CN105755078B - 一种医用级鱼皮胶原的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从鱼皮中提取大分子医用胶原的方法，及鱼皮胶原作为组织修复支架材料的应用。该方法包括如下步骤：1)对鱼皮进行前处理；2)复合多种方法清洗鱼皮；3)酸法提取胶原；4)固定化酶法处理；5)胶原的精制。本发明胶原制备方法能耗低，周期短，操作简便，适用于工业规模化生产，并且所制备胶原具有纯度高、免疫原性低、生物相容性良好等优点，适于开发成胶原医用产品。本发明同时公开了应用鱼皮胶原生产支架材料，以及支架材料在创伤修复中的应用。

Description

一种医用级鱼皮胶原的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于生物医用材料领域，涉及一种从鱼皮中提取可作为生物医用材料的大分子胶原的方法，及鱼皮胶原作为组织修复支架材料的应用。

背景技术

胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因其具有良好的生物相容性而成为生物医用材料的主要原材料之一。近年来，随着胶原基生物材料应用领域的日益拓展，其产品需求量不断增加。但与此同时，以牛、羊及猪等哺乳动物为主要来源的胶原蛋白产品存在原料来源有限、生产成本高以及疯牛病、***等病原传播的潜在危险等诸多问题。因此，胶原蛋白新资源的开发及相关性能和应用的研究正逐步成为该领域的研究热点。随着国内水产加工业的发展，水产加工企业生产过程产生的下脚料如鱼头、鱼皮、鱼骨、鱼鳞等将逐年增多。这些下脚料含有丰富的胶原蛋白，若不加以有效利用，不仅造成极大的浪费，而且还会造成环境的污染，因此从水产动物中开发可用于生物医用材料的胶原蛋白有着广阔的应用前景。

目前，水产动物中胶原蛋白的提取方法的研究报道较多，主要包括热水浸提、酸法浸提、碱法浸提、盐法浸提与酶法浸提等。其中热水浸提法因为采取高温提取，胶原蛋白容易变性；碱法提取的虽然反应迅速彻底，但会破坏胶原的三螺旋结构，使含有羟基和巯基的氨基酸破坏且产生消旋；盐法浸提的主要缺点是其工艺不稳定，使得提取的胶原分子结构也不稳定。因此热水浸提、碱法浸提和盐法浸提均不适合用于生物医用材料用胶原的提取。而酸法浸提法是通过酸性环境破坏胶原分子间的盐键和Schiff键，使胶原纤维溶胀、溶解来提取胶原，优点是最大限度的保持胶原分子的三螺旋结构，缺点主要是产率低；酶法具有水解反应快、对环境友好等优点，而且提取的胶原纯度高、物理化学性质稳定，酶解可切除胶原分子端肽的非螺旋区，降低胶原的抗原性，缺点是成本较高、生产过程中掺进的蛋白酶需要去除。例如专利CN 200910184482，CN 200510047408报道了低温酸法浸提大分子胶原的制备方法；专利201310041670报道了酸法浸提与酶法除端基的生产工艺；另外2013年中国水产科学研究院南海水产研究所郝淑贤以罗非鱼皮为研究对象，分析热水浸提、酸法浸提及超声辅助酶法提取对鱼皮胶原蛋白理化特性的影响(《食品科学》2014年15期)；2014年集美大学王宝周等***比较深海鱼和淡水鱼胶原的差异，利用酸法提取鲨鱼皮胶原和罗非鱼皮胶原，并对它们的理化性质和酶解特性进行了考察(《食品工业科技》2014年第16期)。

然而，目前对鱼皮大分子胶原的提取研究多处于实验室小试阶段，生产工艺存在能耗高、周期长、蛋白纯度低、杂质多、未采取病毒灭活措施等诸多缺点，远远未达到生物医用材料的生产质量要求，亦大大限制了鱼皮胶原作为原材料在医用产品开发中的应用。

发明内容

本发明的目的是从鱼皮中提取可作为生物医用材料的大分子胶原的方法，及鱼皮胶原作为组织修复支架材料的应用。

本发明所提供的一种从鱼皮中提取大分子胶原的方法，具体而言，可包括如下步骤：

1)对鱼皮进行前处理；

2)复合多种方法清洗鱼皮；

3)酸法提取胶原；

4)固定化酶法处理；

5)胶原的精制。

在上述方法中，鱼皮为硬骨鱼或软骨鱼的鱼皮，包括罗非鱼皮、鳕鱼皮、鲤鱼皮、鲢鱼皮、青鱼皮、草鱼皮、鳙鱼皮或鲨鱼皮，优选地，所述鱼皮选用罗非鱼皮。

在上述方法中，步骤1)中，所述前处理包括机械除杂、切块和盐水浸泡三个操作单元，所述三个操作单元的前后顺序可以自由组合，优选地，所述三个操作单元的前后顺序为机械除杂、切块、盐水浸泡。

在上述方法中，所述盐水为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，浸泡时间0.5-2小时。

在上述方法中，步骤2)中，所述复合多种方法清洗鱼皮包括采用表面活性剂溶液进行洗涤脱脂、采用强碱洗涤结合中性盐洗涤去除杂蛋白、弱酸洗涤去除黑色鳞衣、使用双氧水脱色四个操作单元，所述四个操作单元的前后顺序可以自由组合，优选地，所述三个操作单元的前后顺序为采用表面活性剂溶液进行洗涤脱脂、采用强碱洗涤结合中性盐洗涤去除杂蛋白、弱酸洗涤去除黑色鳞衣、使用双氧水脱色；

在上述方法中，所述表面活性剂溶液为质量百分含量为0.1％-1％的Triton×100、吐温80或者吐温20的水溶液，洗涤脱脂的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间6-12小时。

在上述方法中，所述强碱为摩尔浓度为0.05M-0.2M的NaOH、KOH或Ca(OH)₂水溶液，强碱洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间3-6小时；所述中性盐为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，盐碱洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间6-12小时。

在上述方法中，所述弱酸为摩尔浓度为0.01M-0.05M的乙酸、柠檬酸或磷酸的水溶液，弱酸脱色的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，脱色时间1-3小时。

在上述方法中，所述双氧水为质量百分含量0.5-2％过氧化氢的水溶液，双氧水处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，处理时间1-3小时。

在上述方法中，步骤3)中，所述酸为摩尔浓度为0.1M-0.5M的乙酸、柠檬酸或磷酸的水溶液，酸提取的料液比为1:20-1:50(w/v)，振荡速度100-250rpm，提取时间6-12小时，提取后用8000-12000g离心力，离心20-40min。

步骤4)中，所述固定化蛋白酶法是采用活性炭为固定化酶的载体，将蛋白酶固定化后再对胶原端肽进行切割；所述蛋白酶为胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或无花果蛋白酶。

在上述方法中，所述固定化蛋白酶制备方法为按照蛋白酶与鱼皮质量比1:10-1:20(w/w)称取蛋白酶，并将蛋白酶按料液比1:5-1:10(w/v)溶于纯水中，搅拌至完全溶解，然后加入活性炭，蛋白酶与活性炭的质量比是1:10-1:20(w/w)，100-200rpm，振荡1-6小时。

在上述方法中，步骤5)中，所述精制包括等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白、真空冷冻干燥三个操作单元。

在上述方法中，等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白的操作单元的温度控制在10℃-20℃。

在上述方法中，所述超滤是采用截留分子量为50kd、100kd或300kd的超滤膜。

由本发明生产的鱼皮胶原的制得的支架材料也属于本发明的保护范围，所述制剂形式包括并不限于胶原海绵、胶原膜、胶原缝合线等形式；优选地，制剂形式为胶原海绵，主要成分Ⅰ型胶原的蛋白纯度达到98％以上，免疫原性低，具有良好生物相容性。由本发明生产的鱼皮胶原的制得的支架材料，作为止血材料在创伤修复中的应用也在本发明的保护范围内。

本发明提供的从鱼皮中提取大分子胶原的方法，与常见的低温酸提取方法相比具有以下创新点与优势：

(1)在不影响胶原天然结构的前提下，采用提高温度、缩短时间的方法进行提取，能耗低，周期短，适用于工业规模化生产；

(2)先后采用表面活性剂脱脂、弱酸洗涤去除黑色鳞衣、双氧水处理脱色、活性炭吸附脱色脱腥，使得脂肪、色素等杂质的含量很低，同时也降低了免疫原性的风险；

(3)组合采用强碱洗涤膨胀胶原纤维、中性盐洗涤去除杂蛋白、等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白，使得最终蛋白纯度达高98％以上，试验发现生物相容性良好；

(4)综合采用表面活性剂洗涤、强碱洗涤和双氧水处理，降低了动物源性医用材料残存病毒的风险；

(5)创新性地将固定化酶技术应用于酶处理去端肽工艺，即采用活性炭吸附蛋白酶，降低了提取液中游离的蛋白酶含量，酶处理完毕后通过简单离心即可除去大部分蛋白酶，降低了后续蛋白纯化的难度；另外活性炭可以吸附胶原提取液中的残余色素与腥味物质，起到脱色与脱腥作用；

(6)与盐析沉淀胶原相比，等电点沉淀的专属性更好，因为在pH7时胶原达到等电点聚集沉淀，而胃蛋白酶等杂蛋白仍溶解于溶液中，通过简单离心及水洗即可除去水溶性蛋白。

附图说明

图1为罗非鱼皮胶原的SDS-PAGE电泳图谱。其中，泳道M为分子量标准样品，图示显示出100kd分子量条带；泳道1至泳道3为实施例1所制备鱼皮胶原的电泳图谱，泳道4-6为实施例4中对比胶原的电泳图谱，由电泳图谱得知两种胶原均具有典型的α1、α2、β和γ肽链，属于Ⅰ型胶原，然而实施例1所得胶原的杂蛋白条带明显少于对比样品。

图2为所制备的鱼皮胶原的外观照片，外观为纯白色海绵状，无臭无味。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买。除非有特殊说明，用液体制备的溶液浓度用体积比表示(v/v，用固体制备的溶液浓度用重量体积比表示(w/v)。

实施例1一种罗非鱼皮胶原的提取方法

一、鱼皮的前处理

取新鲜罗非鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，用切片机切成面积小于0.5cm²的小块，15℃下用1％NaCl浸泡2小时，料液比1:10(w/v)，并重复一次，沥干；

二、洗涤鱼皮

1、脱脂

向鱼皮中加入0.1％Triton×100(w/w)溶液，料液比1:10(w/v)，15℃，100rpm振荡12小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干；

2、去杂蛋白

向鱼皮中加入0.05M NaOH溶液，料液比1:10(w/v)，15℃，200rpm振荡6小时，沥干；然后向鱼皮中加入含有1％NaCl溶液，料液比1:10(w/v)，8℃,100rpm振荡12小时，每隔4小时换液一次，沥去水分，然后用纯水漂洗3次，沥干；

3、脱色

向鱼皮中加入0.01M乙酸溶液，料液比1:10(w/v)，15℃，100rpm振荡3小时，沥去溶液上部的黑色鳞衣悬浮液，然后后用纯水漂洗3次，沥干；向鱼皮中加入0.5％过氧化氢溶液，料液比1:10(w/v)，15℃,100rpm振荡3小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干；

三、酸法浸提胶原

向鱼皮中加入0.1M乙酸溶液，料液比1:20(w/v)，15℃，100rpm振荡12小时，然后用8000g离心40min，上清液即酸提取胶原液；

四、固定化酶法除端肽

首先制备固定化酶，方法为：将10g胃蛋白酶溶于100ml纯水中，搅拌至完全溶解，然后加入活性炭200g，100rpm振荡6小时，即得固定化酶。

然后将固定化酶加入到步骤5所得酸提取胶原液中，于15℃，50rpm振荡12小时，然后8000g离心40min，所得上清液即为酶处理胶原液；

五、胶原的精制

1、等电点沉淀结合水洗去除水溶性蛋白

用5M NaOH溶液将酶处理胶原液调整至pH6.5，于15℃，50rpm振荡6小时，使胶原充分沉淀，然后8000g离心40min；所得蛋白沉淀以1:10(w/v)料液比加入纯水，50rpm振荡3小时，每隔1小时换液一次，洗除残留的水溶性杂蛋白，沥干；然后加入0.1M乙酸溶液，料液比1:20(w/v)，15℃，100rpm振荡6小时，8000g离心40min，所得上清液即胶原粗提液；

2、超滤纯化

将胶原粗提液用截留分子量300kd的超滤膜包进行超滤透析，所得超滤浓缩组分即胶原纯化液；

3、冷冻干燥

将胶原纯化液于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即得大分子医用级鱼皮胶原。

实施例2一种鳕鱼皮胶原的提取方法

一、鱼皮的前处理

取新鲜鳕鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，用切片机切成面积小于0.5cm²的小块，10℃下用5％NaCl浸泡0.5小时，料液比1:30(w/v)，并重复一次，沥干。

二、洗涤鱼皮

1、脱脂

向鱼皮中加入1％吐温80(w/w)溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡6小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干；

2、去杂蛋白

向鱼皮中加入0.2M KOH溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡3小时，沥干；然后向鱼皮中加入含有5％NaCl溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡6小时，每隔2小时换液一次，沥去水分，然后用纯水漂洗3次，沥干；

3、脱色

向鱼皮中加入0.05M柠檬酸溶液，料液比1:30(w/v)，10℃，250rpm振荡1小时，沥去溶液上部的黑色鳞衣悬浮液，然后后用纯水漂洗3次，沥干；向鱼皮中加入2％过氧化氢溶液，料液比1:30(w/v)，10℃,250rpm振荡1小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干；

三、酸法浸提胶原

向鱼皮中加入0.5M柠檬酸溶液，料液比1:50(w/v)，10℃，250rpm振荡6小时，然后用12000g离心20min，上清液即酸提取胶原液；

四、固定化酶法除端肽

首先制备固定化酶，方法为：将5g中性蛋白酶溶于25ml纯水中，搅拌至完全溶解，然后加入活性炭50g，200rpm温育1小时，即得固定化酶。

然后将固定化酶加入到步骤5所得酸提取胶原液中，于10℃，150rpm振荡6小时，12000g离心20min，所得上清液即为酶处理胶原液；

五、胶原的精制

1、等电点沉淀结合水洗去除水溶性蛋白

用5M NaOH溶液将酶处理胶原液调整至pH7.5，于10℃，150rpm振荡2小时，使胶原充分沉淀，然后12000g离心20min；所得蛋白沉淀以1:30(w/v)料液比加入纯水，150rpm振荡1小时，每隔0.5小时换液一次，洗除残留的水溶性杂蛋白，沥干；然后加入0.5M柠檬酸溶液，料液比1:50(w/v)，10℃，250rpm振荡2小时，12000g离心20min，所得上清液即胶原粗提液；

2、超滤纯化

将胶原粗提液用截留分子量100kd的超滤膜包进行超滤透析，所得超滤浓缩组分即胶原纯化液；

3、冷冻干燥

将胶原纯化液于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即得大分子医用级鱼皮胶原。

实施例3一种鲨鱼皮胶原的提取方法

一、鱼皮的前处理

取新鲜鲨鱼皮100g去净鳞、残肉及脂肪，用切片机切成面积小于0.5cm²的小块，20℃下用3％KCl浸泡1小时，料液比1:20(w/v)，并重复一次，沥干。

二、洗涤鱼皮

1、脱脂

向鱼皮中加入0.3％吐温20溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡9小时，沥去水分，并用纯水漂洗3次，沥干；

2、去杂蛋白

向鱼皮中加入0.1M Ca(OH)₂溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡4.5小时，沥干；然后向鱼皮中加入含有3％KCl溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡9小时，每隔3小时换液一次，沥去水分，然后用纯水漂洗3次，沥干；

3、脱色

向鱼皮中加入0.03M磷酸溶液，料液比1:20(w/v)，20℃，175rpm振荡2小时，沥去溶液上部的黑色鳞衣悬浮液，然后后用纯水漂洗3次，沥干；向鱼皮中加入1％过氧化氢溶液，料液比1:20(w/v)，20℃,175rpm振荡2小时，沥干，然后用纯水漂洗3次，沥干；

三、酸法浸提胶原

向鱼皮中加入0.3M磷酸溶液，料液比1:35(w/v)，20℃，175rpm振荡9小时，然后用10000g离心30min，上清液即酸提取胶原液；

四、固定化酶法除端肽

首先制备固定化酶，方法为：将7g木瓜蛋白酶溶于50ml纯水中，搅拌至完全溶解，然后加入活性炭100g，150rpm温育3小时，即得固定化酶。

然后将固定化酶加入到步骤5所得酸提取胶原液中，于20℃，100rpm振荡9小时，10000g离心30min，所得上清液即为酶处理胶原液；

五、胶原的精制

1、等电点沉淀结合水洗去除水溶性蛋白

用5M NaOH溶液将酶处理胶原液调整至pH7.0，于20℃，100rpm振荡4小时，使胶原充分沉淀，然后10000g离心30min；所得蛋白沉淀以1:20(w/v)料液比加入纯水，100rpm振荡2小时，每隔1小时换液一次，洗除残留的水溶性杂蛋白，沥干；然后加入0.3M磷酸溶液，料液比1:35(w/v)，20℃，175rpm振荡4小时，10000g离心30min，所得上清液即胶原粗提液；

2、超滤纯化

将胶原粗提液用截留分子量50kd的超滤膜包进行超滤透析，所得超滤浓缩组分即胶原纯化液；

3、冷冻干燥

将胶原纯化液于真空冷冻干燥机中冷冻干燥，即得大分子医用级鱼皮胶原。

实施例4鱼皮胶原的性能比较

根据文献“不同提取方法对罗非鱼皮胶原蛋白理化特性的影响”(《食品科学》2014年15期)中的酸提取方法，以罗非鱼皮为原料提取胶原，并与实施例1所得胶原进行以下检测指标的比较：

1、羟脯氨酸含量测定

羟脯氨酸是胶原中特有的氨基酸，动物胶原中的羟脯氨酸含量一般不低于9％，因此羟脯氨酸的含量可间接反映胶原的蛋白纯度。本实施例按照“氨基酸分析仪法测定胶原类硬脑膜补片中羟脯氨酸含量”(《中国医疗器械信息》2012年第07期)所述方法测定羟脯氨酸含量。

2、SDS-PAGE电泳测定蛋白纯度

文献报道的鱼皮胶原多为Ⅰ型胶原，具有典型的α、β和γ肽链电泳图谱。通过电泳图谱可以初步鉴别是否为Ⅰ型胶原，若采用凝胶成像仪的分析软件对电泳图谱进一步分析，则可估算出胶原的蛋白纯度。本实施例按照“鲨鱼皮胶原与罗非鱼皮胶原的理化性质及酶解特性”(《食品工业科技》2014年第16期)所述方法进行蛋白电泳，见图1，由电泳图谱得知两种提取方法得到的胶原均具有典型的α1、α2、β和γ肽链，属于Ⅰ型胶原，然而采用本发明所述方法提取的胶原的杂蛋白条带明显少于对比样品，通过凝胶成像仪分析软件计算蛋白纯度的结果见表1。

3、检测残留脂肪

医用级胶原因为来源于动物组织，需要控制脂肪的残留量，按照“GB/T 5009.6-2003食品中脂肪的测定”所述方法检测胶原产品中残留的脂肪。

4、感官评价脱色与脱腥效果

实施例1所得鱼皮胶原的外观如图2所示，直观地观察胶原样品的色泽，并嗅其是否具有鱼腥味。

5、免疫原性评价

因为胶原属于动物源性医用材料，医疗器械注册法规要求对其进行免疫原性的检测，本实施例按照“鱼皮胶原蛋白海绵组织相容性的体内实验研究”(中国生物医学工程学报，2014年33卷2期)所述方法，对胶原进行血清特异性IgG抗体检测。

两种生产工艺所得罗非鱼皮胶原的检测结果见表1，结果显示：采用本发明所述方法提取的胶原的各项指标均优于对比样品，具有纯度高、杂质少、免疫原性低、生物相容性良好等优点，适于开发成胶原医用产品。

表1两种生产工艺所得罗非鱼皮胶原的性能对比

上文中描述了本发明的具体实施方式，但在本领域中的普通技术人员能够理解、不偏离本发明的精神和范围的情况下，还可以对本发明的具体实施方式作各种变更和替换。这些变更和替换都属于本发明权利要求书限定的范围内。

实施例5鱼皮胶原海绵在创伤修复中的应用

将实施1所制胶原海绵和实施4所制胶原海绵分别以70％乙醇浸泡1h消毒。以10倍体积无菌生理盐水浸泡10min，重复3次，无菌冻干备用。植入时切割为1cm×1cm片状物使用。

新西兰大白兔10只，雄性，体重约2-500-3000g，无菌下在兔耳正中处剥离皮肤，制造1cm×1cm的创面，左耳压敷实施例1所得胶原海绵，右耳压敷实施例4所得胶原，观察止血时间，止血后用纱布打包固定，定期观察其伤口愈合情况。结果如表2所示：

表2两种生产工艺所得罗非鱼皮胶原的创伤修复性能比较

Claims (16)

1.一种从鱼皮中提取可作为生物医用材料的大分子胶原的方法，包括如下步骤：

1)前处理：包括机械除杂、切块和盐水浸泡，共三个操作单元；

2)复合多种方法清洗：对步骤1)所处理的鱼皮进行清洗除杂质，包括先后进行表面活性剂溶液洗涤脱脂、强碱结合中性盐洗涤去除杂蛋白、弱酸洗涤去除黑色鳞衣、双氧水脱色，共四个操作单元，且所述四个操作单元的先后顺序是固定的；

3)酸法提取胶原：对步骤2)所处理的鱼皮采用酸性溶液进行胶原提取；

4)固定化酶法处理：采用活性炭作为蛋白酶的载体，对步骤3)所得胶原提取液进行去端肽与脱色处理；所述蛋白酶为胃蛋白酶、中性蛋白酶或木瓜蛋白酶；

5)胶原精制：对步骤4)所得胶原提取液进行纯化与精制，其中包括等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：鱼皮为硬骨鱼或软骨鱼的鱼皮，包括罗非鱼皮、鳕鱼皮、鲤鱼皮、鲢鱼皮、青鱼皮、草鱼皮、鳙鱼皮或鲨鱼皮。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)中，所述机械除杂、切块和盐水浸泡三个操作单元的前后顺序可以自由组合。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述盐水为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，浸泡时间0.5-2小时。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述表面活性剂溶液为质量百分含量为0.1％-1％的Triton×100、吐温80或者吐温20的水溶液，表面活性剂溶液洗涤脱脂的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间6-12小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述强碱为摩尔浓度为0.05M-0.2M的NaOH、KOH或Ca(OH)₂水溶液，强碱洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间3-6小时；所述中性盐为质量百分含量为1％-5％的NaCl或KCl水溶液，中性盐洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，洗涤时间6-12小时。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述弱酸为摩尔浓度为0.01M-0.05M的乙酸、柠檬酸或磷酸的水溶液，弱酸洗涤的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，处理时间1-3小时。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述双氧水为质量百分含量0.5-2％过氧化氢的水溶液，双氧水处理的料液比为1:10-1:30(w/v)，振荡速度100-250rpm，处理时间1-3小时。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3)中，所述酸为摩尔浓度为0.1M-0.5M的乙酸、柠檬酸或磷酸的水溶液，酸法提取的料液比为1:20-1:50(w/v)，振荡速度100-250rpm，提取时间6-12小时，提取后用8000-12000g离心力，离心20-40min。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述固定化酶法处理的方法为按照蛋白酶与鱼皮质量比1:10-1:20(w/w)称取蛋白酶，并将蛋白酶按料液比1:5-1:10(w/v)溶于纯水中，搅拌至完全溶解，然后加入活性炭，蛋白酶与活性炭的质量比是1:10-1:20(w/w)，100-200rpm，振荡1-6小时。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，所述精制包括等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白、真空冷冻干燥三个操作单元。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：等电点沉淀结合水洗涤去除水溶性杂蛋白、超滤法脱盐并纯化胶原蛋白的操作单元的温度控制在10℃-20℃。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述超滤是采用截留分子量为50kd、100kd或300kd的超滤膜。

14.一种采用权利要求1-13任一方法得到的鱼皮胶原制备得到的支架材料。

15.根据权利要求14所述的支架材料，其特征在于：支架材料呈疏松海绵状，主要成分Ⅰ型胶原的蛋白纯度达到98％以上，免疫原性低，具有良好生物相容性。

16.权利要求14或15所述的支架材料在制备治疗创伤修复中起到止血、促愈合和抑制疤痕药械中的用途。

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