KR100679712B1

KR100679712B1 - 불가사리로부터 콜라겐을 제조하는 방법

Info

Publication number: KR100679712B1
Application number: KR1020050047528A
Authority: KR
Inventors: 박희연; 윤호동; 김연계; 박진일; 김지회; 이가정
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2005-06-03
Publication date: 2007-02-15
Also published as: KR20060125995A

Abstract

본 발명은 수산 양식장의 해적생물이며 해양생태계 파괴의 주범으로 알려진 불가사리로부터 아텔로콜라겐(atelocollagen), 수용성 저분자 콜라겐펩티드(collagen peptide) 및 산가용성 저분자 콜라겐 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 불가사리 껍질에 알칼리를 처리하여 비 콜라겐 성분을 제거하는 방법으로 콜라겐섬유를 제조하고 주석산 또는 구연산을 이용하여 pH를 산성으로 조절한 다음 저온에서 산성프로테아제로 가수분해한 후 염석, 투석, 살균 과정을 거쳐서 아텔로콜라겐을 제조하는 방법과 저온에서 중성프로테아제를 이용하여 상기 아텔로콜라겐으로부터 수용성 저분자 콜라겐펩티드를 제조하는 방법 및 불가사리 콜라겐 섬유로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 생산하는 방법으로 구성되어 있다.

불가사리, 아텔로콜라겐, 콜라겐펩티드, 단백질분해효소

Description

불가사리로부터 콜라겐을 제조하는 방법 {Process for preparing collagen from starfish}

도 1은 알카리물질 종류에 따른 불가사리 효소 가수분해물의 콜라겐 함량을 보여주는 것이다.

도 2는 수산화칼슘의 처리시간에 따른 불가사리 효소 가수분해물의 콜라겐 함량을 보여주는 것이다.

도 3은 수산화칼슘의 처리온도에 따른 불가사리 효소 가수분해물의 콜라겐 함량을 보여주는 것이다.

도 4는 5중량% SDS-polyacrylamide gel 전기영동에 의한 콜라겐의 분자량 측정 결과로서 (a)는 소 아텔로콜라겐, (b)는 불가사리 아텔로콜라겐을 나타낸다.

본 발명은 불가사리로부터 열에 의해 변성되지 않고 텔로펩티드가 제거되어 항원성이 없으므로 인체에 활용도가 높은 아텔로콜라겐을 제조하고, 이것으로부터 수용성이며 분자량이 작아 피부흡수가 용이하므로 화장품 소재로 적합한 콜라겐펩티드를 제조하는 방법 및 불가사리 콜라겐 섬유로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 생 산하는 방법에 관한 것이다.

불가사리는 극피동물문에 속하는 해양저서생물로써 별불가사리(Asterina pectinifera), 아무르불가사리(Asterias amurensis), 가시단풍불가사리(Astropecten polyacanthus) 등 전 세계에 1,700여종이 있는 것으로 학계에 보고되어 있으며 우리나라 근해에도 200여종이 서식하고 있다. 특히, 아무르불가사리 및 별불가사리(이하 불가사리로 표기)는 육식성으로 피조개, 전복, 바지락, 가리비 등 유용패류를 그 먹이로 하고 있어 수산양식 산업에서는 아주 큰 해적생물로 분류되어 있으며 최근, 우리나라는 불가사리의 대량 번식으로 인하여 해양생태계가 파괴될 위험에 처해있다. 불가사리는 옛날부터 어촌에서 퇴비로 이용해왔으며 이에 관련된 공지된 특허기술로는 불가사리 비료(대한민국특허 10-0088787호, 10-0346927호, 10-0387936호, 10-0420978호), 건강보조용 칼슘제(대한민국특허 10-048086호), 항혈전 조성물(대한민국특허 10-0408087호), 항콜레스테롤 조성물(대한민국특허 10-0408089호), 항균 조성물(대한민국특허 10-0449910호) 등이 있으나 불가사리로부터 콜라겐을 제조하는 방법에 대한 특허는 공지된바 없다.

콜라겐은 인간을 비롯한 동물의 체내에서 세포와 세포사이를 메우고 있는 아주 중요한 섬유상의 경단백질(Albuminoid)이다. 세포가 다수 집합되어 있는 부위에는 반드시 콜라겐이 존재하고 있으며 특히 피부, 뼈, 연골, 혈관, 치아, 근육 등에는 콜라겐이 다량 함유되어 있다. 콜라겐은 가용성 콜라겐과 불용성 콜라겐으로 분류할 수 있으며 산가용성 또는 염가용성 콜라겐은 미숙한 동물의 조직으로부터 변성되지 않은 상태로 추출이 가능하나 그 수율이 매우 낮아 경제성이 떨어진다. 이 에 비하여 조직중의 불용성 콜라겐을 가용화하여 추출하는 방법은 실용적이다. 조직 중에 콜라겐이 존재하는 경우에 콜라겐 분자는 fibril, fiver 등의 고차구조를 형성하고 있으며 그 구조 중에 콜라겐 분자는 분자간에 가교를 형성, 불용화 되어 조직의 강도를 높인다. 이 가교는 콜라겐 분자의 양 끝에 비 나선부분인 telopeptide가 존재하며 이 telopeptide 부분을 제거하여 가교를 해제함으로써 콜라겐을 가용화 하는 것이 가능하다. 이 가용화에는 단백질분해효소, 예를 들면 펩신을 사용하는 것이 가능하다. 펩신은 telopeptide 만을 분해하고 나선부분에는 작용하지 못하며 이 방법에 의해 조제한 가용화 콜라겐은 telopeptide를 제거하였다는 의미로 아텔로콜라겐(atelocollagen)이라 칭한다. 아텔로콜라겐은 단백질분해효소에 의해 telopeptide와 비 콜라겐 단백질이 제거되기 때문에 다른 콜라겐에 비하여 순도가 높으며 천연의 콜라겐과 거의 동일한 물성을 가지므로 인체 적용에 있어서 바람직하다. 또한 아텔로콜라겐은 순도가 높을 뿐만 아니라 콜라겐의 주된 항원부위인 telopeptide가 제거된 항원성이 낮은 단백질로서 체내에 삽입하여도 아무런 문제가 발생하지 않는다. 이 저항원성은 콜라겐을 바이오물질로써 이용하는 데에 중요한 요건이 되며, 아텔로콜라겐은 인공피부, 지혈제, 세포배양용 기질 등으로 활용되고 있다.

콜라겐의 생산 재료는 현재까지 주로 소, 돼지 등 축산동물로부터 공급되었으나 최근 광우병 파동으로 인한 유해성 문제가 대두되어 광우병과 관련이 없는 해양생물을 소재로 하는 연구가 활발하게 시도되고 있다.

불가사리의 근육조직은 자기 팔의 1.5배 크기 조개를 포식하는 신축성을 지니고 있으며 손상된 팔이 자라나는 조직 재생 능력이 있는 등 다양한 생리적 기능을 지니고 있다. 그리고 이러한 특성은 콜라겐과 밀접한 관련이 있을 것으로 추정된다. 그러나 불가사리 체벽은 골편(탄산칼슘)과 단백질, 색소, 냄새성분 등으로 복잡하게 구성되어 있어 육상동물의 콜라겐 추출재료와는 많은 차이점이 있다. 따라서 이미 공지된 비 콜라겐 물질 제거법과 콜라겐 추출법인 초산추출법, 펩신추출법 등을 직접 적용할 경우에 효과적인 추출이 곤란하다. 즉, 불가사리의 체벽에는 다량(20-30중량%)의 골편(탄산칼슘)이 존재하고 있어 비 콜라겐 물질 제거조건 규명이 필요하며, 이미 공지된 초산 추출법이나, 산성프로테아제 추출법으로 콜라겐을 추출할 경우 체벽에 존재하는 탄산칼슘과 초산이 반응하여 중화반응을 일으키므로 최적 추출조건을 유지하기 곤란하며, pH를 맞추기 위해 과잉의 산을 사용할 경우에는 중화반응의 결과로 발생한 다량의 초산칼슘에 의해 용액의 이온강도가 증가하여 콜라겐이 침전되어 효소반응 잔사에 혼입되기 때문에 콜라겐의 손실이 커서 경제성이 떨어진다는 문제점이 있다. 또한 열에 의한 콜라겐의 변성온도가 온혈동물이 약 35-40℃인 데에 비하여 불가사리 콜라겐은 25℃로 비교적 낮아 열 변성을 피하기 위해서는 저온에서 처리해야만 한다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 알칼리성 물질을 이용하여 비 콜라겐 물질의 제거조건을 제시하였고, 주석산 또는 구연산을 이용하여 용액의 pH를 산성으로 조정하면 용액의 이온강도에는 영향을 미치지 않아 콜라겐이 침전되지 않음에 착안하여 수율의 저하 없이 아텔로콜라겐을 제조하는 방법을 고안하고자 하였으며, 콜라겐이 변성되지 않는 저온에서 중성 프로테아제를 이용하여 아텔로콜라겐으로부터 콜라겐펩티드로 제조하는 방법을 제공하였다. 그리고 불가사리 체벽으로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 공지된 기술인 투석과정을 거치지 않고 제조하는 것을 기술적 과제로 하였다.

본 발명의 구성은 크게 ① 알칼리물질을 이용하여 불가사리 체벽에 존재하는 비 콜라겐 물질을 제거하여 콜라겐섬유를 제조하는 공정, ② 산성프로테아제를 이용하여 콜라겐섬유로부터 아텔로콜라겐을 제조하는 공정, ③ 중성프로테아제를 이용하여 아텔로콜라겐으로부터 미변성 저분자 콜라겐펩티드를 제조하는 공정, ④ 불가사리 콜라겐 섬유로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 제조하는 공정으로 이루어진다.

본 발명에 사용되는 불가사리재료로는 아무르불가사리 또는 별불가사리를 사용하였다.

① 비콜라겐 물질의 제거

불가사리의 체벽에는 콜라겐 이외의 단백질, 피하지방, 냄새성분(아민류, 지방산, 카르보닐화합물, 황화합물), 무기물(탄산칼슘) 등 이물질이 상당량 존재하므로 콜라겐의 순도를 높이기 위해서는 비 콜라겐 물질의 제거가 필수적이다. 비 콜라겐 물질의 제거방법으로는 알칼리, 산, 효소 등이 이용되고 있으나 어피, 비늘 등 수산물에서 일반적으로 사용되고 있는 방법은 알칼리 처리법이다. 따라서 본 발명에서도 알칼리 처리법을 선택하여 수산화나트륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨에 의한 전처리 조건을 검토하였으며 그중 효과가 가장 우수한 수산화칼슘을 이용하여 적정처리 온도 및 시간을 규명하였다. 먼저 적정 전처리 물질을 찾기 위하여 24시간동안 알칼리 처리한 시료의 콜라겐 함량을 측정하였다(도 1).

알칼리의 종류 및 농도에 따른 콜라겐 함량은 수산화칼슘이 농도1.5중량%에서 85.3중량%, 수산화나트륨이 농도 2.5중량%에서 83.6중량%, 탄산나트륨이 농도 3.0중량%에서 81.5중량%로 최고치를 나타내었으며, 그 이상의 농도에서는 콜라겐 함량이 감소하였다. 이는 고농도의 알칼리 처리로 인하여 비 콜라겐 물질과 함께 콜라겐도 용출되어 소실되는 것으로 추정된다. 이상의 결과를 종합해 보면 불가사리로부터 콜라겐을 추출하기 위한 전처리 물질은 1.5중량% 수산화칼슘이 가장 적합하다.

적정 전처리 시간을 알아보기 위하여 1.5중량% 수산화칼슘용액에 불가사리 체벽을 침지시킨 후에 시간별로 효소 가수분해물의 콜라겐 함량을 측정하였다(도 2). 1.5중량% 수산화칼슘 처리시간별 콜라겐 함량은 1시간이 73중량%, 3시간이 78%중량, 5시간이 80중량%, 12-48시간이 84-85중량%를 나타내었다. 따라서 장시간처리에 따른 콜라겐의 변성 등을 고려하면 1.5중량% 수산화칼슘으로 12시간 동안 처리하는 것이 적당하다.

적정 전처리 온도를 알아보기 위하여 5, 10, 20, 30, 40℃에서 각각 1.5중량% 수산화칼슘용액에 12시간 동안 전처리한 다음 온도별로 효소 가수분해물의 콜라겐 함량을 측정하였다(도 3). 처리 온도별 콜라겐 함량은 84-85중량%로 큰 차이를 보이지 않았으나 불가사리 콜라겐의 열변성 및 미생물 발육 억제 등을 고려하면 5℃에서 처리하는 것이 바람직하다.

② 아텔로콜라겐의 제조

공지된 아텔로콜라겐의 제조방법은 불용성 콜라겐섬유를 증류수에 현탁시킨 다음 염산 또는 초산으로 pH를 3.0으로 조정하여 1-5중량% 산성프로테아제로 5-20℃에서 추출한 다음 NaCl로 염석하여 콜라겐을 침전시킨 후 투석하는 방법으로 콜라겐을 생산한다. 그러나 불가사리의 경우에는 공지된 방법인 산처리를 위하여 염산이나 초산을 사용하게 되면 조직 내에 존재하는 골편(탄산칼슘)과 반응하여 다량의 염화칼슘이나 초산칼슘이 생성된다(화학식 1). 그리고 이 반응에서 생산되는 염화칼슘이나 초산칼슘은 물에 용해되어 이온강도가 높아지고 효소에 의해 추출된 콜라겐의 침전을 유발하여 수율을 저하시키는 요인이 된다.

따라서 본 발명에서는 불가사리 조직 내에 존재하는 탄산칼슘과 반응하여 용해되지 않고 침전물을 형성함으로써 용액의 이온강도에 영향을 주지 않으면서 산성(pH 3.0)을 유지하고 인체에도 해롭지 않은 물질을 찾기 위하여 실험을 실시하였다. 즉 불가사리 골편 10g을 증류수 200ml에 넣고 용액의 pH가 3.0이 될 때 까지 산을 서서히 가한 후 원심분리하여 침전물의 중량을 측정한 결과는 표 1과 같다.

불가사리 골편과 각종 산의 반응 후 침전물 중량

산	염산	초산	구연산	주석산	인산	사과산	젖산
침전물의 중량(g)	0.00	0.00	20.46	41.78	15.38	2.64	0.00

이상의 실험결과로부터 주석산, 구연산, 인산, 사과산이 불가사리 골편에 함유되어 있는 탄산칼슘과 반응하여 칼슘염이 생성되며, 이들 칼슘염은 침전을 일으켜 용액의 이온강도에도 크게 영향을 주지 않으므로 본 발명에서 pH 조절을 위해 사용될 수 있으며, 주석산과 구연산의 경우 탄산칼슘과 반응하여 생성되는 칼슘염의 10℃ 물에 대한 용해도가 각각 0.040g/100ml, 0.065g/100ml으로 매우 낮아 대부분의 양이 녹지 않고 침전되므로 보다 바람직합니다.(화학식 2).

즉, 주석산칼슘 및 구연산칼슘은 물에 난용성이기 때문에 반응액의 이온강도에 영향을 미치지 않아 용액 중에 존재하는 콜라겐이 침전되지 않습니다. 이상의 원리에 착안한 본 발명은 불용성 콜라겐섬유를 증류수에 현탁시킨 다음 주석산 또는 구연산으로 pH를 3.0으로 조정하여 1-5중량% 산성프로테아제로 5-20℃에서 콜라겐을 추출한 다음 NaCl로 염석하여 콜라겐을 침전시킨 후 투석하는 방법으로 아텔로콜라겐을 생산하는 기술을 고안하였다.

③ 미변성 콜라겐펩티드의 생산

산성프로테아제에 의해서 추출된 아텔로콜라겐은 화장품의 적용 pH범위(pH5-6)에서 침전 및 응집되기 때문에 화장품에 적용성이 떨어지는 단점이 있으며 분자량이 약10만으로 피부에 흡수되지 못한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 아텔로콜라겐을 중성에서 분자량 3,000Da 이하의 저분자 펩티드로 분해할 필요가 있다. 따라서 중성프로테아제인 Trypsin, Alcalase, Neutrase, Protamex, Protease NP, Arazyme을 이용하여 불가사리 콜라겐의 열 변성온도인 24℃이하에서 아텔로콜라겐을 저분자화 하는 방법을 검토하였다. 각 효소를 아텔로콜라겐 양의 1중량%를 첨가하여 반응온도 20℃에서 1시간동안 반응시킨 후에 효소별로 가수분해율을 측정하였다(표 2).

효소별 콜라겐 가수분해율

효소	Trypsin	Alcalase	Neutrase	Protamex	Protease NP	Arazyme
가수분해율(%)	67.2	59.0	40.2	37.0	46.5	78.1

효소별 가수분해율은 무당거미 유래 단백질 분해효소인 Arazyme이 78.1%로 가장 우수한 분해력을 나타내었으며 Trypsin 67.2%, Alcalase 59.0%, Protease NP 46.5%, Neutrase 40.2%, Protamex 37.0%순 이었다. 그리고 가수분해율을 높이기 위한 실험으로 Arazyme을 이용하여 반응시간별 가수분해율을 측정하였다(표 3).

반응시간별 Arazyme의 콜라겐 가수분해율

반응시간(hr)	1	3	6	12	18	24
가수분해율(%)	78.1	85.8	90.6	93.5	93.6	93.9

Arazyme의 콜라겐 가수분해율은 12시간까지 증가하였으나 그 이후부터는 증가율이 미미하여 효소반응시간은 12시간이 적당한 것으로 나타났다. 이상의 결과를 종합하면 불가사리 유래 아텔로콜라겐을 이용한 콜라겐펩티드의 제조조건은 1중량%의 Arazyme으로 온도 20℃에서 12시간동안 가수분해하는 것이 바람직하다.

④ 산가용성 콜라겐펩티드의 생산

본 방법은 불가사리 효소 가수분해물로부터 주석산칼슘의 침전 원리를 이용하여 별도의 투석과정 없이 손쉽게 산가용성 콜라겐펩티드를 생산하는 기술에 관한 것이다. 즉, 불가사리 체벽을 알칼리 처리하여 비 콜라겐물질을 제거하고 프로테아제로 가수분해한 다음 골편을 제거한 용액을 주석산을 이용하여 pH 3.0으로 조절하면 콜라겐펩티드는 용액에 녹고 비 콜라겐 성분은 침전하게 된다. 이것을 원심분리하여 비 콜라겐 성분을 제거하고 여기에 탄산칼슘을 첨가하여 중화시키면 주석산칼슘이 생성되어 침전되므로 용액 내에 존재하는 주석산을 별도의 투석과정이 없이 원심분리만으로 제거할 수 있어 순수한 산가용성 콜라겐펩티드의 생산이 가능하다.

다음은 실시예 및 비교예를 이용하여 본 발명의 내용을 좀더 구체적으로 설명하였으나, 본 내용이 발명의 청구범위를 제한하지는 않는다.

비교예

① 내장을 제거한 불가사리의 체벽 100g을 크기 2-5cm³로 절단하여 1리터의 1.5중량% 수산화칼슘 용액에 침지하여 5℃에서 12시간동안 처리한 다음, 수도수로 비 콜라겐 성분을 세척하여 콜라겐섬유 90g을 제조한다.

② ①에서 생산된 콜라겐섬유 90g에 0.9리터의 증류수를 가하고 호모게나이저(Ultra-Turrax T50)로 파쇄한 다음 초산을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 후 펩신 0.9g을 가하여 10℃에서 콜라겐을 추출한 다음 5중량% NaCl로 2-3회 염석하여 콜라겐을 침전시키는 방법으로 정제한 후 12-24시간 동안 투석한 다음 동결건조하여 아텔로콜라겐 1.5g을 얻었다.

실시예 1

② ①에서 생산된 콜라겐섬유 90g에 0.9리터의 증류수를 가하고 호모게나이저(Ultra-Turrax T50)로 파쇄한 다음 주석산을 이용하여 pH 3.0으로 조절한 후 펩신 0.9g을 가하여 10℃에서 콜라겐을 추출한 다음 5중량% NaCl로 2-3회 염석하여 콜라겐을 침전시키는 방법으로 정제한 후 12-24시간 동안 투석한 다음 동결건조하여 아텔로콜라겐 4.5g을 얻었다.

이상의 결과에서 아텔로콜라겐의 수득한 양을 살펴보면, 비교예(초산 사용)가 1.5g이었으나 실시예(주석산 사용)는 4.5g으로 초산 대신 본 발명의 주석산을 사용할 경우가 수득율이 약 3배 가량 더 높다.

상기의 방법에 의해 생산된 아텔로콜라겐의 분자량을 측정한 결과는 도 4와 같다. 즉 불가사리로부터 분리한 아텔로콜라겐은 α1 및 α2사슬로 이루어져 있으며 분자량은 약 10만Da으로 소 콜라겐과 비슷하였다.

실시예 2

실시예 1에서 제조한 아텔로콜라겐 300g에 증류수 10리터를 가하고 Arazyme 1mg으로 20℃에서 12시간동안 가수분해한 것을 한외여과막을 이용하여 분자량 1000-3000Da의 물질만을 분획하고, 그 이상의 분자량을 가진 것은 상기와 동일한 방법으로 재차 가수분해하는 방법으로 농도 3중량% 수용성 저분자 콜라겐펩티드 10리터를 제조하였다.

실시예 3

② ①에서 생산된 콜라겐섬유 90g에 0.9리터의 증류수를 가한 후 Protease NP 0.9g을 가하여 55℃에서 가수분해한 다음 원심분리하여 골편을 제거한 용액을 주석산을 이용하여 pH 3.0으로 조절하여 24시간동안 방치한 후 원심분리하여 용액을 분리한다.

③ ②에서 분리한 용액에 탄산칼슘을 pH 7.0이 될 때까지 서서히 가한 다음 원심분리하여 3.6중량% 산가용성 콜라겐펩티드용액 0.9리터를 얻었다.

본 발명은 수산양식장의 해적생물인 불가사리의 수요를 개발하여 경제적 가치를 향상시킴으로서 불가사리 퇴치에 큰 역할을 할 것으로 예상되며, 아텔로콜라겐은 지혈용 스폰지, 인공피부 및 인체공학을 위한 세포배양 지지체로 활용이 가능하며, 이를 재차 가수분해한 수용성 저분자 콜라겐 펩티드는 화장품 및 식품 소재 로 이용될 수 있어 고부가가치 해양생명공학산업의 활성화에 크게 기여할 것으로 전망된다.

Claims

아래공정을 포함하여 이루어진 아무르불가사리 또는 별불가사리로부터 아텔로콜라겐을 제조하는 방법.

① 수산화나트륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨에서 선택되는 알칼리물질을 이용하여 불가사리 체벽에 존재하는 비 콜라겐 물질을 제거하여 불용성 콜라겐섬유를 제조하는 공정, ② 주석산 또는 구연산을 이용하여 pH를 산성으로 조절한 후 산성프로테아제를 이용하여 콜라겐섬유로부터 아텔로콜라겐을 제조하는 공정.
아래공정을 포함하여 이루어진 아무르불가사리 또는 별불가사리로부터 콜라겐펩티드를 제조하는 방법.

① 수산화나트륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨에서 선택되는 알카리물질을 이용하여 불가사리 체벽에 존재하는 비 콜라겐 물질을 제거하여 불용성콜라겐섬유를 제조하는 공정, ② 주석산 또는 구연산을 이용하여 pH를 산성으로 조절한 후 산성프로테아제를 이용하여 콜라겐섬유로부터 아텔로콜라겐을 제조하는 공정, ③ 상기 아텔로콜라겐을 중성프로테아제를 이용 가수분해하여 수용성 저분자 콜라겐펩티드를 제조하는 공정.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, ② 공정에서 주석산을 이용하여 pH를 3.0 으로 조절하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, ① 공정에서 알칼리물질은 1.5중량% 수산화칼슘용액이고 5℃ 내지 10℃에서 10 내지 15 시간 처리하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 3 항에 있어서, ② 공정에서 산성프로테아제는 1중량%펩신이며, 5℃ 내지 10℃에서 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 2 항에 있어서, ③ 공정에서 중성프로테아제는 아라자임(Arazyme)이며, 10℃ 내지 20℃에서 10 내지 15시간 반응시키는 것을 특징으로 하는 제조방법.
제 2 항에 있어서, ③ 공정에서 가수분해 한 것을 한외여과막을 이용하여 분자량 1000-3000Da의 물질만을 분획하고 그 이상의 분자량을 가진 것은 재차 가수분해하는 것을 특징으로 하는 수용성 저분자 콜라겐펩티드를 제조하는 방법.
아래공정을 포함하여 이루어진 아무르불가사리 또는 별불가사리로부터 산가용성 콜라겐펩티드를 제조하는 방법.

① 수산화나트륨, 수산화칼슘, 탄산나트륨에서 선택되는 알칼리물질을 이용하여 불가사리 체벽에 존재하는 비 콜라겐 물질을 제거하여 불용성 콜라겐섬유를 제조하는 공정, ② ①공정에서 생산된 콜라겐섬유에 증류수 가한 후 산성프로테아제를 이용하여 가수분해한 후 골편을 제거한 용액에 주석산을 이용하여 pH를 3.0 으로 조절하여 비 콜라겐 성분을 침전시키는 공정, ③ 원심분리하여 비콜라겐 성분을 제거하고 탄산칼슘을 가하여 중화시킨후 다시 원심분리하여 침전된 주석산칼슘을 제거하여 산가용성 콜라겐펩티드를 제조하는 공정.