“输入”变异、恒定或其它区域。
此类输入序列可被用以降低免疫原性或降低、提升或修饰结合、亲和力、结合速率、解离速率、结合性、特异性性、半衰期或如同本领域所知的任何其它合适的特性。一般来说，CDR残基为直接且最显著地涉及影响FOLR1结合。因此，虽然变异与恒定区的非人类序列可被人类的或其它氨基酸取代，部分或全部的非人类或人类CDR序列会维持。
抗体还可任选地被人源化、表面重塑、设计或人类抗体以保持对抗原FOLR1高亲和力以及其它有利的生物特性而设计。为了达成这个目标，人源化(或人类的)或设计的抗FOLR1抗体以及表面重塑的抗体可通过亲代序列的分析处理而任选地制备，并且使用亲代的、设计的以及人源化的序列的三度空间模式任选地制备各种概念性的人源化以及设计的产物。三度空间的免疫球蛋白模式为常用的并且对本领域的技术人员是熟悉的。计算机程序是可用的，其说明并展示所选的候选免疫球蛋白序列可能的三度空间构形结构。这些展示的检视容许残基在候选免疫球蛋白序列功能的可能角色的分析，即，影响候选免疫球蛋白结合其抗原(例如FOLR1)的能力的残基的分析。这样，可从一致且输入的序列中筛选与合并骨架(FR)残基，使得达成所希望的抗体特性，例如对标的的抗原增加的亲和力。
本发明的抗体的人源化作用、表面重塑或设计可使用任何已知的方法而进行，例如但不限于描述于Winter(Jonesetal.,Nature321:522(1986)；Riechmannetal.,Nature332:323(1988)；Verhoeyenetal.,Science239:1534(1988))、Simsetal.,J.Immunol.151:2296(1993)；ChothiaandLesk,J.Mol.Biol.196:901(1987)、Carteretal.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992)；Prestaetal.,J.Immunol.151:2623(1993)、美国专利案号5,639,641、5,723,323；5,976,862；5,824,514；5,817,483；5,814,476；5,763,192；5,723,323；5,766,886；5,714,352；6,204,023；6,180,370；5,693,762；5,530,101；5,585,089；5,225,539；4,816,567；PCT/：US98/16280；US96/18978；US91/09630；US91/05939；US94/01234；GB89/01334；GB91/01134；GB92/01755；WO90/14443；WO90/14424；WO90/14430；EP229246；7,557,189；7,538,195以及7,342,110的那些，其每个以全文并入本文作为参考，包括其中引用的参考数据。
在某些替代的具体实施例中，对FOLR1的抗体是人类抗体。人类抗体可使用各种本领域已知的技术直接制备。以体外免疫或是从产生直接对抗目标抗原的抗体的免疫注射的个体分离，可产生不死的人类B淋巴细胞(例如参见，Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss,p.77(1985)；Boemeretal.,1991,J.Immunol.,147(1):86-95；以及美国专利5,750,373)。同时，人类抗体可选自噬菌体基因库，其噬菌体基因库表现人类抗体，举例来说，如同于Vaughanetal.,1996,Nat.Biotech.,14:309-314,Sheetsetal.,1998,Proc.Nat’l.Acad.Sci.,95:6157-6162、HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381以及Marksetal.,1991,J.Mol.Biol.,222:581所描述的)。对于产生和使用抗体噬菌体基因库的技术还描述于美国专利号5,969,108、6,172,197、5,885,793、6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915；6,593,081；6,300,064；6,653,068；6,706,484与7,264,963以及Rotheetal.,2007,J.Mol.Bio.,doi:10.1016/j.jmb.2007.12.018(其每个以全文的方式并入以作为参考)。亲和力成熟(affinitymaturation)策略以及基因片段洗牌(chainshuffling)策略(Marksetal.,1992,Bio/Technology10:779-783，以全文的方式并入以作为参考)为本领域所知的，并且可应用以产生高亲和力的人类抗体。
人源化抗体还可在包含人类免疫球蛋白位点的基因转殖鼠中制造，其于免疫接种时能够在没有内源性免疫球蛋白生产下，制造完全功能的人类抗体。该方法描述于美国专利5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；以及5,661,016。
本发明还包括特异性地辨认人类叶酸受体1的双特异性性抗体。双特异性性抗体为能够特异性地辨认并结合至少两个不同抗原决定基的抗体。不同的抗原决定基可在相同分子内(例如，相同的人类叶酸受体1)或在不同分子上，使得两者，举例来说，抗体可特异性地辨认并结合人类叶酸受体1以及例如1)在白血球上的效应分子例如T细胞受体(例如CD3)或Fc受体(例如CD64、CD32或CD16)或2)如下文详细描述的细胞毒素剂。
示范的双特异性性抗体可结合至两个不同的抗原决定基，其中至少一个来自本发明的多肽。替代地，免疫球蛋白分子的抗-抗原臂可与结合至白血球上的触发分子的臂结合，其白血球例如T细胞受体分子(例如CD2、CD3、CD28或B7)或对IgG的Fc受体，以集中对表现特定抗原细胞的细胞防御机制。还可使用双特异性性抗体以引导细胞毒素剂至表现特定抗原的细胞。这些抗体拥有抗原结合臂以及结合细胞毒素剂或放射核素螫合剂例如EOTUBE、DPTA、DOTA或TETA的臂。用以制作双特异性性抗体的技术在本领域为普遍的(Millsteinetal.,1983,Nature305:537-539；Brennanetal.,1985,Science229:81；Sureshetal,1986,MethodsinEnzymol.121:120；Trauneckeretal.,1991,EMBOJ.10:3655-3659；Shalabyetal.,1992,J.Exp.Med.175:217-225；Kostelnyetal.,1992,J.Immunol.148:1547-1553；Gruberetal.,1994,J.Immunol.152:5368以及美国专利5,731,168)。还考虑带有多于两个性价的抗体。举例来说，可制备三特异性性抗体(Tuttetal.,J.Immunol.147:60(1991))。因此，在某些具体实施例中，对FOLR1的抗体是多特异性性的。
在某些具体实施例中提供，举例来说，增加肿瘤渗透性的抗体片段。已知各种作为生产抗体片段的技术。传统地，这些片段通过完整抗体的蛋白水解消化而衍生(举例来说Morimotoetal.,1993,JournalofBiochemicalandBiophysicalMethods24:107-117；Brennanetal.,1985,Science,229:81)。在某些具体实施例中，以重组产生抗体片段。Fab、Fv以及scFv抗体片段皆可在E.coli或其它宿主细胞中表现并由其分泌，因而使这些片段大量产生。此类抗体片段还可自上述讨论的抗体噬菌体基因库中分离。抗体片段还可以是如同例如美国专利5,641,870中所描述的线性抗体，并且可以是单特异性性或双特异性性的。其它作为生产抗体片段的技术对熟练的从业人员将是显而易见的。
根据本发明，可将技术用于生产对人类叶酸受体1特异性的单链抗体(见美国专利案号4,946,778)。此外，可将方法用于Fab表现基因库的构建(Huse,etal.,Science246:1275-1281(1989))，以快速并且有效率的辨识具有对叶酸1受体或其衍生物、片段、类似物或同源物所希望的特异性性的单株Fab片段。抗体片段可通过本领域的技术生产，包括但不限于：(a)通过抗体分子的胃蛋白酶消化作用产生的F(ab')2片段；(b)通过还原F(ab')2片段的二硫键所生成的Fab片段，(c)通过将抗体分子以木瓜酵素与还原剂处理所生成的Fab片段，以及(d)Fv片段。
为了增加其血清半衰期而修饰抗体可进一步是令人满意的，特别是在抗体片段的例子中。这可以通过，举例来说，将救援受体结合位点合并至抗体片段而达成，其通过抗体片段中合适区域的突变或通过将抗原决定基并入胜肽标记，然后将其融合至抗体片段的尾端或中间任一者(例如，通过DNA或肽合成)。.
异源共轭抗体还在本发明的范围内。异源共轭抗体由两个共价连结的抗体组成。此类抗体，举例来说，已提出使免疫细胞得以针对有害的细胞(美国专利号4,676,980)。考虑到抗体可使用已知合成蛋白化学的方法在体外制备，包括那些涉及交联剂的方法。举例来说，可利用双硫交换反应或通过生成硫醚键而构建免疫毒素。为此目的的合适试剂的例子包括亚胺基硫氢根(iminothiolate)以及甲基-4-巯基丁酰亚胺甲酯盐酸盐。
为了本发明的目的，应理解经修饰的抗体可包含任何类型的变异区，其提供抗体与人类FOLR1的多肽结合。在这方面，变异区可包含或衍生自任何类型的哺乳动物，其可诱导发动体液的反应并且生成对抗希望的肿瘤相关抗原的免疫球蛋白。因此，经修饰的抗体的变异区可以是，举例来说，人类的、鼠类的、非人类灵长类动物的(例如食蟹猴、猕猴等)或lupineorigin。在一些具体实施例中，经修饰的免疫球蛋白的变异区和恒定区两者皆是人类的。在其它具体实施例中，可设计或特异性地修改兼容抗体的变异区(经常衍生自非人类来源)以改善结合特性或降低分子的致免疫性。在这方面，可将本发明中有用的变异区通过送入氨基酸序列的内含物而人源化或以其它方式改变。
在某些具体实施例中，在重和轻链的变异区通过一或更多CDR的至少部分的取代，以及如有必要，通过部分骨架区域取代作用以及序列改变而改变。虽然CDR可衍生自与骨架区域衍生来源相同的类别或甚至子类的抗体，应设想CDR将衍生自不同类别的抗体，以及在某些具体实施例中，衍生自来自不同物种的抗体。可能不必要以来自供应者变异区的完整CDR取代所有的CDR，以将一个变异区的抗原结合能力转变成另一个。相反地，可能仅需要转移那些必要维持抗原结合位置的活性的残基。所给的例子载于美国专利案号5,585,089、5,693,761以及5,693,762，这将是本领域的技术人员很好胜任的，无论是进行例行的实验或试误测试，以获得带有降低致免疫性的功能性抗体。
虽然转变为变异区，本领域的技术人员将领会本发明的经修饰的抗体将包含其中一或更多的恒定区区域的至少一小部分已被删除或以别的方式改变的抗体(例如，全长度抗体或其免疫反应片段)，以提供所需的生化特性例如，当与约略相同的致免疫性的包含天然或未改变的恒定区的抗体比较时，增加的肿瘤局部性或降低的血清半衰期。在一些具体实施例中，经修饰抗体的恒定区将包含人类恒定区。对与本发明相容的恒定区的修饰包含在一或更多区域的或更多氨基酸的加入、删除或取代。还即，本文所揭露的经修饰的抗体可包含对三重链恒定区(CH1、CH2或CH3)和/或对轻链恒定区(CL)的或更多的改变或修饰。在一些具体实施例中，考虑其中一或更多区域为部分地或完全地删除的经修饰的恒定区。在一些具体实施例中，经修饰抗体将包含删除区域的构建物或变异物，其中整个CH2区域已被移除(ΔCH2构建物)。在一些具体实施例中，被省略的恒定区区域将由短的氨基酸间隔(例如10个残基)取代，其间隔提供典型地由缺乏的恒定区所给予的些分子弹性。
除了它们的构形，本领域已知恒定区媒介数种效应功能。举例来说，补体的C1成分结合至抗体活化补体***。补体活化作用对调理作用和细胞病原溶解是重要的。补体活化作用还刺激发炎反应，并且还可与自体免疫过敏性相关。进一步地，抗体通过Fc区域结合至细胞，以在抗体Fc区域上的Fc受***点结合至细胞上的Fc受体(FcR)。有对不同类别的抗体特异性的数个Fc受体，其抗体包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)以及IgM(μ受体)。抗体结合至细胞表面的Fc受体触发数个重要且多样的生物反应，包含抗体包覆颗粒的吞噬与破坏作用、免疫复合物的清除、抗体包覆标的细胞被杀手细胞溶解(称为抗体依赖细胞媒介细胞毒性，或ADCC)、发炎性媒介物的释放、胎盘转移以及免疫球蛋白生成的控制。
在某些具体实施例中，FOLR1结合抗体提供改变的效应功能，其反过来影响所投予抗体的生物概况。举例来说，恒定区的删除或去活化(通过点突变或其它方法)可降低循环的经修饰抗体的Fc受体的结合从而增加肿瘤的局部化。在其它例子中与本发明一致的恒定区修饰作用，可能舒缓补体结合并因而降低血清的半衰期以及共轭细胞毒素的非特异性性关联。其它恒定区的修饰作用仍可用以去除双硫键接或寡醣基元，其使得局部化由于抗原特异性性或抗体灵活度的增加而提升。同样地，符合本发明的对恒定区的修饰作用可在熟练的技术人员的职权范围内，使用熟知的生化或分子工程技术而轻易地制造。
在某些具体实施例中，为抗体的FOLR1结合剂不具有一或更多效应功能。举例来说，在一些具体实施例中，抗体不具有抗体依赖细胞毒性(ADCC)的活性和/或无补体依赖细胞毒性(CDC)的活性。在某些具体实施例中，抗体不结合至Fc受体和/或补体因子。在某些具体实施例中，抗体不具有效应功能。
将注意在某些具体实施例中，经修饰的抗体可设计成直接将CH3区域融合至各自的经修饰抗体的绞链区。在其它建置中，提供肽间隔于绞链区与经修饰的CH2和/或CH3区域之间可能是令人满意的。举例来说，可表示兼容的构建，其中CH2区域已删除并将维持的CH3区域(经修饰或未经修饰)伴随5-20个氨基酸间隔而连结到绞链区。可加入此类间隔，举例来说，以确保恒定区的调节性元素维持自由且易接近的或绞链区维持弹性。然而，在一些例子中，应注意氨基酸间隔可能证明为致免疫性的且引起对构建物有害的免疫反应。因此，在某些具体实施例中，任何加至构建物之间隔将是相对地非致免疫性的，或甚至完全省略，以维持经修饰抗体所希望的生化素质。
除了整个恒定区区域的删除，将领会本发明的抗体可通过少数或单一氨基酸的部分删除或取代而提供。举例来说，在CH2区域的所选的区域中的单一氨基酸突变可能足以实质上地降低Fc结合，并且从而增加肿瘤的局部性。同样地，只删除一或更多控制受调节的效应功能(例如补体C1Q结合)的恒定区区域的部分，可能是令人满意的。此类恒定区的部分删除可改善抗体的所选特性(血清半衰期)而维持其它所希望的与主要恒定区区域相关功能的完整。而且，正如上文提到的，所揭露的抗体的恒定区可通过一或更多的氨基酸突变或取代而修饰，其提高了所生成的构建物的概况。在此方面，扰乱由保守的结合位点(例如Fc结合)所提供的活性，而实质上地维持经修饰抗体的构形与免疫性的概况也许是可能的。某些具体实施例可包含一或更多氨基酸加入至恒定区，以提高所希望的特性例如降低或增加效应功能或提供给更多细胞毒素或碳水化合物的附着。在此类具体实施例中，***或复制衍生自所选的恒定区区域的特定序列可以是令人满意的。
本发明进一步包含与本文所载的嵌合、人源化与人类抗体或其抗体片段实质上同源的变异物与同等物。这些可包含，举例来说，保守性取代突变，即一或更多氨基酸被相似氨基酸的取代作用。举例来说，保守性取代意指氨基酸与另一在相同一般类别的氨基酸例如，举例来说，酸性氨基酸与另一酸性氨基酸、碱性氨基酸与另一碱性氨基酸或中性氨基酸与另一中性氨基酸的取代作用。保守性氨基酸取代的意图是本领域所熟知的。
本发明的多肽可以是包含对抗人类FOLR1的抗体或其片段的重组多肽、天然多肽或合成多肽。本领域将认出本发明的一些氨基酸序列可被改变而对蛋白质的结构或功能没有显著影响。因此，本发明进一步地包括多肽的变异物，其对人类叶酸受体蛋白质显示实质上的活性或是其包括抗体或其片段的区域。此类突变包括缺失、***、倒置、重复以及类型取代。
可进一步将多肽和类似物修饰成为包含非蛋白质寻常部分的额外的化学基元。那些衍生化的基元可改善溶解度、生物半衰期或蛋白质吸收作用。基元还可降低或消除任何所希望的蛋白质以及诸如此类的副作用。对那些基元的概述可发现于REMINGTON'SPHARMACEUTICALSCIENCES,20thed.,MackPublishingCo.,Easton,PA(2000)。
描述于本文的分离的多肽可通过本领域所知的任何合适方法而生产。此类方法范围由直接的蛋白质合成方法，到构建编码分离的多肽序列的DNA序列并且在合适的转殖宿主内表现那些序列。在一些具体实施例中，DNA序列使用重组技术，通过分离或合成编码有兴趣的野生型蛋白质的DNA序列而构建。任选地，可将序列通过定点特异突变而致突变，以提供其功能性类似物。例如参见Zoelleretal.,Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA81:5662-5066(1984)以及美国专利号4,588,585。
在一些具体实施例中，将编码感兴趣的多肽的DNA序列使用寡核苷酸合成仪通过化学合成而构建。此类寡核苷酸可根据所希望的多肽的氨基酸序列而设计，并选择且那些将生产感兴趣重组多肽的宿主细胞中偏好的密码子。可应用标准方法以合成分离的多核苷酸序列，其编码感兴趣的分离多肽。举例来说，完整的氨基酸序列可用以构建倒退转译基因。进一步地，可合成包含核苷酸序列的DNA寡聚合物，其序列编码特定的分离多肽。举例来说，可合成然后接合数种编码所需多肽的部分的小寡核苷酸。个别的寡核苷酸典型地包含5'或3'突出以供互补的组合。
一旦组合(通过合成、定点突变或另外的方法)，编码特定感兴趣的分离多肽的多核苷酸序列将***至表现载体中，并且操作地连接至适用于在希望的宿主中的表现蛋白质的表现控制序列。妥当的组合可通过核苷酸定序、限制图谱以及在合适的宿主中表现具生物活性的多肽而确认。如同本领域所熟知的，为获得转染基因在宿主中的高表现程度，基因必须以操作连接至在所选的表现宿主中具功能的转录与转译的表现控制序列。
在某些具体实施例中，重组表现载体用以放大并表现编码针对人类FOLR1抗体或其片段的DNA。重组表现载体为具有合成的或cDNA衍生的DNA片段的可复制的DNA构建物，其编码抗FOLR1抗体或其片段的多肽链，以操作连接至衍生自哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的合适转录或转译调节元素。转录单元一般包含(1)基因元素或具有在基因表现中调节的角色的元素，举例来说，转录启动子或加强子，(2)转录成mRNA并且转译成蛋白质的结构或编码序列，以及(3)适合的转录与转译起始与终止序列的组合，如同下文所详述者。此类调节元素可包括操纵子序列以控制转录。在宿主中复制的能力，经常由复制的起始所授予，以及可将促进转染物识别的选择基因额外地并入。当它们彼此为功能性地相关时，将DNA区域以操作连接。举例来说，若其表现为参与多肽分泌之前趋物，将作为信号胜肽(分泌引导者)的DNA以操作连接至作为多肽的DNA；若其控制序列转录，将启动子以操作连接至编码序列；或者如果将其置于得以转译的位置，将核糖体结合位置以操作连接至编码序列。意图用于酵母菌表现***的结构元素包括使转译的蛋白质由宿主细胞行细胞外分泌的领导序列。替代地，没有领导或运输序列而表现重组蛋白质处，其可包括N端的甲硫氨酸残基。此残基可被任选地由表现的重组蛋白质连续裂解以提供最终产物。
表现控制序列和表现载体的选择将视宿主的选择而定。可采用多种表现宿主/载体组合。对真核宿主有用的表现载体，包括，举例来说，包含来自SV40、牛乳突瘤病毒、腺病毒以及巨细胞病毒的表现控制序列的载体。对细菌宿主有用的表现载体包括已知的细菌质粒，例如来自大肠杆菌的质粒，包括pCR1、pBR322、pMB9以及它们的衍生物，较宽的宿主范围的质粒，例如M13以及丝状单股DNA噬菌体。
用以表现FOLR1结合多肽或抗体(或使用FOLR1蛋白质作为抗原)的合适的宿主细胞包括在合适的启动子控制下的原核生物、酵母菌、昆虫或更高等的真核细胞。原核生物包括葛兰氏阴性或葛兰氏阳性的个体，举例来说大肠杆菌(E.coli)或杆菌。更高等的真核细胞包括如同描述于下的哺乳动物来源所建立的细胞株。还可采用非细胞转译***(cell-freetranslationsystems)。作为伴随细菌、真菌、酵母菌以及哺乳动物细胞宿主而使用的合适的选殖以及表现载体由Pouwelsetal.描述(CloningVectors:ALaboratoryManual,Elsevier,N.Y.,1985)，其相关的揭露内容以此方式并入以作为参考。关于蛋白质生产方法的额外信息，包括抗体生产，可发现于，例如美国专利申请公开号2008/0187954、美国专利号6,413,746与6,660,501，以及国际专利公开号WO04009823，其每个以此方式将全文并入本文以作为参考。
多种哺乳动物或昆虫细胞培养***也有益地被使用以表现重组蛋白质。在哺乳动物细胞中重组蛋白质的表现可进行，因为此类蛋白质通常是正确地折迭、经合宜的修饰以及具完整地功能。合适的哺乳动物宿主细胞株的例子包括由Gluzman(Cell23:175,1981)描述的HEK-293以及HEK-293T、猴子肾脏细胞的COS-7株，以及其它细胞株包括，举例来说，L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa以及BHK细胞株。哺乳动物表现载体可包含非转录元素例如复制起点、连接至欲表现的基因的合适启动子与加强子以及其它5'或3'毗邻的非转录序列，以及5'或3'非转译序列，例如必需的核醣体结合位置、多腺苷酸位置、剪接提供者与接收者位置以及转录终止序列。在昆虫细胞中生产异源蛋白质的杆状病毒***通过LuckowandSummers,Bio/Technology6:47(1988)回顾。
由转殖宿主生产的蛋白质可根据任何适合的方法纯化。此类标准方法包括层析法(例如，离子交换、亲和力与尺寸管柱层析)、离心、差别溶解度或通过任何其它作为蛋白质纯化的标准技术。亲和力标记例如hexahistidine((组氨酸)6、(His)6)、麦芽糖结合区域、流行性感冒被覆序列以及谷胱甘肽-S-转移酶可被附着于蛋白质通过通过合适的亲和力管柱以容许简单纯化。分离的蛋白质还可使用此类技术如蛋白质水解、核磁共振以及X射线结晶学而物理特征化。
举例来说，来自分泌重组蛋白质至培养基的***的上清液可先使用商业上可取得的蛋白质浓缩过滤器以浓缩，举例来说，Amicon或MilliporePelliconultrafiltrationunit。浓缩步骤之后，可将浓缩物用至合适的纯化基质。替代地，可采用阴离子交换树脂，举例来说，具有悬吊的二乙胺基乙基(DEAE)基团的基质或受质。基质可为丙烯酰胺、琼脂糖、葡聚糖、纤维素或其它常用于蛋白质纯化的种类。替代地，可采用阳离子交换步骤。合适的阳离子交换器包括各种包含磺酸基丙基或羧甲基基团的不溶基质。最后，一或更多的反相高效液相层析法(RP-HPLC)步骤采用疏水性的RP-HPLC培养基，例如，具有悬吊甲基或其它脂肪族基团的硅胶，可被采用以进一步纯化FOLR1结合剂。前述的纯化步骤中的一些或全部还可以不同的结合而用以提供均质的重组蛋白质。
在细菌培养基生产的重组蛋白质可被分离，举例来说，通过起始从细胞沉淀萃取，其次是一或更多的浓缩、盐析、水溶液离子交换或大小排阻层析法(sizeexclusionchromatography)的步骤。可采用高效液相层析法(HPLC)作为最后纯化的步骤。在表现重组蛋白质所采用的微生物细胞可以任何合宜的方法破裂，包括冰冻解冻循环、超音波、机械性破裂或使用细胞水解剂。
本领域所知用以纯化抗体以及其它蛋白质的方法还包括，举例来说，这些描述于美国专利公开号2008/0312425、2008/0177048以及2009/0187005，其每个以此方式将全文并入本文以作为参考。
在某些实施例中，FOLR1结合剂是非抗体的多肽。各种作为识别与生产以高亲和力结合至蛋白质标的的非抗体多肽的方法为本领域所知。见例如，Skerra,Curr.Opin.Biotechnol.,18:295-304(2007)、Hosseetal.,ProteinScience,15:14-27(2006)、Gilletal.,Curr.Opin.Biotechnol.,17:653-658(2006)、Nygren,FEBSJ.,275:2668-76(2008)以及Skerra,FEBSJ.,275:2677-83(2008)，其每个将全文并入本文以作为参考。在某些具体实施例中，噬菌体表现技术已被用以识别/生产FOLR1结合多肽。在某些实施例中，多肽包含选自蛋白质A、脂质载运蛋白(lipocalin)、纤维连结蛋白区域(fribronectindomain)、锚蛋白一致重复区域(ankyrinconsensusrepeatdomain)以及硫代氧化还原蛋白(thioredoxin)所组成的群组的类型的蛋白质鹰架。
在一些实施例中，试剂为非蛋白质分子。在某些实施例中，试剂为小分子。对识别非蛋白质FOLR1结合剂有用的组合式化学数据库(combinatorialchemistrylibraries)以及技术为本领域的技术人员所知的。例如参见Kennedyetal.,J.Comb.Chem,10:345-354(2008)、Dolleetal,J.Comb.Chem.,9:855-902(2007)以及Bhattacharyya,Curr.Med.Chem.,8:1383-404(2001)，其每个将全文并入本文以作为参考。在某些进一步的实施例中，试剂为碳水化合物、醣胺聚多醣、醣蛋白或蛋白多醣。
在某些实施例中，试剂为核酸适体。适体是以它们结合至另一分子的能力为基础而被选出(例如，由随机或突变库)的多核苷酸分子。在一些实施例中，适体包含DNA多核苷酸。在某些替代实施例中，适体包含RNA多核苷酸。在某些实施例中，适体包含一或更多经修饰的核酸残基。生成与筛选作为结合至蛋白质的核酸适体的方法是本领域所熟知的。例如参见，美国专利号5,270,163、美国专利号5,683,867、美国专利号5,763,595、美国专利号6,344,321、美国专利号7,368,236、美国专利号5,582,981、美国专利号5,756,291、美国专利号5,840,867、美国专利号7,312,325、美国专利号7,329,742、国际专利公开号WO02/077262、国际专利公开号WO03/070984、美国专利申请公开号2005/0239134、美国专利申请公开号2005/0124565以及美国专利申请公开号2008/0227735，其每个将全文并入本文以作为参考。
III.免疫缀合物
本发明还针对缀合物(本文还意指为免疫缀合物)，其包含抗FOLR1抗体、抗体片段、功能同等物、改良的抗体以及其如同本文所揭露的方面、连接的或共轭至细胞毒素(药物)或前体药物。因此，在某个实施例中，本发明提供包含特异性地结合人类叶酸受体1的人源化抗体或其抗原结合片段的免疫缀合物，其中抗体包含：(a)包含GYFMN(SEQIDNO:1)的重链CDR1；包含RIHPYDGDTFYNQXaa1FXaa2Xaa3(SEQIDNO:56)的重链CDR2；以及包含YDGSRAMDY(SEQIDNO:3)的重链CDR3；以及(b)包含KASQSVSFAGTSLMH(SEQIDNO:7)的轻链CDR1；包含RASNLEA(SEQIDNO:8)的轻链CDR2；以及包含QQSREYPYT(SEQIDNO:9)的轻链CDR3；其中Xaa1选自K、Q、H以及R；Xaa2选自Q、H、N以及R；并且Xaa3选自G、E、T、S、A以及V。在某些实施例中，抗体是huMov19抗体，其为上述的包含重链CDR2RIHPYDGDTFYNQKFQG(SEQIDNO:2)的抗体。在其它实施例中，抗体是FR1-21并且包含(a)包含SSYGMS(SEQIDNO:30)的重链CDR1；包含TISSGGSYTY(SEQIDNO:31)的重链CDR2；和/或包含DGEGGLYAMDY(SEQIDNO:32)的重链CDR3；以及(b)包含KASDHINNWLA(SEQIDNO:27)的轻链CDR1；包含GATSLET(SEQIDNO:28)的轻链CDR2；以及包含QQYWSTPFT(SEQIDNO:29)的轻链CDR3。在其它实施例中，抗体是FR1-48并且包含(a)包含TNYWMQ(SEQIDNO:60)的重链CDR1；包含AIYPGNGDSR(SEQIDNO:61)的重链CDR2；和/或包含RDGNYAAY(SEQIDNO:62)的重链CDR3；和/或(b)包含RASENIYSNLA(SEQIDNO:57)的轻链CDR1；包含AATNLAD(SEQIDNO:58)的轻链CDR2；以及包含QHFWASPYT(SEQIDNO:59)的轻链CDR3。在其它实施例中，抗体是FR1-49并且包含(a)包含TNYWMY(SEQIDNO:66)的重链CDR1；包含AIYPGNSDTT(SEQIDNO:67)的重链CDR2；和/或包含RHDYGAMDY(SEQIDNO:68)的重链CDR3；和/或(b)包含RASENIYTNLA(SEQIDNO:63)的轻链CDR1；包含TASNLAD(SEQIDNO:64)的轻链CDR2；以及包含QHFWVSPYT(SEQIDNO:65)的轻链CDR3。在其它实施例中，抗体是FR1-57并且包含(a)包含SSFGMH(SEQIDNO:72)的重链CDR1；包含YISSGSSTIS(SEQIDNO:73)的重链CDR2；和/或包含EAYGSSMEY(SEQIDNO:74)的重链CDR3；和/或(b)包含RASQNINNNLH(SEQIDNO:69)的轻链CDR1；包含YVSQSVS(SEQIDNO:70)的轻链CDR2；以及包含QQSNSWPHYT(SEQIDNO:71)的轻链CDR3。在又一具体实施例中，抗体是FR1-65并且包含(a)包含TSYTMH(SEQIDNO:78)的重链CDR1；包含YINPISGYTN(SEQIDNO:79)的重链CDR2；和/或包含GGAYGRKPMDY(SEQIDNO:80)的重链CDR3；和/或(b)包含KASQNVGPNVA(SEQIDNO:75)的轻链CDR1；包含SASYRYS(SEQIDNO:76)的轻链CDR2；以及包含QQYNSYPYT(SEQIDNO:77)的轻链CDR3。
合适的药物或前体药物是本领域所知的。在某些实施例中，药物或前体药物是细胞毒性剂。用于本发明的细胞毒素缀合物的细胞毒性剂可以是造成细胞死亡、或诱发细胞死亡或以某些方式减少细胞存活率的任何化合物，并且包括，举例来说，美登素衍生物以及美登素衍生物类似物、苯二氮平、类紫杉醇、CC-1065、CC-1065类似物、倍癌霉素与倍癌霉素类似物、烯二炔(enediynes)，例如加利车霉素、多拉司他汀、多拉司他汀类似物，其包括奥利斯汀(auristatin)、托美霉素(tomaymycin)衍生物以及细霉素衍生物、甲氨蝶呤、顺铂、卡铂、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春碱、马法兰、丝裂霉素C、氯霉素以及吗啉阿霉素。在某些实施例中，细胞毒性剂是美登素衍生物以及美登素衍生物类似物。
此类缀合物可通过使用连接基团以连接药物或前体药物至抗体或功能同等物而制备。合适的连接基团是本领域所熟知的，并且包括，举例来说，双硫基团、硫醚基团、不耐酸基团、不耐光基团、不耐肽酶基团以及不耐酯酶基团。
药物或前体药物可以，举例来说，通过双硫键被连接至抗FOLR1抗体或其抗体片段。连接元分子或包含反应性化学基团的交联剂，其可以与抗FOLR1抗体或其抗体片段反应。在某些实施例中，作为与细胞结合剂反应的反应性化学基团为N-琥珀酰亚胺酯以及N-磺酸基基琥珀酰亚胺酯。额外地连接元分子包含反应性化学基团，在某些实施例中二硫代吡啶二硫基可与药物反应以生成双硫键。在某些实施例中，连接元分子包括，举例来说，N-琥珀酰亚胺3-(2-吡啶二硫代基)丙酸酯(SPDP)(例如参见，Carlssonetal.,Biochem.J.,173:723-737(1978))、N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代基)丁酸酯(SPDB)(例如参见，美国专利号4,563,304)、N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代基)2-磺酸基丁酸酯(磺酸基基-SPDB)(见美国公开号20090274713)、N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代基)戊酸酯(SPP)(例如参见，CAS注册号341498-08-6)、2-亚胺基硫烷或乙酰基琥珀酸酐。举例来说，抗体或细胞结合剂可以交联剂修饰，并且接着将包含由此衍生的自由或受保护的硫醇的抗体或细胞结合剂与包含二硫化物或硫醇的美登素衍生物反应以产生缀合物。缀合物可通过层析法纯化，其包括但不限于HPLC、大小排斥作用、吸附作用、离子交换以及亲和力补捉、透析或切流式过滤。在某些实施例中，将抗FOLR1抗体通过SPDB或磺酸基-SPDB连接元连接至细胞毒素。在某个实施例中，将huMov19抗体通过SPDB或磺酸基-SPDB连接元连接至细胞毒素。
在本发明的另一方面，将抗FOLR1抗体通过双硫键以及聚乙二醇间隔连接至细胞毒素药物以提高免疫缀合物的强度、可溶性或功效。此类可裂解的亲水性连接元描述于WO2009/0134976。此连接元设计额外的好处为令人满意的高单体比率以及抗体-药物缀合物的最小聚集。在这个方面的具体设想为叙述将细胞结合剂和药物的缀合物通过带有聚乙二醇间隔((CH2CH2O)n＝1-14)的双硫基团(-S-S-)连接，伴随窄范围的药物含量2-8，其显示对癌症细胞相对高效的生物活性并具有高共轭产率以及伴随最小的蛋白质聚集的高单体比率的令人满意的的生化性质。
在这个方面的具体设想为具有化学式(I)的抗FOLR1抗体药物缀合物或具有化学式(I’)的缀合物：
A–[Xl–(–CH2–CH2O–)n–Y–C]m(I)
[C-Y-(–CH2–CH2O–)n–Xl]m-A(I’)
其中：
A代表抗FOLR1抗体或片段；
C代表细胞毒素或药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、胺甲酸酯键或醚键而附接至细胞结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y代表通过双硫键附接至药物的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l是0或1；
m是一个由2至8的整数；以及
n是一个由1至24的整数。
在某些实施例中，m是由2至6的整数。
在某些实施例中，m是由3至5的整数。
同时，在某些实施例中，n是由2至8的整数。替代地，如同揭露于，举例来说，美国专利号6,441,163以及7,368,565，可首先将药物修饰以引入具反应的适合与细胞结合剂反应的反应性酯类。包含伴随细胞结合剂的活化的连接元基元的这些药物的反应提供另一生产细胞结合剂药物缀合物的方法。还可使用PEG链合基团将美登素衍生物连接至抗FOLR1抗体或片段，如同在美国专利号6,716,821中的例子所述。这些PEG非裂解连接基团可溶于水以及非水溶液溶剂中，并可用以连结一或更多细胞毒性剂至细胞结合剂。例子性的PEG连接基团包括异双功能性PEG连接元，其通过在一端为功能性巯基或双硫基团以及在另一端为活性酯类，而与位于连接元相反端的细胞毒性剂以及细胞结合剂反应。作为使用PEG连接基团的细胞毒素缀合物的合成的般例子，再次以美国专利号6,716,821当参考，其以全文并入本文以作为参考。合成以将带有反应性PEG基元的一或更多细胞毒性剂与细胞结合剂的反应开始，造成每个反应性PEG基元末端活性酯类被细胞结合剂的氨基酸残基的取代作用，以生成细胞毒素缀合物，其包含一或更多通过PEG连接基团以共价键结至细胞结合剂的细胞毒性剂。替代地，细胞结合可以双功能PEG交联剂而修饰，以引入反应性二硫化物基元(例如吡啶二硫化物)，其可再以包含硫醇的美登素衍生物处理，以提供缀合物。在另一方法中，细胞结合可以双功能PEG交联剂修饰以引入硫醇基元，其可再以包含反应性二硫化物的美登素衍生物(例如吡啶二硫化物)处理，以提供缀合物。
还可制备带有非可裂解连接的抗体-美登素衍生物缀合物。此类交联剂于本领域所描述(见ThermoScientificPierceCrosslinkingTechnicalHandbook以及美国专利申请公开号2005/0169933)并且包括但不限于，N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺基己酸)，其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC)、κ-马来酰亚胺基十一酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)、β-马来酰亚胺基丙酸N-琥珀酰亚胺酯(BMPS)、γ-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)、ε-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS),m-马来酰亚胺基芐酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、N-(α-马来酰亚胺基乙酰氧代)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)、琥珀酰亚胺-6-(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)、N-琥珀酰亚胺4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)以及N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)、N-琥珀酰亚胺-4-(碘乙酰基)-胺基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺溴乙酸酯(SBA)以及N-琥珀酰亚胺3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。在某些实施例中，将抗体以例如琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、磺酸基-SMCC、马来酰亚胺基芐酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)、磺酸基-MBS或琥珀酰亚胺-碘乙酸酯的交联剂修饰，如同文献中描述的，引入1-10个反应性基团(Yoshitakeetal,Eur.J.Biochem.,101:395-399(1979)；Hashidaetal,J.AppliedBiochem.,56-63(1984)；以及Liuetal,Biochem.,18:690-697(1979))。再将经修饰的抗体与包含硫醇的美登素衍生物反应以产生缀合物。缀合物可通过通过SephadexG25管柱的胶体过滤或通过透析或切流式过滤加以纯化。将经过修饰的抗体以包含硫醇的美登素衍生物(1至2摩尔当量/马来酰亚胺基基团)处理并且将抗体-美登素衍生物缀合物通过通过SephadexG-25管柱的胶体过滤、于陶瓷羟基磷灰石管柱的层析、透析或切流式过滤或其方法的结合而纯化。典型地，平均每抗体连接1-10个美登素衍生物。一个方法是以琥珀酰亚胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(SMCC)修饰抗体，以引入马来酰亚胺基基团，接着是将修饰的抗体与包含硫醇的美登素衍生物反应，以得到硫醚连接的缀合物。再一次地，每个抗体分子带有1-10个药物分子的缀合物生成。抗体、抗体片段、蛋白质荷尔蒙、蛋白质生长因子以及其它蛋白质的美登素衍生物缀合物皆以相同方式制作。
在本发明的另一方面，将FOLR1抗体(例如，huMov19、FR1-21、FR1-48、FR1-49、FR1-57或FR1-65)通过非裂解键结透过PEG间隔中间物而连接至药物。包含亲水性PEG链的合适的交联剂，其在药物与抗FOLR1抗体或片段之间形成连接元，还为本领域所熟知，或为商业上可取得的(举例来说由QuantaBiodesign,Powell,Ohio的例子)。包含PEG的合适的交联剂还可使用本领域的技术人员所知的标准合成化学技术，由商业上可得的PEG本身合成。药物可与通过详述于美国专利公开号20090274713以及于WO2009/0134976的方法，与包含双功能PEG的交联剂反应，以得到下列化学式的化合物，Z–Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–D，其可再与细胞结合剂反应以提供缀合物。替代地，细胞结合可以双功能PEG交联剂修饰，以引进硫醇反应性基团(例如，马来亚酰胺或卤乙酰胺)，硫醇反应性基团可再以包含硫醇的美登素衍生物处理以提供缀合物。在另一方法中，细胞结合可以双功能PEG交联剂修饰，以引进硫醇基元，硫醇基元可再以包含硫醇反应性的美登素衍生物处理(例如带有马来亚酰胺或卤乙酰胺的美登素衍生物)，以提供缀合物。
因此，本发明的另一方面为具有化学式(II)或化学式(II’)的抗FOLR1抗体药物缀合物：
A–[Xl–(–CH2–CH2–O–)n–Yp–C]m(II)
[C-Yp–(–CH2–CH2–O–)n–Xl]m-A(II’)
其中，A代表抗FOLR1抗体或片段；
C代表细胞毒素或药物；
X代表通过硫醚键、酰胺键、胺甲酸酯键或醚键而结合至细胞结合剂的脂肪族、芳香族或杂环单元；
Y代表通过选自以硫醚键、酰胺键、胺甲酸酯键、醚键、胺键、碳-碳键以及腙键所组成的群组的共价键结合至药物的脂肪族、芳香族或杂环单元；
l是0或1；
p是0或1；
m是由2至15的整数；以及
n是由1至2000的整数。
在某一实施例中，m是由2至8的整数；以及
n是由1至24的整数。
在某一实施例中，m是一个由2至6的整数。
在某一实施例中，m是一个由2至8的整数。
在某一实施例中，m是一个由3至5的整数。在某一实施例中，抗体是huMov19。在另一实施例中，抗体是FR-1-21。在另一实施例中，抗体是FR-1-48。在另一实施例中，抗体是FR-1-49。在另一实施例中，抗体是FR-1-57。在另一实施例中，抗体是FR-1-65。
包含PEG的合适连接元的例子包括具有N-琥珀酰亚胺酯或N-磺酸基琥珀酰亚胺酯基元的连接元，用于与抗FOLR1抗体或其抗体片段反应，以及包括以马来酰亚胺或以卤乙酰基为基础的基元，用于与化合物反应。PEG间隔可通过本文所描述的方法并入任何本领域所知的交联剂。
本文中所揭露的许多连接元详述于美国专利公开号20050169933与20090274713，以及于WO2009/0134976；其内容全部并入本文以作为参考。
本发明包括的方面，其中约2至约8药物分子(“药物含量”)，举例来说，美登素衍生物，连接至抗FOLR1抗体或其抗体片段，缀合物的抗肿瘤效果与连接至相同细胞结合剂的较少或较高数目药物含量的药物相较为更有效许多。“药物含量”，如同本文中所使用的，意指可附接至细胞结合剂(例如，抗FOLR1抗体或其抗体片段)的药物分子(例如，美登素衍生物)的数目。在一方面，可附接至细胞结合剂的药物分子的数目可平均从约2至约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)。在某些实施例中，药物是N2’-去乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素(DM1)或N2’-去乙酰-N2’-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)美登素(DM4)。因此，在某个实施例中，抗体huMov19为共轭至DM1或DM4。在另一实施例中，抗体FR-1-21为共轭至DM1或DM4。在另一实施例中，抗体FR-1-48为共轭至DM1或DM4。在另一实施例中，抗体FR-1-49为共轭至DM1或DM4。在另一实施例中，抗体FR-1-57为共轭至DM1或DM4。在另一实施例中，抗体FR-1-65为共轭至DM1或DM4。
因此，在一方面，免疫缀合物包含每抗体1个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体2个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体3个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体4个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体5个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体6个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体7个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体8个美登素衍生物。
在一方面，免疫缀合物包含每抗体大约1至大约8个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体大约2至大约7个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体大约2至大约6个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体大约2至大约5个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体大约3至大约5个美登素衍生物。在另一方面，免疫缀合物包含每抗体大约3至大约4个美登素衍生物。
在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约2至大约8(例如，1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1)个药物分子(例如，美登素衍生物)附接。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约1至大约8个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约2至大约7个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约2至大约6个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约2至大约5个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约3至大约5个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约3至大约4个药物分子(例如，美登素衍生物)。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约3.5至大约4个药物分子(例如，美登素衍生物)。
在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约2±0.5、大约2.5±0.5、大约3±0.5、大约3.5±0.5、大约4±0.5、大约4.5±0.5、大约5±0.5、大约5.5±0.5、大约6±0.5、大约6.5±0.5、大约7±0.5、大约7.5±0.5或大约8±0.5个药物分子(例如，美登素衍生物)附接。在一方面，包含免疫缀合物的组合物具有每抗体平均大约3.5±0.5个药物分子(例如，美登素衍生物)。
抗FOLR1抗体或其抗体片段可通过将双功能交联剂与抗FOLR1抗体或其抗体片段反应而加以修饰，从而造成连接元分子的共价附接至抗FOLR1抗体或其抗体片段。如同本文中所使用的，“双功能交联剂”为任何将细胞结合剂以共价连结至药物的化学基元，例如本文中所描述的药物。在另一方法中，链合基元的一部分由药物提供。在此方面，药物包含作为较大连接元分子的一部分的连接基元，较大连接子分子用以连接细胞结合剂至药物。举例来说，为生成美登素衍生物DM1，位于美登素的C-3羟基基团的侧链被修饰为具有自由的巯基基团(SH)。美登素的此硫醇化形式与经修饰的细胞结合剂反应以生成缀合物。因此，最终的连接元由两成分组合，其中一个由交联剂提供，而另一个由来自DM1的侧链提供。
还可将药物分子通过中间载体分子例如血清白蛋白连接至抗体分子。
如同本文中所使用的，“连接至细胞结合剂”或“连接至抗FOLR1抗体或片段”的表示意指包含至少一个药物衍生物，通过合适的链合基团或其先质而结合至细胞结合剂、抗FOLR1抗体或片段的缀合物分子。在某些实施例中，链合基团为SMCC。
在某些实施例中，本发明中有用的细胞毒性剂是美登素衍生物以及美登素衍生物类似物。合适的美登素衍生物的例子包括美登素醇的酯类以及美登素醇类似物。包括者为抑制微管生成以及对哺乳动物细胞为高度毒性的任何药物，如同为美登素醇以及美登素醇类似物。
合适的美登素醇酯类的例子包括那些具有经修饰的芳香环以及那些具有在其它位置的修饰作用者。此类合适的美登素衍生物揭露于美国专利号4,424,219；4,256,746；4,294,757；4,307,016；4,313,946；4,315,929；4,331,598；4,361,650；4,362,663；4,364,866；4,450,254；4,322,348；4,371,533；5,208,020；5,416,064；5,475,092；5,585,499；5,846,545；6,333,410；7,276,497以及7,473,796。
在某一实施例中，本发明的免疫缀合物利用包含硫醇的美登素衍生物(DM1)，正式名称为N2’-去乙酰-N2’-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素，作为细胞毒性剂。DM1以下列结构式(III)表示：
在另一实施例中，本发明的缀合物利用包含硫醇的美登素衍生物N2’-去乙酰-N2’(4-甲基-4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(例如，DM4)作为细胞毒性剂。DM4以下列结构式(IV)表示：
含有包含立体阻障硫醇键结的侧链的另一美登素衍生物为N2’-去乙酰-N-2’(4-巯基-1-氧代戊基)-美登素(称为DM3)，以下列结构式(V)表示：
于美国专利号5,208,020以及7,276,497中教导的每个美登素衍生物还可用于本发明的缀合物。在这方面，5,208,020以及7,276,697的完整揭露内容并入本文以作为参考。
在美登素衍生物上的许多位置可作为化学地连接链合基元的位置。举例来说，具有羟基基团的C-3位置、以羟甲基修饰的C-14位置、以羟基基团的C-15位置以及具有羟基基团的C-20位置都被预期是有用的。在某些实施例中，C-3位置被利用。在某些实施例中，美登素醇的C-3位置被利用。
某些缀合物的结构表示如下显示：
在某一实施例中，抗体是huMov19。在另一实施例中，抗体是FR1-21。
对于生产此类抗体-美登素衍生物缀合物的数个描述提供于美国专利号6,333,410、6,441,163、6,716,821以及7,368,565，其每个以全文方式并入本文。
一般而言，在缓冲溶液中的抗体溶液可与带反应性基团的具有双硫基元的摩尔数过量的美登素衍生物培养。反应混合物可通过加入过量胺类(例如乙醇胺、牛磺酸等)而平息。美登素-抗体缀合物可再通过胶体过滤而纯化。与每抗体分子结合的美登素衍生物分子的数目可通过分光光度计测量在252nm以及280nm的吸收率而测定。使用平均1-10个美登素衍生物分子/抗体分子，以及在某些实施例中还使用平均2-5个美登素衍生物分子/抗体分子。美登素衍生物分子/抗体的平均数目可以是，举例来说，大约1-10、2-5、3-4、3.5-4或3.5。在一方面，美登素衍生物分子/抗体的平均数目大约为3.5±0.5。在一方面，美登素衍生物分子/抗体的平均数目约为3.5-4。
带有美登素衍生物药物的抗体缀合物被评估其在体外抑制各种有害的细胞株增生的能力。举例来说，例如人类KB细胞株的细胞株可容易地用于这些化合物的细胞毒性评估。待评估的细胞可暴露于化合物4至5天，并且通过已知的方法于直接的试验中测量细胞存活率。可再从试验的结果计算IC50数值。
例如，于美国专利申请公开号2010/0203007描述的苯二氮平化合物(例如，吲哚啉基苯二氮平或恶唑烷基苯二氮平)，其衍生物、其中间产物，还可能用以制备抗FOLR1抗体片段或缀合物。
有用的苯二氮平包括化学式(XIV)、(XV)以及(XVI)的化合物，其中二聚体化合物任选地带有允许连接至细胞结合剂的链合基团。
其中N与C之间的双线代表单键或双键，规定当其为双键时X不存在并且Y为H，以及当其为单键时，X为H或为将化合物转变为前体药物的胺类保护基团；
Y选自-OR、以–OCOR’表示的酯类、以–OCOOR’表示的碳酸盐、以–OCONR’R”表示的胺甲酸酯、以NR’R”表示的胺类或羟基胺、以–NRCOR’表示的酰胺、以NRCOP表示的肽，其中P是氨基酸或包含2至20个氨基酸单元之间的多肽、以SR’表示的硫醚、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、以-SO3表示的亚硫酸盐、以-OSO3表示的亚硫酸氢盐、卤素、氰基、叠氮或硫醇，其中R、R’以及R”为相同或不同，并且选自H、具有从1至10个碳原子的被取代或未被取代的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数、具有从6至10个碳原子的芳基、具有从3至10个碳原子的杂环，其中取代基选自卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、亚硫酸氢盐-OSO3、以SO2NRR’表示的磺化胺、氰基、叠氮、-COR11、OCOR11或OCONR11R12，其中R7、R8、R9、R10、R11以及R12的定义如同上述所提供，任选地R”为OH；
W是C＝O、C＝S、CH2、BH、SO或SO2；
每个R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’独立地选自氢、具有从1至10个碳原子的被取代或未被取代的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数，或取代基选自卤素、胍[-NH(C＝NH)NH2]、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、亚硫酸氢盐-OSO3、以SO2NRR’表示的磺胺、氰基、叠氮、-COR11、OCOR11或OCONR11R12，其中每个R7、R8、R9、R10、R11以及R12独立地选自H、具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数、具有从6至10个碳原子的芳基、具有从3至10个碳原子的杂环，任选地R10是SR13或COR13，其中R13选自具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数、具有从6至10个碳原子的芳基、具有从3至10个碳原子的杂环，任选地R11是OR14，其中R14具有与R相同的定义，任选地，R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’或R4’的任何一个是能通过共价键连接至细胞结合剂的链合基团或选自任选地带有能连接至细胞结合剂的链合基团的聚吡咯基、聚吲哚基、聚咪唑基、聚吡咯-咪唑基、聚吡咯-吲哚基或聚咪唑-吲哚基单元；
Z选自(CH2)n，其中n是1、2或3，CR15R16、NR17、O或S，其中每个R15、R16以及R17是独立地选自H、具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状的烷基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数；
R6是OR、SR或NRR’，其中R与R’具有与上述所提供者相同的定义；
X’选自CH2、NR、CO、BH、SO或SO2，其中R具有与上述所提供者相同的定义；
Y’是O、CH2、NR或S，其中R具有与上述所提供者相同的定义；
Z’是CH2或(CH2)n，其中n是2、3或4，规定X’、Y’以及Z’不全部同时为CH2；
A与A’为相同或不同并且选自O、-CRR’O、S、-CRR’S、-NR15或CRR’NHR15，其中R与R’具有与上述所提供者相同的定义；以及其中R15具有与上述对R所提供的相同的定义；
D与D’为相同或不同并且独立地选自具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、任选地被卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、亚硫酸氢盐-OSO3、以SO2NRR’表示的磺酰胺、氰基、叠氮、-COR11、OCOR11或OCONR11R12中的任何一个取代，其中R7、R8、R9、R10、R11以及R12的定义如上所提供，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数；
L是具有从3至10个任选地被取代的碳原子的随选的苯基基团或杂环，其中取代基为通过共价键使能连接至细胞结合剂的链合基团，或选自具有从1至10个碳原子的线性、分支或环状烷基、烯基或炔基，任选地被卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、亚硫酸氢盐-OSO3、以SO2NRR’表示的磺胺、氰基、叠氮、-COR11、OCOR11或OCONR11R12中的任何一个取代，其中R7、R8、R9、R10、R11以及R12的定义如上所提供，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数；任选地，L本身是通过共价键使能连接至细胞结合剂的链合基团；或这些化合物其药学上可接受的溶剂、盐类、水合物或水合盐类、它们的光学异构物、消旋物、非镜像异构物、镜像异构物或多形性晶体结构；规定化合物具有不超过一个通过共价键使能连接至细胞结合剂的链合基团。
在一方面，N与C之间的双线代表单键或双键，规定当其为双键时，X不存在并且Y为H，以及当其为单键时，X为H或为将化合物转变为前体药物的胺类保护基团；
Y选自-OR、NR’R”、亚硫酸盐-SO3或亚硫酸氢盐-OSO3，其中R选自H、具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数、具有从6至10个碳原子的芳基、具有从3至10个碳原子的杂环；
W是C＝O、CH2或SO2；
每个R1、R2、R3、R4、R1’、R2’、R3’以及R4’独立地选自H、NO2或通过共价键使能连接至细胞结合剂的链合基团；
R6是OR18，其中R18具有与R相同的定义；
Z选自(CH2)n，其中n是1、2或3，CR15R16、NR17、O或S，其中每个R15、R16以及R17独立地选自H、具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数；
X’选自CH2或C＝O；
Y’是O、NR或S，其中R如同上述所定义；
Z’是CH2或(CH2)2；
A与A’每个为O；
D与D’为相同或不同并且独立地选自具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基；
L是随选性的苯基基团或具有从3至10个任选地被取代的碳原子的杂环，其中取代基为通过共价键使能连接至细胞结合剂的链合基团，或选自具有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基、任选地被卤素、OR7、NR8R9、NO2、NRCOR’、SR10、以SOR’表示的亚砜、以-SO2R’表示的砜、亚硫酸盐-SO3、亚硫酸氢盐-OSO3、以SO2NRR’表示的磺胺、氰基、叠氮、-COR11、OCOR11或OCONR11R12中的任何一个取代，聚乙二醇单元(-OCH2CH2)n，其中n是从1至2000的整数；任选地，L本身是通过共价键使能连结至细胞结合剂的链合基团；或这些化合物其药学上可接受的溶剂、盐类、水合物或水合盐类、它们的光学异构物、消旋物、非镜像异构物、镜像异构物或多形性晶体结构。
在另一方面，化合物以化学式(XVII)表示：
其中N与C之间的双线代表单键或双键，规定当其为双键时，X不存在并且Y为H，以及当其为单键时，X为H或为将化合物转变为前体药物的胺类保护基团，以及Y选自OH、以-OR表示的醚、亚硫酸盐-SO3或亚硫酸氢盐-OSO3，其中R选自带有从1至10个碳原子的直线、分支或环状烷基、烯基或炔基，
R2、R3的其中是使能通过共价键连接至细胞结合剂的链合基团以及另一是H，
L’、L”或L”’的其中是使能连接至细胞结合剂的链合基团，而其它的为H；L’可以是链合基团而G是CH或N。其它例子描述于美国专利申请号61/150,201，将其以全文的方式并入本文以供参考。因此，在某一实施例中，抗体huMov19共轭至具有以上述XIX-XXII所显示结构的苯二氮平。在另一实施例中，抗体FR-1-21共轭至具有以上述XIX-XXII所显示结构的苯二氮平。
IV.多核苷酸
在某些实施例中，本发明包括多核苷酸，其含有编码特异性地结合人类FOLR1受体的多肽或此类多肽的片段的多核苷酸。举例来说，本发明提供包含编码对人类FOLR1的抗体或编码此类抗体片段的核酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以为RNA的形式或以DNA的形式。DNA包括cDNA、基因组DNA以及合成的DNA；并且可以是双股或单股的，以及若单股的可为编码股或非编码(反义)股。
在某些实施例中，多核苷酸被分离。在某些实施例中，多核苷酸实质上是纯的。
本发明提供多核苷酸，其包含编码含有选自由SEQIDNO:4、10、11、41、42以及88-103所组成群组的序列的多肽的多核苷酸。还提供编码具有对SEQIDNO:4、10、11、41、42以及88-103至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的多肽的多核苷酸。
多核苷酸SEQIDNO:5、14以及15分别包含对huMov19变异区重链、变异区轻链版本1.00以及变异区轻链版本1.60的编码序列。
本发明进一步提供包含选自由SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127所组成的群组的序列的多核苷酸。还提供的是具有对SEQIDNO:5、14、15、37、38、43、44、47、48以及120-127至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％序列一致性的多核苷酸。因此，在某些实施例中，多核苷酸包含(a)具有对SEQIDNO:5至少约95％序列一致性的多核苷酸，和/或(b)具有对SEQIDNO:14或15至少约95％序列一致性的多核苷酸。在某些实施例中，多核苷酸包含(a)具有SEQIDNO:5的氨基酸序列的多核苷酸；和/或(b)具有SEQIDNO:14或SEQIDNO:15的氨基酸序列的多核苷酸。
在某些实施例中，多核苷酸包含作为成熟多肽的编码序列，其以相同阅读框架融合至多核苷酸，举例来说，该多核苷酸协助来自宿主细胞的多肽的表现以及分泌(例如当作用于控制来自细胞的多肽运输的分泌序列的领导序列)。具有领导序列的多肽是蛋白质前体(preprotein)并且可具有通过宿主细胞切断的领导序列以生成多肽的成熟形式。多核苷酸还可编码前蛋白(proprotein)，其为成熟蛋白质加上额外的5'氨基酸残基。具有前序列的成熟蛋白质为前蛋白并且是蛋白质的不活化形式。一旦前序列被切断，则留下具活性的成熟蛋白质。
在某些实施例中，多核苷酸包含作为成熟多肽的编码序列，其以相同读框融合至标记序列，举例来说，该标记序列允许所编码多肽的纯化。举例来说，在细菌宿主的例子中，标记序列可以是由pQE-9载体所提供的(组氨酸)6标签，以提供用于融合至标记的成熟多肽的纯化，或当使用哺乳动物的宿主(例如COS-7细胞)时，标记序列可以是衍生自流行性感冒血球凝集素蛋白质的血球凝集素(HA)标签。
本发明进一步关于上文所述的编码多核苷酸的变异物，举例来说，片段、类似物以及衍生物。
多核苷酸变异物可包含在编码区、非编码区或两者的替代。在一些实施例中，多核苷酸变异物包含产生沉默性取代、加入或删除的替代，但不改变所编码多肽的特性或活性。在一些实施例中，由于遗传密码变性，核苷酸变异物是沉默取代而产生。多核苷酸变异物可因许多理由而产生，例如，为优化对特定宿主的密码子表现(在人类mRNA改变密码子成为那些细菌宿主例如E.coli所偏好者)。
在本文中所描述的包含多核苷酸的载体以及细胞还被提供。
V.使用方法以及药物组合物
本发明的FOLR1结合剂(包括抗体、免疫缀合物以及多肽)在各种应用中是有用的，其包括但不限于，治疗性的治疗方法，例如癌症治疗。在某些实施例中，试剂对于抑制肿瘤生长、诱导分化、降低肿瘤体积和/或降低肿瘤的致癌性是有用的。使用方法可能是在体外、生物体外或体内的方法。在某些具体实施例中，FOLR1结合剂或抗体或免疫缀合物或多肽为人类FOLR1对其结合者的拮抗剂。
在一方面，本发明的抗FOLR1抗体以及免疫缀合物在检测生物性样本中的FOLR1的存在是有用的。该用语“检测”如同本文中所使用地包括定性的或定量的检测。在某些实施例中，生物性样本包含细胞或组织。在某些实施例中，此类组织包括正常和/或以相对于其它组织较高程度的表现FOLR1的癌组织。在某些实施例中，FOLR1过量表现检测卵巢癌、肺癌、脑癌、乳癌、子宫癌、肾癌或胰腺癌的出现。
在一方面，本发明提供在生物性样本中检测FOLR1的出现的方法。在某些实施例中，方法包含将生物样本与抗FOLR1抗体在允许抗FOLR1抗体结合至FOLR1的条件下接触，并且检测抗FOLR1抗体与FOLR1之间是否生成复合物。
在一方面，本发明提供诊断与FOLR1表现增加相关的失调的方法。在某些实施例中，方法包含将测试细胞与抗FOLR1抗体接触；通过检测抗FOLR1抗体对FOLR1的结合而测定测试细胞的FOLR1的表现量(定量地或定性地)；以及将测试细胞的FOLR1的表现量与由控制组细胞的FOLR1的表现量比较(例如，与测试细胞相同组织来源的正常细胞或表现FOLR1的量与正常细胞相当的细胞)，其中由测试细胞FOLR1的表现量相较于控制组细胞更高表示与FOLR1增加表现相关的失调的存在。在某些实施例中，测试细胞是由怀疑带有与FOLR1增加表现相关的失调的个体而获得。在某些实施例中，失调为细胞增生失调，例如癌症或肿瘤。
在某些具体实施例中，诊断或检测的方法，例如以上所描述的那些，包含检测抗FOLR1抗体对表现于细胞表面上的FOLR1的结合，或者由细胞表面上表现FOLR1的细胞而获得的膜制备。在某些实施例中，方法包含将细胞与抗FOLR1抗体在容许抗FOLR1抗体结合至FOLR1的条件下接触，并检测抗FOLR1抗体与细胞表面上的FOLR1间是否生成复合物。用于检测抗FOLR1抗体结合至表现于细胞表面上的FOLR1的结合的例子性试验为“FACS”试验。
某些其它方法可被用以检测抗FOLR1抗体结合至FOLR1。此类方法包括但不限于，本领域所熟知的抗原结合试验，例如西方墨点法、放射性免疫分析、ELISA(酵素连结免疫吸附分析法)、“三明治”免疫分析、免疫沉淀分析、荧光免疫分析、蛋白质A免疫分析以及免疫组织化学法(IHC)。
在某些实施例中，抗-FOLR1抗体被标记。标记包括但不限于，直接检测的标记或基元(例如荧光、发色、电子密度、化学发光以及放射性标记)以及例如酵素或配位基之间接检测的基元，例如，通过酵素反应或分子交互作用。
在某些实施例中，抗FOLR1抗体固定化于不溶性的基质。固定化必需将抗FOLR1抗体从在溶液中剩余的游离FOLR1中分离。传统地此是通过在分析试验步骤前使抗FOLR1抗体不溶，例如通过吸附至不溶于水的基质或表面(Bennichetal.,美国专利号3,720,760)或者通过共价耦合(举例来说，使用戊二醛交联)或者通过在抗FOLR1抗体以及FOLR1间的复合物生成后使抗FOLR1抗体不溶，例如，通过免疫沉淀而达成。
任何上述实施例的诊断或检测可使用本发明的免疫缀合物取代或加上抗FOLR1抗体而完成。
在某些实施例中，以FOLR1结合剂或拮抗剂(例如huMov19抗体或免疫缀合物)所治疗的疾病为癌症。在某些实施例中，癌症是以表现被FOLR1结合剂(例如，抗体)结合的叶酸受体1的肿瘤为特征。
本发明提供治疗癌症的方法，其包含以在治疗上有效量的FOLR1结合剂施用对象的方法(例如，需要治疗的对象)。在某些实施例中，癌症为选自以直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、脑癌、肾脏癌、***癌、胃肠癌、黑色素癌、子***、膀胱癌、神经胶母细胞瘤以及头颈癌所组成的群组的癌症。在某些实施例中，癌症是卵巢癌。在某些实施例中，癌症是肺癌。在某些实施例中，对象是人类。
本发明进一步提供使用本文中所描述的抗体或其它试剂作为抑制肿瘤生长的方法。在某些实施例中，抑制肿瘤生长的方法包含在体外将细胞与FOLR1结合剂(例如，抗体)接触。举例来说，将表现FOLR1的不死细胞株或癌细胞株培养于加入抗体或其它试剂的培养基中，以抑制肿瘤生长。在一些实施例中，将肿瘤细胞从患者样本中分离例如，举例来说，组织生物检体、肋膜积水或血液样本并且培养于加入FOLR1结合剂的培养基，以抑制肿瘤生长。
在一些实施例中，抑制肿瘤生长的方法包含在体内将肿瘤或肿瘤细胞与FOLR1结合剂(例如，抗体)接触。在具体实施例中，将肿瘤或肿瘤细胞与FOLR1结合剂接触是于动物模式中进行。举例来说，FOLR1结合剂可被施用表现一或更多FOLR1的异体移植物，其成长于免疫不全的小鼠(例如NOD/SCID小鼠)以抑制肿瘤生长。在一些实施例中，癌症干细胞是由患者样本中分离例如，举例来说，组织生物检体、肋膜积水或血清样本，并且注射至免疫受损的小鼠中然后施用FOLR1结合剂以抑制肿瘤细胞生长。在一些实施例中，于引入致癌性细胞进入动物后，将FOLR1结合剂同时或短暂地施用以防止肿瘤生长。在一些实施例中，在致癌性细胞生成至特定尺寸后，将FOLR1结合剂施用为治疗。
在某些实施例中，抑制肿瘤生长的方法包含以治疗上有效量的FOLR1结合剂施用对象。在某些实施例中，对象为人类。在某些实施例中，对象有肿瘤或已有被切除的肿瘤。
在某些实施例中，肿瘤表现FOLR1结合剂或抗体结合的叶酸受体。在某些实施例中，肿瘤过度表现人类FOLR1。
在某些实施例中，肿瘤选自以脑癌、直肠癌、胰腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、乳癌、肾脏癌、***癌、胃肠癌、黑色素癌、子***、膀胱癌、神经胶母细胞瘤以及头颈癌所组成的群组的肿瘤。在某些实施例中，肿瘤是卵巢癌。
此外，本发明提供降低在一对象中的肿瘤致癌性的方法，其包含将治疗上有效量的FOLR1结合剂施用对象。在某些实施例中，肿瘤包含癌症干细胞。在某些实施例中，在肿瘤中癌症干细胞的频率通过施用试剂而降低。
因此，在某些实施例中，本发明提供使用huMov19抗体以及免疫缀合物治疗癌症的方法。在某些实施例中，huMov19免疫缀合物是huMov19-SPDB-DM4、huMov19-磺酸基-SPP-DM1、huMov19-SPP-DM1或huMov19-PEG4-Mal-DM4。
本发明进一步提供将致癌性细胞分化为非致癌性细胞的方法，其包含将致癌性细胞与FOLR1结合剂接触(举例来说，通过将FOLR1结合剂施用具有含致癌性细胞或已有移除此类肿瘤的对象)。在某些实施例中，致癌性细胞为卵巢肿瘤细胞。
本发明进一步提供降低在固态肿瘤基质中的肌纤维母细胞活化的方法，其包含将基质与有效量的FOLR1结合剂、多肽或抗体接触。
本发明进一步提供含有一或更多本文中所描述的FOLR1结合剂的药物组合物。在某些实施例中，药物组合物进一步包含药学上可接受的载具。发现这些药物组合物于人类患者中抑制肿瘤生长以及治疗癌症的用途。
在某些实施例中，通过结合本发明的纯化的抗体或试剂与药学上可接受的载具(例如载体、赋形剂)以制备作为储存与使用的配方(Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEditionMackPublishing,2000)。合适的药学上可接受的载具包括但不限于，非毒性缓冲液例如磷酸、柠檬酸以及其它有机酸；盐类例如氯化钠；抗氧化剂包括抗坏血酸以及甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基芐基氯化铵；六羟季铵氯化物；氯化苯二甲烃铵；氯化苯铵；酚、丁基或芐基醇；烷基苯甲酸酯，例如甲基或丙基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇以及间甲酚)；低分子量多肽(例如少于约10个氨基酸残基)；蛋白质例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物例如聚乙烯吡咯啶；氨基酸例如甘氨酸、谷酰氨酸、天冬酰氨酸、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；碳水化合物例如单醣、双醣、葡萄糖、甘露糖或糊精；螫合剂例如EDTA；糖例如蔗糖、甘露醇、菌藻糖或山梨糖醇；盐类生成反离子例如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；以及非离子界面活性剂例如TWEEN或聚乙二醇(PEG)。
本发明的药物组合物可以任何数目的方法作为局部或全身治疗而施用。施用可以为局部的(例如至黏膜包括***与直肠投递)例如皮肤贴片、软膏、涂剂、膏状物、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾、液体和粉末；肺的(例如，通过粉末或喷雾剂的吸入或吹气，包括通过雾化器；气管的、鼻腔的、表皮的以及经皮的)；口服的或非口服的包括静脉内、动脉内、皮下、腹膜内或肌肉内注射或注入；或颅内(例如，鞘内或脑室内)施用。
本发明的抗体或免疫缀合物可伴随具有抗癌特性的第二化合物以药学组合配方而结合，或以剂量疗法作为结合疗法。药学组合配方的第二化合物或剂量疗法优选地具有对结合的ADC的互补活性使得它们不会敌对地影响彼此。包含FOLR1结合剂与第二抗癌试剂的药物组合物还被提供。
作为疾病的治疗，本发明的抗体或试剂的合适剂量依欲治疗的疾病类型、严重程度以及疾病进程、疾病的回应性而定，不论抗体或试剂是为治疗或预防的目的而施用、先前的疗法、患者的临床历史等皆在治疗师的考虑内。抗体或试剂可施用一次或通过一连串的治疗从持续数天至数月，或直到产生治愈或达成疾病状态的减弱(例如降低肿瘤大小)。优化的剂量时程表可由在患者体内药物累积的测量而计算并且将依个别抗体或试剂的相对强度而变化。施用的医师可容易地决定理想剂量、给剂方法以及重复率。在某些实施例中，剂量是由每公斤体重0.01μg至100mg，并且可每天、每周、每月或每年一或更多次给予。在某些实施例中，每两周一次或每三周一次给予抗体或其它FOLR1结合剂。在某些实施例中，抗体或其它FOLR1结合剂的药剂量是由每公斤体重约0.1mg至约20mg。治疗师可基于药物在体液或组织中的测量停留时间以及浓度评估给剂重复率。
组合疗法可提供“协同”以及证明为“协同的”，即当一起使用活性成分时达到的功效大于分别地使用化合物引起的效果总和。当活性成分为：(1)共同配制与施用或者同时地以结合的、单位剂量配方而施用；(2)通过轮流或平行为个别的配方；或(3)通过一些其它的疗法时，可达到协同效果。当以交替疗法施用时，当化合物是施用或连续地投递时可达到协同效果，例如通过在个别的注射器的不同的注射。一般而言，在交替疗法期间，每个活性成分的有效剂量是被连续地施用，即连续地，而在结合疗法中，二或更多活性成分的有效剂量被一起施用。
VI.包含FOLR1结合剂的试剂盒
本发明提供包含描述于本文的抗体、免疫缀合物或其它试剂的试剂盒，并且试剂盒可用以完成描述于本文的方法。在某些实施例中，试剂盒包含于一或更多的容器中至少一种对人类叶酸受体1的纯化抗体。在一些实施例中，试剂盒包含必要的和/或足以完成检测试验的所有成分，包括所有控制组、完成试验的说明以及用于分析与结果呈现的任何必要软件。本领域的技术人员将容易地认识本发明所揭露的抗体、免疫缀合物或其它试剂可轻易地并入本领域所熟知已建立的试剂盒模式其中的。
进一步提供的是包含FOLR1结合剂(例如，FOLR1结合抗体)以及第二抗癌试剂的试剂盒。在某些实施例中，第二抗癌试剂为化疗试剂(例如，吉西他滨或伊立替康)。
本揭露内容的实施例可进一步由参考下列非限制性的例子而定义，其详述本揭露内容的特定抗体的制备以及使用本揭露内容的抗体的方法。许多对材料与方法两者的修改可在不悖离本揭露内容的范围下而实施对本领域的技术人员是显而易见的。
例子
可被了解的是描述于本文的例子以及实施例仅为说明性的目的，且因其各种修改或改变将由本领域的技术人员提议并包括于此申请案的精神与范围的内。
例子1
鼠类单株抗体Mov19的嵌合作用
对于Mov19的变异区氨基酸序列是由NCBI数据库获得(轻链(SEQIDNO:24)的登录号CAA68253以及重链(SEQIDNO:23)的登录号CAA68252)且然后通过BlueHeronBiotechnology将密码子优化以及合成。轻链变异区被选殖入pAbKZeo质粒的EcoRI与BsiWI切位，并且重链变异区被选殖入pAbG1Neo质粒HindIII的与Apa1切位。
例子2
鼠类单株抗体Mov19以及FR1-21的人源化
将Mov19抗体按照前述的骨架表面重塑方法加以人源化(RoguskaM.et.al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994Feb；91:969-973以及Roguskaetal.,ProteinEng.9(10):895-904(1996))。简言的，使用来自PDB库料库中紧密相关的溶解的抗体结构计算对于每个变异区骨架残基的平均溶剂的可亲性，并且将带有超过30％平均可亲性的位置标示为表面残基(PedersenJ.T.et.Al,J.Mol.Biol.1994；235:959-973)。通过比对Kabat数据库中鼠类抗体序列的表面位置与人类抗体种是序列的相对应位置而选出人类表面取代序列(Johnson,G.andWu,T.T.(2001)NucleicAcidsResearch,29:205-206)。选出最同源的人类轻链变异区表面(选殖株DPK19，对于Mov19IMGT的位置IGKV2D-30*01以及对于FR1-21IMGT的位置IGKV1/OR2-0*01)以及最同源的人类重链变异区表面(选殖株8M27，对于Mov19IMGT的位置IGHV1-69*08以及对于FR1-21IMGT的位置IGHV5-51*02)以取代鼠类Mov19骨架表面位置，留下未替代的6CDR(表格1)。鼠类与人类Mov19以及FR1-21表面位置以及残基提出于第1A-D图。
没有残基改变会引起影响Mov19或FR1-21CDR与它们在叶酸受体1上的标的抗体决定基的交互作用的关注，所以对于任一抗体的人源化序列没有表面回复突变的考虑。然而表面重塑的Mov19序列确实引入于轻链N74上一致的N端连结醣化位置(轻链版本1.00)，所以制出第二个人源化轻链版本以移除此位置。一篇Kabat人类轻链序列数据库的回顾显示出苏氨酸是发现于轻链位置74的最普遍残基，因此以位于位置74的苏氨酸建立人源化Mov19轻链版本1.60。位置74不是表面残基，所以此残基取代作用对通过表面重塑的人源化不具有影响。鼠类以及人源化的Mov19以及FR1-21的变异区序列的比对提出于第2图。
将人源化的Mov19以及FR1-21的变异区序列通过BlueHeronBiotechnology密码子优化并合成。序列相邻于限制酶切位，以促进单链哺乳动物表现质粒中的各自的恒定序列同一读框(in-frame)的选殖。将轻链变异区选殖至pAbKZeo质粒的EcoRI与BsiWI切位。编码huMov19轻链的生成质粒DNAs被保藏于ATCC成为ATCC保藏编号PTA-10773与PTA-10774，并且编码huFR1-21轻链的生成质粒DNA被保藏为ATCC保藏编号PTA-10776。重链变异区被选殖至pAbG1Neo质粒的HindIII与Apa1切位。编码huMov19重链的生成质粒DNA被保藏于ATCC成为ATCC保藏编号PTA-10772，并且编码huFR1-21重链的生成质粒DNA被保藏为ATCC保藏编号PTA-10775。再将这些质粒如同例子3中所述转染以产生huMov19。编码任何一个huMov19轻链的质粒(即，其保藏为ATCC保藏编号PTA-10773或PTA-10774)可与编码huMov19重链的质粒配对，根据本文所提供并且为本领域具一般技艺的技术人员熟知的方法创造huMov19抗体。
例子3
重组抗体表现
嵌合的以及人源化抗体构建物在旋转角瓶中使用标准磷酸钙程序于贴附性的HEK-293T细胞(BDBiosciences,CalPhosMammalianTransfectionKit,Cat#631312)或使用修饰的PEI程序的适悬浮性HEK-293T细胞[DurocherY,PerretS,KamenAHigh-levelandhigh-throughputrecombinantproteinproductionbytransienttransfectionofsuspension-growinghuman293-EBNA1cells.NucleicAcidsRes.2002Jan15；30(2):E9]暂时性地生产。除了将HEK-293T细胞生长于Freestyle293(Invitrogen)中并且在加入PEI-DNA复合物后使培养体积为未稀释的，将PEI暂时性转染如同先前所述而完成(Durocher,Y.etal.,NucleicAcidsRes.30(2):E9(2002))。将贴附性与悬浮性暂时转染物两者皆培养一星期，然后将澄清的上清液通过如同下述的CM管柱离子交换层析法的蛋白质A管柱纯化。如同第3图所显示的，在转染细胞中huMov19的表现比嵌合Mov19的表现至少高10倍。
例子4
抗体纯化
使用标准方法将抗体由澄清的细胞培养上清液中纯化，例如，举例来说蛋白质A或G层析法(HiTrapProteinAorGHP,1mL,AmershamBiosciences)。简言的，通过加入1/10体积的1MTris/HCl缓冲液,pH8.0而制备供层析法的上清液。将经调整pH的上清液通过0.22μm滤膜过滤并且装入以结合缓冲液(PBS,pH7.3)平衡的管柱。以结合缓冲液清洗管柱直到获得在280nm无吸光度的稳定基线。以包含0.15MNaCl,pH2.8的0.1M醋酸缓冲液冲提抗体，使用流速0.5mL/min。收集约0.25mL的馏分并且通过加入1/10体积的1MTris/HCl,pH8.0加以中和。将波峰馏分对1xPBS隔夜透析两次并且通过过滤通过0.2μm滤膜加以灭菌。以A280的吸光度定量纯化的抗体。
使用离子交换层析法(IEX)及羧甲基(CM)层析法而将蛋白质A纯化的馏分进一步纯化。简言的，将来自蛋白质A纯化的样本交换缓冲液至起始缓冲液(10mM磷酸钾、10mM氯化钠，pH7.5)中并且过滤通过0.22μm过滤器。再将所制备的样本装入于流速120cm/hr、以起始缓冲液平衡的CM快速流动树脂(GElifesciences)。选择管柱尺寸以具有足够能力以结合样本中的所有抗体。再以结合缓冲液清洗管柱直到获得在280nm无吸光度的稳定基线。将抗体通过起始在20倍管柱体积(CV)中由10mM至500mM的梯度的氯化钠加以冲提。收集主波峰的UV读取高于50mAu的馏分。使用AgilentHPLC1100***(Agilent,SantaClara,CA)以在TSK胶体G3000SWXL,7.8×300mm伴随SWXL保护管，6.0×40mm(TosohBioscience,Montgomeryville,PA)的尺寸排阻层析法(SEC)评估纯度(单体以及可溶性高分子量聚集物的百分率)。集合带有所希望的纯度(>95％)的馏分，使用TFF***交换缓冲液至PBS(pH7.4)，并且通过过滤通过0.2μm滤膜消毒。将纯化的抗体进一步通过SEC测试其纯度，并且使用消光系数1.47、通过在280nm的吸光度测量以测定IgG浓度。如有必要则做稀释。替代地，可使用陶瓷羟基磷灰石(CHT)以精炼具有改善的选择性的鼠类与人源化抗体两者。具有40μm颗粒大小的第II型CHT树脂(Bio-RadLaboratories)被使用以与IEX层析相似的计划书以精炼抗体。用于CHT的起始缓冲液为20mM磷酸钠，pH7.0，并且将抗体通过在20个CV的20-160mM梯度的磷酸钠冲提。
例子5
鼠类抗FOLR1抗体的培育
有两个不同的免疫接种/筛选系列。第一系列导致FR1-21选殖株的产生，第二系列造成FR1-48、FR1-49、FR1-57以及FR1-65选殖株的产生。在第一系列中将小鼠以约5x106表现FOLR1的KB细胞由皮下免疫接种(美国菌种中心，ATCCCCL-17)。在第二系列中于它们的表面表现人类FOLR1的300-19细胞被用来免疫接种小鼠。为制造这些细胞，由NCBI网站(登录号NP_057937)获得人类FOLR1氨基酸序列，再将其密码子优化并由BlueHeronbiotechnologies合成，与EcoRI以及Xba1限制酶切位相邻，以帮助选殖至pSRa哺乳动物表现质粒。将300-19细胞，一种源自Balb/c小鼠的B前细胞株(Rethetal.,Nature,317:353-355(1985))，以pSRa-FolR1表现质粒转染以在细胞表面稳定地表现大量的人类FOLR1。将为技术人员所知的标准免疫接种计划书，举例来说，像是那些使用于ImmunoGen,Inc者应用于两系列。在牺牲前三天将免疫接种小鼠追加抗原以生成融合瘤。根据标准动物计划书收集来自小鼠的脾脏，像是举例来说在两片无菌、冻干的显微镜玻片间研磨组织，以获得在RPMI-1640培养液中的单一细胞悬浮液。将脾脏细胞离心、沉淀、清洗并与鼠类骨髓瘤融合，像是举例来说使用聚乙二醇-1500(Roche783641)的P3X63Ag8.653细胞(Kearneyetal.,J.Immunol.,123:1548-1550(1979))。将融合的细胞悬浮于包含次黄嘌呤-胺基蝶呤-胸苷(HAT)(SigmaH-0262)的RPMI-1640筛选培养基并以生长于37℃、5％CO2的96孔平底培养盘(Corning-Costar3596，每孔0.2ml细胞悬浮液)进行筛选。在5天的培养后，将0.1ml培养悬浮液自每孔中移出并以包含次黄嘌呤-胸苷(HT)补充剂(SigmaH-0137)的0.1ml的RPMI-1640培养液取代。继续培养于37℃及5％CO2直到融合瘤选殖株准备好进行抗体筛选。还可使用其它免疫接种以及融合瘤生产的技术，包括那些描述于Langoneetal.(Eds.,“ImmunochemicalTechniques,PartI”,MethodsinEnzymology,AcademicPress,volume121,Florida)以及Harlowetal.(“Antibodies:ALaboratoryManual”；ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork(1988))。
例子6
融合瘤的筛选与选择
分别于第一以及第二系列筛选使用以人类FOLR1以及KB细胞转染的FOLR1-300-19细胞。将来自融合瘤的培养上清液通过流式细胞计数法筛选小鼠单株抗体的分泌，其结合至FOLR1阳性细胞，例如表现FOLR1的300-19细胞或KB细胞，但不结合至FOLR1阴性细胞，例如未转染的300-19细胞。将0.1ml的融合瘤上清液与FOLR1阳性细胞或未转染的300-19细胞(每样本1x105细胞)的任一者于0.1ml的FACS缓冲液(添加2％正常羊血清的RPMI-1640培养液)培养3小时。接着，将细胞离心、沉淀、清洗并与0.1ml的PE-共轭羊抗小鼠IgG抗体培养1小时(像是例如由JacksonLaboratory获得的，在FACS缓冲液中6μg/mL)。将细胞离心、再沉淀、以FACS缓冲液清洗并悬浮于包含1％甲醛的0.2mlPBS。使用FACSCalibur流式细胞仪伴随HTS多孔采样器或FACS数组流式细胞仪以测量细胞相关的荧光并且使用CellQuestPro分析(皆来自BDBiosciences,SanDiego,US)。将阳性融合瘤选殖株通过限制稀释而次选殖。选择来自每个融合瘤的一个选殖株，其通过流式细胞计数法对FOLR1显示与亲代细胞相同的反应，以作为后续分析。培养稳定的次选殖株并使用市售同型试剂(Roche1493027)识别每个分泌的抗FOLR1抗体的同型。鼠类抗体以如同上述的澄清融合瘤培养液中以蛋白质A纯化。这些抗体被称为FR-1抗体。
例子7
鼠类单株抗体纯化
使用标准方法，例如，举例来说蛋白质A或G层析法(HiTrap蛋白质A或GHP，1mL，AmershamBiosciences)由融合瘤次选殖株上清液纯化出抗体。简言的，用于层析法的上清液系通过加入1/10体积的1MTris/HCl缓冲液(pH8.0)而制备。将经调整pH的上清液通过0.22μm滤膜过滤通过并且装入以结合缓冲液(PBS,pH7.3)平衡的管柱。以结合缓冲液清洗管柱直到获得在280nm无吸光度的稳定基线。以包含0.15MNaCl,pH2.8的0.1M醋酸缓冲液及使用流速0.5mL/min冲提抗体。收集约0.25mL的馏分并且通过加入1/10体积的1MTris/HCl,pH8.0加以中和。将波峰馏分对1xPBS隔夜透析两次并且通过过滤通过0.2μm滤膜以灭菌。以A280的吸光度定量纯化的抗体。
例子8
通过流式细胞计数法的结合特征化
使用纯化的抗体并通过流式细胞计数法测试结合特异性性。证实抗FOLR1对表现FOLR1的300-19细胞的结合以及缺乏结合至亲代300-19细胞的FACS直方图显示于第4图。将每个抗体与表现FOLR1的300-19细胞或非转染的300-19细胞(每样本1x105细胞)的任一者于FACS缓冲液(添加2％正常羊血清的RPMI-1640培养液)培养3小时。接着，将细胞沉淀、清洗并以0.1ml的FITC-共轭羊抗小鼠IgG抗体(像是例如由JacksonLaboratory获得的，在FACS缓冲液中6μg/mL)培养1小时。将细胞再沉淀、以FACS缓冲液清洗并重新悬浮于包含1％甲醛的200μLPBS。使用FACSCalibur流式细胞仪伴随HTS多孔采样器或FACS数组流式细胞仪以获取样本并且使用CellQuestPro分析(皆来自BDBiosciences,SanDiego,US)。抗FOLR1抗体的FACS直方图显示荧光位移，然而亲代300-19细胞则否。此外，当任一细胞株仅单独与FITC共轭的羊抗人类IgG抗体培养时，检测不到显著荧光位移。
例子9
muFR1-21的VL与VH区域的选殖与定序
根据制造商的计划书使用RNeasy试剂盒(QIAgen)由5x106个融合瘤细胞制备总细胞RNA。随后使用SuperScriptIIcDNA合成试剂盒(Invitrogen)由总RNA合成cDNA。衍生自融合瘤细胞的cDNA第一回合的退化性PCR反应(degeneratePCRreaction)的程序是根据描述于Wangetal.((2000)JImmunolMethods.Jan13；233(1-2):167-77)以及Coetal.((1992)JImmunol.Feb15；148(4):1149-54)的方法。使用下列退化性引物通过PCR扩增VH序列：EcoMH1CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTC(SEQIDNO:50)EcoMH2CTTCCGGAATTCSARGTNMAGCTGSAGSAGTCWGG(SEQIDNO:51)以及BamIgG1GGAGGATCCATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC(SEQIDNO:52)。使用下列退化性引物通过PCR扩增VL序列：SacIMKGGAGCTCGAYATTGTGMTSACMCARWCTMCA(SEQIDNO:53)以及HindKLTATAGAGCTCAAGCTTGGATGGTGGGAAGATGGATACAGTTGGTGC(SEQIDNO:54)。(混合碱基定义如下：N＝G+A+T+C、S＝G+C、Y＝C+T、M＝A+C、R＝A+G、W＝A+T)。
再将PCR反应混合物于1％低熔融琼脂糖凝胶分离，切取300至400bp的宽带，使用ZymoDNA小管柱纯化，并寄至AgencourtBiosciences进行定序。使用各自的5’以及3’PCR引物作为定序引物，以从两个方向生成变异区cDNAs。通过以VectorNTI软件转译DNA定序结果获得VH以及VL区域的氨基酸序列。
为识别在初步变异区cDNA序列中5’端引物定序人工物，利用NCBIIgBlast站(www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)搜寻抗体序列所衍生的鼠类生殖细胞序列。再将清空的变异区序列与作为特异性的抗体恒定区的NCBI参考序列合并以组装所期望的全长鼠类抗体序列。再计算所期望的鼠类Fr1-21轻与重链的分子量并且与由液相层析/质量分光光度计(LC/MS)分析所测得的质量比较。将鼠类FR1-21重链比较所测质量，但轻链需要后续的定序工作，以测定5’端序列。设计CD37-1LClead1PCR引物(ttttgaattcgccaccatgaagtttccttctcaacttct)以黏着至鼠类抗体的生殖细胞连结的领导序列，使得这个新的PCR反应将生成一个未被引物改变的完整变异区cDNA序列。如同上述完成PCR反应、条带纯化(bandpurification)以及定序并且新的完整序列编码与通过LC/MS测量的Fr1-21轻链质量配对的一个轻链。
例子10
参考抗体的表现
Morphotech抗FOLR1抗体、MorAb-003(Farletuzumab)、氨基酸序列从世界卫生组织(WHO)国际非专利药品名称(INN)清单获得，并且由BlueHeronBiotechnology密码子优化并合成。将轻链变异区序列相邻于EcoRI与BsiWI限制酶切位，并且将重链变异区序列相邻于HindIII与Apa1限制酶切位，用于选殖在单一链哺乳动物表现质粒中与各自的恒定序列同一读框。如同上述对于人源化Mov19以及Fr1-21完成选殖、表现以及纯化。
例子11
huMov19的ADCC活性
使用乳酸去氢酶(LDH)释放试验以测量肿瘤细胞株的抗体依赖细胞媒介细胞毒性(ADCC)，其是使用新鲜分离的人类天然杀手(NK)细胞作为效应细胞(例如，Shields,J.Biol.Chem.,276(9):6591-6604(2001))。首先使用对NKIsolationKitII修改的计划书(MiltenyiBiotech,130-091-152)将NK细胞从来自正常捐献者(ResearchBloodComponents,Inc.,Brighton,MA)的人类血液中分离。将血液以1xPBS稀释2倍。将25mL的稀释血液在50mL圆锥管中通过25mLFicollPaque小心地分层，并且在室温下以400g离心45分钟。从界面收集周边血液单核细胞(PBMC)，转移至新的50mL锥形管，并以1xPBS清洗一次。将PBMC重新悬浮于2mL的NK分离缓冲液(1xPBS,0.5％BSA,2mMEDTA)，然后将500μL的生物素-抗体鸡尾酒加至细胞悬浮液。生物素-抗体鸡尾酒包含结合至淋巴细胞的生物素化的抗体，除了对NK细胞外，造成NK细胞的负选择。将混合物于4℃培养10分钟，然后加入1.5mLofNK分离缓冲液以及1mL的抗生物素微珠。将细胞抗体混合物于4℃培养另一个15分钟。接着，将细胞以50mLNK分离缓冲液清洗一次并重新悬浮于3mLNK分离缓冲液。接着，将MACSLS管柱安装于autoMACS分离器(MiltenyiBiotech)并且以3mLNK分离缓冲液预先清洗。细胞悬浮液被自动地用于管柱、清洗，并且将具有未标记的NK细胞的流出馏分收集至新的50mL圆锥管。将生成的NK细胞铺于30mL的完全RPMI培养液(添加5％胎牛血清、1％青霉素-链霉素、1mMHEPES、1mM丙酮酸钠、1％100XMEM非必需氨基酸溶液的RPMI-1640)隔夜。后续的分析以及所有稀释是于RHBP培养液(添加20mMHEPES,pH7.4、0.1％BSA以及1％青霉素-链霉素的RPMI1640)中完成。将在RHBP培养液中各种浓度的抗体以50μL/孔二重复分装于圆底96孔盘。将目标细胞以106细胞/mL重新悬浮于RHBP培养液中并以100μL/孔加至包含抗体稀释液的每孔中。将包含目标细胞以及抗体稀释液的盘于37℃培养30分钟。再将NK细胞以50μL/孔加至包含目标细胞的孔中。典型的比率为大约1个目标细胞对3-4个NK细胞。对于每个实验至少建立下列控制组：仅NK细胞、仅目标细胞(自动释放LDH)、伴随NK细胞的目标细胞(抗体独立性LDH释放)、伴随10％TritonX-100的目标细胞(最大LDH释放)。将混合物于37℃培养4小时，以使细胞水解。将盘于1200rpm离心10分钟，并将100μL上清液小心转移至新的平底96孔盘。将来自细胞毒杀检测试剂盒(Roche1644793)的LDH反应混合物(100μL/孔)加至每孔中并且于室温下培养5至30分钟。于490nm(OD490)测量样本的光学密度。每个样本的特异性性水解百分比是使用下列公式测定：特异性性水解百分比＝(样本数值–自动释放)/(最大释放-自动释放)*100。
在人类NK效应细胞的存在下与huMov19培养引起对IGROV-1细胞良好的ADCC活性。将IGROV-1细胞的ADCC活性与huMov19、huFR-1-21、Mor003以及chTK1(同型控制组)比较(第6图)。以0.9ng/mlhuMov19处理造成约30％IGROV-1细胞裂解，与以其它抗FOLR1抗体所观察到的活性相似。huMov19的ADCC活性具有EC500.20ng/mL、huFr-1-21具有EC500.11ng/mL、Mor003具有0.16ng/mL而chTK1不显示任何对IGROV-1细胞的活性。
例子12
抗FOLR1免疫缀合物的制备
huMOV19v1.6-磺酸基-SPDB-DM4的制备
将例子性的2-磺酸基-SPDB连接元溶解于DMA。将huMOV19v1.6抗体以8mg/mL与12倍摩尔数的过量2-磺酸基-SPDB连接元于25℃、pH7.5下培养约2小时。将反应混合物以使用包含50mMNaCl,2mMEDTA,pH6.5的50mM磷酸钾缓冲液平衡的SEPHADEXTMG25F管柱纯化。将美登素衍生物DM4溶解于二甲基乙酰胺(DMA，最终浓度为5％)并且以和连接元相比1.7倍摩尔数的过量逐滴加入磺酸基-SPDB修饰的抗体。将反应混合物以1mHEPES缓冲液调整至pH7.5。在室温下隔夜培养后，将共轭抗体通过在以10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖、pH5.5平衡的SEPHADEXTMG25F的层析法纯化。使用先前报导的对抗体与美登素衍生物的消光系数来测定每抗体分子连结的DM4分子数目(Widdison,WC,etal.JMedChem,49:4392-4408(2006))。如同上述，测定总游离的美登素衍生物种类的百分率。每huMov19v1.6抗体中带有3.5-4个DM4分子的缀合物是以<1％存在为未共轭的美登素衍生物而获得。
huMOV19v1.6-SPP-DM1的制备
将示范的N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯(SPP)连接元溶解于乙醇。将huMOV19v1.6抗体以8mg/mL伴随6.5至6倍摩尔数的过量SPP连接元于室温在包含50mMNaCl、2mMEDTA以及5％乙醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中培养约2小时。将经SPP修饰的抗体于PBS(pH6.5)中稀释2倍，并且通过加入在二甲基乙酰胺(DMA)中的DM1浓缩溶液(15-30mM)，以1.5倍摩尔数过量的美登素衍生物DM1修饰。将DMA浓度调整至5％并且在室温下隔夜培养后，通过使用以10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖、pH5.5平衡的SEPHADEXTMG25F层析以纯化共轭抗体。使用先前报导的对抗体与DM1的消光系数测定每抗体分子连结的DM1分子数目(Liuetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,8618-8623(1996))。在共轭反应后，存在的游离美登素衍生物的百分率是通过注射20-50μg缀合物至HiSepTM管柱而测定，HiSepTM管柱是于在pH7.0、100mM醋酸铵中的25％乙腈的缓冲液中平衡，并且以乙腈冲提。总游离的美登素衍生物种类(以梯度冲提并且通过与已知标准比较冲提时间而识别)的波峰面积是使用设定至252nm波长的吸光度检测器测量，并且与相关于被结合的美登素衍生物种类(于管柱流出的馏分被冲提出的共轭波峰)的波峰面积比较，以计算全部游离的美登素衍生物种类的百分率。每huMov19v1.6抗体中带有3.5-4个DM1分子的缀合物是以<1％存在为未共轭的美登素衍生物而获得。
huMOV19v1.6SPDB-DM4的制备
将示范的N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯(SPDB)连接元溶解于乙醇。将huMOV19v1.6抗体以8mg/mL伴随5.5-5倍摩尔数的过量SPDB连接元于室温在包含50mMNaCl、2mMEDTA以及3％乙醇的50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中培养约2小时。将经SPDB修饰的抗体于PBS,pH6.5中稀释2倍，并且通过加入在二甲基乙酰胺(DMA)中的DM4浓缩溶液(15-30mM)以1.5倍摩尔数过量的美登素衍生物DM4修饰。在室温下培养隔夜后，将共轭抗体通过在以10mM组氨酸、250mM甘氨酸、1％蔗糖、pH5.5平衡的SEPHADEXTMG25F的层析法纯化。使用先前报导的对抗体与美登素衍生物的消光系数测定每抗体分子连结的DM4分子数目(Widdison,WC,etal.JMedChem,49:4392-4408(2006))。全部游离的美登素衍生物种类的百分率是如同上述而测定。每huMov19v1.6抗体中带有3.5-4个DM4分子的缀合物是以<1％存在为未共轭的美登素衍生物而获得。
huMOV19v1.0-3-磺酸基-mal-DM4的制备
将NHS-3-磺酸基-mal连接子以及DM4分别地溶解于DMA中。将连接子与DM4硫醇于包含40％200mM的琥珀酸缓冲液、2mMEDTA,pH5.0的DMA溶液共同混合以得到DM4对连接子的摩尔比1.6:1并且DM4的最终浓度等于10mM。将混合物于25℃反应2小时。将反应混合物不纯化而加入，使得在最终共轭条件4mg/mL抗体、90％磷酸缓冲液/10％DMApH7.5(v/v)下，将9.6当量摩尔过量的连接子对抗体加至在磷酸缓冲液(pH7.5)中的huMOV19v1.0抗体溶液。于室温下隔夜培养后，以于PBSpH7.5中平衡的SEPHADEXG25层析法纯化共轭混合物。接着，将huMOV19v1.0-3-磺酸基-mal-DM4透析至包含9.55mM磷酸、139.6mMNaCl,pH6.5的缓冲液。使用先前报导的对抗体与美登素衍生物的消光系数来测定每抗体分子连接的DM4分子数目(Widdison,WC,etal.JMedChem,49:4392-4408(2006))。如上所述，测定总游离的美登素衍生物种类的百分率。每huMOV19v1.0抗体中带有3.5-4DM4分子的缀合物以存在<1％未共轭的美登素衍生物而获得。
huMOV19v1.0-SMCC-DM1的制备
将NHS-磺酸基-SMCC连接子以及DM1分别地溶解于DMA中。将连接子与DM1硫醇于包含40％200mM的琥珀酸缓冲液、2mMEDTA,pH5.0的DMA溶液共同混合以得到DM1对连接子的摩尔比1.2:1并且DM1的最终浓度等于3.75mM。将混合物于20℃反应75分钟。将反应混合物不纯化而加入，使得在最终共轭条件4mg/mL抗体、88％50mM磷酸钾、50mMNaCl、2mMEDTA、pH7.5/12％DMApH7.5(v/v)下，将6.4当量摩尔过量的连接子对抗体加至在磷酸缓冲液(pH7.5)中的huMOV19v1.0抗体溶液。于20℃下培养2小时后，以于PBSpH7.5中平衡的SEPHADEXG25层析法纯化共轭混合物。接着，将huMOV19v1.0-SMCC-DM1透析至包含250mM甘氨酸、10mM组氨酸pH5.5的缓冲液。使用先前报导的对抗体与美登素衍生物的消光系数来测定每抗体分子连接的DM1分子数目(Widdison,WC,etal.JMedChem,49:4392-4408(2006))。如上所述，测定总游离的美登素衍生物种类的百分率。每huMOV19v1.0抗体中带有3.5-4DM1分子的缀合物以存在<2.8％未共轭美登素衍生物而获得。
huMOV19v1.0-PEG4-mal-DM1的制备
将NHS-PEG4-mal-DM11步骤试剂溶解于DMA。在25℃下，将huMov19v1.0抗体以5mg/mL伴随5.7倍摩尔过量的NHS-PEG4-mal-DM1在50mMKpi、50mMNaCl、2mMEDTA,pH7.5与10％体积的DMA中培养隔夜。以于PBSpH7.5中平衡的SEPHADEXG25层析法纯化反应混合物。接着，将huMOV19v1.0-PEG4-mal-DM1透析至包含250mM甘氨酸、10mM组氨酸pH5.5的缓冲液。使用先前报导的对抗体与美登素衍生物的消光系数来测定每抗体分子连接的DM1分子数目(Widdison,WC,etal.JMedChem,49:4392-4408(2006))。如上所述，测定总全部游离的美登素衍生物种类的百分率。每huMOV19v1.0抗体中带有3.5-4DM1分子的缀合物以存在<1.1％未共轭美登素衍生物而获得。
例子13
抗体与缀合物的结合亲和力
以流体细胞计数法分析抗-FOLR1抗体以及其SPDB-DM4、PEG4Mal-DM4、SMCC-DM1或抗FOLR1-磺酸基-SPDB-DM4缀合物的结合亲和力。将表现FOLR1的SKOV3细胞与不同浓度的抗FOLR1抗体或其缀合物培养并且如同上述而进行流式细胞计数分析。使用CellQuestPro执行数据分析(BDBiosciences,SanDiego,US)并且对每个样本输出对FL1的平均荧光强度(MFI)并对抗体浓度以半对数图绘制图形。利用非线性回归产生剂量反应曲线，以及使用GraphPadPrismv4(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)计算对于结合至SKOV3细胞的测试样本的视平衡解离常数(Kd)数值并且呈现于第5图。结果显示通过任一所使用的连接子与无论DM1或是DM4结合，不显著改变任一抗体(例如，huMov19)的亲和力。
例子14
体外细胞毒性试验
使用通过KovtunYVetal.(CancerRes66:3214-3221(2006))描述的方法的体外细胞毒性分析来测量示范的muFR1-9、muFR1-13、muFR1-22、muFR1-23、huFR1-23、muFR1-21以及huFR1-21缀合物抑制细胞生长活性的能力。将各种浓度的PEG4-mal-DM4缀合物加至在96孔盘中以每孔1,000细胞于100μL完整RPMI培养基(RPMI-1640、10％胎牛血清、2mM谷酰氨酸、1％健他霉素，所有试剂皆来自Invitrogen)中的表现FOLR1的KB细胞。使用3倍连续稀释将抗体与缀合物稀释至完整RPMI培养基中并于每孔加入100μL。最终浓度典型地在3x10-8M至4.6x10-12M之间。每个分析盘包括了含有细胞与培养基但缺乏缀合物的控制组孔，以及仅含有培养基的孔。将盘在含有5％CO2的湿化环境中于37℃培养四到六天。接着，将WST-8试剂，10％v/v(DojindoMolecularTechnologies,Gaithersburg,MD,US)加至孔中并将盘于37℃培养2-6小时。通过活细胞中的去氢酶将WST-8还原至橘色(在组织培养基中可溶的最大量甲臜产物。产生的甲臜量为与存活细胞数成正比。将盘以多孔盘读取仪测量于450nm(A450)以及于650nm(A650)的吸光度来进行分析。首先，将A650减去细胞的乳白光(A650)的背景值，接着将产生的A*450用于测定细胞存活部分。背景A*450吸光值为带有培养基与仅有WST-8的A*450吸光值。存活部分计算如下：存活百分比＝100x(经A*450处理的样本–A*450背景)/(未经A*450处理的样本–A*450背景)。将对于每个处理的存活部分数值对抗体或缀合物浓度以半对数图绘制。接着使用GraphPadPrismv4(GraphPadsoftware,SanDiego,CA)从这些数据测定IC50数值并呈现于第5图。于第5图显示的结果证实所有缀合物在对表现FOLR1的KB细胞的细胞毒性能力为相似地具活性。为进一步验证抗FOLR1-美登素衍生物缀合物对FOLR1的特异性性，在对KB细胞过量的非共轭抗体的存在，评估其活性。加入过量竞争性非共轭抗体至缀合物以抑制它们的细胞毒性，如同第7图所见的。这些数据表示缀合物以抗原相关方式杀害KB细胞。额外的资料证实在体外试验于KB细胞中huMov19-SPDB-DM4诱导的细胞周期停滞于G2/M期。
例子15
KB异体移植模式中huMov19-PEG4Mal-DM4以及huMov19-SPDB-DM4缀合物与相似的非标的缀合物相较的体内效用
使用将KB细胞皮下植入SCID小鼠的已建立的异体移植模式，对FOLR1-标的可裂解缀合物huMov19-SPDB-DM4与非标的huC242-SPDB-DM4的比较以及将非可裂解缀合物huMov19-PEG4-Mal-DM4与非标的huC242-PEG4Mal-DM4的比较进行测试。将小鼠以体重随机分配至治疗组，并且于细胞接种后第三天以单一地(SPDB缀合物)或于细胞接种后第3、10以及17天每周三次，分别以5与10mg/kg缀合物处理。将不同治疗组的中位数肿瘤体积绘图于第8图。与PBS相较，以无论huMov19-SPDB-DM4或huMov19-PEG4Mal-DM4的任一处理造成中位数肿瘤体积减少，而以任一者各自的非标的缀合物处理没有产生任何显著效果。
例子16
KB异体移植模式中抗FOLR1-PEG4Mal-DM4缀合物的体内效用
使用将KB细胞皮下植入SCID小鼠的已建立的异体移植模式以测试示范的抗FOLR1抗体huMov19、muFR-1-9、muFR-1-13、muFR-1-22、muFR-1-23以及huFR-1-21的PEG4Mal-DM4缀合物。将小鼠以体重随机分配至治疗组，并于细胞接种后第三天以10mg/kg上面所列缀合物其中的或仅以PBS处理一次。HuMov19-PEG4Mal-DM4显示于上是与muFR-1-9、muFR-1-13、muFR-1-22、muFR-1-23以及huFR-1-21的PEG4Mal-DM4缀合物于体外其细胞毒性能力相似。HuMov19-PEG4Mal-DM4与huFR-1-21-PEG4Mal-DM4在体内显著地比任何其它缀合物更有效，于中位数肿瘤体积造成更显著的减少(第9与第10图)。强度还证实为剂量相关的(第11图)并且连接子的选择还扮演了角色(第12图与第13图)。
例子17
异体移植模式中抗FOLR1-磺酸基-SPDB-DM4缀合物的体内效用
在三个卵巢浆液性腺癌异体移植OVCAR-3、IGROV-1以及OV-90中测试抗FOLR1huMov19-磺酸基-SPDB-DM4缀合物。当于***固定石蜡包埋切片使用校正免疫组织化学(IHC)染色方法以测量这些异体移植肿瘤，每一个异体移植肿瘤显示相当于患者肿瘤的FOLR1表现程度。将带有已建立的皮下异体移植肿瘤(约100mm3)的小鼠以1.2、2.5以及5.0mg/kghuMov19-磺酸基-SPDB-DM4缀合物的单一静脉注射治疗(根据抗体浓度；第14-16图以μg/kg显示美登素衍生物缀合物浓度)。缀合物在所有三种评估的模式中皆具有活性。在OVCAR-3异体移植中，最小有效剂量(MED)为1.2mg/kg(第14图)。较高的剂量等级为高度活性的，引起在2.5与5.0mg/kg治疗组中分别4/6以及2/6的小鼠完全消失(CR)。以MED2.5mg/kg、单一注射的缀合物治疗造成在IGROV-1以及OV-90异体移植模式中优秀的抗肿瘤活性(第15与16图)。这些资料证实huMov19-磺酸基-SPDB-DM4缀合物对带有相当于患者肿瘤FOLR1表现程度的卵巢异体移植肿瘤优秀的抗肿瘤活性。
例子18
连接子对免疫缀合物效能的影响
将抗FOLR1抗体huMov19通过含有双硫化物的可裂解连接子SPP、SPDB或磺酸基-SPDB或通过非裂解连接子SMCC连接至DM1或DM4。检查这些缀合物于KB、IGROV-1以及JEG-3细胞株的体外细胞毒素活性。FACS分析指出KB(子宫颈)细胞具有每细胞>2,000,000抗体结合位点。IGROV-1(卵巢的)细胞具有每细胞260,000抗体结合位点，以及JEG-3(绒毛膜癌)细胞具有每细胞40,000抗体结合位点。体外的细胞毒性结果总结于下面表格2。相较于SMCC缀合物的体外活性，可裂解缀合物展现显著较大的体外活性。
表格2：体外免疫缀合物连接子对细胞毒性的影响
还测试在FOLR1阳性KB-以及OVCAR-3-肿瘤模式的缀合物的体内活性。第17图显示的结果证实可裂解的SPDB-DM4以及磺酸基-SPDB-DM4缀合物较非可裂解的SMCC-DM1缀合物在体内为更有效。此外，在可裂解的缀合物中，SPP-DM1缀合物在两种异体移植模式中与无论SPDB-DM4或磺酸基-SPDB-DM4缀合物相较为低活性的(第18图)。后两者缀合物对KB肿瘤相似地具有活性，而磺酸基-SPDB-DM4缀合物对OVCAR-3模式更有效。使用OVCAR-3模式获得的数据总结于下面表格3。
表格3：OVCAR-3异体移植模式中免疫缀合物连接子对肿瘤尺寸的效用
缀合物 失去控制的肿瘤(％) 部分反应 完全反应 反应57 -->
SPP-DM1 54 0/6 0/6 无活性
SPDB-DM4 9 6/6 1/6 高度活性
磺酸基-DPDB-DM4 0 6/6 4/6 高度活性
这些数据证实包含可裂解连接子的免疫缀合物在体外以及体内两者皆显示增加的效果，以及包含磺酸基-SPDB的抗FOLR1免疫缀合物在肿瘤模式中是高度活性的。
例子19
huFR1抗体SMCC-DM1缀合物的体外以及体内效果
将抗FOLR1huFR1-48、huFR1-49、huFR1-57以及huFR1-65与SMCC连接子以及DM1结合并且对KB细胞以及使用上述异体移植模式的体内的效果如同上述分析。每个抗体在KB细胞模式中显示相似的效果，同时huFR1-48、huFR1-49、huFR1-57以及huFR1-65免疫缀合物在异体移植模式***中于200μg/kg剂量显示变异但在体内效果显著(表格4以及第19图)。
表格4：huFR1抗体SMCC-DM1缀合物的体外以及体内效果
所有于本文引用的出版物、专利、专利申请案、网站以及登录号/数据库序列(包括多核苷酸与多肽序列两者)为了所有目的在此以全文并入以作为参考，犹如每个各别的出版物、专利、专利申请案、网站以及登录号/数据库序列特异性地且分别地所意指者的相同程度，因此并入以作为参考。

Claims (59)

1.一种特异性地结合人类叶酸受体1的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其抗原结合片段包含：
(a)免疫球蛋白重链可变区(VH)，其包含：SEQIDNO:30的重链(HC)CDR1氨基酸序列；SEQIDNO:31、SEQIDNO:33或SEQIDNO:34的HCCDR2氨基酸序列；和SEQIDNO:32的HCCDR3氨基酸序列；以及
(b)免疫球蛋白轻链可变区(VL)，其包含：SEQIDNO:27的轻链(LC)CDR1氨基酸序列；SEQIDNO:28的LCCDR2氨基酸序列；和SEQIDNO:29的LCCDR3氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQIDNO:34的HCCDR2氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:42的VH氨基酸序列和SEQIDNO:41的VL氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQIDNO:46的HC氨基酸序列和SEQIDNO:45的LC氨基酸序列。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含SEQIDNO:33的HCCDR2氨基酸序列。
6.如权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含SEQIDNO:36的VH氨基酸序列和SEQIDNO:35的VL氨基酸序列。
7.如权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含SEQIDNO:40的HC氨基酸序列和SEQIDNO:39的LC氨基酸序列。
8.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含由2010年4月7日保藏于ATCC并具有ATCC保藏编号PTA-10775的质粒DNA编码的HC以及由2010年4月7日保藏于ATCC并具有ATCC保藏编号PTA-10776的质粒DNA编码的LC。
9.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为全长抗体。
10.如权利要求1-3、5和6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其为抗原结合片段。
11.如权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双硫化物连接的Fv、内抗体、IgG-CH2、微抗体、F(ab')3、四链抗体、三链抗体、双链抗体、DVD-Ig、mAb2、(scFv)2或scFv-Fc。
12.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其以0.07至10nM的Kd与人类叶酸受体1结合。
13.如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段被人源化。
14.一种制造如权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包含(a)培养表达所述抗体或其抗原结合片段的细胞；以及(b)从该培养的细胞中分离所述抗体或其抗原结合片段。
15.一种药物组合物，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及药学上可接受的载体。
16.一种具有该结构式(A)-(L)-(C)的免疫缀合物，其中：
(A)为如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
(L)为连接子；和
(C)为细胞毒性剂；以及
其中(L)连接(A)至(C)。
17.如权利要求16所述的免疫缀合物，其中(A)包含SEQIDNO:42的VH氨基酸序列和SEQIDNO:41的VL氨基酸序列。
18.如权利要求16或17所述的免疫缀合物，其中所述连接子选自：可裂解连接子、不可裂解连接子、亲水性连接子以及二羧酸为基底的连接子所组成的群组。
19.如权利要求18所述的免疫缀合物，其中所述连接子选自：N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)戊酸酯；N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基戊酸酯；N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯；N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基丁酸酯；N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯；N-磺酸基琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯；N-琥珀酰亚胺-4-(碘乙酰基)-胺基苯甲酸酯；以及N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯。
20.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯。
21.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯。
22.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基丁酸酯。
23.如权利要求19所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷羧酸酯。
24.如权利要求16或17所述的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂选自美登素衍生物、阿霉素、苯并二氮呯、类紫杉醇、CC-1065、倍癌霉素、加利车霉素、多拉司他汀、奥利斯汀、或所述细胞毒性剂的前药。
25.如权利要求24所述的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂是美登素衍生物。
26.如权利要求25所述的免疫缀合物，其中所述细胞毒性剂是N(2')-去乙酰-N(2')-(3-巯基-1-氧代丙基)-美登素或N(2')-去乙酰-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
27.如权利要求16或17所述的免疫缀合物，其进一步包含2-6个(C)。
28.如权利要求16或17所述的免疫缀合物，其中所述免疫缀合物包含每(A)3-4个(C)。
29.如权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺-[(N-马来酰亚胺基丙酰胺基)-四甘醇]酯，以及其中所述细胞毒性剂是N(2')-去乙酰-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
30.如权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)丁酸酯，以及其中所述细胞毒性剂是N(2')-去乙酰-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
31.如权利要求17所述的免疫缀合物，其中所述连接子是N-琥珀酰亚胺4-(2-吡啶二硫代)-2-磺酸基丁酸酯，以及其中所述细胞毒性剂是N(2')-去乙酰-N2'-(4-巯基-4-甲基-1-氧代戊基)-美登素。
32.一种药物组合物，其包含如权利要求16-31中任一项所述的免疫缀合物以及药学上可接受的载体。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其中所述免疫缀合物具有每(A)平均3至4个(C)。
34.一种试剂盒，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，如权利要求16-31中任一项所述的免疫缀合物，或如权利要求15、32或33中任一项所述的药物组合物。
35.一种诊断试剂，其包含如权利要求1-13中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
36.如权利要求35所述的诊断试剂，其进一步包含标记。
37.如权利要求36所述的诊断试剂，其中该标记选自放射性标记、荧光团、发色团、造影剂以及金属离子所组成的群组。
38.如权利要求1-13以及15-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物在制备用于抑制在受试者中肿瘤生长的药物中的用途，其中抑制在受试者中肿瘤生长包括施用该受试者治疗有效量的如权利要求1-13以及15-33中任一项所述的该抗体、抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物。
39.如权利要求38所述的用途，其中所述肿瘤选自卵巢肿瘤、子宫肿瘤、胰腺肿瘤、肾肿瘤、肺肿瘤、腹膜肿瘤、子宫内膜肿瘤、以及***肿瘤。
40.如权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是卵巢肿瘤。
41.如权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是肺肿瘤。
42.如权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是子宫内膜肿瘤。
43.如权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是腹膜肿瘤。
44.如权利要求39所述的用途，其中所述肿瘤是子宫肿瘤。
45.如权利要求38-44中任一项所述的用途，其中抑制肿瘤生长以治疗癌症。
46.如权利要求1-13以及15-33中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物在制备用于治疗在受试者中的癌症的药物中的用途，其中治疗在受试者中的癌症包括施用该受试者治疗有效量的如权利要求1-13以及15-33中任一项所述的抗体、抗原结合片段、免疫缀合物或药物组合物。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述癌症选自卵巢癌、子宫癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、腹膜癌、子宫内膜癌以及乳癌。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述癌症是卵巢癌。
49.如权利要求47所述的用途，其中所述癌症是肺癌。
50.如权利要求47所述的用途，其中所述癌症是子宫内膜癌。
51.如权利要求47所述的用途，其中所述癌症是腹膜癌。
52.如权利要求47所述的用途，其中所述癌症是子宫癌。
53.一种产生如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的经分离的细胞。
54.一种经分离的多核苷酸，其包含编码如权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列。
55.如权利要求54所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:37以及SEQIDNO:38的核酸序列。
56.如权利要求54所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:43以及SEQIDNO:44的核酸序列。
57.如权利要求56所述的经分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQIDNO:47以及SEQIDNO:48的核酸序列。
58.一种包含如权利要求54-57中任一项所述的多核苷酸的载体。
59.一种包含如权利要求54-57中任一项所述的多核苷酸或如权利要求58所述的载体的经分离的细胞。
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